브로콜리(Brassica oleracea var. italica)는 십자화과(Brassicaceae)에 속하는 식물로, 소아시아와 동지중해 지역에서 유래하여 현재 국내에서는 제주도, 강원도, 충청도에서 주로 재배되고 있다. 브로콜리는 항산화 및 항콜레스테롤 효과와 같은 면역 증진 효과가 있다고 알려져 있으며(Ravikumar, 2015), 이러한 효과는 tannins, selenium, 플라보노이드, 폴리페놀 외에도 십자화과 식물에서 특이적으로 발견되는 sulforaphane에 기인한 것으로 보고되고 있다(Lee와 Rhee, 1997). 그러나 이러한 저분자 물질은 브로콜리의 유통 과정에서 수반되는 가열, 가공, 저장 공정을 거치면서 서서히 파괴되어 그 함량이 줄어들어, 이 성분들이 대부분의 생리 활성에 기여한다고 보기 어렵다(Shim 등, 1992).

최근 천연물 유래 고분자 다당류의 다양한 약리 활성이 보고되고 있으며, 이들은 낮은 독성과 물에 잘 녹는다는 장점이 있다(Maxwell 등, 2012). 그중에서도 펙틴은 모든 식물체의 1차 세포벽에 존재하는 복합 다당류로, 복잡한 구조로 인해 항암(Choi 등, 2022) 및 항염증(Liu 등, 2021) 효과를 나타낸다고 보고된 바 있다. 펙틴은 galacturonic acid(GalA)가 α-1, 4로 결합된 선형의 homogalacturonan(HG)을 주쇄로 하여, rhamnogalacturonan(RG)이 곁사슬로 공유 결합한 형태의 다당류이다(Ridley 등, 2001). RG 영역에는 다양한 중성당과 중성사슬이 털과 같은 형태로 분지되어 있으며, 구성하는 당의 종류와 결합에 따라 RG-I과 RG-II로 분류된다(Lee 등, 2015; Wu 등, 2020). 펙틴의 면역 자극 활성은 이러한 RG 영역에 기인한 것으로 알려져 있으며(Yamada와 Kiyohara, 2007), 특히 식물체 유래 다당류의 생물학적 활성은 식물의 종, 재배지 및 추출 방법에 따라 구조 및 특성이 다르므로 활용 가능성이 매우 높다(Shin, 2012). 따라서 오랫동안 식용으로 이용된 식물 유래 성분은 안전성 확보가 용이하기 때문에 우수한 면역 조절제 소재로 평가되고 있다.

이러한 면역 조절은 다당류가 체내의 선천 면역세포를 활성화하고, 이들이 분비하는 면역물질이 전신 면역계의 증진에 기여하는 것으로 알려져 있다. 대표적인 선천 면역세포 중 하나인 대식세포는 외부 물질 및 병원체에 비특이적으로 반응하며, 다양한 chemokine과 cytokine을 분비하여 1차 방어 역할을 수행한다(Kim 등, 2012). 이러한 면역물질은 면역세포 간의 의사소통을 조절하여 주위 면역 세포를 활성화하거나, 염증 반응, 세포의 성장 및 분화를 촉진하고 염증 부위로 이동할 수 있도록 신호를 보내는 역할을 수행한다. 특히 활성화된 대식세포가 많이 분비하는 것으로 알려진 nitric oxide(NO), interleukin(IL)-6, tumor necrosis factor(TNF)-α는 염증을 매개하는 방어 물질로서, 직접적인 세포 독성을 가질 뿐만 아니라 다른 면역 세포를 활성화하거나 집중을 유도한다(Schepetkin과 Quinn, 2006). 이 외에도 대식세포는 식세포 작용을 통해 외부 인자를 직접적으로 탐식하거나(Gordon, 2016), 항원 제시 세포로서 적응 면역 세포에 신호를 전달하여 적응 면역과 네트워크를 형성하는 데 기여한다(Uribe-Querol과 Rosales, 2020). 이러한 대식세포의 활성화는 표면에 존재하는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor, PRR)가 다당류를 인식한 후 세포 내에서 다양한 신호 전달 경로가 이루어진다고 알려져 있다(Zhao 등, 2020). 대식세포의 대표적인 신호전달 경로로는 mitogen activated protein kinase(MAPK), nuclear factor-kappa B(NF-κB) 경로가 있으며, 이들은 다양한 하위 단백질 분자로 구성되어 있다(Kyriakis와 Avruch, 2001; Liacini 등, 2002). MAPK는 염증 반응, 세포 분열 및 전사 조절과 관련되어 있으며, NF-κB는 염증과 면역 반응을 조절하는 주요 경로로 TNF-α와 같은 염증성 cytokine 분비를 유도한다(Zeng 등, 2024). 신호 전달 단백질의 인산화를 통해 활성화된 경로는 다양한 전사인자를 핵으로 이동시키고 유전자 발현을 촉진하여 다양한 염증성 chemokine과 cytokine의 생산 활성을 증가시킨다고 보고되어 있다(Yang 등, 2003). 최근 번데기 동충하초(Cordyceps militaris) 유래 다당류가 MAPK 경로를 활성화하여 NO의 생성과 염증 관련 mRNA 발현을 조절한다고 보고되었으며(Liu 등, 2024), Tetrastigma hemsleyanum에서 분리한 다당류가 MAPK/NF-κB 경로를 활성화화여 다양한 염증성 cytokine의 유도와 식세포능을 활성화한다고 보고된 바 있다(Wu 등, 2023).

따라서 본 연구에서는 열수 추출, 에탄올 침전, 상업용 효소 처리를 통해 브로콜리로부터 면역 활성 조다당 획분을 분리하였으며, 이의 일반화학적 특성과 대식세포 활성을 in vitro 상에서 측정하고 RAW264.7 대식세포를 이용해 MAPK 및 NF-κB의 신호 전달 기전을 규명하여 새로운 건강기능식품 소재화를 위한 기초 자료를 제시하고자 하였다.

실험 재료

본 실험에서 사용한 브로콜리는 2024년 제주도에서 재배된 생채를 구매하여 가식부를 사용하였다.

시약

본 실험에 사용된 pectinase(Plantase max^TM)는 비전바이오캠에서, galactose(Gal), GalA, bovine serum albumin(BSA), 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid (KDO), m-hydroxybiphenyl, thiobarbituric acid, dimethylsulfoxide, trifluoroacetic acid(TFA), NaBH₄, acetic acid, acetic acid anhydride, lipopolysaccharide from E. coli O127:B8(LPS)은 Sigma Co.에서 구입하여 사용하였다. Pullulan series는 Showa Denko에서, sulfuric acid, phenol, chloroform 및 pyridine은 Junsei에서 구입하여 사용하였다. 세포 실험에 사용된 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM), penicillin/streptomycin(P/S), phosphate-buffered saline(PBS)은 Gibco에서, fetal bovine serum(FBS)은 Welgene에서 구입하여 사용하였다. Mouse IL-6 kit은 BD Biosciences의 제품을, mouse TNF-α kit은 Invitrogen의 제품을, Griess’ reagent for nitrite는 Promega의 제품을, EZ-cytox 및 EZ-western은 Dogen의 제품을, BCA protein kit은 Thermo Fisher Scientific의 제품을 각각 구입하여 사용하였다.

대식세포 활성화 기작을 규명하기 위해 사용된 1차 항체 c-Jun, p-c-Jun, Jun N-terminal kinase(JNK), p-JNK, p-extracellular signal-regulated kinase(ERK), p-p38, inhibitor of NF-κB alpha(IκBα) antibodies는 Cell Signaling Technology의 제품을, p38, p65, ERK 및 β-actin은 Santa Cruz Technology의 제품을 구입하여 실험에 이용하였다. 2차 항체로 사용된 m-IgGκBP-horseradish peroxidase(HRP)는 Santa Cruz Biotechnology의 제품을, Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins/HRP는 Dako에서 구입하여 사용하였다. 또한 specific inhibitor인 SB203580, JNK inhibitor II, PD98059 및 BAY 11-7082는 Calbiochem으로부터 구입하여 사용하였다.

세포 배양

본 실험에 사용된 마우스 유래 대식세포주 RAW264.7은 DMEM에 10% FBS 및 1% P/S를 혼합한 배지를 사용하여 5% CO₂, 37°C 배양기에서 배양하였다. 세포가 배양 접시에 80% 이상 포화하면 PBS로 세포의 단층을 세척한 후 cell scraper를 이용하여 회수한 뒤 3×10⁵ cells/mL로 조정하여 계대 배양하였다.

브로콜리 유래 다당의 분리

세척한 브로콜리에 2배 부피의 증류수를 가한 뒤 믹서기로 거칠게 분쇄하고, 8배 부피의 99% 에탄올을 첨가하여 저분자 및 색소 물질을 제거하였다. 이후 원심분리(2,500×g, 15 min, 4°C)하여 얻은 침전물에 10배 부피의 증류수를 가하고, 절반의 부피가 될 때까지 100°C에서 열수 추출을 수행하였다. 열수 추출물을 원심분리(2,500×g, 15 min, 4°C)하여 얻은 상등액에 상업용 pectinase를 처리하고 48시간 동안 반응시킨 후 100°C에서 효소 활성을 실활하였다. 이어서 4배 부피의 99% 에탄올을 가하고 24시간 방치하여 에탄올 침전을 하였으며, 이후 원심분리(2,500×g, 15 min, 4°C)하여 침전물을 회수하였다. 이를 소량의 증류수에 용해하고 투석 및 동결 건조하여 브로콜리 유래 효소 처리 조다당(broccoli polysaccharide treated with enzyme; BCE-0)을 얻었다(Fig. 1A).

Fig 1. Isolation procedure of immunostimulating polysaccharide from broccoli (A) and its elution pattern on gel permeation chromatography using HPLC equipped with a Superdex^TM 75 GL column (B).

일반화학적 특성 분석

BCE-0의 일반 성분은 중성당, 산성당, 단백질, KDO의 함량으로 측정되었다. 중성당은 phenol-sulfuric acid 법(DuBois 등, 1956)으로, 산성당 함량은 m-hydroxybiphenyl 법(Blumenkrantz와 Asboe-Hansen, 1973)으로, 단백질 함량은 Bradford 법(1976)으로, KDO는 thiobarbituric acid 비색정량법(Karkhanis 등, 1978)을 통하여 정량 분석하였다. 각각의 분석에는 Gal, GalA, BSA 및 KDO를 표준물질로 사용하였다.

BCE-0의 분자량 분포도는 10 mg/mL의 농도로 증류수에 용해된 BCE-0를 사용하여, 표준물질로 pullulan series(P-800, 400, 200, 100, 50, 20, 10, 5)를 이용하였다. 이후 Superdex^TM 75 GL column(GE Healthcare Bio-Sciences)이 장착된 high performance liquid chromatography(1260 Infinity G1362A, Agilent Technologies Co.)의 refractive index detector(G1362A, Agilent Technologies Co.)를 사용하였으며, 50 mM ammonium formate buffer(pH 5.5)를 이동상으로 하여 0.5 mL/min의 유속으로 60분간 등용리 조건(isocratic mode)으로 분석하였다. 분자량의 결정은 표준물질을 이용해 얻은 표준 곡선에 BCE-0의 retention time을 대입하여 수행하였다.

구성당 분석

BCE-0의 구성당 분석은 Jones와 Albersheim(1972)의 방법을 일부 변형하여 gas chromatography(GC)로 분석하였다. 먼저 시료(1 mg)에 2 M TFA를 가한 후 121°C에서 반응시켜 단당류 형태로 가수분해한 후 건조하고 50 mg NaBH₄ in 1 M NH₄OH를 첨가하여 상온에서 4시간 동안 반응시켜 개환 및 환원시켰으며, acetic acid를 첨가하여 환원 반응을 정지하였다. 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하기 위하여 메탄올 첨가 및 건조를 반복하였다. 이렇게 얻어진 alditol 형태로 전환된 시료를 alditol acetate로 유도체화하기 위해, acetic acid anhydride와 pyridine을 첨가하여 121°C에서 반응시킨 후 건조하였다. 이를 chloroform/H₂O 2상 용매계로 분리하여 추출하고, chloroform 층만을 회수 및 건조하여 소량의 acetone에 용해한 후 GC 분석에 사용하였다. 분석에는 SP-2380 capillary column(Supelco)이 장착된 GC(ACME-6100, Young-Lin Co.)의 flame ionization detector(FID, Young-Lin Co.)를 사용하였으며, 질소 가스를 이동상으로 하여 1.5 mL/min의 유속으로 [60°C(1 min), 60°C→180°C(30°C/ min), 220°C(12 min), 220°C→250°C(8°C/min), 250°C(15 min)]의 최적 온도 조건에서 분석하였다. 각 구성당의 정량을 위해 다수의 단당 표준물질을 동일 방법으로 유도체화하여 얻어진 chromatogram의 retention time을 이용해 표준곡선을 얻었으며, 여기에 각 유도체의 peak 면적비, 분자량 및 FID에 대한 반응계수를 이용하여 mol%를 계산하였다.

RAW264.7에 대한 chemokine 및 cytokine 생산능 측정

BCE-0의 대식세포에 대한 chemokine 및 cytokine 생산능을 측정하기 위해 RAW264.7을 DMEM(with FBS, P/S)에 2.5×10⁶ cells/mL가 되도록 조정하여 96-well plate에 100 μL씩 분주한 후 5% CO₂, 37°C 배양기에서 2시간 동안 세포를 배양 및 안정화하였다. 이후 BCE-0를 DMEM(with FBS, P/S)을 이용하여 세포에 처리 시 1,000 μg/mL의 농도가 되도록 제조하였으며, 이를 2배수로 연속 희석하였다. 음성대조군으로는 medium을, 양성대조군으로는 1 μg/mL 농도의 LPS를 사용하였다. 이들을 각각 100 μL씩 처리한 후, 5% CO₂, 37°C 배양기에서 24시간 동안 배양하였으며 원심분리(400×g, 5 min)하여 상등액과 침전물을 각각 회수하였다. 가라앉은 세포에는 EZ-cytox를 사용하여 시료에 의한 세포 독성을 측정하였으며, 상등액에 유도된 NO는 griess’ reagent로, IL-6 및 TNF-α는 mouse IL-6 kit 및 mouse TNF-α kit을 이용한 ELISA 방법으로 제조사의 지침에 따라 chemokine 및 cytokine 함량을 측정하였다.

Western blotting을 통한 신호전달 경로 확인

계대 배양된 RAW264.7을 2×10⁶ cells/mL로 조정하여 6 cm dish에서 5% CO₂, 37°C의 조건으로 24시간 배양하였다. 이후 BCE-0를 DMEM(with FBS, P/S)을 이용하여 세포에 처리 시 0, 50, 100, 200, 500 μg/mL의 농도가 되도록 제조하였으며, 양성대조군으로는 1 μg/mL 농도의 LPS를 사용하였다. 이들을 각각 세포에 분주 후 5% CO₂, 37°C 조건에서 30분간 방치시켰으며, 배양 종료 후 상등액을 제거한 뒤 tris buffered saline(TBS)으로 세척하였다. 이어서 차가운 lysis buffer(protease inhibitor cocktail, 1 mM ditiotheitol, 1 mM sodium orthovanadate, 20 mM β-glycerophosphate, 1 mM phenylmethane sulphonyl fluoride in ripa buffer)를 400 μL 처리하여 세포를 lysis 및 회수하였으며, BCA kit을 이용하여 단백질의 농도를 정량하고 sample을 제조하였다. 제조한 sample을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 단백질을 분리한 후 PVDF membrane(Millipore)으로 transfer 하였다. 이후 membrane을 5% skim milk 또는 5% BSA를 이용하여 60분간 blocking을 진행하였고 TBS-T(Tris 247 mM, NaCl 1,370 mM, KCl 27 mM, Tween20 0.5%, pH 7.6)를 이용하여 3회 세척하였다. 추가로 membrane을 상온에서 90분 동안 1차 항체와 반응시키고 TBS-T를 사용하여 3회 세척 후 2차 항체와 함께 상온에서 60분 동안 배양하였다. 항체 부착이 완료된 membrane은 EZ-western을 이용하여 X-ray film으로 단백질의 발현량을 확인하였다.

Specific inhibitor를 통한 신호전달 세부 경로 확인

계대 배양된 RAW264.7을 2×10⁶ cells/mL로 조정하여 6 cm dish에서 5% CO₂, 37°C의 조건으로 24시간 배양하였다. 여기에 신호전달 단백질의 inhibitor인 PD 98059, SB203580 및 JNK II inhibitor를 10 μM의 농도로, BAY 11-7082를 5 μM의 농도가 되도록 처리하였으며, 1시간 동안 동일한 조건에서 배양하였다. BCE-0와 LPS는 DMEM(with FBS, P/S)을 이용하여 처리 시 최종 농도가 각 500 μg/mL, 1 μg/mL가 되도록 조제 및 처리하였으며 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 30분간 배양하였다. 배양 종료 후 앞서 언급한 방법과 동일한 방법으로 sample을 제조하고 western blotting을 시행하였다.

Specific inhibitor를 처리한 RAW264.7 cell의 cytokine 및 chemokine 분비능계대 배양한 RAW264.7을 2×10⁶ cells/mL가 되도록 조정하여 96-well plate에 100 μL씩 분주 후 5% CO₂, 37°C 배양기에서 2시간 동안 세포를 배양 및 안정화하였다. 그 후 inhibitor를 각 농도에 맞게 분주한 뒤 동일한 조건에서 1시간 배양하였다. 이어서 BCE-0를 최종 농도가 500 μg/mL가 되도록 처리한 후 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하여 chemokine과 cytokine의 분비를 유도하였다. 배양 종료 후 원심분리(400×g, 5 min)하여 세포배양액을 회수하였고, 앞서 언급한 방법을 통해 NO와 IL-6의 분비량을 측정하여 specific inhibitor의 첨가에 따른 생산량을 비교･분석하였다.

통계 처리

모든 실험 결과는 IBM SPSS Statistics 21(IBM Co.)을 이용하여 통계 처리하였으며, 측정 항목에 대한 평균(mean)과 표준편차(standard deviation)로 나타내었다. 시료 간 유의차 및 처리 농도 간 유의성은 ANOVA test 후 Duncan’s multiple range test를 통해 P<0.05 수준에서 구체적인 사후 검증을 거쳐 기재하였다.

브로콜리 유래 다당의 추출과 일반화학적 특성

브로콜리를 대상으로 열수 추출, 에탄올 침전, pectinase 처리를 통해 건물 기준 3.13%의 수율로 효소 처리 조다당인 BCE-0를 얻을 수 있었다(Fig. 1A). 펙틴 계열의 다당은 다양한 종류의 당과 그것들의 복잡한 구조로 구성된 RG 영역에 의해 생리 활성을 나타낸다고 알려져 있으나(Yamada와 Kiyohara, 1989), 단순 열수 추출을 행할 경우 생물 활성이 없는 HG의 존재에 기인하여 수율과 효과를 기대하기 어려우므로 추가적인 효소 처리 등의 추출 방법이 필요하다. 따라서 에탄올 침전법을 사용하여 고분자 다당과 그 외 물질을 신속하게 분리한 뒤, pectinase 처리를 통해 비활성 영역인 HG를 제거해 활성 영역인 RG의 수율을 높일 수 있었다.

BCE-0의 분자량의 분포를 Superdex^TM 75 GL column으로 측정한 결과, 고분자 물질과 저분자 물질이 혼재됨을 확인할 수 있었으며, 넓은 범위의 저분자 peak는 pectinase 처리를 통한 가수분해가 정상적으로 이루어졌음을 나타낸다(Fig. 1B). 한편 분자량 75~100 kDa의 고분자 peak와 분자량 5~15 kDa의 중간 분자 peak는 각각 활성 다당 RG-I과 RG-II 다당 영역으로 추정되었다. 이어서 일반 화학적 성분을 분석한 결과, 중성당 57.7%, 산성당 34.9%, 단백질 4.7%, KDO 2.7%의 비율로 구성되어 있었다. 구성당 분석 결과 RG 다당의 주요 구성당인 산성당(GalA, GlcA 34.9%), Gal(19.2%), Rha(14.4%), Ara(12.2%)가 높은 비율로 검출되었으며, 이외에도 RG-II에만 존재한다고 알려진 2-methyl fucose, 2-methyl xylose, apiose 및 aceric acid와 같은 특이당의 존재도 확인되었다(Table 1). RG-I은 주로 Gal, Ara, Rha와 같은 중성당이 포함되며, RG-II는 aceric acid, apiose, 3-deoxy-lyxo-2-heptulosaric acid 및 KDO와 같은 특이당이 포함된다(Voragen 등, 2009). 일반성분 분석에서 대부분이 중성당과 산성당으로 이루어진 것을 통해 BCE-0는 당으로 이루어진 시료임을 알 수 있을 뿐만 아니라, 구성당 분석에서 RG-I의 대표 구성당인 Gal, Rha, Ara가 BCE-0의 대부분을 구성하는 것과 RG-II의 구조에서 발견되는 KDO 및 특이당이 검출된 사실을 통해, BCE-0는 산성 다당체인 펙틴 계열의 다당임을 유추할 수 있었다. 따라서 BCE-0는 면역 세포 자극을 통한 생리 활성을 가질 가능성이 높을 것이라 기대되었다.

Table 1 . Chemical properties of BCE-0 from pectinase digests of broccoli.

Chemical properties (%).	BCE-01).
Neutral sugar. Uronic acid. Protein. KDO2)-like materials.	57.7±1.2. 34.9±0.3. 4.7±0.1. 2.7±0.5.
Component sugar (mol%).
2-Methyl-fucose. Rhamnose. Fucose. 2-Methyl-xylose. Arabinose. Xylose. Apiose. Aceric acid. Mannose. Galactose. Glucose. Glucuronic acid＋galacturonic acid.	2.1±0.0. 14.4±0.1. 2.3±0.0. 2.0±0.0. 12.2±0.1. 1.0±0.1. 1.0±0.0. 1.5±0.3. 0.9±0.0. 19.2±0.2. 1.3±0.0. 34.9±0.3.

¹⁾BCE-0: broccoli polysaccharide treated with enzyme..

²⁾KDO: 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid..

브로콜리 유래 다당의 대식세포 활성화

대식세포는 수지상 세포와 함께 다양한 cytokine과 chemokine을 분비함으로써 방어 체계에 중요한 역할을 수행한다. 대식세포가 나타내는 여러 생리 활성 중에서 다당 시료에 대한 증식 능력과 NO, IL-6 및 TNF-α를 측정하기 위해 대식세포주 RAW264.7에 BCE-0를 처리하였다. Fig. 2A에 나타난 바와 같이 BCE-0의 모든 농도 범위(7.8~1,000 μg/mL)에서 세포 독성은 나타나지 않았으며, 농도 의존적인 세포 증식능을 보였다. 특히 가장 고농도인 1,000 μg/mL의 경우 LPS를 처리한 양성대조군과 비슷한 수준의 증식능을 보여 BCE-0가 대식세포 증식에 효과가 있음을 시사하였다. 이어서 chemokine과 cytokine을 측정한 결과, NO의 생산량은 125 μg/mL에서부터 농도 의존적으로 증가하였으며, 1,000 μg/mL에서 음성 대조군 대비 분비량이 약 2.5배 증가하였다(Fig. 2B). NO는 외부 감염에 의해 활성화된 대식세포에 의해 생성되며, 병원체에 대해 산화적 탈아미노화를 일으켜 DNA 손상을 유발함으로써 IL-6와 같은 염증성 cytokine과 함께 방어 물질로 작용한다고 알려져 있다(Cinelli 등, 2020; Yu 등, 2015). 이어서 IL-6 또한 125 μg/mL부터 농도 의존적으로 증가하였고, TNF-α의 경우 가장 낮은 농도인 7.8 μg/mL에서도 음성대조군보다 높은 수치를 보임에 따라 두드러지는 cytokine 생산량을 보였으며, 250 μg/mL부터는 양성대조군과 비슷한 수준을 보였다(Fig. 2C, 2D). IL-6는 면역 체계와 대사 조절에 영향을 미치는 전염증성 cytokine으로서 면역 반응의 초기 단계에서 대식세포에 의해 빠르게 생성된다(Fielding 등, 2008). TNF-α는 염증을 매개하며 종양세포에 대한 사멸을 유도하고 대식세포의 식균 능력을 증가시키는 염증성 cytokine이다(Jang 등, 2021; Parameswaran과 Patial, 2010). Fig. 2는 BCE-0가 대식세포를 자극하여 증식 능력을 향상시킬 뿐만 아니라, 다양한 면역 물질의 분비를 촉진하는 것을 보여준다. 활성화된 대식세포는 cytokine 및 chemokine을 분비하고 이를 통해 주변의 다른 면역 세포들을 활성화하는 연쇄 반응을 일으키며, 이로 인해 면역 물질의 양이 폭발적으로 증가한다고 알려져 있다(Ruytinx 등, 2018). 따라서 NO, IL-6 및 TNF-α의 농도 의존적 증가는 BCE-0에 의해 대식세포가 활성화되었음을 보여주며, 500 μg/mL 농도의 BCE-0 처리가 대식세포의 활성화를 여러 측면에서 확인할 수 있는 농도로 판단되었다. 이상의 결과는 LPS의 혼입 여부를 판별할 수 있는 polymyxin B(PLB) 처리에 의한 활성의 변화를 관찰한 후 시행되었으며, PLB 처리에 의한 변화를 보이지 않아 BCE-0 자체의 활성임을 재차 확인하였다(자료 미제시).

Fig 2. Effect of broccoli polysaccharide treated with enzyme (BCE-0) on cytotoxcitiy and production of chemokine and cytokines production by RAW264.7 cells in vitro. RAW264.7 cells (2.5×10⁶ cells/mL) were treated with various concentrations of samples for 24 h. The medium and lipopolysaccharide (1 μg/mL) represent the negative (NC) and positive controls (PC), respectively. Means with different letters (a-g) are indicated significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test (n=3).

대식세포의 MAPK 및 NF-κB 신호 전달 경로에 대한 BCE-0의 효과

앞선 실험에서 BCE-0가 대식세포 자극에 따른 증식능 및 면역 물질 유도를 확인한 결과, BCE-0는 대식세포를 활성화하는 것으로 사료되었다. 이에 따라 MAPK와 NF-κB 경로와 같은 세포 내 신호 전달 경로를 확인하고자, RAW 264.7 세포를 BCE-0 농도 0~500 μg/mL로 자극하고 western blotting을 수행하였다. BCE-0는 MAPK 관련 단백질(JNK, ERK, p38)의 인산화를 농도 의존적으로 유도하였으며, activating protein(AP)-1 family의 c-Jun도 전사인자로서 동일한 경향을 보였고 500 μg/mL의 농도에서 최대 인산화가 관찰되었다. JNK와 c-Jun의 인산화는 50 μg/mL에서 확인되었으며, ERK는 100 μg/mL, p38은 200 μg/mL에서 인산화가 확인되었다(Fig. 3A). MAPK는 JNK, ERK 및 p38에 의해 매개되며, ERK는 세포 분열, p38은 염증반응, JNK는 전사 조절과 관련되어 있다고 보고되고 있다(Johnson과 Lapadat, 2002; Yang 등, 2014). 또한 JNK의 활성화는 AP-1 계열에 속하는 c-Jun을 인산화시켜 유전자 발현을 조절한다고 알려져 있다(Yang 등, 2003). 이러한 신호전달 단백질의 인산화는 대식세포 표면에 발현된 PRR의 활성화로 시작되며, 이후 어댑터 단백질을 통한 하위 신호 전달로 진행된다(Kawai와 Akira, 2011). 따라서 BCE-0 처리에 따른 MAPK의 인산화를 통해 BCE-0가 대식세포 내 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 다당 시료임을 확인할 수 있으며, 농도 의존적인 경향은 PRR과 결합하는 다당의 수가 증가함에 따라 PRR의 활성화가 촉진되어 이후 하위 신호 전달과 단백질의 인산화가 유도된 것으로 사료되었다.

Fig 3. Phosphorylation of MAPKs, and transcription factor (A), and NF-κB (B) pathway-related proteins following broccoli polysaccharide treated with enzyme (BCE-0) treatment at different concentrations in RAW264.7 cells. RAW264.7 cells (2.0×10⁶ cells/mL) were treated with various concentrations of BCE-0 for 30 min. The medium (0 μg/mL of BCE-0) and lipopolysaccharide (LPS) (1 μg/mL) represent the negative and positive controls, respectively. Means with different letters (a-e) are indicated significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test (n=3).

이어서 NF-κB 경로의 활성화를 확인한 결과, IκBα는 200 μg/mL부터 감소하였으며 농도 의존적인 감소 경향을 보였고 반대로 p65의 인산화는 증가하는 경향을 보였다. 특히 500 μg/mL 농도에서 p65의 인산화는 양성대조군인 LPS에 의한 인산화 정도와 비슷한 수치를 보였다(Fig. 3B). NF-κB 단백질은 세포질 내에서 IκB kinase(IKK) 복합체와 결합하여 억제된 상태로 존재하며, NF-κB 경로가 활성화되면 IKK 복합체는 IκBα를 인산화시켜 NF-κB에서 IκBα와 p65의 분해를 유도한다(Son 등, 2024). 이후 유리된 p65는 인산화되어 핵으로 이동해 전사인자로서 역할을 수행하는데(Guo 등, 2020), 이러한 NF-κB 경로는 염증, 세포 증식 및 면역 반응 증진 등 여러 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(Li 등, 2015). 이에 비추어 보았을 때 Fig. 3B의 결과는 NF-κB 경로의 활성화를 나타내며, 특히 농도 의존적인 IκBα의 감소는 p-IκBα의 증가를 의미하고 p-p65의 증가는 면역 물질 생성에 필요한 전사 인자의 활성화를 의미한다고 판단할 수 있다.

활성화된 대식세포에 대한 specific inhibitor의 영향

MAPK와 NF-κB의 신호 전달 경로를 통한 BCE-0의 cytokine 생산 경로를 구체적으로 확인하기 위해 신호 전달 관련 단백질의 specific inhibitor를 사용하여 각 경로의 활성화를 차단하였다. Specific inhibitor는 target 신호전달 단백질의 활성부위에 결합하거나 인산화 유도 효소를 저해함으로써 인산화를 억제한다. 사용된 SB203580은 p38의 하위 signaling을 억제하며, JNK inhibitor II는 JNK의 활성을 직접적으로 억제하는 inhibitor이다. PD 98059는 ERK의 상위자인 MEK1/2를 억제함으로써 ERK signaling을 억제하고, BAY 11-7085는 NF-κB를 비활성 상태로 존재하도록 하는 IκBα의 인산화 억제제로서 NF-κB signaling을 억제한다고 알려져 있다(Kim 등, 2019). 본 실험에 사용할 inhibitor에 의한 경로별 활성 단백질의 저해를 확인하고자 inhibitor 처리 후 western blotting을 시행하였다. p38을 억제하는 SB를 처리했을 경우 인산화 단백질인 p-p38이 BCE-0만을 처리한 양성대조군보다 감소하였으며, PD를 처리했을 때 p-ERK, JNK II를 처리했을 때 p-JNK가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. NF-κB 경로를 억제하는 BAY를 처리하였을 때 IκBα가 증가하였으며, 인산화 단백질인 p-p65는 감소한 것을 통해 NF-κB 경로의 활성이 저해된 것을 관찰하였다(Fig. 4A). 각 inhibitor 처리 후 target 단백질의 인산화가 뚜렷이 저해된 것을 통해 inhibitor의 효과를 확인하였으며, 이로 인한 cytokine 및 chemokine의 분비량을 ELISA로 측정하였다.

Fig 4. Effect of phosphorylation of signaling pathway (A), and signaling specific inhibitors on interleukin (IL)-6, nitric oxide (NO) secretion (B) in broccoli polysaccharide treated with enzyme (BCE-0)-activated RAW264.7 cells. (A) RAW264.7 cells (2.0×10⁶ cells/mL) were pretreated with SB203580 (10 μM), PD 98059 (10 μM), JNK inhibitor II (10 μM), BAY 11-7082 (5 μM) for 1 h and the stimulated with BCE-0 (500 μg/mL) for 30 min in 6 cm dish. Whole-cell lysates were immunoblotted with the specific antibodies indicated. β-Actin served as an internal loading control. (B) RAW264.7 cells (2.0×10⁶ cells/mL) were pretreated with inhibitors (SB, JNK II, and PD, 10 μM; BAY 5 μM) for 1 h, and then stimulated with BCE-0 (500 μg/mL) for 24 h. The concentrations of IL-6 and NO in the cultured medium were determined by mouse IL-6 ELISA kit and Griess’ reagent system. Means with different letters (a-e) are indicated significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

IL-6의 경우 BAY를 처리하였을 때 cytokine의 생산량이 급격히 감소하였으며, SB와 JNK II를 처리하였을 때도 유의미한 감소가 관찰된 반면, PD를 처리하였을 때는 IL-6의 분비량이 대조군(BCE-0 처리군)과 비슷한 수준을 보였다. 한편, NO의 경우 처리한 모든 inhibitor에 의해 분비가 억제되었다. 특히, SB, JNK II 및 BAY에 의해 크게 감소하였으며, PD를 처리하였을 때 일부 감소하였다. 신호전달의 체계는 대식세포 표면에 노출된 PRR과 다당의 결합으로 활성화되어 여러 신호전달 단백질의 인산화가 발생한다. 이후 NF-κB와 AP-1과 같은 전자 인자들이 핵 내로 이동하며 IL-6 및 iNOS 유전자의 발현을 유도한다고 알려져 있다(Shen 등, 2017). 이러한 결과는 IL-6가 주로 NF-κB 경로를 통해 생산되며, 일부는 JNK와 p38 경로를 통해서도 생산된다는 것을 나타내고 ERK 경로는 관여하지 않는 것으로 확인되었다. 반면, NO는 p38, JNK, ERK 및 NF-κB를 포함한 다양한 경로를 통해 생산되는 것으로 확인되었다(Fig. 4B). 이로써 BCE-0가 다양한 경로에 위치한 단백질의 인산화를 통해 신호를 전달하며, 주로 NF-κB 경로를 통하여 IL-6를 생산하고 p38, JNK, NF-κB 경로를 통하여 NO를 생산함으로써 체내의 면역계를 활성화하는 것으로 최종 확인되었다.

본 연구는 브로콜리 유래 효소 처리 조다당 BCE-0의 대식세포 활성 및 신호전달 메커니즘을 규명하여 건강기능식품 소재로써 활용할 수 있는 기초 자료를 제공하고자 수행되었다. 생채의 브로콜리에서 추출된 조다당 BCE-0는 열수 추출, 에탄올 침전, pectinase 처리 과정을 통해 얻어졌으며 수율은 3.13%였다. BCE-0의 주요 구성 성분은 중성당(57.7%), 산성당(34.9%), 단백질(4.7%), KDO(2.7%)로 확인되었고, 주요 구성당으로는 산성당(GalA, GlcA), Gal, Rha, Ara 등이 포함되었다. 이러한 구성 성분을 통해 BCE-0가 펙틴 계열의 산성 다당 복합체로 추정되었다. BCE-0는 대식세포주 RAW264.7에서

세포 독성이 없었으며, 농도 의존적으로 세포 증식능을 증가시켰다. 또한 NO, IL-6, TNF-α 등의 면역물질의 분비를 농도 의존적으로 증가시켰으며, 특히 NO와 IL-6의 경우 125 μg/mL부터, TNF-α는 7.8 μg/mL부터 분비가 증가하였다. 이를 통해 BCE-0가 대식세포의 증식과 cytokine 및 chemokine의 분비를 자극하는 시료임이 확인되었다. BCE-0는 MAPK 신호 전달 경로(JNK, ERK, p38)와 NF-κB 경로를 통해 대식세포를 활성화하였다. 각 경로의 인산화는 농도 의존적으로 증가하였으며, p65의 인산화와 IκBα의 감소도 확인되었다. 이를 통해 BCE-0가 대식세포의 신호 전달 경로를 활성화하여 면역 관련 단백질 생산을 유도함을 확인할 수 있었다. 각 신호 전달 경로의 specific inhibitor를 사용하여 BCE-0의 cytokine 생산 경로를 확인한 결과, IL-6는 주로 NF-κB 경로를 통해, NO는 p38, JNK, NF-κB 경로를 통해 생산되는 것으로 나타났다. 또한 specific inhibitor를 처리했을 때 관련 신호 전달 단백질의 인산화가 감소함을 확인하였다. 이를 통해 BCE-0의 면역 반응 유도 메커니즘에는 다양한 신호 전달 경로가 관여함을 확인할 수 있었다. 향후 연구에서는 BCE-0의 다양한 면역 조절 효과를 심도 있게 조사하고 in vivo 실험을 통해 확인함으로써 브로콜리 유래 다당을 이용한 건강 기능성 식품 소재로의 활용을 진행하고자 한다.

이 논문은 2023년도 경기대학교 연구년 수혜로 연구되었음.