비만은 에너지의 섭취와 소비가 불균형하게 이루어져 비정상적이거나 과도하게 지방이 축적된 상태를 의미하며(Trigueros 등, 2013), 제2형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 지방간 등의 질병 원인으로 알려진 바 있다(Cho 등, 2018). 비만은 전 세계적으로 주요 건강 문제로 인식되고 있으며(Ono 등, 2006), 이에 따라 비만 치료에 관한 관심도 증가하고 있다(Roh와 Jung, 2012). 현재 시판되는 비만 치료제는 orlistat, sibutramine 등이 있으며, 중추신경계에 작용하여 장내 지방 흡수를 감소시키거나 식욕을 억제시킨다(Cho 등, 2018; Yun, 2010). 이러한 비만 치료제는 위장 장애, 고혈압, 구토, 변비, 두통 등의 부작용을 유발할 수 있다고 보고된 바 있으며(Fu 등, 2016; Tak과 Lee, 2021), 이를 대체하기 위하여 식물 유래 항비만 약물에 관한 연구가 증가하는 추세이다(de Souza Oliveira 등, 2022; Yun, 2010). 마늘(Allium sativum L.)은 백합과 식물 중 하나로 요리와 의약품으로 이용되어왔다(dos Santos 등, 2022; Min 등, 2020). 마늘은 항산화, 항균, 항종양 등의 활성이 보고된 바 있으며(Bayan 등, 2014; Fufa, 2019), 알리신이라는 성분이 풍부하여 지질 합성에 관여하는 효소 억제, 혈소판 응집 감소 등의 효과가 알려져 있다(Noda 등, 2019). 이러한 마늘을 수확하는 과정에서 껍질이 마늘 생산량의 25% 정도 배출되며, 이는 일반적으로 농업폐기물로 버려진다(Chhouk 등, 2017; Kallel 등, 2014). 그러나 최근 연구에 따르면 마늘 껍질에서 카페인산, ρ-쿠마르산, 페룰산 등의 페놀성 화합물이 검출되어 항산화 및 항균 활성이 나타난다고 보고된 바 있다(Chhouk 등, 2017). 이에 마늘을 재배 및 가공하는 과정에서 얻어지는 농부산물인 마늘 껍질을 활용하여 지속 가능한 원료로 이용하기 위해 다양한 연구가 진행되고 있는 추세이다(Thach, 2022).

일반적으로 열처리는 식품의 저장 수명 연장, 식품의 향미와 질감을 향상시키기 위해 적용한다고 알려져 있다(Hwang 등, 2006; Kim 등, 2008). 페놀성 화합물은 열처리에 영향을 받아 영양소 파괴 및 손실 등의 문제를 야기할 수 있지만, 최근에 생리 활성에 영향을 줄 수 있다는 연구 결과가 보고된 바 있다(Choi 등, 2006; Juániz 등, 2016). 양파, 피망 등의 채소는 열처리 이후에 페놀성 화합물의 농도가 증가하여 항산화 능력이 향상되었다고 보고된 바 있으며(Juániz 등, 2016), huyou 껍질을 열처리하여 메탄올을 이용해 추출하면 유리된 페놀산이 증가하면서 항산화 활성이 증가하였다고 보고된 바 있다(Xu 등, 2007). 또한 Kim 등(2023)의 연구에 따르면 농부산물 중 하나인 양파 껍질을 열처리하여 에탄올 추출하였을 때, 열처리하지 않은 추출물보다 높은 항산화 활성과 항비만 효과를 나타내었다고 보고하였다. 이와 같이 열처리에 따른 생리 활성 증가에 관한 연구는 증가하고 있다. 이에 본 연구에서는 열처리 온도에 따른 마늘 껍질의 항산화 활성을 비교하고, 3T3-L1 지방세포에서의 지방 축적 억제 효과를 확인하여 농부산물인 마늘 껍질의 천연 항산화 및 항비만 기능 소재로서의 가능성을 알아보고자 하였다.

재료 및 추출물의 제조

마늘 껍질 추출물 제조 방법에 관하여 Fig. 1에 그림으로 나타내었다. 마늘 껍질은 전라남도 구례군에서 재배된 것을 구매하였으며, 원물을 분쇄하여 convection oven(Hysc Lab)에서 0°C(0-GSE), 140°C(140-GSE), 170°C(170-GSE), 200°C(200-GSE)로 1시간 동안 열처리하였다. 열처리한 시료와 70% 에탄올(Daejung Chemical Co.)을 1:20(w/v) 비율로 수직 진탕기(Taitec Corporation)를 이용해 상온, 0.00138 g에서 2시간 동안 진탕하였다. 이후 면보를 이용하여 1차 여과한 뒤에 원심분리기(Hanil Science Industrial)로 6,000×g, 10분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. Whatman No. 2 filter paper(Whatman Ltd.)를 활용하여 감압여과 후 50°C에서 감압농축을 진행하였다. 이후 동결건조(Ilshinbiobase Co.)하여 열처리 온도에 따른 마늘 껍질 에탄올 추출물(GSE)을 제조하였다. 항산화 실험에는 증류수를 이용하여 1,000 ppm 농도로 희석하여 사용하였다.

Fig 1. The produce for obtaining heated garlic skin ethanol extract.

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 활성 실험은 Oh 등(2015)의 방법을 참고하여 진행하였다. 메탄올(Daejung Chemical Co.)을 이용해 0.1 mM DPPH(Sigma-Aldrich Co.)를 제조하였다. 0.1 mM DPPH 0.75 mL와 각각의 시료 0.25 mL를 섞어 30분 암실 반응한 뒤, 분광광도계(UV-2101, Shimadzu)를 이용하여 517 nm에서 측정하였다. 결과는 표준물질로 ascorbic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 μg ascorbic acid equivalent(AAE)/g extract로 나타내었다.

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid(ABTS) 양이온 라디칼 소거 활성

ABTS⁺ 라디칼 소거 활성 실험은 Kim 등(2021)의 방법을 참고하여 진행하였다. 증류수를 이용하여 7 mM ABTS(Fluka), 에탄올(Daejung Chemical Co.)을 이용하여 2.45 mM potassium persulfate(Wako)를 제조하여 1:1 비율로 섞어 12시간 동안 암실 반응하였다. 이를 에탄올을 이용하여 734 nm에서 흡광도 값 0.700±0.050으로 희석해 ABTS solution을 제조하였다. 이후 ABTS solution 1.9 mL와 시료 50 μL를 섞어 6분 동안 실온에서 반응시킨 뒤, 분광광도계(UV-2101, Shimadzu)를 이용하여 734 nm에서 측정하였다. 표준물질로 ascorbic acid를 사용하여 μg AAE/g extract로 표현하였다.

Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 측정

FRAP 실험은 Oh 등(2015)의 방법을 참고하여 진행하였다. 300 mM Sodium acetate buffer(Sigma-Aldrich Co.)와 40 mM HCl로 제조한 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine(Sigma-Aldrich Co.), 20 mM FeCl₃을 10:1:1(v/v/v) 비율로 혼합하여 FRAP solution을 제조해 37°C에서 평형시켰다. 이후에 FRAP solution 0.9 mL와 시료 1 mL를 혼합하여 30분 동안 암실 반응하였다. 분광광도계(UV-2101, Shimadzu)를 사용해 593 nm에서 측정하였다. 마찬가지로 ascorbic acid를 표준물질로 사용하여 μg AAE/g extract로 표현하였다.

3T3-L1 세포주 배양 및 분화 과정

실험에 사용된 3T3-L1(murine pre-adipocytes of fibroblast cell line) 세포주는 American Type Culture Collection에서 구매하였다. 3T3-L1 전지방세포를 1% penicillin/streptomycin(P/S, HyClone Laboratories Inc.) 및 10% bovine calf serum(HyClone Laboratories Inc.)이 첨가된 Dulbecco modified Eagle medium/high glucose(DMEM, HyClone Laboratories Inc.) 배지를 이용하여 37°C, 5% CO₂로 설정한 배양기(FormaTM Series II 3110, Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 계대 배양한 이후 6-well plate에 분주하여 배양하였다. 세포를 분화시키기 위해 배지를 10% fetal bovine serum(FBS, HyClone Laboratories Inc.), 1% P/S, 1 μM dexamethasone(Sigma Aldrich Co.), 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(Sigma Aldrich Co.), 5 μg/mL insulin(Welgene Inc.)의 혼합 배지로 교체하였으며 시료는 dimethyl sulfoxide(Sigma Aldrich Co.)를 이용하여 25, 50, 75, 100 μg/mL 농도로 희석하여 2 μL씩 처리하였다. 처리한 후에는 5% CO₂, 37°C 상태의 인큐베이터에서 유지하였다. 분화유도 2일 후에는 10% FBS, 1% P/S, insulin 5 μg/mL로 구성된 DMEM 배지를 이용하여 시료를 3회(2일에 1회) 처리하여 실험하였다.

Oil red O 염색

Oil red O 염색은 Kim 등(2023)의 연구 방법에 따라 세포 내 지질 축적량을 측정하였다. Isopropanol(Sigma Aldrich Co.)을 이용하여 0.5% Oil red O(Sigma Aldrich Co.)를 제조하여 Whatman No.2 filter paper(Whatman)를 이용해 2번 여과해 Oil red O solution을 제조하였다. 지방 분화가 유도된 6-well plate의 media를 제거하여 배양된 세포를 phosphate buffered saline(PBS, SPL life sciences)으로 세척하고, 10% formalin solution(Tech&Innovation)을 30분 동안 처리하였다. 10% Formalin solution을 제거하고 PBS로 세척하였다. 이후 0.5% Oil red O를 처리하여 실온에서 30분 염색을 진행하였다. 염색 후 용액을 제거하고 PBS로 세척하여 건조시켰다. 염색된 세포를 isopropanol을 사용하여 Oil red O를 용출시켰으며, ELISA microplate reader(Bio Teck)를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

Quantitative real-time polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석

RT-PCR 분석은 Kim 등(2021)의 연구 방법을 참고하였다. 분화된 세포를 PBS를 이용하여 세척한 뒤 TRIzol(Invitrogen)을 1 mL 분주하였다. 이를 실온에서 1시간 동안 교반한 후 분화된 지방세포에서 total RNA를 분리하였다. 이를 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Toyobo Co., Ltd.)를 이용해 cDNA로 합성한 뒤, SYBR Green PCR RT Master Mix(Toyobo Co., Ltd.), oligonucleotide primer와 혼합하여 qPCR(Quant studio 3, Applied Biosystems)로 총 40 cycle 반복하여 수행하였다. Oligonucleotide primer의 서열은 Table 1에 나타내었으며, 아래의 식과 같이 상대적 발현 수준을 계산하였다.

Table 1 . Sequences of primers on 3T3-L1 adipocyte.

Target gene	Direction	Sequence (5'→3')
Peroxisome proliferator-activated receptor γ (pparγ)	F1)	CCATTCTGGCCCACCAAC
	R2)	AATGCGAGTGGTCTTCCATCA
CCAAT enhancer-binding protein-α (c/ebp-α)	F	GCGGGCAAAGCCAAGAA
	R	GCGTTCCCGCCGTACC
Sterol-regulatory element-binding protein 1c (srebp-1c)	F	GGTTTTGAACGACATCGAAGA
	R	CGGGAAGTCACTGTCTTGGT
Adipocyte fatty acid-binding protein (ap2)	F	AGCTGGTGGTGGAATGTGTTATGA
	R	ATTTCCATCCAGGCCTCTTCCT
Fatty acid synthase (fas)	F	GCTGCTGTTGGAAGTCAGC
	R	AGTGTTCGTTCCTCGGAGTG
Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1 (scd1)	F	CACCTGCCTCTTCGGGATTT
	R	AGCCGTGCCTTGTAAGTTCT
Acetyl-CoA carboxylase 1 (acc1)	F	GCAGCCCTGGGCACAG
	R	GGGAATACCCGTGGGAGTAGTT
Cluster of differentiation 36 (cd36)	F	GGCCAAGCTATTGCGACAT
	R	CAGATCCGAACACAGCGTAGA
β-actin	F	CTAGGCACCAGGGTGTGATG
	R	GTCCCAGTTGGTAACAATGCC

¹⁾F: forward. ²⁾R: reverse..

ΔCT＝CT (Target)－CT (Control)

Western blot 분석

Western blot은 Lee와 Kim(2022)의 연구를 참고하여 진행하였다. 분화가 완료된 세포에 1× radioimmunoprecipitation assay buffer(RIPA buffer, Biosesang)를 200 μL씩 처리하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 Bicinchoninic acid assay kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 사용해 단백질 농도를 4.25 μg으로 정량하였다. 정량된 단백질을 sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel(SDS-PAGE)을 이용해 전기영동하여 분리하였으며, 이를 0.2 μm의 PVDF membrane(Bio-Rad Laboratories Inc.)으로 transfer 하였다. Tris buffered saline(Tech&Innovation)과 Tween 20(Bio-rad Laboratories Inc.)을 혼합한 TBST를 제조하여 5% skim milk(Bioshop Canada Inc.)를 제작하였다. Membrane을 5% skim milk로 2시간 동안 blocking하고 용액을 제거하였다. 5% Skim milk에 1차 항체인 peroxisome proliferator-activated receptor γ(1:500)(PPARγ, sc-7273, Santa Cruz Biotechnology), CCAAT enhancer binding protein α(1:200)(C/EBP-α, sc-365318, Santa Cruz Biotechnology), adipocyte fatty acid-binding protein 2(1:20,000)(AP2, sc-18661, Santa Cruz Biotechnology), sterol regulatory element binding protein-1c(1:500)(SREBP-1C, sc-13551, Santa Cruz Biotechnology), fatty acid synthase(1:3,000)(FAS, G-11, Santa Cruz Biotechnology), stearoyl-Coenzyme A desaturase 1(1:200)(SCD1, sc-515844, Santa Cruz Biotechnology), β-ACTIN(1:5,000)(sc-47778, Santa Cruz Biotechnology)을 각각 희석하여 15시간 동안 4°C에서 반응시켰다. 5% Skim milk에 secondary antibody(1:5,000)(Invitrogen)를 희석하여 2시간 동안 실온에서 반응시키고 용액을 제거한 뒤 TBST로 5분간 6회 세척하여 TBST를 분주하여 실험 전까지 4°C에서 보관하였다. TBST를 제거한 뒤 ECL western blotting substrate(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 분주하여 X-ray film에 현상하였으며, 단백질 양은 imageJ(LOCI)로 측정하여 β-ACTIN으로 정량하였다.

통계 처리

모든 시료의 분석은 3회 반복하여 결과를 얻었으며 SPSS program, ver 24(SPSS Inc.)를 사용하여 평균±표준편차로 나타내었다. 유의성 검정은 Student’s t-test 및 one-way ANOVA로 분석하여 P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test로 사후 검증하였다.

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물의 항산화 활성 평가

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물의 항산화 활성을 평가한 결과는 Table 2에 나타내었다. DPPH 실험 결과, 마늘 껍질의 열처리 온도가 증가할수록 항산화 활성이 증가하였다. 특히 200-GSE가 140.3 mg AAE/g으로 0-GSE보다 유의적으로 1.6배 높은 항산화 활성이 나타났다(P<0.05). ABTS 실험 결과에서도 열처리 온도가 증가할수록 항산화 활성이 증가하였으며, 그중 200-GSE가 65.9 mg AAE/g으로 0-GSE보다 유의적으로 3.8배 높은 항산화 활성이 나타났다(P<0.05). FRAP 실험 결과도 마찬가지로 열처리 온도가 증가할수록 항산화 활성이 증가하였다. 그중 200-GSE가 119.7 mg AAE/g으로 0-GSE보다 유의적으로 3.5배 높은 항산화 활성이 나타났다(P<0.05).

Table 2 . DPPH, ABTS⁺, and FRAP of heated garlic skin ethanol extracts (mg ascorbic acid equivalent/g extract).

Sampls	DPPH1)	ABTS2)	FRAP3)
0°C	89.5±2.3d	17.2±1.3d	34.3±0.9d
140°C	100.0±0.7c	23.3±1.0c	44.6±0.3c
170°C	111.2±2.3b	34.7±3.9b	65.0±1.3b
200°C	140.3±1.5a	65.9±0.2a	119.7±0.9a

¹⁾DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl..

²⁾ABTS: 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid..

³⁾FRAP: ferric reducing antioxidant power..

Each value is mean±SD (n=3). Different letters are significant P<0.05..

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방세포 내 지방 축적 억제 평가

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방세포 내 지방 축적 억제 효과를 평가한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 3T3-L1 지방세포 내 지방 축적 정도를 육안으로 확인한 결과(Fig. 2A), 열처리 온도가 증가하였을 때, 시료 처리 농도가 증가하였을 때 3T3-L1 지방세포의 지방 축적이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 수치화한 결과(Fig. 2B)를 확인하였을 때, 0-GSE에서 adipocytes(AD)군과 비교하여 25, 75, 100 μg/mL에서 각각 유의적으로 6%, 4%, 13% 감소한 것으로 나타났으며(P<0.05), 140-GSE에서 AD군과 비교하여 25, 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 유의적으로 10%, 16%, 22%, 16% 감소한 것을 관찰할 수 있었다(P<0.05). 170-GSE에서는 AD군과 비교하여 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 유의적으로 8%, 13%, 18% 감소하였으며(P<0.05), 200-GSE에서 AD군과 비교하여 25, 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 유의적으로 7%, 6%, 14%, 14% 감소한 것으로 나타났다(P<0.05). 0-GSE와 비교하였을 때 200-GSE 75 μg/mL와 140-GSE 50, 75 μg/mL 농도에서 지방 축적이 각각 10%, 9%, 9% 감소한 것으로 나타났다.

Fig 2. Effect of heated garlic skin ethanol extract on fat accumulation in 3T3-L1 adipocytes. (A) Morphology of Oil red O stained adipocytes (magnification ×200), (B) optical density values extracted using isopropanol from adipocytes stained with ORO. Pre: pre-adipocytes, AD: adipocytes. Each value is mean ±SEM (n=5). ^**Significant at P<0.01 compared to AD, ^***Significant at P<0.001 compared to AD.

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방세포 내 지방 분화 및 축적 관련 유전자 발현 분석

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방세포 내 지방 분화 및 축적 관련된 유전자 발현을 분석한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. Pparγ 유전자의 발현을 확인하였을 때(Fig. 3A), 0-GSE 25, 75 μg/mL에서 각각 AD군보다 10%, 31% 유의적으로 감소하였으며(P<0.05), 140-GSE 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 29%, 47% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었다(P<0.05). 170-GSE 50, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 15%, 31% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었으며(P<0.05), 200-GSE 25, 50, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 32%, 13%, 12% 유의적으로 억제되었다(P<0.05). C/ebp-α 유전자의 경우(Fig. 3B), 0-GSE 25, 75 μg/mL에서 각각 AD군보다 18%, 29% 유의적으로 유전자 발현이 감소하였으며(P<0.05), 140-GSE 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 30%, 54% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었다(P<0.05). 170-GSE 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 15%, 25% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었으며(P<0.05), 200-GSE 75 μg/mL에서 AD군보다 15% 유의적으로 감소하였다(P<0.05). Srebp-1c 유전자 발현을 확인한 결과(Fig. 3C), 0-GSE 25, 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 28%, 38%, 22% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었으며(P<0.05), 140-GSE 100 μg/mL에서 AD군보다 58% 유의적으로 발현이 감소하였다(P<0.05). 170-GSE 25, 50, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 18%, 26%, 40% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었으며(P<0.05), 200-GSE 25, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 24%, 48% 유의적으로 억제되었다(P<0.05). Ap2 유전자의 발현을 확인한 결과(Fig. 3D), 모든 시료 처리군에서 AD군보다 유의적으로 유전자 발현이 억제되었으며(P<0.05), 그중 140-GSE 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 84%, 84% 유의적으로 유전자 발현이 가장 크게 감소하였다(P<0.05). Fas 유전자 발현을 확인한 결과(Fig. 3E), 0-GSE 25, 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 35%, 7%, 43%, 24% 유의적으로 유전자 발현이 감소하였으며(P<0.05), 140-GSE 25, 50, 75, 100 μg/mL에서 AD군보다 20%, 21%, 30%, 66% 유의적으로 발현이 감소하였다(P<0.05). 170-GSE 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 34%, 13%, 42% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었으며(P<0.05), 200-GSE 25 μg/mL에서 AD군보다 32% 유의적으로 유전자 발현이 감소하였다(P<0.05). Scd1 유전자의 경우(Fig. 3F), 0-GSE 25, 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 40%, 17%, 50%, 54% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었으며(P<0.05), 140-GSE 50, 75, 100 μg/mL에서 AD군보다 28%, 52%, 78% 유의적으로 유전자 발현이 감소하였다(P<0.05). 170-GSE 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 9%, 65% 유의적으로 유전자 발현이 억제되었으며(P<0.05), 200-GSE 25, 100 μg/mL에서 AD군보다 각각 41%, 20% 유의적으로 발현이 억제되었다(P<0.05).

Fig 3. Effect of heated garlic skin ethanol extract on adipogenesis markers mRNA in 3T3-L1 determined by RT-PCR analysis. (A) Peroxisome proliferator-activated receptor γ (pparγ), (B) CCAAT enhancer-binding protein-α (c/ebp-α), (C) Sterol regulatory element-binding protein 1c (srebp-1c), (D) Adipocyte protein 2 (ap2), (E) Fatty acid synthase (fas), (F) Stearoyl-CoA desaturase 1 (scd1). AD: Adipocyte. Each value is mean±SEM (n=3). ^*Significant at P<0.05 compared to AD, ^**Significant at P<0.01 compared to AD, ^***Significant at P<0.001 compared to AD.

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방세포 내 지방 분화 및 축적 관련 단백질 발현 분석

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물 중 지방 분화 및 축적과 연관된 유전자 발현을 분석한 결과로 140-GSE가 가장 우수하게 유전자 발현을 억제하였으므로 0-GSE와 140-GSE의 3T3-L1 지방세포 내 지방 분화 및 축적 관련된 단백질 발현을 분석하여 비교하고자 하였다(Fig. 4). PPARγ의 결과(Fig. 4B), 0-GSE와 140-GSE의 100 μg/mL 농도에서 AD군보다 단백질 발현이 각각 37%, 62% 유의적으로 감소하였다(P<0.05). C/EBP-α의 경우(Fig. 4C), 140-GSE 100 μg/mL 농도에서 AD군보다 단백질 발현이 18% 유의적으로 감소하였다(P<0.05). SREBP-1C의 경우(Fig. 4D)에 0-GSE 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 단백질 발현이 26%, 34% 유의적으로 감소하였으며(P<0.05), 140-GSE 75, 100 μg/mL에서 각각 AD군보다 단백질 발현이 60%, 25% 유의적으로 억제되었다(P<0.05). AP2의 결과(Fig. 4E), AD군보다 0-GSE 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 단백질 발현이 38%, 62%, 91% 유의적으로 억제되었으며(P<0.05), 140-GSE 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 52%, 84%, 87% 단백질 발현이 유의적으로 감소하였다(P<0.05). FAS의 경우(Fig. 4F), AD군과 비교하여 0-GSE 75, 100 μg/mL에서 각각 단백질 발현이 28%, 57% 유의적으로 감소하였으며(P<0.05), 140-GSE 50, 75, 100 μg/mL에서 각각 17%, 41%, 55% 단백질 발현이 유의적으로 억제되었다(P<0.05). SCD1의 경우(Fig. 4G), AD군과 비교하여 0-GSE와 140-GSE 100 μg/mL 농도에서 각각 단백질 발현이 각각 48%, 62% 유의적으로 감소한 것으로 나타났다(P<0.05).

Fig 4. Effect of heated garlic skin ethanol extract on the expression of adipocyte-related proteins. (A) Band of protein expression in 3T3-L1 adipocytes containing with heated garlic skin ethanol extract, (B) peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), (C) CCAAT enhancer-binding protein-α (C/EBP-α), (D) sterol regulatory element-binding protein 1c (SREBP-1C), (E) adipocyte protein 2 (AP2), (F) fatty acid synthase (FAS), and (G) stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1). AD: adipocyte. Each value is mean±SEM (n=3). ^*Significant at P<0.05 compared to AD, ^**Significant at P<0.01 compared to AD, ^***Significant at P<0.001 compared to AD.

본 연구는 열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물이 항산화 활성 및 3T3-L1 지방세포 분화 시 지방 축적에 미치는 효과를 알아보고자 하였다. 열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물에서 열처리 온도가 증가함에 따라 항산화 활성이 증가하는 것으로 나타났다. Maghsoudlou 등(2019)은 180°C로 열처리한 모과 에탄올 추출물과 열처리를 하지 않은 모과 에탄올 추출물을 비교하였을 때, 열처리한 모과 에탄올 추출물이 더 높은 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타났다고 보고하였다. Xu 등(2007)의 연구에서는 huyou 껍질을 90°C, 120°C, 150°C로 열처리하여 80% 메탄올로 추출하였을 때, 열처리

온도가 증가함에 따라 ABTS 양이온 라디칼 소거능과 FRAP 활성의 증가가 관찰되었다고 보고하였다. 식물에서 항산화 활성을 나타내는 폴리페놀 화합물은 주로 불용성 폴리머와 공유 결합한 형태로 존재하는데(Jeong 등, 2004), 식물을 열처리하게 되면 결합형 폴리페놀이 유리형 폴리페놀로 전환되어 항산화 활성이 증가한다(Jang 등, 2012; Kim 등, 2008). 앞서 보고된 연구 결과들은 열처리 온도가 증가함에 따라 항산화 활성이 증가하여 본 연구의 결과와 유사한 경향을 나타내었는데, 이는 유리형 폴리페놀의 증가에 의한 산화 활성 증가에 기인한 것으로 생각된다.

열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물을 3T3-L1 지방세포에 처리하였을 때, 0-GSE 50 μg/mL와 170-GSE 25 μg/mL 농도를 제외하고 모든 군에서 지방 축적 억제가 나타났으며, AD군과 비교하여 140-GSE 75 μg/mL에서 가장 우수하게 지방 축적을 억제하는 것으로 나타났다. Kim 등(2023)의 연구에서는 양파 껍질을 0°C, 140°C, 170°C, 200°C 조건으로 열처리하여 3T3-L1 지방세포에 처리하였을 때 열처리 온도가 증가함에 따라 지방 축적이 감소하였다고 보고하였고, Sung 등(2019)은 감귤 껍질을 150°C로 가열한 후 메탄올 추출하여 3T3-L1 지방세포에 처리하였을 때 열처리하지 않은 감귤 껍질 메탄올 추출물보다 지방 축적을 크게 억제하였으며, 이는 열처리가 세포벽을 파괴함에 따른 폴리페놀 함량의 증가에 의한 것이라고 보고하였다. Yen 등(2011)은 플라보노이드 및 페놀산 등의 폴리페놀 성분이 3T3-L1 지방세포 내 지방 축적에 영향을 주는 염증 유발 인자를 억제한다고 보고하였다. 이에 따라 본 연구에서 마늘 껍질에 열처리한 온도가 증가할수록 지방 축적 억제 효과가 증가한 것은 마늘 껍질을 가열하면서 세포벽이 파괴되어 폴리페놀 함량이 증가해 영향을 준 것으로 생각된다.

AMP-activated protein kinase(AMPK)는 세포 에너지의 항상성을 조절하는 주요 인자로 탄수화물과 지방 대사를 조절한다(Ha 등, 2016). AMPK는 세포 내 AMP/ATP 비율에 따라 Thr172 인산화에 의해 활성화되어 다양한 생합성 경로에서 에너지 소비를 감소시키고 지방 산화를 증가시켜 에너지를 생산하며, PPARγ, C/EBP-α, SREBP-1C와 같은 전사인자를 조절하여 지질 대사에 관여한다(Jo 등, 2015; Kim 등, 2023; Ono와 Fujimori, 2011). PPARγ, C/EBP-α는 지방 생성 초기에 유도되며(Watanabe 등, 2003), 지질 흡수 및 지질 대사 효소를 활성화 시킨다(Park 등, 2011). 또한 SREBP-1C는 PPARγ, C/EBP-α와 함께 활성화되어 콜레스테롤과 지방산 합성에 관여하며(Lee 등, 2010), 나아가 FAS, SCD1 발현에 관여한다(Im 등, 2006). AP2는 염증성 사이토카인을 생산하며(Xu 등, 2006), FAS는 세포질에서 장쇄 지방산을 생성한다(Kuhajda, 2006). SCD1의 경우 지질 축적을 촉진하는데, 포화지방산을 단일불포화지방산으로 전환한다(Ralston과 Mutch, 2015). 지방 분화는 섬유아세포에서 preadipocytes를 거쳐 adipocytes가 형성되는 과정인데, 분화 초기 단계에서 PPARγ, C/EBP-α, SREBP-1C의 발현이 촉진되고 이들은 분화 후기 단계의 AP2, FAS, SCD1의 발현을 유도한다고 알려져 있다(Lee와 Kim, 2022; Margoni 등, 2012). 본 연구에서 열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물 중 140-GSE를 처리하였을 때 지방 축적과 관련된 유전자와 단백질 발현이 크게 억제되었는데, 이는 지방 분화 초기에 관여하는 PPARγ, C/EBP-α, SREBP-1C의 발현이 억제되면서, 이들의 하위조절 인자인 AP2, FAS, SCD1의 발현이 하향 조절되어 3T3-L1 지방세포 내에서 지방 축적을 억제한 것으로 판단된다.

본 연구는 다양한 온도로 열처리한 마늘 껍질을 에탄올 추출하여 항산화 활성 및 3T3-L1 지방세포가 분화하는 과정에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 항산화 활성을 알아보고자 DPPH, ABTS, FRAP를 측정한 결과, 마늘 껍질의 열처리 온도가 증가할수록 항산화 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 3T3-L1 지방세포 내 지방 축적 억제를 확인하고자 Oil red O 실험을 진행한 결과, AD군과 비교하여 지방 축적이 0-GSE, 140-GSE, 170-GSE, 200-GSE의 100 μg/mL 농도에서 각각 13%, 16%, 18%, 14% 유의적으로 억제되었다. 지방 분화 및 축적과 관련된 유전자 발현을 확인한 결과, pparγ, c/ebp-α, srebp-1c, ap2, fas, scd1, acc1, cd36 유전자 발현이 AD군과 비교하여 140-GSE의 100 μg/mL 농도에서 각각 47%, 54%, 58%, 84%, 66%, 78%, 59%, 70% 유의적으로 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 또한 지방 분화 및 축적과 연관된 단백질 발현을 분석한 결과, PPARγ, C/EBP-α, SREBP-1C, AP2, FAS, SCD1에서 AD군과 비교하여 140-GSE의 100 μg/mL 농도에서 각각 62%, 18%, 25%, 87%, 55%, 62% 유의적으로 억제되었다. 본 연구를 통해 140°C에서 열처리한 마늘 껍질 에탄올 추출물이 열처리하지 않은 마늘 껍질 에탄올 추출물보다 항산화 활성과 3T3-L1 지방세포 내 지방 분화 및 축적을 억제함으로써 지속 가능한 천연 항산화 및 항비만 기능성 소재로서의 가능성을 확인할 수 있었다.