비만은 잘못된 식습관, 운동 부족, 유전적 요인 등 다양한 원인에 의한 영양소의 과잉섭취로 인해 체내 과도한 지방이 축적되어 발생한다(Lee 등, 2008). 이러한 과잉 영양소 섭취는 체내에서 지방세포의 분화를 유도하고 크기와 수를 증가시켜 비만을 유도하게 된다. 비만은 크게 지방 전구 세포의 분화(adipogenesis)와 지방합성(lipogenesis) 과정을 통해 분화된 지방세포 내 중성지방이 축적되어 발생한다(Hwang 등, 2022). 지방세포 내로 유입되는 포도당들은 에너지 저장을 위하여 지방세포의 분화를 촉진하게 되며, 지방합성과 관련된 단백질들의 발현을 유도함으로써 에너지대사 경로를 발생시킨다(Tong과 Hotamisligil, 2001). 이러한 에너지대사 경로 및 지방세포 분화 과정에서는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다(de Villiers 등, 2017; Tormos 등, 2011). 과도한 ROS는 체내 항산화 항상성을 붕괴시키며, 2형 당뇨, 심혈관 질환, 인지 저하 등 다양한 대사성 질환을 일으키는 주요한 원인으로 알려져 있다(Furukawa 등, 2004). 뿐만 아니라 지방세포 분화과정 초기에는 ROS가 지방세포 분화와 관련된 인자(CCAAT/enhancer-binding protein(C/EBPs), peroxisome proliferator-activated receptor(PPARγ))의 발현을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 비만 발생의 주요한 원인 중 하나로 보고되었다(Lee 등, 2009). 따라서 지방세포 분화과정 및 지질축적과정에서 발생하는 ROS를 억제하는 물질은 항비만 소재로의 가능성이 있으며, 이에 관한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

미네랄은 체중의 약 4%를 차지하고 있지만, 체내에서 합성되지 않기 때문에 반드시 식품으로 섭취해야 하는 미량영양소이다(Bae와 Cho, 2008; Kwon 등, 2006). 또한 미네랄은 직접적인 에너지 공급원은 아니지만 에너지 생성 과정에서 필수적인 역할을 하며, 뼈와 치아의 구성성분, 체내 효소의 보조인자로써 세포의 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 한다(Bogden, 2000). 체내 미네랄(Ca, P, K, Na, Mg, Fe, Zn, Se, Cu, Mn, I)의 불균형은 세 가지의 주요 에너지 공급원(탄수화물, 지방, 단백질)의 식이 구조에 영향을 주어 비만 발생 위험을 증가시키는 것으로 보고되었다(Wang 등, 2019). 현재까지 미네랄의 중요성과 생리활성이 보고되어 오고 있지만, 미네랄이 지방세포 분화 및 지질축적 관련 기작에 대한 연구는 부족한 실정이다. 구리(Cu), 아연(Zn), 망간(Mn)은 인체의 내인성 항산화 효소 중 가장 강력한 활성을 가지는 것으로 알려진 SOD의 보조인자로써 히스티딘 리간드와 결합을 통해 효소의 활성화에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Csire 등, 2017). Mn-SOD는 미토콘드리아의 내막에 존재하며, Cu-SOD와 Zn-SOD는 미토콘드리아 외부에 존재하여 superoxide를 hydrogen peroxide(H₂O₂)의 형태로 전환한다(Brand, 2016; Koningsberger 등, 1994). 이러한 SOD는 지방세포 분화과정에서 발생하는 특이적인 ROS인 superoxide의 제거에 효과적인 항산화 효소이다. 따라서 본 연구에서는 3T3-L1 지방 전구 세포주를 이용하여 3가지 미네랄(Mn, Zn, Cu)이 내인성 항산화 효소의 발현에 미치는 영향과 ROS 생성억제를 통한 항비만 효능을 평가하고자 하였다.

시약

본 실험에 사용된 MnCO₃, ZnCO₃, CuCO₃, 3-isobutyl-1-methylxan-thine(IBMX), insulin, dexamethasone, 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), Oil Red O staining solution, nitroblue tetrazolium(NBT)은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), bovine calf serum(BCS), fetal bovine serum(FBS), antibiotics/antimycotics, Dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS)은 Welgene Inc.에서 구입하여 사용하였다.

세포 배양 및 분화유도

3T3-L1 지방 전구 세포는 American Type Culture Collection(CL-173)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 10% BCS와 1% antibiotics/antimycotics를 첨가한 DMEM 배지(LM 001-05, Welgene Inc.)를 사용하여 37°C, 5% carbon dioxide(CO₂) 조건에서 배양하였다. 3T3-L1 adipocyte로의 분화는 24-well plate에 5×10⁴ cells/mL의 농도로 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 조건에서 100% confluent 상태가 되도록 배양하였다. Confluent 된 세포는 FBS 배지(10% FBS＋1% antibiotics in DMEM)에 MDI cocktail(0.5 mM IBMX, 10 μg/mL insulin, 1 μM dexamethasone)을 처리하여 3일간 배양하였다. 이후 10 μg/mL 인슐린이 포함된 FBS 배지를 2일에 한 번씩 교체하여 4일간 추가 배양하였다.

MTT assay를 이용한 세포독성 평가

3T3-L1에서의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 96-Well plate에 1.5×10³ cells/mL의 농도로 분주하였다. Confluence가 이루어진 세포에 Mn, Zn, Cu를 농도별(0, 5, 10, 20, 50, 100 μM)로 처리하였다. 48시간 후 MTT stock solution(5 mg/mL)을 첨가하고, 2시간 동안 추가 배양하여 형성된 MTT formazan을 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 20분간 녹인 후 570 nm(measure wave), 660 nm(reference wave)에서 microplate reader(SPECTRA MAX190, Molecular Devices)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

ORO assay를 이용한 지질축적 억제 효능평가

3T3-L1 세포의 지질축적 억제 효과는 Oil-red-O(ORO) 염색법을 이용하여 확인하였다. Adipocyte로 분화된 3T3-L1 세포는 DPBS로 세척하고 3.7% paraformaldehyde로 고정시켰다. 고정된 세포는 DPBS로 세척 후 60% isopropyl alcohol(IPA)로 세척하였다. ORO stock solution:증류수(3:2)로 혼합한 용액을 여과하여 20분간 염색하였다. 용액을 제거한 후 증류수로 3회 세척하였다. 이후 현미경으로 염색된 세포를 촬영하고 100% IPA로 녹여 96-well plate에 490 nm에서 microplate reader(SPECTRA MAX 190, Molecular Devices)로 흡광도를 측정하였다.

NBT assay를 이용한 ROS 억제 효능 평가

지방세포 분화과정에서 발생하는 ROS 생성량은 NBT 시약을 이용하여 측정하였다. NBT 시약은 세포 내 superoxide와 반응하여 formazan을 형성하게 되며, 이러한 원리를 이용하여 세포 내 ROS 함량을 측정할 수 있다. 분화된 3T3-L1 세포는 DPBS로 세척 한 후 0.2% NBT 시약을 처리하여 CO₂ 인큐베이터에서 90분간 반응시켰다. 생성된 dark blue formazan은 DMSO:1 N KOH(7:3) 용액을 이용하여 용출시킨 뒤 microplate reader(SPECTRA MAX190, Molecular Devices)를 사용하여 흡광도(570 nm)를 측정하였다.

qRT-PCR를 이용한 mRNA 발현량 측정

분화된 3T3-L1 세포는 차가운 DPBS로 2회 세척한 후 RNAiso Plus(9109, Takara Bio Inc.)를 사용하여 RNA를 추출하였고, 2 μg의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다(FSQ-301, Toyobo Co.). qRT-PCR(Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR detection System, Bio-Rad Laboratories) 분석은 Faststart universal SYBR Green(ROX)(4913914001, Roche Molecular Biochemicals), primer, cDNA, RNase-free water를 넣어 95°C에서 10분, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 65°C에서 5초로 39 cycle로 시행하였다. 각 유전자의 발현량은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 발현량을 기준으로 상대 정량하였다. 본 실험에 사용된 프라이머는 Table 1과 같다.

Table 1 . Total phenolic acid, total flavonoid, and total polysaccharide contents of Raphanus sativus water extract.

Origin	Gene	Direction	Sequence (5′-3′)
Mouse	Mn-SOD	Forward	GGGTTGGCTTGGTTTCAATAAGGAA
		Reverse	AGGTAGTAAGCGTGCTCCCACACAT
	Cu/Zn-SOD	Forward	CAGCATGGGTTCCACGTCCA
		Reverse	CACATTGGCCACACCGTCC
	GPx	Forward	CTCGGTTTCCCGTGCAATCAG
		Reverse	GTGCAGCCAGTAATCACCAAG
	Catalase	Forward	TCTGCAGATACCTGTGAACTG
		Reverse	TAGTCAGGGTGGACGTCAGTG
	GAPDH	Forward	CAAGGTCATCCATGACAACTTT
		Reverse	GGCCATCCACAGTCTTCTGG

Western blot

지방세포 분화 및 지방 생성 관련 단백질 발현은 western blot 방법을 이용하여 확인하였다. 분화된 3T3-L1 세포는 차가운 DPBS를 세척한 후, phosphate inhibitor와 protease inhibitor를 혼합한 cell lysis buffer(Cell Signaling Technology)를 사용하여 추출하였다. 단백질 정량은 BCA assay(iNtron Biotechnology, Inc.)를 사용하여 정량하였다. 7~20 μg의 단백질을 10% SDS page gel에 전기영동 하였으며, polyvinylidene fluoride membrane을 이용하여 transfer 하였다. 이후 membrane을 blocking 하여 1차 항체를 12시간 이상 4°C에서 반응시킨 후, TBST 용액으로 세척하고 horse radish peroxidase가 결합한 anti-mouse 또는 anti-rabit IgG(Cell Signaling Technology) 2차 항체를 이용하여 상온에서 1시간 이상 반응시켰다. ECL과 반응 후 Chemidoc을 이용하여 밴드를 검출하였다.

통계 처리

모든 실험 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation)로 나타냈다. 통계분석은 GraphPad Prism(ver 8.0, GraphPad Software)을 사용하여 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)으로 실험군 간의 유의성을 확인한 후, Tukey 방법을 이용하여 사후 검증하였다(P<0.05).

세포독성 평가

3T3-L1 지방 전구 세포에서 3종의 미네랄(Mn, Zn, Cu)에 대한 세포독성을 평가한 결과는 Fig. 1A와 같다. 3종의 미네랄 처리는 5, 10, 20, 50, 100 μM 농도에서 모두 세포독성을 나타내지 않았다. 반면, 8일간의 분화과정 동안 3종의 미네랄의 세포독성을 평가한 결과, CuCO₃의 처리는 5 μM 이상의 농도 처리 시 MDI 처리군(100%) 대비 세포 생존율이 약 30% 이하의 강한 세포독성을 나타냄에 따라 실험군에서 제외했다(Fig. 1B). Zn과 Mn은 100 μM 농도에서도 90% 이상의 세포 생존율을 나타냈으며, 이후 실험은 안전하다고 판단되는 50 μM 이하의 농도에서 수행하였다.

Fig 1. Effect of minerals (Mn, Zn, and Cu) on cytotoxicity and lipid accumulation in 3T3-L1 cells. Cell viability of minerals (Mn, Zn, and Cu) in 3T3-L1 preadipocytes (A). Cell viability of minerals (Mn, Zn, and Cu) during 3T3-L1 differentiation (B). Cell image by microscopy (C) and lipid accumulation (D) after Oil-red-O staining in 3T3-L1 adipocytes with or without minerals (Mn and Zn). All data are express as the mean±SD (n=3). Different lower-case letters indicate the statistical differences (P<0.05).

지질축적 억제 효능 평가

ORO 염색법을 통해 지질축적 억제 효능을 평가한 결과는 Fig. 1C, 1D와 같다. MDI로 유도된 지방세포 분화 후 지질축적이 유도되었음을 확인할 수 있었다. Zn은 지질축적 억제 효과가 관찰되지 않았지만, Mn의 처리는 MDI 단독 처리군(100.00%) 대비 50 μM 농도에서 약 45.14%의 지질축적 억제 효과를 나타냈다.

ROS 억제 효능

Mn의 지방세포 분화과정에서 발생하는 ROS 생성 억제 효과를 확인하기 위하여 NBT 염색을 수행하였다. 그 결과, MDI 처리에 의한 분화과정에서 세포 내 ROS가 생성되었으며, Mn 처리 시 MDI 처리군(100%) 대비 20 μM 농도에서 약 10.79%, 50 μM 농도 처리 시 약 29.95%의 ROS 생성 억제 효과가 확인되었다(Fig. 2). 이는 3T3-L1 내의 지방 축적감소와 유사한 경향을 나타내어 지방세포 내 축적된 지질이 산화적 스트레스의 증가와 관련이 있음을 나타내고, Mn의 지질축적 억제 효과는 ROS의 생성과 관련 있음을 추측할 수 있는 결과로 사료된다.

Fig 2. Inhibitory effect of Mn on ROS production in 3T3-L1 adipocytes. Cell images (A) and quantificated results (B) by NBT assay in 3T3-L1 adipocytes with or without Mn. All data are express as the mean±SD (n=3). Different lower-case letters indicate the statistical differences (P<0.05).

내인성 항산화 효소 주요 유전자 발현

ROS를 소거하는 주요 항산화 효소(Mn-SOD, Cu/Zn-SOD, GPx, catalase)의 mRNA 발현량은 qRT-PCR을 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 Fig. 3과 같다. 지방세포 분화과정에서 내인성 항산화 효소들의 mRNA 발현은 감소하는 것으로 나타났다. 반면, Mn의 처리는 지방세포 분화과정에서 감소하는 Mn-SOD 및 GPx mRNA 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다.

Fig 3. Effect of Mn on mRNA expression level of internal antioxidant enzymes (Mn-SOD, Cu/Zn-SOD, GPx, and catalase) in 3T3-L1 adipocytes. All data are express as the mean±SD (n=3). Differ-ent lower-case letters indicate the statistical differences (P<0.05).

Mn-SOD 및 관련 기전 단백질 발현

Mn-SOD, GPx의 상위 조절 단백질인 nuclear factor erythroid 2-related factor(Nrf2)의 발현 및 Mn-SOD의 단백질 발현 및 활성을 평가하였으며, 그 결과는 Fig. 4와 같다. MDI 처리로 인한 지방세포의 분화 및 지질축적과정에서 Nrf2의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었으며, 이는 하위 기전인 Mn-SOD 발현을 감소시키고 ROS 생성을 유도하는 기전을 확인할 수 있었다. 이러한 기전에서 Mn의 처리는 Nrf2의 발현을 증가시키고 내인성 항산화 효소의 Mn-SOD의 발현과 활성을 증가시킴으로써 지방세포 분화과정에서 효과적으로 ROS의 생성을 억제하는 것으로 판단된다.

Fig 4. Effect of Mn on Nrf2 signaling-related Mn-SOD protein expression during 3T3-L1 differentiation. Band images (A) and quantificated results (B) by western blot assay, and Mn-SOD activity (C) in 3T3-L1 adipocytes with or without Mn. All data are express as the mean±SD (n=3). Different lower-case letters indicate the statistical differences (P<0.05).

지방세포 분화 및 지질축적 관련 단백질 발현

지질축적 억제 효과를 나타낸 Mn의 지방세포 분화(PPARγ) 및 지질축적과 관련 단백질(fatty acid synthase, FASN) 발현량은 western blot 방법을 이용하여 측정하였고, 결과는 Fig. 5와 같다. 3T3-L1 지방세포 분화과정에서 분화 관련 단백질인 PPARγ는 발현량이 증가하였으며, 지질 합성에 중요한 단백질인 FASN도 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다. 분화과정에서 증가한 PPARγ와 FASN은 Mn 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, Mn은 지방세포분화 및 지질축적과 관련된 단백질 발현을 조절함으로써 효과적으로 지질축적을 억제하며, 항비만 기능성 소재로 가능성을 시사한다.

Fig 5. Effect of Mn on adipogenesis and lipogenesis-realted protein expression in 3T3-L1 adipocytes. Band images (A), and quantificated results (B) by western blot assay in 3T3-L1 adipocytes with or without Mn. All data are express as the mean±SD (n=3). Different lower-case letters indicate the statistical differences (P<0.05).

미네랄은 인체 내 보조효소 등으로 작용하는 생리작용에 매우 중요한 영양 요소로서 Na와 K는 체액균형 조절, Mg는 에너지대사, Ca는 체내 골격 유지, Fe는 헴단백질과 결합하여 혈액의 산소 전달, Mn과 Zn은 체내 다양한 효소의 보조인자, Cr은 체내 포도당 항상성 유지에 작용하는 등 미네랄은 생체 내 생화학 반응에 매우 중요한 요소이다(Seo 등, 2019). 미네랄과 비만 간의 상관관계를 분석한 논문에 따르면, 미네랄의 불균형은 비만 발생의 위험을 초래한다고 보고하였다. 칼슘과 마그네슘과 같은 미네랄이 풍부한 용암 해수가 3T3-L1 세포 및 고지방식이로 유도된 마우스에서 항비만 효과에 도움을 줄 수 있다고 보고되기도 하였다(Wang 등, 2019). 하지만 미네랄이 지방세포의 분화과정에 미치는 영향에 관한 직접적인 연구는 매우 부족한 실정이다. 본 연구 결과에서 SOD 보조인자인 3가지 미네랄의 지질축적 억제 효과를 확인한 결과 Mn이 가장 우수한 억제 효과를 나타냈다(Fig. 1). 반면 Cu는 지방분화과정에서 독성을 나타내었지만, 이는 구리 공급원을 CuCO₃에 한정하여 실험하였다는 측면에서 해석의 차이가 있을 수 있다. 따라서 copper(Ⅱ) gluconate, copper(Ⅱ) sulfate 및 copper(Ⅱ) chloride와 같은 다양한 구리 공급원 측면에서의 연구는 필요하다고 사료된다.

Mn은 혈당조절, 뼈 형성, 지질, 단백질, 탄수화물 대사, 항산화 및 면역 반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 세포의 기능과 조절을 유지하기 위해서 필수적인 미네랄이다. 건강한 한국인 258명을 대상으로 24시간 회상법을 통하여 미네랄 섭취량을 추정하고, 7가지 미네랄(Ca, P, Mg, Fe, Zn, Cu, Mn)을 대상으로 혈청 지질과의 상관성을 분석한 연구 결과에서 Mg, Cu, Mn의 섭취가 한국 성인의 지질 조절에 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 보고되었다(Kim과 Choi, 2013). 그중 Mn의 섭취량은 혈중 내 총콜레스테롤 및 중성지방과 음의 상관관계를 나타냈다. 이는 회상법을 통하여 Mn 섭취량을 추정한 결과치로 직접적인 연구 결과는 아니지만, 본 연구에서 Mn의 처리가 지질축적 억제 효과를 나타낸 결과는 이를 뒷받침해 주는 연구 결과로 사료된다.

Superoxide, H₂O₂ 등 다양한 ROS는 세포 대사 과정 중에 대한 다양한 경로에 의하여 발생한다. 세포 내로 유입된 포도당들을 저장하기 위하여 에너지대사 경로를 거치게 되며, 이러한 과정에서도 ROS가 발생한다(Li 등, 2023). 특히, 지방세포의 분화 초기 단계에서는 미토콘드리아 대사가 활성화되는 특징을 나타내는데, 이때 발생하는 superoxide가 지방세포의 분화를 시작하는 데 필수적이라는 연구 결과가 보고되었다. 미토콘드리아 내에서 산소 분자의 일부가 산화적 인산화 과정을 통해 adenosine triphosphate를 생산하는 과정에서 electron transport chain의 미토콘드리아 복합체 Ⅲ에서 superoxide가 생성되고, superoxide는 지방세포 분화과정을 촉발하는 것으로 알려져 있다(Tormos 등, 2011). 즉, 지방세포 분화과정 초기에 발생하는 ROS의 생성 조절은 지방세포의 분화 및 지질축적을 예방할 수 있는 주요한 기전으로 작용할 수 있다. 발생된 superoxide는 SOD에 의해 H₂O₂로 전환되며, H₂O₂는 glutathione peroxidase(GPx)와 catalase에 의해 물로 전환되는 일련의 항산화 기전을 가진다. 본 연구에서 항산화 효소의 mRNA 발현을 측정한 결과, Mn은 Mn-SOD 및 GPx 유전자 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(Fig. 3). Mn은 Mn-SOD 발현을 통하여 일차적으로 superoxide를 H₂O₂로 전환시킬 뿐만 아니라, GPx를 통해 H₂O₂를 물로 전환함으로써 지방세포 분화과정에서 발생하는 ROS를 중화시키는 점에 있어 매우 효과적인 소재라고 판단된다.

Nrf2/Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)은 세포 내 ROS 조절하는 대표적인 기전으로 알려져 있다(Taguchi 등, 2011). Nrf2는 Keap1과 결합하여 비활성화 상태로 존재하지만, ROS의 자극에 의하여 Keap1로부터 분리되어 활성화되면 체내 항산화 효소의 발현을 촉진한다(Kusunoki 등, 2013). 3T3-L1 지방세포 분화과정에서 Nrf2의 발현을 활성화하는 phytochomical의 처리가 지방분화 및 지방축적에도 효과적이라는 연구 결과들이 보고되고 있다. ω-3 불포화 지방산은 Nrf2에 의한 heme oxygenase-1(HO-1)의 발현을 조절하여 3T3-L1 지방세포로의 분화를 효과적으로 억제한다고 보고하였다(Kusunoki 등, 2013). 검정무 추출물은 3T3-L1 지방세포 분화과정에서 Nrf2/HO-1 pathway 활성화를 통한 산화적 스트레스의 감소가 지방세포 분화 관련 단백질(C/EBPα/δ, PPARγ)의 발현을 감소시키는 데 도움을 주는 것으로 보고하였다(Yang 등, 2019). 특히 강력한 항산화제로 알려진 phenolic compound(quinic acid, glucosyl gallate, gallic acid, methylgallate, mangiferin)를 포함하는 망고 껍질과 씨앗 추출물은 3T3-L1 지방세포 분화과정에서 Nrf2의 발현을 증가시키고 Mn-SOD와 HO-1의 발현을 유도하여 ROS의 생성을 효과적으로 억제한다고 보고하였으며, 이러한 체내 항산화 효소의 증가는 지방분화 대표 인자들의 발현 및 지질축적을 억제함으로써 항비만 소재로의 가능성을 증명하였다(Pratelli 등, 2023). 본 연구 결과에서 Mn은 Nrf2 발현을 증가시킴으로써 항산화 효소의 발현 및 활성화를 유도하고 지방세포 분화과정에서 생산된 ROS 완화하는 데 영향을 미치며, 더 나아가 지방세포 분화와 지질축적억제와 관련된 인자들의 발현에도 영향을 주었을 것으로 사료된다.

3T3-L1 세포의 초기 분화 발생과정에서 전사인자인 sterol regulatory element-binding protein-1c, PPARγ 및 C/EBPs의 발현이 증가한다. 지방세포 분화과정에서 C/EBPs와 PPARγ는 분화과정을 유도하는 핵심적인 조절자이며, 지방산 합성 및 수송을 촉진하여 지방의 축적을 유도하게 된다. 이후 전사인자의 활성화는 지방산 합성 효소(FASN) 및 fatty acid-binding protein 4(FABP4)와 같은 인자들의 발현을 증가시켜 지질축적이 유도된다(Rosen과 MacDougald, 2006). 특히 PPARγ는 지방세포의 분화, 지질대사의 조절, 인슐린 민감성과 같은 지방 대사에서 중요한 역할을 하는 전사인자이며, 지방세포 분화과정에서의 ROS에 의하여 클론 확장 유사분열(mitotic clonal expansion) 단계에서 발현이 촉진된다. 항산화제는 이러한 mitotic clonal expansion 단계를 억제함으로써 PPARγ의 초기 발현을 억제하는 것으로 보고되었다(Chang과 Kim 등, 2019; Lee 등, 2009). 최근 많은 연구는 항산화제가 이러한 ROS 억제를 통해 지질축적 억제 효능을 나타낸다고 보고하였다(Lee 등, 2009). 미네랄 중 하나인 selenium의 보충은 GPx의 발현을 통하여 ROS 수준을 감소시키고, 이는 지방세포 분화 및 지질축적과 관련된 인자(Selenbp1, PPARγ, Cebpα, FABP4)를 효과적으로 감소하는 데 도움을 주는 것으로 보고되었다(Tinkov 등, 2020). 녹차의 대표적인 항산화 물질이면서 대표적인 항비만 억제제로 알려진 epigallocatechin-3-gallate는 SOD, CAT, GPx 및 GR의 활성을 유도하고, 분화과정 동안 ROS 제거를 통하여 C/EBPα, aP2의 발현억제를 통해 항비만 효과를 나타낸다고 보고하였다(Kim, 2017). 특히, 강력한 항산화제 중 하나인 N-acetylcysteine은 지방세포 분화과정에서 항산화 효소들의 발현을 촉진함으로써 지방세포 분화를 억제하는 것으로 보고되었다(Calzadilla 등, 2011). 이러한 연구를 종합하여 볼 때 Mn은 3T3-L1 세포 분화과정에서 Mn-SOD 및 GPx와 같은 항산화 효소의 발현을 통해 ROS 생성을 억제함으로써 지방세포 분화과정에서 PPARγ 발현을 조절하는 데 영향을 주었을 것으로 사료된다.

요약하면, Mn은 지방세포의 분화와 지질 생성을 효과적으로 억제하며, 이는 Nrf2의 발현 증가를 통해 항산화 효소인 Mn-SOD 발현 및 활성화를 유도함으로써 지방세포 분화과정에서 발생하는 ROS 생성을 억제하는 기전에 의한 것으로 추측된다. 또한, Mn은 지방세포 분화과정에서 항산화제로 작용하여 비만으로 유도될 수 있는 다양한 만성질환 예방에도 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다. 향후 이러한 항산화 효소의 발현 및 효소활성과 관련된 기전적인 측면에서 복합적인 연구의 필요성은 있지만, 본 연구 결과는 지방세포의 분화과정에서 SOD 보조인자로써 미량영양소인 Mn이 효과적인 소재임을 확인하였으며, 추후 연구에 있어 과학적 기초자료로써 활용하는 데 유용할 것으로 사료된다.

본 연구에서는 SOD의 보조인자인 3종의 미네랄 Mn, Zn, Cu의 비만억제 효능 및 ROS 관련 기전을 확인함으로써 식이 영양인자인 미네랄의 지방세포 분화과정 억제에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 3T3-L1 분화과정에서 Mn은 가장 우수한 지질축적 억제 효과를 나타내었으며, 세포 내 ROS 생성 억제 효과를 나타냈다. Mn은 지방세포 분화과정에서 Nfr2의 발현을 통하여 Mn-SOD와 같은 내인성 항산화효소의 발현과 활성화를 유도함으로써 세포 내 ROS를 효과적으로 제거하는 것으로 확인되었다. 초기 지방세포 분화에서 ROS 억제는 PPARγ 발현에 영향을 미치며, Mn이 이러한 인자들의 발현 조절에 효과적인 것으로 나타났다. 향후 추가적인 동물세포 및 조직 내 추가적인 여러 기전의 연구가 요구되지만, 본 연구의 결과는 미량 영양소인 Mn이 비만 예방 효능 및 다양한 비만 유도성 대사질환에 대한 효과적인 소재로의 가능성을 보여 주는 결과로 판단된다.

본 연구는 한국식품연구원 사업연구비(과제번호: E0210601-04)의 지원을 받아 수행한 연구 결과로 이에 감사드립니다.