인구 증가와 고령화로 인하여 심혈관계 질환의 환자 수는 지속적으로 증가하는 추세이며, 심혈관계 질환은 주요 사망원인 중 하나로 지목되었다(Li 등, 2021). 이와 같은 심혈관계 질환의 핵심 원인 중 하나인 활성산소는 체내에서 필수적이지만 과도하게 생성 및 축적되면 산화스트레스로 인해 세포가 사멸하여 질병 발병의 원인이 된다고 알려져 있다(Dubois-Deruy 등, 2020). 산화스트레스는 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)에 의해 유발되며, 이는 superoxide radical(O₂^-), hydrogen peroxide(H₂O₂), hydroxyl radical(OH•)과 같은 불안정한 산소를 포함하는 화학물질들을 말한다(Zorov 등, 2014). ROS는 세포의 성장과 증식에 필수적인 역할을 하지만, 과도한 ROS 생성은 미토콘드리아 기능의 손상을 일으키며, 세포는 산화스트레스 상황에서 자체적인 DNA 복구 시스템을 통해 보호되는데 이는 항산화 효소의 생성과 같은 방식으로 이루어진다. 항산화 체계와 ROS 생성의 불균형은 DNA 손상, 세포 내 지질의 산화 및 거대 분자의 손상과 같은 결과를 초래하여 세포의 자가 프로그램된 죽음인 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 있다(Kannan과 Jain, 2000). Apoptosis는 심혈관 질환과 밀접한 관계가 있는데, 심근의 재생 능력을 약화시켜 심근경색을 유발하고 심근세포의 손실을 초래하여 심장 수축 기능을 유지하는 능력이 감소하여 남아있는 세포들에 부담이 전가되어 심장 비대에 이르게 된다. 또한 당뇨병 환자들이 심혈관 질환의 발병률이 높은 이유로 비정상적인 세포 대사와 세포 소기관의 결함으로 인한 apoptosis가 원인 중 하나로 알려져 있다(Lee와 Gustafsson, 2009). 이러한 산화스트레스로부터 질병을 예방하기 위하여 합성 항산화제를 대신하여 천연 항산화제를 개발하려는 연구들이 지속되고 있으며(Akbari 등, 2022), embryonic rat 심장 조직에서 유래된 심장근육 세포주로 심근세포의 특성을 표현하고 심근세포와 유사한 성질을 지닌 H9C2 세포를 활용하여 in vitro 수준의 심장질환 연구 모델로 활용한다(Watkins 등, 2011).

인구 증가로 인하여 육류 소비량이 증가하였으며, 소비량에 맞추어 가축의 사육량이 증가하는 추세이다. 가축 사육 시 발생하는 이산화탄소는 환경오염의 주범으로, 이를 해결하고자 대체 단백질 중 하나인 식용 곤충에 관해 관심이 커지고 있다(Lange와 Nakamura, 2021). 식용 곤충은 오랜 시간 다양한 국가에서 식용, 약용으로 활용해 온 것으로 알려져 있다(Feng 등, 2018). 대한민국의 경우 농촌진흥청과 식품의약품안전처에서 식용으로 허가한 곤충은 10종으로, 식용 곤충은 고단백질원으로 다양한 아미노산을 포함한다고 알려져 있다(Rumpold와 Schlüter, 2013). 이 중 흰점박이꽃무지 유충 열수 추출물은 아데닌, 히폭산틴, 우리딘, 아데노신, 이노신, 벤조산 등을 함유하며 항산화 활성을 갖는다고 알려져 있다(Lee 등, 2021). 이와 같이 다양한 성분을 포함하는 흰점박이꽃무지 유충을 활용하여 항비만, 간세포 보호, 항골다공증 등 다양한 연구가 진행되고 있다(Ahn 등, 2019; Choi 등, 2023; Park과 Lee, 2023). 하지만 현재 흰점박이꽃무지 유충의 H₂O₂로 유도된 산화스트레스로부터 항산화능에 의한 심근세포 보호 효과에 관한 연구는 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서 ascorbic acid를 함유한 증류수로 추출한 흰점박이꽃무지 유충이 항산화능을 통해 H₂O₂로 유도된 산화 스트레스로부터 심근세포를 보호하여 기능성 소재로 이용될 수 있는지 평가하고자 한다.

PBLE 추출

실험에 사용된 흰점박이꽃무지 유충은 (주)퓨처푸드랩에서 구매하였다. 흰점박이꽃무지 유충을 동결건조 방식으로 분말화하였으며, 분말 10 g과 ascorbic acid를 첨가한 100 mL의 증류수(0.16% ascorbic acid)를 혼합하여 5°C에서 24시간 동안 교반하여 추출하였다. 추출물을 30분간 원심분리(1,977×g, 5°C) 한 후 거름종이(No. 4, Whatman)로 여과하여 동결 건조하였다. Protaetia brevitarsis larvae extract(PBLE)는 phosphate buffered saline(PBS)에 희석하여 실험에 사용하였다.

H9C2 세포 배양

본 실험에 사용된 H9C2 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Welgene)에 10% fetal bovine serum과 1% antibiotics(100 unit/mL penicillin, 100 unit/mL streptomycin)를 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터(Thermo Fisher)에서 배양하였다.

H9C2 세포 생존율 평가

96-Well plate에 H9C2 세포를 1×10⁴ cells/well을 분주하여 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 24시간 동안 부착하였다. 세포가 부착된 후 PBLE(50, 100, 200 μg/mL)와 H₂O₂(50, 100, 200, 300, 1,000 μM)를 처리하였다. 그 후 media를 제거한 다음 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich)를 0.5 mg/mL로 DMEM으로 희석한 용액을 well당 100 μL씩 첨가하고, formazan crystal이 생성되면 MTT 시약을 제거한 다음 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich)로 녹여 흡광도(570 nm)를 측정하였다.

DPPH assay를 이용한 라디칼 소거능 평가

흰점박이꽃무지 유충 추출물(PBLE)의 DPPH(Sigma-Aldrich) 라디칼 소거능을 측정하여 항산화 활성을 측정하였다. 96-Well plate에 PBLE(62.5, 125, 250, 500 μg/mL)를 100 μL씩 분주한 후 DPPH 용액을 메탄올에 희석해 300 μM의 농도로 100 μL씩 분주하였다. 20분간 암실에서 시료를 반응시킨 후 microplate reader에서 517 nm로 흡광도 값을 측정하였다.

A_sample은 sample과 DPPH 시약의 반응 후 흡광도를 의미하고, A_blank1과 A_blind는 각각 sample과 DPPH 용액의 흡광도 값이며, A_blank2는 용매를 나타낸다. 대조군으로 1,000 μM 농도의 ascorbic acid(AsA)를 이용하였다.

ABTS assay를 이용한 라디칼 소거능 평가

PBLE의 항산화 활성을 ABTS(Sigma-Aldrich) 라디칼 소거능을 활용하여 확인하였다. 7 mM ABTS와 140 mM potassium persulfate(Sigma-Aldrich)를 5 mL:88 μL로 섞어 암실에서 16시간 반응하여 라디칼을 형성하였으며, 760 nm에서 흡광도 값이 0.6~0.8이 되도록 증류수에 희석했다. 농도별 PBLE(62.5, 125, 250, 500 μg/mL) 100 μL에 희석된 ABTS 용액을 100 μL씩 첨가하여 30분 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 760 nm에서 흡광도 값을 측정하였다.

A_sample은 sample과 ABTS 시약과 반응하여 나타낸 흡광도를 의미하고, A_blind는 ABTS 시약의 흡광도 값이며 대조군으로 AsA(1,000 μM)를 이용하였다.

Western blot

6-Well plate에 H9C2 세포를 분주하여 37°C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 부착시키고 PBLE(100, 200 μg/mL) 처리 후 H₂O₂(300 μM)를 처리하였다. 37°C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양한 후 세포를 PBS로 2회 세척하고, NP40 cell lysis buffer(Biosource)와 RIPA buffer를 20분간 반응시켰다. 반응 이후 원심분리(16,000×g, 30분) 하여 cell lysate를 분리하고 BCA protein detection kit을 이용하여 정량하였다. 동량의 단백질을 10% polyacrylamide gel에 loading 하여 전기영동 하였다. Gel을 다시 polyvinylidene difluoride membrane(Milipore)으로 50분간 전이시키고 비특이적 단백질이 붙지 않도록 10 mL의 blocking solution(5% skim milk)을 처리하였다. TBST(20 nM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5)로 세척한 뒤 분석할 1차 antibody를 처리하여 4°C 냉장고에서 overnight 후 TBST로 5분간 3회 세척하였다. 그 후 1:3,000 농도로 제작한 2차 antibody(goat-anti rabbit IgG, Calbiochem)를 1시간 반응하였으며, chemiluminescence detection solution(EZ-western Lumi Femto, DoGenBio)을 이용하여 단백질 발현량을 비교하였다.

통계 처리

3회 이상 측정값을 GraphPad Prism version 8.0(Graph Pad Prism Software)을 이용하여 one-way ANOVA test로 분석하였다. 이후 Tukey’s multiple comparisons test를 실시하여 P<0.05 수준에서 시료 간 유의성을 검정하였다.

PBLE의 전자공여능 및 항산화 측정

PBLE의 항산화 활성을 DPPH assay와 ABTS 라디칼 소거능을 통해 확인하였다. 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 알려진 AsA(1 mM)를 대조군으로 사용하였다(Njus 등, 2020). 자유라디칼은 일반적으로 불안정하고 반응성이 높으며, DNA, 단백질, 지질 등에 손상을 입힌다고 알려져 있다(Dizdaroglu와 Jaruga, 2012). 항산화 물질은 자유라디칼을 안정화시켜 독성을 줄여주는 물질로, 라디칼 제거 정도를 수치화하여 항산화능을 평가할 수 있다(Gulcin, 2020). DPPH assay는 자유라디칼을 포함하는 DPPH가 항산화 물질에 의해 활성산소가 제거되어 색이 변하는 원리를 이용하는 것으로 활성산소가 제거되는 정도를 색도 농도로 측정하는 시험법이다(Kedare와 Singh, 2011). 이에 따라 PBLE의 라디칼 소거능을 DPPH assay를 이용하여 측정한 결과, Fig. 1A와 같이 PBLE의 농도가 62.5, 125, 250, 500 μg/mL로 농도 의존적으로 증가할수록 PBLE의 라디칼 소거 활성이 1.98%, 6.69%, 15.59%, 38.96%로 증가하였다.

Fig 1. DPPH radical (A) and ABTS radical scavenging activities (B) from Protaetia brevitarsis seulensis larvae water extracts (PBLE). Different letters above bars indicate significantly differences (P<0.05), using Tukey's test.

ABTS는 과황산포타슘과 ABTS 시료가 결합하여 청록색을 띠는 ABTS 양이온 라디칼이 생성되며, 생성된 라디칼이 항산화 물질과 반응하면 하늘색으로 변하게 된다(Miller와 Rice-Evans, 1997). 따라서 PBLE의 ABTS 라디칼 소거능에 대해 측정해 본 결과, PBLE 처리군(62.5, 125, 250, 500 μg/mL)은 각각 3.69%, 10.38%, 25.76%, 53.35%로 나타났으며(Fig. 1B), PBLE의 증가에 따라 ABTS 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인하였다. DPPH assay와 ABTS 라디칼 소거능 확인을 통하여 PBLE의 농도가 증가함에 따라 항산화능이 증가하였음을 확인하였다. 이는 AsA를 함유한 증류수에서 시료를 추출함으로써 PBLE의 이노신과 벤조산과 같은 유효성분들의 파괴가 줄어들고 수율이 향상되었을 것이라 예상된다(Amarender 등, 2020; Chandra-Hioe 등, 2019). 이와 같은 활성을 가지는 PBLE의 항산화능을 통하여 H₂O₂로 유도된 산화스트레스로부터 세포 사멸 방지 효과를 가질 가능성이 있다고 사료된다.

PBLE의 H₂O₂로 유도된 H9C2 세포 사멸 보호

H9C2 세포는 산화스트레스로 인해 세포 사멸이 유도될 수 있으며, 항산화능을 통해 세포 사멸을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Shen 등, 2022). 이에 따라 항산화능을 갖는 PBLE가 MTT assay를 통해 H9C2 세포의 사멸을 방지하는지 확인하였다. 먼저 PBLE가 H9C2 세포에서 독성을 나타내는지 확인하기 위해 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 확인하였다(Kamiloglu 등, 2020). PBLE(50, 100, 200 μg/mL)를 H9C2 세포에 분주하였을 때 세포 사멸이 일어나지 않았다(Fig. 2A).

Fig 2. Protaetia brevitarsis seulensis larvae water extracts (PBLE) rescued H₂O₂-induced loss of cell viability. Cells were treated with various concentrations of H₂O₂ for 12 h (A). H9C2 cells were preincubated with different concentrations of PBLE (50 to 1,000 μg/mL) for 12 h (B) and then treated with 300 μM H₂O₂ for 12 h (C). MTT assay was taken to measure cell viability. Different letters above bars indicate significantly differences (P<0.05), using Tukey’s test.

세포에 H₂O₂로 유도된 산화스트레스 수준을 고정하기 위해 H₂O₂(50, 100, 200, 300, 400, 500, 1,000 μM)를 H9C2 세포에 처리하였다. 실험 결과, H₂O₂의 농도가 높아짐에 따라 세포 사멸이 증가하는 것을 확인하였으며, 80% 생존율을 나타낸 H₂O₂ 300 μM 농도로 고정하여 추후 실험을 진행하였다(Fig. 2B).

독성을 나타내지 않은 PBLE(50, 100, 200 μg/mL)가 H₂O₂로부터 유도된 산화 스트레스로부터 세포 사멸을 방지하는지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 그 결과, PBLE 전처리군이 H₂O₂ 단독 처리군과 비교하여 H9C2 세포 보호 수준이 증가한 것을 확인하였다(Fig. 2C). 이는 PBLE가 H₂O₂로 유도된 산화 스트레스로부터 H9C2 세포의 apoptosis를 방지하는 것으로 판단된다. 특히 100, 200 μg/mL 농도의 PBLE를 전처리하였을 때 세포 사멸이 두드러지게 방지되는 것을 확인하였다. 따라서 이후 실험에서 PBLE의 농도를 100, 200 μg/mL로 진행하였다.

PBLE의 세포 사멸 신호 발현에 미치는 영향

세포 사멸 프로그램인 apoptosis는 내부인자에 의해 발생하는 intrinsic pathway와 외부인자에 의해 발생하는 extrinsic pathway로 나뉘며, 세포가 과도한 스트레스로 인하여 손상되면 apoptosis가 일어난다(Riedl과 Shi, 2004). Intrinsic pathway는 다음과 같이 진행된다. Bcl-2는 cytochrome c의 방출을 억제하여 세포 사멸을 방지하고 Bax는 Bcl-2 family 단백질 중 하나로 cytochrome c의 방출을 촉진하여 세포 사멸을 촉진하는데, 스트레스로 인해 Bax의 발현이 높아져 균형이 깨지면 미토콘드리아에서 cytochrome c가 세포질로 방출되고 Apaf-1과 복합체를 형성하여 caspase 9의 활성화 형태인 cleaved caspase 9를 생성하며, 이는 caspase 3을 활성화시켜 최종적으로 세포 사멸을 일으킨다(Bagci 등, 2006; Kuida, 2000). Extrinsic pathway는 세포 표면에서 death ligands가 각각의 death receptors와 결합하여 시작된다. 이 결합은 caspase 8을 축적 및 활성화로 이어지게 되며, 활성화된 caspase 8은 caspase 3을 활성화하여 세포 사멸을 일으킨다(van Raam과 Salvesen, 2012). 따라서 본 실험에서는 PBLE가 apoptosis의 intrinsic pathway와 extrinsic pathway를 효과적으로 억제하는지 확인하기 위하여 western blot assay를 활용하여 단백질량을 확인하였다(Taylor와 Posch, 2014). 본 연구 결과에 따르면 PBLE(100, 200 μg/mL) 전처리군에서 H₂O₂(300 μM) 단독 처리군과 비교하였을 때 Bax의 발현을 감소 억제하고 Bcl-2의 발현을 촉진시켜 세포 사멸을 방지하여 CON 수준으로 억제한 것을 확인하였다(Fig. 3). 또한 initiator인 caspase 8, 9와 effector인 caspase 3의 활성화 형태인 cleaved caspase의 발현과 Bax/Bcl-2 균형이 깨짐으로써 방출되는 cytochrome c의 발현이 PBLE 전처리군에서 H₂O₂ 단독 처리군 대비 감소시켜 CON 수준으로 억제한 것을 확인하였다. 따라서 PBLE가 intrinsic pathway에서 Bcl-2/Bax 균형이 깨지는 것을 방지하여 cytochrome c의 방출이 억제되었으며 caspase 9의 활성화와 최종적으로 caspase 3의 활성을 방지하여 세포 사멸을 억제하는 것으로 보인다. 또한 extrinsic pathway에서 caspase 8의 활성화를 억제하여 연쇄적으로 caspase 3의 활성을 방지하여 세포 사멸을 억제하였다. 이는 PBLE가 세포 사멸 프로그램인 apoptosis의 intrinsic, extrinsic pathway 모두에서 세포 사멸을 억제하는 효과를 지닌 것으로 사료된다.

Fig 3. Protaetia brevitarsis seulensis larvae water extracts (PBLE) modulated apoptosis related protein. H9C2 cells pretreated with/without PBLE (100, 200 μg/mL) for 3 h and then incubated with 300 μM H₂O₂ of for 3 h. The level of β-actin was determined as an internal control. Different letters above bar indicate significantly differences (P<0.05), using Tukey’s test.

PBLE의 항산화 신호 발현에 미치는 영향

PBLE의 산화스트레스로부터의 세포 보호 효과가 세포 보호 단백질로 알려진 nuclear factor erythropoietin-2-related factor 2(Nrf2)와 heme oxygenase-1(HO-1)과 관련된 것인지 western blot assay를 통해 확인하였다. Nrf2는 HO-1과 같은 다양한 항산화 유전자를 활성화시켜 산화 스트레스에 대한 세포 방어에 관여한다고 알려져 있다(Ryter 등, 2006). 또한 Nrf2가 핵에 들어가면 DNA 내 antioxidant response elements와 결합하여 다양한 항산화 및 세포 보호 유전자의 전사를 활성화한다고 알려져 있다(Guo와 Mo, 2020). 본 실험 결과에 따르면 PBLE 전처리군에서 H₂O₂ 단독 처리군에 비해 HO-1의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, cytosolic Nrf2의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4). 이러한 결과를 통해 PBLE가 Nrf2/HO-1 pathway에서 항산화 시스템은 활성화시키고 세포 전사인자를 낮추어 효과적으로 세포 사멸을 방지한 것으로 사료된다.

Fig 4. Nrf2/HO-1 pathways according to Protaetia brevitarsis seulensis larvae water extracts (PBLE) treatment in H₂O₂-induced H9C2 cell death. H9C2 cells pre-exposed with/without PBLE (100, 200 μg/mL) for 3 h and then administered with 300 μM H₂O₂ of for 3 h. The level of β-actin was analyzed as an internal control. Different letters above bars indicate significantly differences (P<0.05), using Tukey’s test.

본 연구는 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 심근세포에서 H₂O₂에 의해 유도된 산화스트레스로부터 세포 보호 효과를 나타내는지 확인하였다. 항산화능을 확인하기 위하여 PBLE를 DPPH, ABTS assay를 이용하여 농도 의존적으로 항산화 효과가 증가함을 확인하였다. 또한 MTT assay를 통해 PBLE가 세포 독성이 없다는 사실과 H₂O₂로 유도된 산화 스트레스에 대해 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다. Western blot을 통해 세포 내외 경로의 apoptosis를 PBLE가 방지하여 이와 같은 보호 효과가 나타났음을 확인하였으며, 세포 내 항산화 유전자를 활성화시켜 세포를 보호하였음을 확인하였다. 이러한 결과는 AsA가 포함된 증류수로 흰점박이꽃무지 유충을 추출하였으므로 유효성분의 파괴가 줄어들어 항산화 효과 및 세포 보호 효과 나타났을 것이라 예상된다. PBLE가 산화스트레스로부터 유발된 심혈관질환의 예방 효과를 가진 기능성 소재로의 활용 가능성을 시사한다. 본 연구에서는 유효성분을 명확히 규명하지 못하였다는 한계점이 있으므로 후속 연구가 필요한 실정이다.

본 연구는 2022년도 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기본연구사업(No. NRF-2022R1F1A1063850)으로 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.