지용성인 비타민 K는 혈액 응고, 골대사 등에 관여하는 단백질의 합성을 위한 보조 인자로 알려져 있다. 비타민 ‘K’라는 용어의 어원 또한 혈액을 응고시키거나 출혈을 예방하는 능력을 의미하는 게르만어 Koagulation에서 유래되었다(Schwalfenberg, 2017). 비타민 K는 자연에 필로퀴논(phylloquinone, PK)과 메나퀴논(menaquinone, MK) 두 가지 형태로 존재하며, Fig. 1과 같이 둘 다 구조 내 2-methyl-1,4-naphthoquinone 고리를 가지고 있는 것이 특징이며, naphthoquinone 고리에 부착되는 지방족 측쇄 형태에 따라 종류가 나뉜다(National Center for Biotechnology Information, 2024; Shearer와 Newman, 2008). PK는 4개의 isoprenoid기가 부착되어 있으며 이 중 3개가 포화되어 있다. 반면 MK는 isoprenoid기가 부착되는 개수에 따라 MK-n으로 명명되는데 MK-4와 MK-7이 대표적이며, 대부분의 측쇄가 불포화 상태이다(Beulens 등, 2013).

Fig 1. Chemical structures of phylloquinone, menaquinone-6, and menaquinone-7.

비타민 K는 오스테오칼신(osteocalcin)을 활성화시켜 뼈 형성과 골 흡수를 촉진함으로써 골다공증을 예방하고(Lanham-New, 2008), 칼슘대사에 관여하는 Matrix Gla protein의 활성화를 통해 혈관 석회화를 억제하여 심혈관계 질환과 말초동맥질환을 예방하는 것으로 알려져 있다(Halder 등, 2019). 이외에도 단백질 키나아제 A(protein kinase A) 활성화를 통해 암세포 성장이나 재발을 억제하고, 스핑고지질의 합성에 관여함으로써 인지능력을 향상시킬 뿐 아니라 황 전이효소(sulfotransferase)의 활성과 성장인자 및 티로신 키나아제 수용체(tyrosine kinase receptor) 활성의 조절을 통해 알츠하이머 예방에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Schwalfenberg, 2017). 이 같은 다양한 연구 자료를 기반으로 비타민 K의 영양학적 중요성이 인정되어 국내 ｢건강기능식품 기준 및 규격｣(MFDS, 2016)의 영양성분 목록에 원료로 등재되어 있으나, 정상적인 혈액 응고와 뼈의 구성에 필요한 성분으로 PK만 원료로 허용되어 있다. 그러나 비타민 K₂, 특히 MK-7에 관한 메타분석 논문 등에서 MK-7 역시 혈액 응고 및 조직 석회화에 관여하는 단백질의 성분으로 경직, 관상동맥 심장질환 위험 감소 및 비카르복실화율 증가 등 MGP 혈장의 농도와 골밀도 증가 등에 관여한다는 다양한 임상 연구 결과들이 보고된 바 있다(Chen 등, 2019; Liu 등, 2021b). 또한, MK-7은 다른 비타민 K에 비해 체내 흡수율이 높고(Schurgers와 Vermeer, 2000), PK와 MK-4의 반감기가 약 1.5~2시간인 것에 비해 MK-7은 긴 반감기를 가지고 있어 생체이용률이 높은 것으로 보고되면서(Klapkova 등, 2018; Schurgers 등, 2007), 미국을 비롯한 유럽, 캐나다, 일본 등의 제외국에서는 MK-7을 원료로 인정하여 시장에 trans MK-7을 함유한 다양한 제형의 건강기능식품이 유통･판매되고 있다(European Commission, 2009, 2018; Goverment of Canada, 2023; Shimizu, 2003; USDA, 2015). 이에 우리나라는 최근 국제 기준과 조화를 이루고 건강기능식품 제조 현장의 수요를 반영하고자 MK-7을 ｢식품첨가물의 기준 및 규격｣에 영양강화제로 등재하고(고시번호 2023-480호), 건강기능식품의 영양성분으로 사용할 수 있도록 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣ 제 3, 1, 1-5 비타민 K의 원료로 추가하였으며, 그에 따라 품질관리를 위해 건강기능식품 내 MK-7을 분석할 수 있는 시험법을 마련할 필요가 있다.

일반적으로 MK-7은 Bacillus subtilis에 의해 발효된 콩 식품, 효소 합성 박테리아 등 발효식품이나 육류, 유제품 등에 존재하나 그 함량이 적어 Bacillus 종의 발효에 의한 생물학적 합성이나 화학적 합성을 통해 생산된다(Baj 등, 2016; Novin 등, 2020). 그러나 합성 과정에서 cis형 MK-7이나 MK-6가 생성되는데, cis형 MK-7의 생리활성은 trans형 MK-7의 1% 정도로 매우 낮으며 MK-6는 trans MK-7 합성 시 불완전한 합성을 거치며 생성된 부산물이다(Szterk 등, 2018a). 따라서 MK-7 함유 건강기능식품 제조 시 trans MK-7의 함량은 높이되 cis MK-7과 MK-6의 혼입을 최소화할 수 있도록 각각의 기준･규격을 설정하고, 이들을 동시 검출할 수 있는 시험법이 필요하다. 건강기능식품 내 trans MK-7을 분석한 연구는 현재까지 국내에선 확인되지 않았으나 국외는 3건의 연구가 확인되었다. 그러나 수행된 연구 중 2건은 건강기능식품이나 고형 제제 내 trans MK-7 검출을 위한 초고압 액체 크로마토그래피(ultra high performance liquid chromatography, UHPLC) 분석 조건 최적화에 초점이 맞추어져 있으며(Becze 등, 2021; Jehangir 등, 2017), 다른 1건은 건강기능식품 내 cis/trans MK-7 동시분석을 위해 고분해능질량분석기(HRMS-QTOF)의 분석 조건을 최적화한 연구(Szterk 등, 2018b)로 건강기능식품 내 cis/trans MK-7 및 MK-6 3종의 동시분석이 가능하되 건강기능식품의 품질관리를 위한 범용성을 갖춘 분석법으로는 적합하지 않다고 할 수 있다. 또한 기존에 MK-7을 비롯한 비타민 K 분석에 관한 선행연구는 zinc가 충진된 포스트 컬럼을 통해 구조 내 퀴논을 하이드로퀴논으로 환원시킨 후 이를 형광 검출기를 사용하여 검출하는 방식을 사용하나, 분석 방법이 복잡하다는 단점이 있다(Huang과 Li, 2020; Koivu-Tikkanen 등, 2000; Wang 등, 2023).

본 연구에서는 유통 제품의 규격 및 품질관리 효율성을 높이기 위해 분석 편의성이 높고 범용적인 trans/cis MK-7과 MK-6 동시분석법을 마련하고자 하였다. 이에 AOAC 밸리데이션 가이드라인(AOAC, 2023)에 따라 시험법 밸리데이션을 진행하고 건강기능식품의 다양한 제형별 적용성 검토를 실시하였다.

재료 및 시약

표준물질 MK-6와 trans MK-7은 United States Pharmacopeia(USP)에서 구입하였으며, 분석 시 사용한 메탄올, 에탄올, 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)는 Sigma-Aldrich Co.에서 구입한 것을 사용하였다. 시료 전처리와 이동상에 사용된 물은 3차 증류수로 18.0 MΩ 이상인 것을 사용하였다.

건강기능식품의 적용성 검토를 위한 시험재료는 제형의 다양성(경질캡슐, 연질캡슐, 정제), MK-7 외 기능성분(칼슘, 비타민 D, 마그네슘 등) 함유 여부, MK-7이 all-trans 형태임을 입증하는 표시 및 함량 기재 여부를 기준으로 총 7개의 제품을 선정한 뒤 온라인 판매처에서 구매하였다.

표준용액 조제

MK-6와 trans MK-7을 각각 25 mg씩 칭량하고, THF 1 mL를 가하여 완전히 녹인 후 에탄올을 이용해 50 mL로 정용한 뒤 0.45 μm polyvinylidene fluoride(PVDF) 필터에 여과한 용액을 표준원액으로 하였다. 이 용액에 에탄올을 가하여 적정 농도(MK-6: 0.06, 0.13, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 μg/mL, trans MK-7: 0.16, 0.63, 1.25, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL)로 희석하여 표준용액으로 사용하였다.

시험용액 조제

시료 0.25~2 g을 정밀히 칭량한 후 dimethyl sulfoxide 10 mL를 넣어 용해한 뒤 70°C에서 5분간 초음파 추출하였다. 이후 에탄올 20 mL를 첨가하여 70°C에서 5분 간격으로 교반하며 총 15분간 초음파 추출하고 42,172×g에서 2분간 원심분리하여 상등액 일부를 취하였다. 이어 0.45 μm PVDF 필터로 여과한 뒤 시험용액으로 사용하였다.

기기분석 조건

MK-6, cis/trans MK-7 분석을 위해 photo diode array(PDA)가 장착된 Nanospace SI-2(Shiseido Co.)와 YMC Carotenoid C₃₀ 컬럼(4.6×250 mm, 5 μm, YMC America Inc.)을 사용하였으며, 이때 컬럼 온도는 25°C로 설정하였다. 이동상은 물:에탄올:메탄올:테트라하이드로퓨란(1:15:30:10, v/v) 혼합액을 사용하였으며, 유속과 주입량은 각각 10 μL, 0.8 mL/min으로 설정하였다. 검출 파장은 비타민 K 구조의 분광학적 특성을 연구한 Abul-Hajj(1978)의 연구에서 비타민 K의 최대 흡수 파장이 268 nm로 나타났다는 연구 결과를 기반으로 하여 268 nm로 설정 후 분석하였다(Table 1).

Table 1 . HPLC conditions for MK-6 and cis/trans MK-7.

Item	Conditions
Column	YMC Carotenoid C30 (YMC, 4.6×250 mm, 5 μm)
Column temperature	25°C
Flow rate	0.8 mL/min
Injection volume	10 μL
Wavelength	268 nm
Mobile phase	Water:ethanol:methanol:tetrahydrofuran (1:15:80:10, v/v)

MK-6 및 trans MK-7 정량

MK-6는 시험용액 중 MK-6의 피크면적을 자동적분법에 따라 측정하여 다음과 같은 식으로 MK-6의 양을 구하였으며, MK-6의 양은 허용 기준(%) 이하이다.

MK-6의 양(%)＝[(Ru/Rs)×(Cs/Cu)]×100

Ru＝시험용액 중 MK-6의 피크면적

Rs＝표준용액 중 trans MK-7의 피크면적

Cs＝표준용액 중 trans MK-7의 농도(mg/mL)

Cu＝시험용액 중 trans MK-7의 농도(mg/mL)

trans MK-7의 함량은 표준용액을 통해 작성한 표준곡선으로부터 구하였으며, cis MK-7은 면적 백분율법에 따라 시험용액 중 cis MK-7의 피크면적을 시험용액 중 cis MK-7과 trans MK-7의 피크면적의 합계로 나눈 값으로부터 구하였다.

cis MK-7 (%)＝(A1/A2)×100

A1＝시험용액 중 cis MK-7 피크 면적

A2＝시험용액 중 cis MK-7과 trans MK-7 피크의 합계 면적

시험법 밸리데이션

특이성 검증을 위하여 표준용액과 시험용액의 분리도, 머무름시간과 스펙트럼 일치 여부를 확인하였다. 직선성은 시료에서 MK-6 및 trans MK-7이 검출되는 농도 범위를 중간값으로 설정하여 MK-6는 0.2, 0.3, 1.3, 2.5, 5, 10, 20 μg/mL, trans MK-7은 0.4, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 μg/mL로 각각 총 7개 농도에 대한 직선성을 검토하였다. 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대한 3 반복 실험을 수행하여 검량선을 작성하였다. 직선성의 평가는 검량선의 상관계수(correlation coefficient, R²)가 0.99 이상일 때 직선성을 인정하였다. 또한 검출한계와 정량한계는 검량선에 근거한 방법을 사용하여 계산하였다. 즉, 표준용액을 3회 분석한 검량선의 기울기(S) 및 y절편의 표준편차(σ) 값을 이용하여 검출한계는 3.3×σ/S, 정량한계는 10×σ/S 식을 통해 구하였다. 정밀성은 반복성(repeatability)과 재현성(reproducibility)을 측정하여 확인하였다. 반복성은 선정된 표본원료의 100, 250, 400 mg에 대한 시료량 변화를 측정하여 평가하였다. MK-6는 표본원료에서 검출되지 않아 표본용액을 첨가하여 최종함량이 1.2 mg/g이 되도록 하였다. 실험실 간 재현성은 세 실험실에서 표본원료 1개를 각 5회 반복 측정하여 확인하였다. 정확성은 trans MK-7 표본원료에 MK-6 표준용액을 첨가하여 최종농도가 trans MK-7은 20, 30, 40 μg/mL, MK-6는 5, 10, 15 μg/mL가 되도록 만들고 각각의 농도를 5회 반복 측정한 뒤 회수율을 구하여 확인하였다.

최적 분석 조건 확립

다양한 제형의 건강기능식품에서 MK-6와 cis/trans MK-7을 동시 분석할 수 있는 최적화된 시험법을 확립하고자 USP monograph에 따른 두 가지 시험법과 원료 제조사에서 제시하고 있는 시험법을 참고하여 전처리 및 기기분석 조건을 변화시키며 분석을 진행하였다(Gnosis by Lesaffre, 2022; USP, 2022a, 2022b). 먼저 각각 다른 컬럼(C₁₈ 및 C₃₀)을 사용하는 USP 시험법 간 비교한 결과, C₁₈ 컬럼을 사용했을 때는 cis형 MK-7이 분리되지 않은 반면, C₃₀ 컬럼으로 변경하고 이동상을 97% 에탄올에서 물, 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로퓨란의 혼합물로 변경하여 실험을 진행하였을 때 cis MK-7의 분리능이 개선되는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 이같은 결과는 MK-7 이성질체 분리를 위해 컬럼별 분리능을 비교한 결과 C₁₈ 컬럼보다 C₃₀ 컬럼에서 분리능이 향상되었다고 보고한 Jedynak 등(2017)의 연구 결과와 유사한 경향을 보였다. 또한 cis/trans MK-7 동시 분석법 개발을 위해 순상과 역상 분리 모드에서 고정상이 다른 HPLC 컬럼을 비교한 Jedynak 등(2017)의 연구에서 순상 크로마토그래피에 사용되는 컬럼의 경우 머무름 계수가 낮아 MK-7의 분리능이 떨어지며, 역상 크로마토그래피에 가장 많이 사용되는 C₁₈ 컬럼은 MK-7의 이성질체를 분리하지 못한 반면 C₃₀ 컬럼에서 분리능이 향상되었다고 보고하여 본 연구 결과의 경향과 유사하였다. 본 연구에 사용된 YMC carotenoid는 C₃₀ 컬럼은 고정상이 이성질체 구조를 구별할 수 있어 비타민 K₂를 비롯한 카로티노이드, 토코페롤의 이성질체 분리에 널리 사용되고 있는데, 이는 C₁₈ 컬럼보다 C₃₀ 컬럼 내 고정상의 소수성이 크기 때문에 MK-7의 이성질체에 높은 선택성을 가지므로 cis MK-7을 검출하는 데 효과적인 것으로 판단된다(Cook 등, 1999; Emenhiser 등, 1995; Liu 등, 2021a; Sander 등, 1994). 실험 결과와 유사 문헌의 결과를 바탕으로 이후 분석에서 C₃₀ 컬럼을 분석 컬럼으로 고정하였다.

Fig 2. HPLC-PDA chromatograms comparison of analysis results by (A) C₁₈ column (4.6×150 mm, 2.6 μm) and (B) C₃₀ column (4.6×250 mm, 5 μm). Chromatographic conditions of (A): mobile phase, ethanol:water (97:3, v/v); flow rate of 0.8 mL/min; column temperature of 25°C; wavelength of 268 nm; injection volume of 10 μL. Chromatographic conditions of (B): mobile phase water:ethanol:methanol:tetrahydrofuran (1:15:80:10, v/v); flow rate of 0.8 mL/min; column temperature of 25°C; wavelength of 268 nm; injection volume of 10 μL.

이후 C₃₀ 컬럼일 때 추출용매 종류에 따른 trans MK-7 회수율과 cis MK-7 및 MK-6 검출 여부를 확인한 결과는 Table 2와 같다. cis MK-7 및 MK-6는 제형과 용매에 상관없이 USP에서 제시하고 있는 혼입 한계치인 2%, 3% 이내로 나타났다. 그러나 trans MK-7은 분말이나 오일 제형에서는 용매 종류에 상관없이 trans MK-7의 회수율이 평균 80.3~107.7%로 비교적 함량이 안정적으로 분석된 반면, 미세캡슐화된 분말 제형의 경우 테트라하이드로퓨란과 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 사용하여 추출하였을 때 소재 특성에 따라 회수율의 편차가 크게 발생하였다. 그러나 이와 대조적으로 디메틸설폭사이드를 추출용매로 사용하였을 때는 모든 제형에서 일정한 회수율을 보여 다양한 제형으로 유통되고 있는 건강기능식품의 비타민 K₂ 함량 분석 시 용매로 적합함을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 Szterk 등(2018a)이 미세캡슐화된 건강기능식품 내 MK-7 추출 시 테트라하이드로퓨란을 추출용매로 사용한 경우 회수율이 7.33%로 매우 낮았다고 보고한 것과 유사하였다. MK-7은 빛이나 열, 산소와 같은 환경 요인에 민감하고 알칼리에 불안정하여 구조적 변화가 발생하고 분해에 따른 불순물이 생성되는 것으로 보고되었다. 이에 최근 MK-7의 유통 중 안정성을 높이고 생체이용률을 향상시키기 위해 미세캡슐화 등의 생산기술을 적용하는데 테트라하이드로퓨란이 미세캡슐화된 제품의 수용성 코팅을 효율적으로 용해하지 못해 MK-7 중 일부만 유기상으로 전달됨으로써 회수율이 감소한 것으로 판단된다(Bergeland 등, 2019). 에틸아세테이트를 추출용매로 사용하는 USP-2 시험법의 경우, 미세캡슐화 분말을 분석하기 위해 개발된 시험법임에도 불구하고 제품의 모든 미세캡슐화 분말에 적용되지 않는 것으로 나타났다. 이는 미세캡슐화 소재로 사용되는 말토덱스트린이 친수성이 강한 디메틸설폭사이드에서 용해도가 증가하기 때문으로 생각된다(Du 등, 2021; Plou 등, 2002). 이에 다양한 제형의 건강기능식품 중 비타민 K₂ 분석을 위한 시험 용매로 디메틸설폭사이드를 추출용매로 선정하였다.

Table 2 . Comparison of analysis results by various solvents (sample amount).

Form	USP-1			USP-2			A
	THF			EA			DMSO
	cis MK-7(%)	trans MK-7(%)	MK-6(%)	cis MK-7(%)	trans MK-7(%)	MK-6(%)	cis MK-7(%)	trans MK-7(%)	MK-6(%)
Powder 1	0.39±0.07	99.08±0.11	0.01±0.00	1.58±0.28	99.84±1.31	0.05±0.02	0.83±0.07	93.79±1.01	0.00±0.00
Powder 2	0.51±0.04	107.68±0.27	0.73±0.04	1.68±0.10	104.11±1.02	0.71±0.21	0.13±0.02	106.19±1.02	0.73±0.01
Powder 3	0.38±0.05	97.46±0.69	0.12±0.03	1.94±0.13	96.77±1.54	0.22±0.09	0.14±0.02	93.42±1.80	0.15±0.00
Oil 1	0.19±0.03	102.33±0.64	0.00±0.00	1.54±0.12	102.77±1.62	0.08±0.02	0.83±0.07	92.24±3.14	0.06±0.01
Oil 2	0.09±0.01	102.41±0.84	0.90±0.06	1.70±0.05	101.76±1.28	1.00±0.16	0.16±0.02	98.34±0.39	0.76±0.01
Oil 3	0.41±0.05	102.35±1.08	0.52±0.05	1.98±0.15	103.36±1.08	0.40±0.06	0.07±0.01	80.26±0.41	0.45±0.02
Microencapsulated powder 1	1.83±0.04	5.59±0.08	1.37±0.02	1.83±0.11	24.27±1.29	1.37±0.07	0.56±	106.86±0.71	0.86±0.03
Microencapsulated powder 2	0.52±0.07	106.53±1.30	1.26±0.08	1.91±0.08	100.06±1.88	1.31±0.28	0.37±0.07	99.35±2.02	1.24±0.11
Microencapsulated powder 3	0.39±0.06	5.86±0.44	0.00±0.00	1.66±0.13	102.55±2.63	0.07±0.03	0.33±0.01	105.02±0.40	0.00±0.00
Microencapsulated powder 4	0.73±1.27	3.71±0.20	0.00±0.00	1.21±0.03	151.66±0.73	0.00±0.00	0.81±0.28	100.33±1.61	0.00±0.00

Values are mean (n=3)..

USP-1, united states pharmacopeia monograph for solid and liquid preparation; USP-2, united states pharmacopeia monograph for microencapsulated powder preparation; A, testing method of manufacturer..

THF, tetrahydrofuran; EA, ethyl acetate; DMSO, dimethyl sulfoxide..

시험법 검증

확립된 시험법 검증을 위해 표준용액과 시험용액에서 분리도 및 머무름시간을 확인함으로써 특이성을 확인하였다. 표준용액과 비타민 K₂ 원료를 분석한 크로마토그램으로 동일한 위치에서 피크를 확인하였으며, 표준용액과 원료에서 MK-6의 머무름시간이 12.6분, trans MK-7은 17.6분에서 일치하였다. 또한 분리된 MK-7의 피크의 정점에서 PDA 스펙트럼은 표준물질과 원료의 패턴이 일치함을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig 3. HPLC chromatograms and spectrums of MK-6 and cis/trans MK-7 in (A) standard chromatograms and spectrum, and (B) sample chromatograms and spectrum. Chromatographic conditions: mobile phase water:ethanol:methanol:tetrahydrofuran (1:15:80: 10, v/v); flow rate of 0.8 mL/min; column temperature of 25°C; wavelength of 268 nm; injection volume of 10 μL. The inset figures show the spectral details and the λ max of peaks of trans MK-7 on the chromatogram. AU, absorbance units.

시험 용액에서 MK-6와 trans MK-7이 검출되는 농도 범위를 중간값으로 설정하여 총 7개 농도에 대한 직선성을 검토하였으며, 실험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위해 각 농도에 대해 3 반복 실험을 수행하였다. 실험 결과 검량선 상관계수(R2)는 모두 0.99 이상으로 나타나 AOAC 가이드라인에서 제시하는 기준(R2>0.99)을 만족시켜 높은 직선성을 보였다. 표준용액을 3회 분석한 검량선을 이용하여 y절편의 표준편차 3.3배로 곱한 값을 기울기의 평균값으로 나눈 값을 검출한계로, 10배 곱한 값에 기울기의 평균값으로 나눈 값을 정량한계로 설정하였으며, 각각의 데이터는 Table 3과 같다.

Table 3 . Linearity regression, limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ) for MK-6 and trnas MK-7.

Standard	Regressiom equation	R2	LOD (μg/mL)	LOQ (μg/mL)
MK-6	Y=30,494x+6,447.1	0.999	0.5	1.5
trnas MK-7	Y=129,127x+36,772	0.998	0.7	2.2

정확성은 trans MK-7을 함유하는 표본검체 1개에 대하여 각각 다른 농도를 spiking/recovery 방법으로 회수되는 백분율을 통해 매트릭스 영향을 검토하였다. 표준물질 첨가법에 따라 원료에 대하여 일정량의 시료를 채취하고 표준용액을 첨가하였을 때 최종농도가 MK-6는 5, 10, 15 μg/mL, trans MK-7은 20, 30, 40 μg/mL가 되도록 하였다. MK-6의 회수율은 96.8~105.7%였으며, trans MK-7의 회수율은 95.6~101.5%로 나타났다(Table 4). 이는 AOAC 가이드라인의 회수율 기준인 분석물의 농도가 1%일 때, 평균 회수율 범위는 92~105%에 모두 부합하는 결과로 본 분석법의 적합성을 확인할 수 있었다.

Table 4 . Validation (accuracy, repeatability, reproducibility) of analysis method for MK-6 and trans MK-7.

	Treatment	Spiked concentration (μg/mL)
		MK-6			trans MK-7
		5	10	15	20	30	40
Accuracy	1	4.77	10.58	14.78	19.52	29.08	40.50
	2	4.90	10.67	14.87	19.53	31.72	40.25
	3	4.97	10.73	15.16	18.47	30.95	40.40
	4	4.86	10.42	14.94	19.29	30.01	40.78
	5	4.70	10.45	14.81	18.82	30.44	40.03
	Measured mean (μg/mL)	4.84	10.57	14.91	19.13	30.44	40.40
	%RSD	2.19	1.27	1.00	2.44	3.27	0.67
	Recovery mean (%)	96.8	105.7	99.4	95.6	101.5	101.0
	Treatment	Analysis sample volume (mg/g)
		MK-6			trans MK-7
		100	250	400	100	250	400
Repeatability	1	1.275	1.214	1.209	2.786	2.645	2.702
	2	1.258	1.256	1.273	2.592	2.652	2.696
	3	1.191	1.266	1.224	2.753	2.643	2.647
	4	1.231	1.179	1.255	2.670	2.748	2.653
	5	1.217	1.265	1.275	2.765	2.649	2.702
	Measured mean (mg/g)	1.234	1.236	1.247	2.713	2.667	2.680
	SD	0.033	0.038	0.030	0.081	0.045	0.028
	%RSD	2.671	3.095	2.371	2.978	1.694	1.029
	Treatment	Laboratory
		MK-6			trans MK-7
		A	B	C	A	B	C
Reproducibility	1	1.214	1.194	1.203	2.645	2.620	2.722
	2	1.256	1.216	1.193	2.652	2.620	2.747
	3	1.266	1.201	1.195	2.643	2.600	2.739
	4	1.179	1.208	1.192	2.748	2.599	2.722
	5	1.175	1.205	1.209	2.649	2.609	2.834
	Measured mean (mg/g)		1.207			2.677
	SD		0.025			0.070
	%RSD		2.055			2.627

정밀도를 확인하기 위하여 반복성과 재현성을 측정한 결과는 Table 4와 같다. MK-6와 trans MK-7 모두 표본검체 1개를 선정하여 각각 시료량 100, 250, 400 mg을 취하여 시료량 변화에 대한 반복 정밀도를 측정한 결과, MK-6의 함량은 1.234, 1.236, 1.247 mg/g, 상대표준편차는 2.671%, 3.095%, 2.371%로 나타났다. 또한 trans MK-7의 함량은 2.713, 2.667, 2.680 mg/g이었으며, 상대표준편차는 2.978%, 1.694%, 1.029%임을 확인하였다. 실험실 간 재현성을 확인하기 위해 표본검체 1개를 선정하여 세 실험실에서 각 5회 반복 측정하였다. 이때 표본검체에서 MK-6가 검출되지 않으므로 표준물질을 첨가하여 최종 함량이 1.2 mg/g이 되도록 하였다. MK-6와 trans MK-7의 재현성의 상대표준편차를 확인한 결과, 각각 2.055%, 2.627%로 나타났다(Table 4). 이 결과들은 AOAC에서 제시하는 분석물 농도가 0.1%일 때, 반복성과 재현성 기준인 3%와 6%에 부합하는 결과로 우수한 정밀성을 보였다.

건강기능식품의 적용성 검토

확립된 시험법을 이용하여 수거한 검체의 기능(지표) 성분 함유량에 대한 적용성 검토를 수행하였다. 총 7건의 검체의 trans MK-7 회수율과 검체 내 cis MK-7 및 MK-6의 비율을 3 반복으로 분석한 결과, 모든 검체의 trans MK-7은 표시함량 대비 88.1~138.5%(평균 104.53%), cis MK-7과 MK-6는 모두 USP에 규정된 혼입 기준치인 2% 및 3% 이내로 검출되었다(Table 5). 이와 같은 결과는 Becze 등(2021)이 확립된 UHPLC 분석법을 이용하여 유통 중인 건강기능식품 내 trans MK-7 회수율을 분석한 결과, 회수율 범위(평균)가 96~104%(101.2%) 나타났다고 보고한 것과 유사하였다. 또한 최적화된 UHPLC 분석법을 통해 정제 제제 내 trans MK-7을 분석한 결과 회수율이 102.87%로 나타났다고 보고한 Jehangir 등(2017)의 연구와도 유사한 결과를 보였다. 본 연구 결과를 통하여 확립된 분석법은 선행연구의 trans MK-7 개별정량법과 비교했을 때, MK-6 및 cis/trans MK-7의 동시분석이 가능할 뿐만 아니라 범용성이 높은 HPLC를 사용한다는 점에서 향후 유통될 비타민 K₂ 함유 건강기능식품의 효율적인 품질관리를 가능케 할 것으로 기대된다.

Table 5 . Results of application of the developed method on health functional foods.

		MK-6 (%)	trans MK-7			cis MK-7 (%)
			Labeled amount (mg/g)	Actual amount (mg/g)±SD	Recovery (%)
1	Hard	1.4±0.04	0.10	0.20±0.00	138.5	0.9±0.01
2	Hard	1.4±0.19	0.30	0.30±0.01	95.7	0.4±0.02
3	Hard	0.3±0.33	0.05	0.06±0.00	107.7	0.0±0.00
4	Soft	1.1±0.26	0.30	0.30±0.07	97.6	0.0±0.00
5	Tablet	0.1±0.02	0.62	0.50±0.01	88.1	0.2±0.10
6	Tablet	0.0±0.00	0.003	0.003±0.00	102.4	0.0±0.00
7	Tablet	0.0±0.00	0.04	0.04±0.00	101.7	0.0±0.00

본 연구는 영양강화제나 영양성분으로서 비타민 K₂(trans MK-7) 등재 시 제품의 규격 관리를 위한 건강기능식품 중 cis/trans MK-7과 MK-6 동시분석법을 마련함으로써 분석의 편의성을 높이고, 유통 제품의 품질관리 효율성을 높이고자 다양한 제형별 적용성 검토를 하여 비타민 K₂ 기준･규격 설정 시 기초 자료를 마련하고자 하였다. 추출용매로 분말, 캡슐, 마이크로캡슐 등 다양한 제형에 적용 가능한 디메틸설폭사이드를 선정하였으며, MK-6와 trans MK-7 각 물질의 분리도가 높은 YMC carotenoid C₃₀ 컬럼을 이용하였고 분석 파장대는 가장 높은 흡수 파장대(268 nm)를 선정하여 분석 기기 조건으로 설정하였다. 시험법 밸리데이션 결과, 직선성 정량범위 내에서 상관계수(R²) 0.99 이상의 유의수준을 보였으며, MK-6와 trans MK-7의 검출한계는 각각 0.5, 0.7 μg/mL이었으며 정량한계는 1.5, 2.2 μg/mL로 나타났다. 정확성은 MK-6의 회수율 구간이 96.8~106.0%, trans MK-7의 회수율 구간은 95.6~101.5%임을 확인하였다. 반복성과 재현성 측정 결과, MK-6 함량은 1.234, 1.236, 1.247 mg/g, 상대표준편차는 각각 2.671%, 3.095%, 2.371%였으며, trans MK-7 함량은 2.713, 2.667, 2.680 mg/g, 상대표준편차는 각각 2.978%, 1.694%, 1.029%임을 확인하였다. MK-6와 trans MK-7의 재현성의 상대표준편차는 각각 2.055%, 2.627%로 나타났다. 마지막으로 적용성 검토를 통해 제품 내 trans MK-7 표시량 대비 함량과 cis MK-7와 MK-6의 비율을 분석한 결과, 모든 제품이 trans MK-7 표시량 대비 함량이 80% 이상, cis MK-7과 MK-6는 모두 2% 및 3% 이내로 검출되어 동시에 정량 가능한 시험법임을 재확인하였다. 본 연구에서 설정된 표준화된 시험법은 비타민 K₂ 함유한 건강기능식품 유통 시 제품의 규격 관리에 대한 소비자 신뢰도를 높일 수 있을 것으로 기대한다.

본 연구는 2022년도 식품의약품안전처 연구개발사업의 연구비지원(22191미래식044)에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.