허브란 ‘푸른 풀’이라는 뜻을 가진 라틴어의 헤르바(herba)에서 유래된 어원이며 줄기와 잎, 뿌리, 열매 등 다양한 부위가 유용하게 활용될 수 있는 식물의 총칭으로 불리고 있다(Ryoo와 Cha, 1998). 허브는 종류에 따라 특유의 맛과 향을 가지고 있어 주로 향신료로 이용되어 왔으나 허브 내 함유된 여러 기능 성분의 유용성이 알려지면서 이를 활용한 화장품, 건강 보조 식품, 항산화제 등으로써 사용량이 증가하고 있다(Choi 등, 2010). 식품첨가물로 사용되는 허브의 경우 식품의 기호성을 증진시킬 뿐만 아니라 미생물 작용에 의해 발생하는 식품의 부패 및 변질을 억제하는 데 도움을 줄 수 있는데, 근래에는 소비자들이 건강 지향적인 식품 섭취를 선호함에 따라 인공적으로 제조된 합성 보존료가 아닌 천연 성분을 이용한 보존료의 사용을 지향하게 되었고 식품의 안전성과 신선함을 동시에 만족시킬 수 있는 허브가 합성 보존료의 적합한 대체제로 각광받고 있다(Choi와 Rhim, 2010; Yoo 등, 2005).

로즈마리(Rosmarinus officinalis L.)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 상록 관목으로 해안에서 주로 자생하며, 장뇌와 유사한 향을 가진 방향성 식물로 유럽이나 지중해 연안에서는 향수나 약품의 재료로 이용되었다(Choi 등, 2009; Kim과 Ko, 2013). 또한 국내에서는 월동이 가능한 남부지역에서 산업적 이용을 목적으로 활발하게 생산되고 있으며 미용, 관상용, 약용, 식용 등 다양한 분야에서 활용되고 있다(Li 등, 2019). 로즈마리에 함유된 주요 성분은 carnosol, carnosic acid, rosmarinic acid, caffeic acid, ursolic acid 등이 있으며, 이러한 천연 항산화 물질들은 활성산소종으로부터 유도되는 산화적 스트레스를 예방하고 지질의 산화를 억제하는 등의 강력한 항산화 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다(Jeong 등, 2018; Rašković 등, 2014). 또한 로즈마리의 정유 성분은 대부분 1,8-cineole, camphor, α-pinene, limonene, thymol, β-pinene과 같은 monoterpenes로 구성되어 있으며 살균, 방충, 소독 등의 작용을 하여 식품의 보존성을 증진시키는 것으로 알려져 있다(Ibáñez 등, 1999; Kim과 Ko, 2013). Chae 등(2010)은 국내에서 유통 중인 허브 6종에 대한 항산화 및 항균 효과를 분석한 결과 로즈마리가 총 폴리페놀 함량과 자유라디칼 소거능에 있어 가장 우수한 효능을 보였으며, Staphylococcus aureus와 Escherichia coli O157:H7에 대한 항균 효과 또한 가장 뛰어난 것으로 보고하였다. 또한 Jeong과 Kim(2023)은 닭고기 분쇄육 제조 시 향신료 첨가에 따른 미생물적 안전성을 분석한 결과 로즈마리 첨가군에서 가장 우수한 일반 세균 및 대장균 증식 억제능을 보여 로즈마리의 식품 보존료로서의 기능성을 보고하였다. 현재 로즈마리의 다양한 생리활성 탐색에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있는데, Cho 등(2005)의 연구에 따르면 로즈마리를 60% 에탄올로 추출했을 때 angiotensin converting enzyme과 xanthin oxidase 저해율이 각각 89.8%와 100%로 나타나 고혈압, 통풍에 효과가 있을 것으로 보고하였다. 또한 Muhlbauer 등(2003)은 로즈마리에 함유된 정유 성분이 쥐의 bone resorption을 효과적으로 억제하였다고 보고하여 로즈마리의 골다공증 예방 효과에 대한 가능성을 확인하였다. 이와 같이 현재 로즈마리와 관련된 다양한 연구가 진행되고 있으나 대부분 용매를 이용하여 추출한 뒤 시료로 이용하였고 균주를 접종하여 발효추출 후 생리활성과 화장품 소재로서 효능을 분석한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 천연물 발효 균주로서 유용하게 활용되고 있는 5종의 미생물을 선정하여 로즈마리를 발효시킨 뒤 각 발효물에 대한 이화학적 특성, 생리활성 및 미용 관련 효소 저해능을 기존의 로즈마리와 비교 분석하여 향후 항산화, 피부 노화 방지 등에 효과가 있는 새로운 건강 기능성 식품 원료로의 활용 가능성을 탐색하고자 하였다.

사용 균주

로즈마리 발효에 사용된 균주는 Bacillus subtilis KACC 14549, Saccharomyces cerevisiae KACC 48234, Levilactobacillus brevis KACC 18270, Lacticaseibacillus casei KACC 12413, Lactiplantibacillus plantarum KACC 18510으로 농업유전자원센터(Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양받아 사용하였다. B. subtilis는 nutrient broth(Difco Laboratories), S. cerevisiae는 YM broth(Difco Laboratories), L. brevis, L. casei, L. plantarum은 Lactobacilli MRS broth(Difco Laboratories)에서 24시간 주기로 3회 계대 배양 후 600 nm에서 흡광도 값이 0.4~0.6 범위 안에 들게 하여 발효 균주의 생장이 이루어진 것을 확인한 후 사용하였다.

로즈마리 발효물 제조

본 실험에 사용된 로즈마리(터키산)는 건조된 원물 형태를 2023년 8월 진성 BNF에서 구입하였고 이를 분말화한 뒤 -24°C에서 냉동보관 하면서 실험에 사용하였다. 로즈마리 발효물의 제조 과정은 250 mL의 증류수에 5 g의 glucose(Sigma-Aldrich Co.)와 1.25 g의 peptone(Life Technologies Corp.)을 넣고 교반한 뒤 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하여 실온에서 서서히 식힌 다음 로즈마리 분말 12.5 g과 미리 활성화한 5종의 발효 균주를 각각 2.5 mL 주입하였다. B. subtilis(BS), S. cerevisiae(SC)는 30°C, L. brevis(LB), L. casei(LC), L. plantarum(LP)은 37°C의 incubator(HB-101-4, Hanbaek Scientific Co.)에서 24시간 동안 배양한 후 배양액을 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하고 멸균된 배양액을 원심분리기(LaboGene 416, LaboGene™)로 원심분리(2,700×g, 10 min)한 뒤 여과(Whatman No. 4, GE Healthcare Life Sciences)하여 동결건조(FD8508, Ilshin Lab Co., Ltd.)한 후 -50°C deep freezer(FR-300CW, Daehan CRYO Co.)에 보관하면서 실험에 사용하였다. 무발효 대조군은 로즈마리 분말 12.5 g에 250 mL의 증류수를 가한 뒤 실온에서 24시간 추출한 후 원심분리(2,700×g, 10 min) 및 여과(GE Healthcare Life Sciences)한 다음 동결건조하여 얻은 분말(이하 무발효군)을 사용하였다. 각 시료는 증류수에 녹여 원하는 농도로 제조한 후 실험에 사용하였다.

로즈마리 발효물의 수율

로즈마리 발효물의 동결건조 수율은 제조한 발효 및 무발효 로즈마리 추출물을 동결건조하여 건조중량을 구한 후 추출물 조제 시 사용된 원료 중량에 대한 백분율(%)로 나타내었다.

사용 균주에 따른 로즈마리 발효액의 배양 특성

균주 성장에 따른 발효액의 pH 변화는 24시간 배양 후 멸균된 발효액을 여과한 다음 pH meter(K2000-pH, iSTEK Inc.)를 이용하여 측정하였다. 혼탁도 측정은 24시간 배양 후 멸균 및 여과된 발효액을 600 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 발효 정도를 확인하였다. 생균수 측정은 24시간 배양한 로즈마리 발효액을 멸균수에 희석하여 충분히 혼합한 후 BS, LB, LC, LP는 plate count agar(Difco Laboratories), SC는 potato dextrose agar(Difco Laboratories)에 분주한 다음 각각 37°C, 30°C에서 24~48시간 배양하여 생균수를 측정하였다.

총당 및 환원당 측정

총당 함량 측정은 phenol-sulfuric acid 방법(Cho 등, 2015)을 사용하여 측정하였다. 시료에 5% phenol(Junsei Chemical Co., Ltd.)과 sulfuric acid(H₂SO₄, Junsei Chemical Co., Ltd.)를 첨가하여 혼합하고 20분간 방치한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

환원당 함량 측정은 DNS 방법(Meller, 1959)을 사용하여 측정하였다. 시료에 DNS 용액을 넣고 혼합한 후 10분간 끓는 물에서 반응시킨 뒤 5분간 냉각하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총당과 환원당의 함량은 glucose(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 표준물질로 하여 검량선을 작성한 후 시료 100 mg에 대한 mg glucose equivalents(GE)로 나타내었다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량 측정은 Folin과 Denis(1912)법을 응용하여 측정하였다. 시료에 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma-Aldrich Co.)와 증류수를 1:2(v/v)의 비율로 섞은 혼합액을 첨가하여 3분간 반응시킨 후 10% Na₂CO₃(w/v, Duksan Chemical Co., Ltd.) 용액을 섞어 1시간 동안 암실에서 반응시키고 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 검량선을 작성한 후 시료 1 g에 대한 mg gallic acid equivalents(GAE)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량 측정은 Zhishen 등(1999)의 방법을 사용하여 측정하였다. 시료에 증류수와 5% NaNO₂(w/v, Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 넣어 섞은 후 5분간 방치하였다. 이후 10% AlCl₃･6H₂O(w/v, Junsei Chemical Co., Ltd.)를 넣고 6분간 방치한 다음 1 M NaOH(Daejung Chemical & Metals Co., Ltd.)를 가하여 11분간 반응시킨 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 catechin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 검량선을 작성한 후 시료 1 g에 대한 mg catechin equivalents(CE)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료에 0.2 mM DPPH(Sigma-Aldrich Co.) solution을 첨가하여 혼합한 다음 암실에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 시료 희석용매인 증류수를 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였고, 결괏값은 대조군에 대한 시료 첨가군의 감소한 흡광도를 백분율(%)로 구한 후 IC₅₀값으로 나타내었다. 양성대조군으로 기존의 항산화제인 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성 측정

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS) 라디칼 소거 활성은 Fellegrini 등(1999)의 방법을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 140 mM K₂S₂O₈(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)에 증류수를 가한 후 ABTS diammonium salt tablet(Sigma-Aldrich Co.) 2알을 넣어 암실에서 12~16시간 동안 방치하고 이를 95% 에탄올(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)과 혼합하여 734 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 조절하여 사용하였다. 시료에 ABTS solution 1 mL를 가한 후 2분 30초간 암실에서 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 희석용매인 증류수를 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였고, 결괏값은 대조군에 대한 시료 첨가군의 감소한 흡광도를 백분율(%)로 구한 후 IC₅₀값으로 나타내었다. 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하여 비교하였다.

FRAP 활성 측정

Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 측정 방법은 Benzie와 Strain(1996) 방법을 참고하여 측정하였다. FRAP solution은 300 mM acetate buffer(pH 3.6)와 40 mM HCl(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.), 20 mM FeCl₃･6H₂O(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 섞은 후 37°C에서 10분간 반응시켜 제조한 후 사용하였다. 시료에 증류수와 FRAP solution을 넣고 37°C에서 10분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP value는 FeSO₄･7H₂O(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 대입하여 환산하였으며, 시료 1 g에 들어있는 FeSO₄･7H₂O의 mM 함량으로 나타내었다.

항균 활성 측정

항균 활성은 각 유해 균주를 대상으로 disc diffusion assay(Bauer 등, 1966)를 통해 측정하였다. 항균 활성 측정에 사용된 균주는 Gram positive bacteria인 Bacillus cereus KCTC 1012, Bacillus subtilis KACC 14549, S. aureus KCTC 3881과 Gram negative bacteria인 E. coli KCTC 2441, Enterobacter cloacae KCTC 1685, Salmonella Typhimurium KCTC 2515, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636의 총 7종을 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture) 및 농업유전자원센터에서 분양받아 사용하였다. 휴면 상태의 균주들을 Table 1의 조건으로 생육 배양하였고 활성화된 각 균주를 nutrient agar(Difco Laboratories)에 분주한 뒤 멸균된 spreader로 도말하여 항균시험용 평판배지를 준비하였다. 시료를 paper disc에 흡수시키고 용매를 휘발시킨 뒤 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 24시간 동안 30°C와 37°C에서 배양하였다. 이후 disc 주변에 생성된 생육 저해환의 직경을 측정하여 항균력을 비교하였다. 생육 저해환의 결괏값은 paper disc의 직경인 8 mm를 제외한 값으로 나타내었다.

Table 1 . List of strains used for antimicrobial experiments.

	Strains	Media1)	Temp. (°C)
Gram positive bacteria	Bacillus cereus	NA/NB	30
	Bacillus subtilis	NA/NB	30
	Staphylococcus aureus	NA/NB	30
Gram negative bacteria	Escherichia coli	NA/NB	30
	Enterobacter cloacae	NA/NB	30
	Salmonella enterica Typhimurium	NA/NB	37
	Pseudomonas aeruginosa	NA/NB	37

¹⁾NA: nutrient agar, NB: nutrient broth..

아질산염 소거 활성 분석

아질산염 소거 활성 측정 방법은 Gray와 Dugan(1975)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료에 1 mM NaNO₂(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)와 0.2 M citrate buffer(pH 3.0)를 가하고 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 혼합물에 2% acetic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.), Griess reagent(30% acetic acid를 이용하여 제조한 1% sulfanilic acid, 1% 1-naphthylamine을 사용 직전 1:1 비율로 섞어 제조)를 가하여 15분간 반응시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였으며 결괏값은 시료 첨가군과 시료 무첨가군을 백분율(%)로 산출하여 나타내었다.

Tyrosinase 저해 활성 평가

Tyrosinase 저해 활성은 Flurkey(1991)의 방법을 이용하여 측정하였다. 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8), 시료, 10 mM L-DOPA(dihydroxy-phenylalanine, Sigma-Aldrich Co.)를 넣고 혼합한 뒤 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8)에 용해한 효소액(mushroom tyrosinase, 100 unit/mL, Sigma-Aldrich Co.)을 첨가하여 37°C에서 15분간 반응시키고 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. Kojic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 양성대조군으로 사용하여 비교하였으며 tyrosinase 저해 활성은 시료 첨가군과 시료 무첨가군을 백분율(%)로 산출하여 나타내었다.

Elastase 저해 활성 평가

Elastase 저해 활성은 Kraunsoe 등(1996)의 방법을 참고하여 측정하였다. 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0), 시료, N-succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide를 넣고 혼합한 뒤 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0)에 용해한 효소액 elastase (pancreatic from porcine pancreas, PPE, 0.1 unit/mL, Sigma Chemical Co.)를 첨가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 뒤 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Ascorbic acid (Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 양성대조군으로 사용하여 비교하였으며 elastase 저해 활성은 시료 첨가군과 시료 무첨가군을 백분율(%)로 산출하여 나타내었다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 실시하였고 자료의 통계처리는 SPSS 26.0(Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc.)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 수율 결과를 제외한 모든 데이터는 일원배치 분산분석(one way ANOVA)을 통해 95% 유의수준에서 통계적 유의성(P<0.05)이 확인된 경우 Duncan’s multiple range test를 통해 각 측정값 간의 유의성을 검증하였다. 항균 활성 분석 실험에서 대조군과 실험군 간의 유의성은 발효 전과 후 비교이기 때문에 비모수 검정인 Mann-Whitney U test로 분석한 후 P값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

로즈마리 발효물의 수율

5종의 유용 미생물로 발효시킨 로즈마리의 동결건조 수율은 Table 2에 나타내었다. 로즈마리 발효물의 수율은 BS 발효군이 53.64%로 가장 높게 나타났고 LP(52.81%), SC(52.41%), LB(51.73%), LC(34.17%), control(15.61%) 순으로 높은 수율을 보였으며 무발효 대조군인 control에 비해 로즈마리 발효군의 수율이 증가하는 경향을 보였다. 이는 Lee와 Yook(2023)의 눈개승마를 여러 유용 균주를 이용하여 발효한 연구에서 발효군의 수율이 가장 높게 나타났다는 보고와 일치하였고 눈개승마 발효군의 수율이 증가한 이유는 발효 과정 중 균주로부터 유도되는 여러 효소에 의해 대사산물 생성량이 증가한 것과 관련이 있을 것으로 추측된다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 로즈마리 발효군의 수율이 증가한 이유 또한 각 미생물이 로즈마리 내 유기화합물의 분해를 유도하여 여러 분해 산물이 생성된 것에 영향을 받은 것으로 판단된다.

Table 2 . The yield of fermented Rosmarinus officinalis L. extracts by various microorganism.

Samples1)	Yield (%)
Control	15.61
BS	53.64
SC	52.41
LC	34.17
LB	51.73
LP	52.81

¹⁾Control, non-fermented Rosmarinus officinalis L.; BS, Bacillus subtilis; SC, Saccharomyces cerevisiae; LC, Lacticaseibacillus casei; LB, Levilactobacillus brevis; LP, Lactiplantibacillus plantarum..

로즈마리 발효물의 배양 특성

로즈마리 발효 정도를 확인하기 위해 미생물별 24시간 발효시킨 로즈마리 발효액의 배양 특성 결과를 Table 3에 나타냈다. Hur 등(2014)은 발효 중 미생물에 의한 pH 변화가 식품 성분의 세포벽 분해 정도에 영향을 미치고 페놀성 화합물의 함량 및 구조의 변화를 유도하여 항산화 활성에 영향을 미칠 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서 control의 pH는 5.66±0.01로 나타났고 발효군의 pH는 4.44~4.83 범위를 보여 로즈마리 발효 시 control에 비해 pH가 감소하는 것으로 나타났다(P<0.05). 이에 따라 모든 발효군에서 미생물의 유기물 분해작용이 발생하여 다양한 유기산 및 아미노산의 함량이 증가한 것으로 사료되며 발효가 잘 진행된 것으로 판단된다(Jin 등, 2007).

Table 3 . pH value, turbidity, and viable cell count in the broth of fermented Rosmarinus officinalis L. extracts by various microorganism.

Samples1)	pH	Turbidity2)	Viable cell count (log CFU/mL)
Control	5.66±0.01a3)4)	0.32±0.00e	－
BS	4.81±0.01c	0.38±0.01d	7.24±0.01e
SC	4.83±0.01b	0.42±0.00c	7.97±0.05b
LC	4.44±0.01f	0.45±0.00a	9.23±0.02a
LB	4.74±0.00d	0.38±0.00d	7.68±0.06d
LP	4.67±0.00e	0.43±0.00b	7.77±0.03c

¹⁾Samples are the same as in Table 2..

²⁾Turbidity measurement based on OD₆₀₀ in the broth of Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara extracts fermented by microorganism..

³⁾Mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different letters in a column differ significantly (P<0.05)..

로즈마리 발효물의 혼탁도 분석 결과 control은 0.32±0.00으로 나타났고 발효군의 혼탁도는 0.38~0.45의 범위를 보여 로즈마리 발효 시 혼탁도가 유의적으로 증가했음을 확인하였다(P<0.05). 따라서 발효 균주의 성장과 함께 흡광도에 영향을 주는 부유 물질의 함량이 증가한 것으로 사료된다. 발효군의 혼탁도는 LC 발효물에서 0.45±0.00으로 가장 높게 나타났고 LP(0.43±0.00), SC(0.42±0.00), LB(0.38±0.00), BS(0.38±0.01) 순으로 높은 혼탁도 값을 보였으며, 이 중 LB와 BS 발효군 간의 유의적인 차이는 없었다. Lee 등(2013b)은 효모의 종류를 달리하여 복분자를 발효했을 때 발효 균주에 따라 혼탁도 값의 차이가 발생했는데 이는 효모 종류에 따라 대사 물질, 응집성 등이 다르기 때문에 발효액 중에 있는 혼탁물질의 침전속도에 차이가 발생한 것이라 보고했으며, 본 연구 결과 또한 각 미생물의 대사 특성에 영향을 받아 발효군 내 혼탁도 차이가 발생한 것으로 사료된다.

로즈마리 발효물이 미생물 생장에 영향을 미치는 정도를 판단하기 위해 로즈마리 발효액의 생균수를 측정했으며, 각 발효물의 생균수는 7.24~9.23 log CFU/mL로 나타났다. LC 발효군이 9.23±0.02 log CFU/mL로 가장 높았으며 이어서 SC(7.97±0.05 log CFU/mL), LP(7.77±0.03 log CFU/mL), LB (7.68±0.06 log CFU/mL), BS(7.24±0.01 log CFU/mL) 순으로 높은 생균수를 보였다. Kurmann과 Rasic(1991)은 체내에서 유용한 성분을 생성하기 위한 프로바이오틱스의 최소 미생물 개체 수는 10⁵ CFU/mL 이상이어야 한다고 보고했으며, 본 연구에서는 모든 발효군에서 7 log CFU/mL 이상의 생균수를 보여 로즈마리 발효 과정 중 미생물 생장이 활발하게 진행되었음을 확인하였고 유용 균주들의 생장에 의해 다양한 생리활성 물질이 생성될 가능성이 있을 것으로 사료된다.

총당 및 환원당 함량

미생물별 로즈마리 발효물의 총당 및 환원당 측정 결과는 Table 4에 나타냈다. Control의 총당 함량은 29.27±0.19 GE mg/100 mg으로 나타났고 발효군은 53.88~90.21 GE mg/100 mg 범위를 보여 로즈마리를 발효했을 때 총당 함량이 전반적으로 증가하는 경향을 보였다(P<0.05). 환원당 함량 또한 control이 31.74±0.17 GE mg/100 mg으로 가장 낮게 나타났고 발효군은 43.56~70.70 GE mg/100 mg 범위를 보여 발효 시 환원당의 함량이 유의하게 증가한 것으로 확인하였다(P<0.05). 발효물 중 LC 발효군의 총당과 환원당 함량이 각각 53.88±0.22 GE mg/100 mg, 43.56±0.42 GE mg/100 mg으로 가장 낮았고 SC 발효군의 총당과 환원당 함량이 각각 90.21±0.28 GE mg/100 mg, 70.70±0.29 GE mg/100 mg으로 가장 높게 나타났는데, 이는 로즈마리 발효물의 pH 결괏값과 동일한 경향을 보였다. LC, SC 균주는 발효 과정 중 amylase 효소를 활성화하고 전분질 원료를 당화시키는 것으로 알려져 있는데(Hur 등, 2014; Park 등, 2010), 본 연구 결과 당 함량에서 차이가 발생한 이유는 LC 균주가 로즈마리 내 탄수화물을 분해함과 동시에 당분을 발효 기질이나 영양원으로 이용하였기 때문에 이에 따라 유기산 등의 분해 대사산물 생성량이 증가하여 pH와 당 함량이 다른 발효군에 비해 낮게 나타난 것으로 사료되며(Lee 등, 2013a), SC 균주의 경우 로즈마리 내 탄수화물 분해에 따른 당 생성 속도가 다른 균주에 비해 비교적 빨랐기 때문에 높은 당 함량을 보인 것으로 추정된다. 로즈마리 발효 시 이러한 당 함량의 증가는 로즈마리의 감미도를 증진시켜 관능적 기호도에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 판단된다.

Table 4 . Total sugars and reducing sugars of fermented Rosmarinus officinalis L. extracts by various microorganism.

Samples1)	Total sugars (GE mg/100 mg2))	Reducing sugars (GE mg/100 mg)
Control	29.27±0.19e3)4)	31.74±0.17e
BS	84.01±0.94c	67.94±0.35c
SC	90.21±0.28a	70.70±0.29a
LC	53.88±0.22d	43.56±0.42d
LB	87.60±0.52b	68.27±0.10c
LP	87.54±0.45b	68.88±0.17b

¹⁾Samples are the same as in Table 2..

²⁾Glucose equivalent mg/100 mg..

³⁾Mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different superscripts (a-e) in a column indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

총 폴리페놀 함량

로즈마리 발효물의 균주별 폴리페놀 함량 측정 결과는 Table 5와 같으며, LC 발효군이 205.85±1.65 GAE mg/g으로 모든 발효 및 무발효군 중 유의적으로 가장 높은 값을 나타냈다(P<0.05). 로즈마리 잎에 함유된 carnosic acid와 rosmarinic acid는 로즈마리의 항산화 활성에 있어서 높은 영향을 미치는데, 이 중 carnosic acid는 소수성이 높지만 rosmarinic acid는 네 개의 -OH기와 -COOH기를 가지고 있어 물에 대한 용해도가 비교적 높다고 보고되어 있다(Rodriguez-Rojo 등, 2012). 본 연구에서 로즈마리 발효 및 무발효 추출물은 증류수를 통해 추출되었기 때문에 로즈마리 내 다양한 생리활성을 보이는 성분 중에서도 수용성 페놀 화합물인 rosmarinic acid가 주로 함유되어 있을 것으로 사료되며, 발효 균주의 생장에 따른 rosmarinic acid 함량 변화가 총 폴리페놀 함량에 큰 영향을 미쳤을 것으로 추측된다. Yang 등(2009)의 연구 결과에 따르면 레몬밤 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서는 caffeic acid와 rosmarinic acid의 비율이 비슷하게 존재하였으나 레몬밤 발효 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서는 rosmarinic acid가 주성분으로 확인되었다고 보고하였다. Park과 Kim(2020)의 보고에 따르면 유산균이 폴리페놀, 플라보노이드, 안토시아닌 등과 같은 항산화 물질의 농도를 직접적으로 증가시킬 수 없으나 유산균 발효에 의해 죽순피의 폴리페놀 함량이 증가한 이유는 죽순피가 발효되는 동안 세포의 구조가 파괴되면서 세포질 내 존재하던 수용성 항산화 물질이 방출되었기 때문으로 사료된다고 보고하였다. 본 연구에서도 발효 균주로부터 유도되는 β-glucosidase 등의 효소가 로즈마리를 구성하던 세포의 구조적 파괴를 유도하여 rosmarinic acid를 비롯한 수용성 항산화 성분들이 용출된 것으로 사료되며(Hur 등, 2014), 특히 로즈마리를 LC 균주로 발효했을 때 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 보였으므로 LC 발효물에서의 페놀 화합물 유출 속도가 비교적 높았던 것으로 추측된다. Kim 등(2016)은 어성초를 유산균으로 발효했을 때 무발효군보다 총 폴리페놀 함량이 증가하였고 균의 종류와 발효 온도에 따라 총 폴리페놀 함량에 차이가 발생했다고 보고하였는데, 본 연구에서도 발효에 사용된 균주의 특성에 따라 효소 활성에 차이가 발생했을 것으로 추측되고 이에 따라 로즈마리 내 함유된 총 폴리페놀 등의 유효성분 증감에 영향을 받았을 것으로 판단된다.

Table 5 . Total phenolic contents and total flavonoid contents of fermented Rosmarinus officinalis L. extracts by various microorganism.

Samples1)	Total phenolic contents (GAE mg/g2))	Total flavonoid contents (CE mg/g3))
Control	149.72±1.65d4)5)	55.91±1.14de
BS	159.63±1.65b	71.64±1.14b
SC	152.47±0.95c	58.53±1.14d
LC	205.85±1.65a	120.15±1.97a
LB	149.17±0.95d	54.60±1.14e
LP	154.12±0.95c	64.43±2.27c

¹⁾Samples are the same as in Table 2..

²⁾Gallic acid equivalent mg/g..

³⁾Catechin equivalent mg/g..

⁴⁾Mean±SD (n=3)..

⁵⁾Different superscripts (a-d) in a column indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

총 플라보노이드 함량

로즈마리 발효물의 균주별 총 플라보노이드 함량 측정 결과는 Table 5에 나타냈으며, LC 발효군이 120.15±1.97 CE mg/g으로 모든 발효 및 무발효군 중 유의적으로 가장 높은 함량을 보였다(P<0.05). 로즈마리 발효물의 총 플라보노이드 함량은 총 폴리페놀 함량 측정 결과와 동일한 경향을 보였으며, 따라서 로즈마리 발효 시 LB 균주를 제외한 모든 균주에서 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 평균적으로 증가하는 것을 확인하였다. Lactic acid bacteria의 발효 중에 생성된 lactic acid는 식물체에서 유리된 아미노산과 함께 각각 hydrogen bond acceptor, hydrogen bond dono로 작용하여 천연 공융용매(natural deep eutectic solvent, NADES)를 형성할 가능성이 있다고 보고되었으며, lactic acid를 기반으로 하는 NADES는 식물체 내 플라보노이드의 추출 효율을 증진한다고 알려져 있다(Agatonovic-Kustrin 등, 2022; Son과 Lee, 2022). 본 연구에서도 발효 균주에 의해 유도되는 protease에 의해 발효물 내 아미노산 생성량이 증가한 상태에서 균주의 대사에 의해 생성된 lactic acid와 작용하여 NADES를 형성했을 가능성이 있을 것으로 사료되며, 로즈마리 발효물의 총 플라보노이드 추출량 증가에 기여한 것으로 추측된다. 특히 LC 균주를 이용한 발효물은 본 연구에서 가장 높은 총 플라보노이드 함량과 가장 낮은 pH(4.44±0.01)를 보여 균주의 유기물 분해작용이 비교적 활발하게 발생했을 것으로 추측되고, 이에 따라 NADES의 형성에 필요한 lactic acid 및 아미노산의 함량이 다른 균주들에 비해 높았을 것으로 추측된다.

DPPH 라디칼 소거능

로즈마리 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과는 50% 라디칼을 소거하는 시료 농도인 IC₅₀값으로 Table 6에 나타냈다. 실험에 사용된 positive control인 ascorbic acid의 IC₅₀값은 0.017±0.000 mg/mL로 나타났으며, LC 발효군의 IC₅₀값은 0.067±0.001 mg/mL로 로즈마리 발효 및 무발효군 중 유의적으로 가장 낮은 값을 보였다(P<0.05). Park 등(2009)은 더덕을 발효시켰을 때 생더덕에 비해 DPPH 소거 활성이 약 4배 이상 증가하였고 이와 같은 전자공여능의 증가는 발효 더덕에 함유된 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량으로부터 비롯된 것으로 판단된다고 보고했으며, Kang 등(1996)은 각종 페놀성 화합물의 전자공여능을 조사한 결과 gallic acid, hydrocaffeic acid, catechin 등을 포함한 기타 페놀성 성분에서 높은 전자 공여능이 나타났다고 보고하였다. 본 연구에서도 로즈마리 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 총 폴리페놀 함량과 유사한 경향성을 나타내었으며 이에 대한 비례적 상관관계가 있을 것으로 추측된다. Nguyen 등(2021)은 로즈마리 수성 추출물에 다양한 protease와 cellulase를 첨가했을 때 rosmarinic acid의 추출 효율이 증가했는데 이는 효소가 세포벽 및 세포막을 가수분해하여 세포로부터 rosmarinic acid의 방출을 유도한 것이라고 보고하였다. 본 연구에서도 발효 균주로부터 유도되는 cellulase, proteinase, peptidase, glucosidase 등의 효소가 활성화함에 따라 rosmarinic acid 등을 비롯한 다양한 페놀 화합물이 증가하여 DPPH 라디칼 소거 활성에 영향을 미친 것으로 사료된다(Hur 등, 2014). 반면, 로즈마리 LB 발효군의 경우 control보다 낮은 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량을 나타냈다. Kim 등(2012)의 연구 결과에 따르면 포도 가공 부산물 발효 시 무발효군에 비해 전자공여능이 감소했는데, 이는 발효 시 감소한 총 폴리페놀 함량과 관련이 있을 것이며 더불어 비타민, catechin 등의 항산화 성분들이 발효 과정 중 산화된 것으로 추측된다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서도 LB 균주를 이용하여 로즈마리를 발효할 때 페놀 화합물을 비롯한 여러 항산화 성분이 산화되어 DPPH 라디칼 소거 활성에 영향을 미친 것으로 사료된다.

Table 6 . DPPH and ABTS radical scavenging activity and ferric reducing antioxidant power (FRAP) value of fermented Rosmarinus officinalis L. extracts by various microorganism.

Samples1)	DPPH radical scavenging activity IC50 (mg/mL)2)	ABTS radical scavenging activity IC50 (mg/mL)	FRAP value (mM/g)
Ascorbic acid	0.017±0.000e3)4)	0.12±0.00e	－
Control	0.092±0.001b	0.69±0.00b	1,398.28±46.22d
BS	0.091±0.001b	0.68±0.00bc	1,508.16±14.10b
SC	0.092±0.001b	0.76±0.00a	1,418.63±12.21cd
LC	0.067±0.001d	0.50±0.01d	2,330.20±61.45a
LB	0.095±0.001a	0.76±0.00a	1,386.07±14.10d
LP	0.089±0.000c	0.68±0.01c	1,463.40±7.05bc

¹⁾Samples are the same as in Table 2..

²⁾Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by interpolation of concentration inhibition curve..

³⁾Mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different letters in a column differ significantly (P<0.05)..

ABTS 라디칼 소거능

로즈마리 발효물의 ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과는 50% 라디칼을 소거하는 시료 농도인 IC₅₀값으로 Table 6에 나타냈다. 실험에 사용된 positive control인 ascorbic acid의 IC₅₀값은 0.12±0.00 mg/mL로 나타났으며, LC 발효군의 IC₅₀값은 0.50±0.01 mg/mL로 로즈마리 발효 및 무발효군 중 유의적으로 가장 낮은 값을 보였다(P<0.05). Yun 등(2020)의 연구 결과에 따르면 율무 추출물에 노루궁뎅이 균사 발효물을 첨가했을 때 ABTS 라디칼 소거능의 IC₅₀값이 3.5±0.3으로 나타나 율무 열수 추출물보다 우수한 항산화 활성을 나타냈다고 보고했으며, 본 연구 결과와 비교했을 때 발효를 통해 전자공여능이 증가한 결과는 유사했으나 로즈마리 발효물의 ABTS 라디칼 소거능이 상당히 높은 수치임을 확인할 수 있었다. 반면, 로즈마리 SC 발효군의 경우 control보다 유의적으로 낮은 ABTS 라디칼 소거능을 보여 DPPH 라디칼 소거능과는 다른 경향을 보였다. Huang 등(2005)은 DPPH 라디칼의 농도를 50% 감소시키는 EC₅₀ 농도에서 steady state로 도달하는 데 필요한 시간이 비타민 C는 1.15분, rutin은 103분으로 차이가 발생했으며, peroxyl 라디칼과 반응하는 여러 산화방지제가 DPPH와 느리게 반응하거나 활성을 나타내지 않을 수 있다고 보고하였다. ABTS 라디칼 소거능의 경우 ABTS 라디칼 존재 하에 과산화수소와 metmyoglobin의 활성화를 기반으로 항산화능이 발생하기 때문에 비교적 반응성이 높지만(Re 등, 1999), 이와 달리 DPPH 라디칼은 용매, 화합물 등 여러 요인에 의해 반응 속도에 크게 영향을 받을 수 있기 때문에 본 연구에서도 SC 균주를 통해 생성된 로즈마리 내 항산화 성분이 DPPH 라디칼보다 ABTS 라디칼과의 반응성이 더 뛰어났을 것으로 판단된다.

FRAP 활성

로즈마리 발효물의 균주별 FRAP 측정 결과는 Table 6에 나타냈다. LC 발효군의 FRAP 값은 2,330.20±61.45 mM/g으로 유의적으로 가장 높은 값을 보였고(P<0.05), BS(1,508.16±14.10 mM/g), LP(1,463.40±7.05 mM/g), SC(1,418.63±12.21 mM/g), control(1,398.28±46.22 mM/g), LB(1,386.07±14.10 mM/g) 순으로 높은 값을 보여 본 연구의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정 결과와 동일한 경향을 나타냈다. Ghafar 등(2010)은 citrus류의 항산화 활성을 측정한 결과 총 폴리페놀 함량과 FRAP 값 사이에 R²=0.9090의 강한 양의 상관관계를 나타냈다고 보고하였고, Bae 등(2019)은 명월초 LC 발효 시 FRAP 값이 발효 전 57.33±0.31에서 발효 후 139.40±1.64로 약 2.4배 증가하였다고 보고하여 본 연구 결과와 유사한 결과를 보였으며, 이러한 결과가 나타난 이유는 발효 과정 중 LC 균주로부터 유도되는 여러 효소가 항산화 활성을 나타내는 대사산물의 생성에 관여한 것으로 판단된다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서도 로즈마리 발효물 내 페놀 및 플라보노이드 화합물의 함량과 FRAP 값 간에 비례적 상관관계가 있을 것으로 추측된다.

항균 활성

균주별 로즈마리 발효물의 항균 활성을 측정한 결과는 Table 7과 같으며 모든 로즈마리 발효 및 무발효군에서 B. cereus, B. subtilis, S. Typhimurium에 대한 항균 활성은 측정되지 않았다. S. aureus는 모든 발효군에서 생육 저해환이 관찰되었으며, 항균 활성이 측정되지 않은 control과 비교했을 때 모든 로즈마리 발효군의 항균능이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(P<0.05). E. coli에 대한 로즈마리 발효군의 항균 활성을 control(1.11±0.08 mm)과 비교했을 때 BS, SC 발효군에서만 유의적인 차이가 발생했다(P<0.05). Ent. cloacae에 대한 항균 활성은 LB 발효군(2.07±0.10 mm)에서 확인되었고, 항균 활성이 측정되지 않은 control과 비교했을 때 LB 발효군의 생육 저해환이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(P<0.05). P. aeruginosa에 대한 항균 활성 측정 결과 모든 발효군에서 항균능이 확인되었으며, 저해환이 측정되지 않은 control과 비교했을 때 모든 로즈마리 발효군의 항균능이 유의적으로 증가했음을 확인하였다(P<0.05). 그람 양성균인 S. aureus와 그람 음성균인 P. aeruginosa, E. coli는 피부 상재균으로 피부 질환을 유발할 수 있는 대표적인 균주로 피부의 장벽이나 세포의 기능을 손상시키는 것으로 보고되어 있다(Jang과 Park, 2014). 본 연구에서 일부 발효군의 경우 해당 피부 상재균들의 항균 활성이 control보다 우수하게 나타나 피부 질환 유발균으로부터의 보호 효과와 화장품의 천연 방부 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. Kim 등(2009)의 보고에 의하면 유산균 발효 시 대사산물로 생성되는 acetic acid, lactic acid 등에 의해 미생물 세포 내 pH가 저하되어 생육이 억제된다고 언급하였다. 또한, Ryu 등(2011)은 유산균의 병원성 균주에 대한 항균 활성은 유기산의 증진, bacteriocin 작용뿐만 아니라 유산균 발효물의 pH가 발효 제품에 함유된 향미 성분인 diacetyl(2,3-butan edione)과 상호작용을 함으로써 유해 균주에 대한 강한 생육 억제능을 나타낸다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서도 LC, LB, LP 균주가 생산하는 acetic acid, bacteriocin 등의 성분에 의해 일부 균주의 생육이 억제된 것으로 사료된다. 반면 SC, BS 발효군은 유산균 발효군(LC, LB, LP)보다 pH 감소 폭이 낮았으나 일부 균주에 대해서는 더 높은 항균능을 보였는데, 이를 통해서 로즈마리를 발효함에 따라 camphor, α-pinene, limonene, thymol 등 항균 활성을 나타내는 성분의 증진에 긍정적인 영향을 주는 것으로 사료된다.

Table 7 . Antibacterial activities of fermented Rosmarinus officinalis L. extracts by various microorganism.

Microorganism	Size of clear zone (mm)
	Samples1)	Fraction conc. (mg/disc)2)
		10.0
Bacillus cereus	Control	－3)
	BS	－
	SC	－
	LC	－
	LB	－
	LP	－
Bacillus subtilis	Control	－
	BS	－
	SC	－
	LC	－
	LB	－
	LP	－
Staphylococcus aureus	Control	－
	BS	1.01±0.14*4)
	SC	1.09±0.08*
	LC	1.43±0.13*
	LB	1.13±0.13*
	LP	1.39±0.17*
Escherichia coli	Control	1.11±0.08
	BS	2.13±0.10*
	SC	1.65±0.13*
	LC	1.08±0.07
	LB	1.14±0.09
	LP	－
Enterobacter cloacae	Control	－
	BS	－
	SC	－
	LC	－
	LB	2.07±0.10*
	LP	－
Salmonella enterica Typhimurium	Control	－
	BS	－
	SC	－
	LC	－
	LB	－
	LP	－
Pseudomonas aeruginosa5)	Control	－
	BS	6.98±0.38*
	SC	5.07±0.83*
	LC	9.04±0.55*
	LB	5.60±0.47*
	LP	6.56±0.21*

¹⁾Samples are the same as in Table 2..

²⁾Antibacterial activities was not measured at 5.0 mg/disc concentrations except for P. aeruginosa..

³⁾Not detected: 0.00±0.00 mm..

⁴⁾Mean±SD (n=3)..

⁵⁾Antibacterial activities at 5.0 mg/disc concentration: control, not detected; BS, 2.99±0.06^*; SC, 2.13±0.07^*; LC, 5.48±0.40^*; LB, 2.50±0.11^*; LP, 2.78±0.11^*..

^*P<0.05..

아질산염 소거 활성

본 연구에서 로즈마리 발효 및 무발효군의 아질산염 소거 활성을 측정한 결과는 Table 8과 같으며, 발효 및 무발효군과 ascorbic acid의 농도는 5 mg/mL로 제조하여 실험에 사용하였다. Positive control인 ascorbic acid의 아질산염 소거 활성은 97.27±0.22%로 나타났으며, LC 발효군이 82.18±0.16%로 로즈마리 발효 및 무발효군 중 유의적으로 가장 높은 소거 활성을 보였다(P<0.05). Lee와 Choi(1993)는 catechin, morin, chlorogenic acid, luteolin, naringenin 등의 플라보노이드 화합물이 상당한 아질산염 소거 활성을 나타냈다고 보고하였고, Lee 등(2000)은 페놀 화합물이 아질산염 소거 활성에 주로 영향을 미친다고 보고하였는데 본 연구 결과 또한 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 가장 우수했던 LC 발효군이 아질산염 소거 활성 또한 유의적으로 가장 높은 수치를 나타내어 이들 간의 상관관계가 있을 것으로 추측된다. 아민류와 아질산염의 반응에 의한 니트로사민의 생성은 위 내 pH처럼 강산성의 환경에서 더욱 활성화되기 때문에 pH가 감소할수록 아질산염 소거 작용이 증가하는 경우가 많은데, Park 등(1995)은 결명자 용매 분획물의 아질산염 소거 활성을 측정했을 때 pH 1.2와 pH 3.0에서는 우수한 활성이 나타났지만, pH 4.2와 pH 6.0에서는 활성이 낮았다고 보고하여 pH 의존성이 매우 크다고 언급하였다. 본 연구에서 LB 발효군의 경우 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 control과 유의한 차이를 나타내지 않았으나(P>0.05) 아질산염 소거 활성은 control보다 유의적으로 높은 활성을 나타내어(P<0.05) 다른 경향성을 보였는데, 이는 로즈마리 LB 발효 중 생성된 유기산, 아미노산 등의 대사산물에 의해 control보다 더 낮은 pH의 환경을 조성하게 되어 아질산염 소거 작용이 더 용이하게 진행된 것으로 추측된다.

Table 8 . Nitrite scavenging ability, tyrosinase and elastase inhibition activity of fermented Rosmarinus officinalis L. extracts by various microorganism.

Samples1)	Nitrite scavenging ability (%)	Tyrosinase inhibition activity (%)	Elastase inhibition activity (%)
Positive control2)	97.27±0.22a3)4)	99.82±0.15a	81.14±1.23a
Control	61.79±1.08e	28.90±1.32e	43.80±0.60d
BS	74.31±0.59c	41.32±0.95c	47.39±0.66c
SC	70.99±0.75d	27.84±0.70e	38.51±0.46f
LC	82.18±0.16b	84.23±2.71b	53.44±0.49b
LB	70.61±1.03d	14.63±1.73f	39.69±0.40ef
LP	70.14±1.08d	34.80±1.25d	40.78±0.67e

¹⁾Samples are the same as in Table 2..

²⁾Nitrite scavenging ability: ascorbic acid, tyrosinase inhibition activity: kojic acid, elastase inhibition activity: ascorbic acid..

³⁾Mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different letters in a column differ significantly (P<0.05)..

Tyrosinase 저해 활성 평가

본 연구에서 로즈마리 발효 및 무발효군의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과는 Table 8과 같으며, 발효 및 무발효군과 kojic acid의 농도는 1 mg/mL로 제조하여 실험에 사용하였다. Positive control인 kojic acid의 tyrosinase 저해 활성은 99.82±0.15%로 나타났으며, LC 발효군이 84.23±2.71%로 로즈마리 발효 및 무발효군 중 유의적으로 가장 높은 저해 활성을 보였다(P<0.05). 다음으로 BS(41.32±0.95%), LP(34.80±1.25%), control(28.90±1.32%), SC(27.84±0.70%), LB(14.63±1.73%) 순으로 높은 저해 활성을 나타냈으며 이 중 control과 SC 발효군의 유의적인 차이는 없었다. 일반적으로 항산화 활성 및 총 폴리페놀 함량은 tyrosinase 저해능과 어느 정도 관련성이 있다고 보고되어 있고, 플라보노이드, ferulic acid, glycolic acid 등이 tyrosinase를 저해하는 데 관여하는 대표적인 화합물로 알려져 있다(Cabanes 등, 1994; Jung 등, 1995; Lee 등, 2009). 본 연구에서도 로즈마리 LC 발효군이 총 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물 함량, 항산화 활성에 있어서 모든 발효군 중 가장 우수했기 때문에 tyrosinase 억제능 또한 높은 활성을 보인 것으로 사료된다.

Elastase 저해 활성 평가

본 연구에서 로즈마리 발효 및 무발효군의 elastase 저해 활성을 측정한 결과는 Table 8과 같으며, 발효 및 무발효군과 ascorbic acid의 농도는 1 mg/mL로 제조하여 실험에 사용하였다. Positive control인 ascorbic acid의 elastase 저해 활성은 81.14±1.23%로 나타났으며 LC 발효군이 53.44±0.49%로 로즈마리 발효 및 무발효군 중 유의적으로 가장 높은 저해 활성을 보였다(P<0.05). 다음으로 BS(47.39±0.66%), control(43.80±0.60%), LP(40.78±0.67%), LB(39.69±0.40%), SC(38.51±0.46%) 순으로 높은 저해 활성을 나타냈으며 이 중 LB와 LP 발효군, LP와 SC 발효군 간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. Kang 등(2021)은 괴각을 여러 유용 균주를 통해 발효했을 때 LP 발효군을 제외한 모든 발효군에서 elastase 저해능이 무발효군보다 유의적으로 증가했으며, 발효 균주에 따라서 효소 저해 활성 정도가 달라지는 것으로 추측된다고 보고하였다. 또한 Song 등(2017)은 다래잎의 elastase 저해 활성과 총 플라보노이드 함량 간의 비례적 상관관계가 확인되어 다래잎 내 isoquercitrin, catechin 등의 플라보노이드 성분이 elastase 저해 활성에 기여하는 것으로 판단된다고 보고하여 본 연구 결과와 유사한 경향성을 보였다. 따라서 로즈마리 LC, BS 발효군의 elastase 저해 활성이 control 대비 유의적으로 증가함에 따라 피부 탄력 증진 및 노화 예방의 기능성 식품 원료로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 다양한 생리적 기능성이 입증된 로즈마리에 5종의 유용 균주를 접종하여 발효시킨 뒤 각 발효물의 배양 특성과 항산화 활성을 기존의 로즈마리 추출물과 비교 분석함으로써 발효 추출 방법을 최적화하고 향후 새로운 건강 기능성 식품의 원료로써 활용 가능성을 탐색하고자 하였다. 로즈마리 발효물의 수율은 control에 비해 전체적으로 증가하는 경향을 보였고, 로즈마리 발효군의 pH는 control에 비해 유의적으로 낮아졌는데(P<0.05), 이는 미생물의 유기물 분해작용이 발생하여 다양한 유기산 및 아미노산의 함량이 증가한 것으로 판단된다. 로즈마리 발효군의 혼탁도 측정 결과 control 대비 유의적으로 증가했는데(P<0.05), 발효 균주의 성장과 함께 흡광도에 영향을 주는 부유 물질의 함량이 증가한 것으로 사료된다. 또한 모든 발효군에서 7 log CFU/mL 이상의 생균수를 보여 로즈마리 발효 과정 중 미생물 생장이 활발하게 진행되었음을 확인하였다. 총당 및 환원당 함량 측정 결과 모든 발효군에서 control 대비 유의적으로 증가했으며(P<0.05) 이러한 당 함량의 증가는 로즈마리의 감미도를 증진해 관능적 기호도에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 판단된다. 로즈마리 발효물의 항산화 활성을 측정한 결과 일부 발효군에서 control 대비 항산화 활성이 유의하게 증가하는 것을 확인했으며, 특히 로즈마리 LC 발효군이 총 폴리페놀 함량(205.85±1.65 GAE mg/g), 총 플라보노이드 함량(120.15±1.97 CE mg/g), DPPH 라디칼 소거 활성(IC₅₀, 0.067±0.001 mg/mL), ABTS 라디칼 소거 활성(IC₅₀, 0.50±0.01 mg/mL), FRAP 활성(2,330.20±61.45 mM/g)에 있어서 모든 발효 및 무발효군 중 유의하게 가장 높은 값을 보였다(P<0.05). 로즈마리 발효물의 항균 활성 측정 결과 S. aureus, E. coli, Ent. cloacae, P. aeruginosa에 대한 생육 저해환이 일부 발효군에서 측정되었으며, E. coli에 대한 LB(1.14±0.09), LC(1.08±0.07) 발효군의 항균 활성을 제외했을 때 모든 로즈마리 발효군의 생육 저해환이 control 대비 유의적으로 증가하였다(P<0.05). 로즈마리 발효물의 아질산염 소거 활성 측정 결과 모든 발효군에서 control 대비 소거 활성이 유의하게 증가한 것으로 나타났다(P<0.05). 로즈마리 발효물의 미용 관련 효소 저해 활성을 측정했을 때 tyrosinase 및 elastase 저해 활성이 LC 발효군에서 각각 84.23±2.71%, 53.44±0.49%로 나타나 로즈마리 발효 및 무발효군 중 유의적으로 가장 높은 저해 활성을 보였다(P<0.05). 따라서 항산화, 항균 및 미용 관련 효소 저해 활성을 측정한 결과 로즈마리를 LC 균주로 발효했을 때 가장 우수한 활성을 나타내었기에 로즈마리 LC 발효 추출물이 향후 노화 예방 기능성 식품 및 화장품 소재로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 상기의 결과를 종합해볼 때 각 균주에 대한 로즈마리 발효 추출물 내 주요 생리활성 물질 함량이 발효 과정 중 변화하여 항산화 활성에 기여한 것으로 판단되며 추가적인 근거 확보를 위해 로즈마리 발효물 내 유효성분 변화량을 정량적으로 검증하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.