대장암(colorectal cancer, CRC)은 소화계에서 가장 흔한 악성종양 중 하나이다. 전 세계 대장암 발병률 및 사망률은 각각 10%와 9.4%로 상당히 높은 것으로 보고되고 있으며(Sung 등, 2021), 통계청에 따르면 우리나라 대장암 발병률은 꾸준히 증가하는 추세이다(Hong 등, 2021). 최근 들어 비정상적인 포도당 대사가 대장암 위험 증가와 관련이 있다는 많은 연구가 있다(Huang 등, 2011). 제2형 당뇨병 환자의 대장암 발병 위험은 30%에 달하며, 대장암 발병률에 대한 역학 자료의 대부분은 제2형 당뇨병의 사망률이 대장암에 의해 유발된다는 것을 시사한다(Giouleme 등, 2011). 하지만 당뇨병 환자의 고혈당증이 대장암 촉진에 관여하는 자세한 기전은 여전히 이해되지 않고 있다. 최근 잠재적으로 유용한 암 예방 및 치료에 관한 연구가 지속적으로 진행 중이다(Labianca 등, 2010). 식이인자를 이용한 암 예방은 암의 다단계 발암 중 촉진 단계에서의 개입이 가장 적절한 것으로 보고되고 있다(Joern 등, 2015). 최근 몇 년간 암 연구에서의 암 억제 전략 중 하나는 세포자연사(apoptosis) 유도를 통한 진행억제이다(Ahmed 등, 2019).

염증은 암의 다단계 발암 중 촉진 및 진행 단계의 주요 요소로 알려져 있다. Interleukin(IL)-6, tumor necrosis factor(TNF)-α는 잘 알려진 전염증성 사이토카인으로 이러한 전염증성 사이토카인의 발현에는 mitogen activated protein kinases(MAPKs)의 인산화와 nuclear factor-κB(NF-κB)의 전사가 중요하게 관여한다고 알려져 있다(Braicu 등, 2019). 또한 coxygenase-2(COX-2) 과발현 억제는 종양 세포의 세포자연사 잠재력을 향상시킬 수 있다고 보고된다(Newman 등, 2003). COX-2는 암세포 적응의 주요 단계를 조절함으로써 혈관신생에 중요한 역할을 할 수 있고(Camandola 등, 1996), NF-κB 활성화는 암화과정에서 중요한 표적이 된다(Kwon 등, 2013). Sirtuin 1(SIRT1)은 여러 신호 경로에 관여하는 히스톤 및 비히스톤 기질을 탈아세틸화함으로써 종양 형성을 촉진 또는 억제한다(Lin과 Fang, 2013). 대표적으로 레스베라트롤(resveratrol), 퀘르세틴(quercetin), 펜에틸 이소티오시아네이트(phenethyl isothiocyanate), 베툴린산(betulinic acid), 아피제닌(apigenin)과 같은 다양한 생리활성 식이인자는 여러 암세포의 세포자연사 활성화에 관여한다고 보고되고 있다(Cagnol과 Chambard, 2010).

Sargassaceae과에 속하는 갈조류(Phaeophyceae)의 속인 Sargassum은 약 400종이 존재한다. Sargassum 종은 식품 및 의약품으로 한국과 중국에서 오랫동안 사용되었다(Liu 등, 2012). 갈색 해조류인 Sargassum serratifolium은 항산화 성분인 meroterpenoids를 다량 함유하는 것으로 알려져 있다(Yende 등, 2014). Sargahydroquinoic acid(SHQA)는 S. serratifolium의 주성분 중 하나로 현재까지의 보고된 바에 따르면, SHQA는 강력한 항산화, 항염증, 항혈전 활성, 항지방 생성 및 간 보호 특성을 가진다(Catarino 등, 2023). 따라서 본 연구에서는 in vitro에서 고농도의 글루코오스를 처리한 인간 대장암 HCT116 세포에서 SHQA의 효과와 기전을 조사하고 세포 사멸을 통한 암세포 성장 억제 메커니즘을 연구하고자 하였다.

실험 재료

Human HCT116 세포는 한국세포주은행에서 구입하였고, SHQA는 전남대학교 식품영양학과 신태선 교수로부터 양도받았다. SHQA는 해양 갈조류 Sargassum incisifolium의 에탄올 추출물 중 Meroterpenoid-Rich 분획으로부터 SHQA를 분리하였다(Lim 등, 2019). Thiazolyl blue tetrazolium blue(MTT)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 1차 항체 COX-2, NF-κB p65, β-actin은 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. SIRT1에 대한 항체, histone H1은 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. BCA protein assay kit은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. 달리 명시하지 않은 다른 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich 또는 Biosesang에서 구입하였다.

HCT116 세포 배양 및 SHQA의 처리

HCT116 대장암 세포를 10% fatal bovine serum과 1% penicillin streptomycin(Welgene)을 첨가한 RPMI 1640 배지(Welgene)에서 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 실험에는 passage 5~10 사이의 세포를 사용하였다. HCT116 세포는 정상혈당(5.5 mM/L 포도당) 또는 고혈당(25 mM/L 포도당) 조건에서 배양되었고, 이 환경에서 SHQA(1.25~10 μM)를 72시간 동안 처리하였다. 세포에서 생성된 사이토카인 측정을 위해 배지를 수집하여 -80°C에 pellet 상태로 저장하였다.

세포 생존율 분석

HCT116 세포에 대한 SHQA의 세포 독성 효과는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법을 이용하여 측정하였다. HCT116 세포는 96-well plate에서 well당 1×10⁵ cells로 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 그 후 SHQA을 농도별로 처리하여 37°C 및 5% CO₂ 조건에서 72시간 동안 배양한 다음 MTT(0.5 mg/mL)를 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 배양하였다. Formazan 형성을 현미경으로 관찰한 후 모든 well의 배지를 제거하고 각 well에 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하여 formazan을 완전히 용해하였다. 그 후 ELISA reader(Biochrom)를 이용하여 흡광도 570 nm에서 측정하였다. 모든 실험은 적어도 세 번 반복되었다. 살아있는 세포의 백분율을 계산하고 각 well에 대해 평균화하였다.

단백질의 분리 및 western blot 분석

Whole cell lysates는 세포 pellet을 RIPA buffer(Biosesang) 및 protease 및 phosphate inhibitor cocktail(Thermo Fisher Scientific)로 용해하여 추출하였다. Cytoplasmic cell lysates는 10% NP-40이 포함된 lysis buffer[10 mM 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid(HEPES), 10 mM KCl, 0.1 mM thylenediaminetetraacetic acid(EDTA), 0.1 mM egta ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA), 1 mM dithiothreitol, 0.5 mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)]로 용해하여 추출하였고 nuclear cell lysates 10% NP-40이 포함된 lysis buffer(20 mM HEPES, 0.4 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 1 mM PMSF)로 재용해하여 추출하였다. 추출한 단백질은 16,343×g에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하고 분리된 상등액의 단백질은 BCA protein assay kit(Pierce)을 사용하여 단백질을 정량하였다. 이후 정량된 단백질 20~25 μg을 8~15% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) gel에 loading 시켜 전기영동하고 Tetra Cell Blotting module(Bio-Rad)을 이용하여 gel에서 membrane으로 단백질을 transfer 하였다. 그 후 membrane은 blocking buffer(5% non-fat dry milk/ 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 2시간 동안 blocking 하였다. 1차 항체반응은 PARP, pro-caspase-3, Bcl-2, Bax, NF-κB, COX-2, SIRT1을 이용하여 4°C에서 2시간 동안 반응시켰으며, 이후 tris-buffered saline with 0.1% Tween^® 20 detergent(TBST)를 사용해 10분 간격으로 2회 세척하고 2차 HRP 접합(horseradish peroxidase-conjugated) 항체와 1시간 동안 반응시킨 후 10분 간격으로 3회 세척하였다. 그 후 화학발광(western blotting luminol reagent, Santa Cruz)을 Chemidoc MP system(Bio-Rad)을 통해 측정하였다. β-Actin 또는 histone H1은 하우스키핑 단백질 및 로딩 제어로써 사용되어 gel에 대한 단백질의 균등 로딩을 확인하였다.

DAPI 염색에 의한 세포 사멸의 형태학적 평가

세포의 형태학적 변화는 4′,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride(DAPI) 염색을 통하여 측정하였다. HCT 116 세포는 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 SHQA(1.25, 2.5, 5, 10 μM)를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후 4% paraformaldehyde(PFA)를 처리하여 30분 동안 고정한 뒤 4% PFA를 제거하고 0.1% Triton X-100으로 세척하였다. DAPI(3.5 μg/mL)를 처리하여 상온에서 10분간 염색하였다. 그 후 mounting solution을 처리한 후 형광현미경(Leica Microsystems)을 이용하여 핵을 관찰하였다.

실시간 중합효소연쇄반응

총 RNA는 Trizol reagent(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 배양된 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. Omniscript RT kit(QIAGEN)을 사용하여 cDNA로 전사하였다. SYBR green-based quantitative PCR은 CFX96 Touch real-time PCR detection system과 함께 iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 96-well plate에서 수행하였다. 특정 프라이머로 NF-κB, SIRT1, IL-6, TNF-α 및 β-actin을 로딩 컨트롤로 사용하였다. 상대 발현은 2^-ΔΔCT 방법을 사용하여 β-actin 값에 대한 정상화로 계산하였다.

통계분석

각 실험은 적어도 세 번 수행되었으며, 결과는 평균±표준편차(standard deviation)로 나타내었다. 각 실험 결과의 통계적 유의성을 검토하기 위해 SPSS(version 19.0, SPSS Inc.)를 이용하여 Student’s t-test에 의하여 판정하였다. P값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다. 통계적 유의성은 P<0.05, P<0.01로 표현하였다.

고농도 글루코오스로 처리한 세포 환경에서 SHQA 처리에 의한 인간 대장암세포 증식 억제

SHQA가 고농도 글루코오스(25 mM/L glucose)로 처리한 HCT116 세포의 증식억제에 미치는 영향을 알아보기 위해서 여러 가지 농도의 SHQA(1.25~10 μM)를 72시간 동안 처리하고, MTT 분석법을 이용하여 세포 증식 억제능을 측정하였다. 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포는 SHQA의 농도 의존적으로 유의하게 세포 생존력이 억제되었다(P<0.01). 암세포를 50% 성장 억제하는 농도인 IC₅₀은 4.2 μM이었다. Lim 등(2016)의 연구에서는 HCT116 세포에 100 μg/mL 농도로 천궁 추출물을 처리하였을 때 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. Kim 등(2021)의 연구에서는 HCT116 세포에서 감태나무 뿌리 추출물을 처리하였을 때 1,016.27±259.03 μg/mL 농도에서 세포 생존율이 감소함을 확인하였다. 이와 비교하면 우리 연구에서 HCT116 세포에 처리한 SHQA의 경우 상당히 더 낮은 농도에서 암세포 증식의 억제 효능을 보였다(자료 미제시).

고농도 글루코오스로 처리한 세포 환경에서 SHQA 처리에 의한 세포자연사 유발

고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에 여러 가지 농도의 SHQA(1.25~10 μM)를 72시간 동안 처리한 후 DAPI로 염색하였다. 형광 현미경으로 관찰한 결과, SHQA에 처리되었을 때 HCT116 세포의 염색질 응축 및 세포자멸 핵 형태와 같은 세포자연사의 전형적인 형태학적 변화가 일어났다(Fig. 1A). 세포자연사는 SHQA 농도 의존적으로 유의하게 나타났다(P<0.01). 현재까지 여러 식물추출물이나 식이인자에 의해서 유발되는 세포자연사를 통한 암세포 증식 억제 연구들이 보고되고 있다. 남아메리카 라파초 나무의 추출물인 베타-lapachone이 3 μM 농도로 처리된 인간 비소폐암세포에서 막 수축, 염색질의 응축 및 DNA 단편화를 포함한 세포자연사의 많은 특징이 확인되었다(Lee 등, 2004). Hong 등(2014)의 연구에서는 HCT116 세포에 길경 추출물을 2 mg/mL 농도로 처리하였을 때 여러 세포자연사 특징을 확인하였고, 대표적으로 핵의 단편화를 관찰하였다. 이와 같은 세포자연사의 특징은 HCT116 세포 증식 억제의 주된 기전이 될 수 있다. 세포자연사의 가장 중요한 역할을 하는 것은 caspase 활성에 의한 기질 분절로 여러 천연물은 caspase의 활성을 증가시켜 암세포의 세포자연사를 유도하였다(Ye 등, 2005). Caspase는 상호 작용을 하는데, 세포자연사 하위의 effector caspase를 활성화하는 initiator caspase에는 caspase-8과 caspase-9가 있다. 이들은 서로 다른 경로에 의해 활성화되어 결과적으로 그 하위 신호인 caspase-3의 활성화로 이어져 세포자연사가 일어난다(Shi 등, 2014). 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA 처리에 의한 세포자연사 유도 관련 단백질들의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해서 SHQA(1.25~10 μM)를 72시간 동안 처리하고 단백질의 발현은 western blot 방법으로 분석하였다. 세포자연사가 유도될 때 중요한 분자로 알려진 caspase-3의 pro-form 형태인 pro-caspase-3의 활성화를 측정한 결과 Fig. 1B 및 1D와 같이 농도 의존적으로 pro-caspase-3의 활성화가 감소하였다. 또한 세포자연사가 유도될 때 caspase-3에 의해 촉매되는 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의

Fig 1. Effects of SHQA on apoptosis under high glucose-induced HCT116 cells. (A) HCT116 cells were treated with 1.25∼10 µM Sargahydroquinoic acid for 72 h and fixed with 4% paraformaldehyde. Signal quantification was assessed by fluorescence microscope; Magnification ×400. (B) HCT116 cells were treated with 1.25∼10 µM Sargahydroquinoic acid for 72 h. Protein levels were evaluated by western blot for PARP and pro-caspase-3. Equal loading of protein was confirmed by stripping the immunoblot and reprobing it for actin protein. (C) Effects of sargahydroquinoic acid on PARP protein expression under high glucose-induced HCT116 cells. (D) Effects of sargahydroquinoic acid on pro-caspase-3 protein expression under high glucose-induced HCT116 cells. β-actin was used as an internal control. The volume at control group was set at 1-fold and the ratio of the normalized fold change was relatively calculated and quantified. Results are mean±SD of triplicate experiments. ^##P<0.01 compared with NG, ^**P<0.01 compared with HG. NG (5.5 mM/L glucose): normoglycemic condition, HG (25 mM/L glucose): hyperglycemic condition, SHQA: sargahydroquinoic acid, PARP: poly (ADP-ribose) polymerase.

절단에 미치는 영향을 알아보기 위해서 89 kDa의 cleaved PARP(cPARP)의 발현을 조사하였다. Fig. 1C와 같이 cPARP의 발현은 SHQA 처리에 의해 농도 의존적으로 그 발현이 유의하게 줄어들었다(P<0.01). 이러한 결과는 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA 처리가 용량 의존적으로 pro-caspase-3를 활성화하여 PARP의 절단(cleavage)을 유도함을 보여준다. Kim 등(2010)의 연구에서도 HCT116 세포에서 fucoidan 추출물 처리에 의한 PARP 절단 유도를 확인하였다. George 등(2016) 연구에서는 흑색종 및 폐암세포에서 열대 산딸기추출물 처리에 의해 caspase-3 활성화가 증가함을 확인하였다. Reddivari 등(2007)의 연구에서는 감자추출물 중 안토시아닌 분획물을 처리한 전립선암세포에서 caspase-3의 활성화와 PARP의 절단이 유도됨을 확인하였다. 즉, 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA에 의해 pro-caspase-3 활성이 증가하고, 이는 PARP의 절단을 유발하였으며, 결과적으로 세포자연사가 유도됨을 보여준다.

고농도 글루코오스로 처리한 세포 환경에서 SHQA 처리에 의한 Bax와 Bcl-2의 단백질 발현 조절

Bcl-2 family는 미토콘드리아 막 투과성을 조절하는 단백질로 미토콘드리아 막에 존재하거나 막으로 이동하여 세포자연사를 조절하는 중요한 역할을 한다(de Moraes 등, 2007). Pro-apoptotic 단백질인 Bax는 미토콘드리아의 막 투과성을 증가시키고 cytochrome c 방출이 증가하여 세포자연사를 유도한다(Zhang 등, 2017). 반면, anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2는 pro-apoptotic 단백질과 heterodimer를 형성하여 pro-apoptitic 단백질 활성을 억제하여 세포자연사를 저해하는 것으로 보고되고 있다(Salakou 등, 2007). 따라서 Bcl-2와 Bax의 단백질 발현 정도를 확인하기 위하여 western blot을 이용하여 분석하였다. Fig. 2와 같이 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA를 농도별로 처리하였을 때 Bcl-2 단백질 발현은 농도 의존적으로 감소하였고 Bax의 발현 수준은 증가하는 것을 확인하였다. 우리 연구와 유사하게 Guon 등(2015) 연구에서는 Kigelia africana 및 Moringa oleifera 추출물의 농도가 증가할수록 Bcl-2의 발현 수준은 감소하고 Bax의 발현 수준은 증가함을 확인하였다. 이를 통해 SHQA는 미토콘드리아의 막 투과성을 조절하는 단백질인 Bax/Bcl-2 발현 수준을 증가시키고 세포자연사의 특징을 유발하는 것으로 보인다.

Fig 2. Effects of SHQA on Bcl-2 and Bax gene expression under high glucose-induced HCT116 cells. (A) HCT116 cells were treated with 1.25∼10 µM Sargahydroquinoic acid for 72 h. Protein levels were evaluated by western blot for Bcl-2 and Bax. Equal loading of protein was confirmed by stripping the immunoblot and reprobing it for actin protein. (B) Effects of sargahydroquinoic acid on Bcl-2 gene expression under high glucose-induced HCT116 cells (C) Effects of sargahydroquinoic acid on Bax gene expression under high glucose-induced HCT116 cells β-actin was used as an internal control. The volume at control group was set at 1-fold and the ratio of the normalized fold change was relatively calculated and quantified. Results are mean±SD of triplicate experiments. ^##P<0.01 compared with NG, ^**P<0.01 compared with HG. NG (5.5 mM/L glucose): normoglycemic condition, HG (25 mM/L glucose): hyperglycemic condition, SHQA: sargahydroquinoic acid.

세포 내 SHQA 처리에 의한 고농도 글루코오스로 인한 전염증성 사이토카인 분비 감소 및 NF-κB 활성화 유도 억제

SHQA가 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 NF-κB 및 COX-2 단백질의 과발현을 억제하는지를 확인하기 위해 western blot을 이용하여 분석하였다. Fig. 3과 같이 TNF-α, IL-6 mRNA 및 COX-2 단백질 발현 수준은 SHQA를 처리하지 않은 대조군에 비해 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA 처리로 감소하였다. 면역과 염증 반응을 조절하는 전사인자인 NF-κB는 세포의 증식, 세포자연사 및 염증 등에 관여하는 유전자의 발현을 조절한다. 이러한 NF-κB의 과도한 활성화는 암을 포함한 다양한 질병 유발과 연관되어 있다(Kim 등, 2021). 최근 여러 연구에서 암세포의 악성종양으로의 진행 과정에서 전염증성 사이토카인의 과발현이 보고되고 있다(Morris 등, 2022). 예를 들어 난소암 세포는 전염증성 사이토카인인 IL-6 등 종양 형성을 촉진하는 사이토카인을 지속적으로 분비하고(Browning 등, 2018) 유방암 세포에서 암세포의 증식과 침입을 자극하는 IL-1, IL-6, IL-11 및 TGF-β 등의 분비가 증가하였다(Esquivel-Velázquez 등, 2015). 따라서 염증 및 암을 치료하기 위해서는 전염증성 사이토카인의 분비량을 감소시키는 것이 중요하다. Kartini 등(2017)의 연구에서 Plantago major 추출물 처리로 lipopolysaccharide에 노출된 대식세포의 암세포 증식 및 사이토카인 생성이 억제됨을 확인하였다. Fig. 4를 보면 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA를 처리하면 농도 의존적으로 NF-κB 활성화가 감소하였다. 그에 따라 전염증성 사이토카인 분비가 억제된다. 즉, SHQA는 고농도 글루코스로 처리되어 과도하게 발현되는 염증을 억제함으로써 HCT116 세포의 암세포 증식을 조절할 수 있음을 보여주었다.

Fig 3. Effects of SHQA on Cox-2, IL-6, and TNF-α expression under high glucose-induced HCT116 cells. (A) HCT116 cells were treated with 1.25∼10 µM Sargahydroquinoic acid for 72 h. Protein levels were evaluated by western blot for COX-2. Equal loading of protein was confirmed by stripping the immunoblot and reprobing it for actin protein. (B) Effects of sargahydroquinoic acid on COX-2 gene expression under high glucose-induced HCT116 cells β-actin was used as an internal control. (C) The expression of the IL-6 mRNA in high glucose-induced HCT116 cells was evaluated. (D) The expression of the TNF-α mRNA in high glucose-induced HCT116 cells was evaluated. HCT116 cells were treated with 1.25∼10 µM sargahydroquinoic acid for 72 h. Values were analyzed by the 2^-∆∆CT method. Significance was determined by comparison with β-actin normalized 2^-∆∆CT values. Data represent the means±SD. ^##P<0.01 compared with NG, ^*P<0.05, ^**P<0.01 compared with HG. NG (5.5 mM/L glucose): normoglycemic condition, HG (25 mM/L glucose): hyperglycemic condition, SHQA: sargahydroquinoic acid.

Fig 4. Effects of SHQA on NF-κB expression under high glucose-induced HCT116 cells. (A) HCT116 cells were treated with 1.25∼10 µM Sargahydroquinoic acid for 72 h. Protein levels were evaluated by western blot for NF-κB. Equal loading of protein was confirmed by stripping the immunoblot and reprobing it for actin protein. (B) Effects of sargahydroquinoic acid on NF-κB gene expression under high glucose-induced HCT116 cells β-actin was used as an internal control. β-actin was used as an internal control. The volume at control group was set at 1-fold and the ratio of the normalized fold change was relatively calculated and quantified. (C) The expression of the NF-κB mRNA in high glucose-induced HCT116 cells was evaluated. Results are mean±SD of triplicate experiments. Values were analyzed by the 2^-∆∆CT method. Significance was determined by comparison with β-actin normalized 2^-∆∆CT values. ^##P<0.01 compared with NG, ^**P<0.01 compared with HG. NG (5.5 mM/L glucose): normoglycemic condition, HG (25 mM/L glucose): hyperglycemic condition, SHQA: sargahydroquinoic acid.

고농도 글루코오스로 처리한 세포 환경에서 SHQA 처리에 의한 SIRT1 발현 수준 증가

SIRT1은 핵에 존재하는 단백질로 NAD-의존성 탈아세틸화 효소의 활성을 가지고 있다. 이를 통해 여러 단백질을 탈아세틸화하여 세포 성장, 노화, 죽음, 대사, DNA 손상 복구 등 세포 기능을 조절한다(Luo 등, 2000). SIRT1은 염증을 유발하는 NF-κB 신호 전달 경로 활성화를 차단한다(Kauppinen 등, 2013). 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA 처리에 의한 SIRT1의 활성을 확인하기 위하여 western blot을 이용하여 분석하였다. 핵 내 SIRT1 발현 수준은 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 감소하였다. 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에 SHQA를 처리하면 SIRT1의 핵 내 발현이 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 5). 우리의 연구와 유사하게 Zhao 등(2016) 연구에서는 야관문 추출물을 HT-29 인간 대장암 세포에 처리한 결과 항염증 및 항암과 관련된 단백질인 SIRT1 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 즉, SHQA는 항염증과 항암 관련 기전에 관여하는 SIRT1의 발현을 증가시킴으로써 암세포 증식 억제에 관여함을 알 수 있었다.

Fig 5. Effects of SHQA on SIRT1 gene expression under high glucose-induced HCT116 cells. (A) HCT116 cells were treated with 1.25∼10 µM Sargahydroquinoic acid for 72 h. Protein levels were evaluated by western blot for SIRT1. Equal loading of nuclear protein was confirmed by stripping the immunoblot and reprobing it for actin protein. (B) Effects of sargahydroquinoic acid on SIRT1 (cytosol) gene expression under high glucose-induced HCT116 cells β-actin was used as an internal control. (C) Effects of sargahydroquinoic acid on SIRT1 (nuclear) gene expression under high glucose-induced HCT116 cells β-actin was used as an internal control. (D) Effects of sargahydroquinoic acid on SIRT1 (whole) gene expression under high glucose-induced HCT116 cells β-actin was used as an internal control. β-actin was used as an internal control. The volume at control group was set at 1-fold and the the normalized fold change was relatively calculated and quantified. Results are mean±SD of triplicate experiments. (B) Values were analyzed by the 2^-∆∆CT method. Significance was determined by comparison with β-actin normalized 2^-∆∆CT values. ^##P<0.01 compared with NG, ^**P<0.01 compared with HG. NG (5.5 mM/L glucose): normoglycemic condition, HG (25 mM/L glucose): hyperglycemic condition, SHQA: sargahydroquinoic acid.

고농도 글루코오스로 처리한 세포 환경에서 SHQA 처리에 의한 MAPKs의 인산화 억제

MAPKs의 3가지 주요 그룹은 extracellular signal-regulated kinase(ERK), c-Jun N-terminal kinase/stress-activated kinase(JNK)과 p38 kinase(p38)로 포유동물 세포 내 발견된다(Lee 등, 2015). 각각의 그룹은 다양한 세포 외부의 자극과 스트레스에 의해 세포 내부의 경로가 변화할 수 있도록 조절하는 단백질들을 가지고 있다(Choi, 2020). 그중 ERK는 세포 생존과 증식에 관여하는 대표적인 신호전달 분자이다(Fang과 Richardson, 2005). 현재 많은 연구에서 MAPK의 다양한 역할이 연구되고 있고(Timofeev 등, 2024), 그중 ERK의 활성화는 질병에 발병, 진행 및 비정상적인 세포 증식에 관여한다는 증거가 많이 보고되고 있다(Guo 등, 2020).

현재의 연구에서는 HCT116 세포에 고농도 글루코오스로 처리하였을 때 ERK의 활성 형태인 p-ERK 발현수준이 증가하였으나, 식이인자 SHQA 처리로 p-ERK의 발현이 억제되었다(Fig. 6). 또한 세포의 스트레스 반응 및 사멸에 관여하는 JNK는 SHQA(5 μM 이상) 처리로 활성화됨을 확인하였다. Park과 Park(2021)의 연구에서는 전통 한의학에서 사용되는 Morus alba L.의 뿌리껍질의 디클로로메탄 추출물이 농도 의존적으로 ERK, JNK, p38을 포함하는 MAPKs의 인산화를 조절한다는 것을 확인하였다. 우리의 연구에서는 SHQA 처리가 p-ERK 발현을 저해함으로써 JNK의 활성화를 증가시켜 고농도 글루코오스로 처리한 대장암 HCT116 세포의 성장을 감소시키고 세포자연사를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.

Fig 6. Effects of SHQA on phosphorylation of MAPK under high glucose-induced HCT116 cells. HCT116 cells were treated with 1.25∼10 µM Sargahydroquinoic acid for 72 h. Protein levels were evaluated by western blot for p-ERK, p-JNK. Equal loading of nuclear protein was confirmed by stripping the immunoblot and reprobing it for actin protein. β-actin was used as an internal control. The volume at control group was set at 1-fold and the ratio of the normalized fold change was relatively calculated and quantified. Results are mean±SD of triplicate experiments. ^##P<0.01 compared with NG, ^**P<0.01 compared with HG. NG (5.5 mM/L glucose): normoglycemic condition, HG (25 mM/L glucose): hyperglycemic condition, SHQA: sargahydroquinoic acid.

본 연구에서는 인간 HCT116 세포를 SHQA(1.25, 2.5, 5, 10 μM)의 부재 또는 존재 하에 정상혈당(5.5 mM/L glucose) 및 고혈당(25 mM/L glucose) 조건에서 배양하였다. 세포자연사의 형태학적인 특징을 관찰하기 위해 DAPI staining 한 결과, 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA의 용량 의존적으로 세포자멸 핵과 같은 핵 형태의 변화가 관찰되었다.

세포자연사 관련 인자인 pro-caspase-3, Bcl-2, Bax의 단백질 발현과 암의 발암 과정 중 촉진 및 진행 단계에서의 주요 요소로 알려지는 염증 매개 인자인 COX-2, NF-κB, SIRT1, p-ERK, p-JNK의 단백질 발현 정도를 측정하였다. 그 결과 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 SHQA 처리가 용량 의존적으로 pro-caspase-3를 활성화하고 PARP의 절단을 유도하며 세포자연사를 억제하는 단백질인 Bcl-2 수준이 하향 조절되고 세포자연사를 촉진하는 단백질인 Bax 수준이 상향 조절됨을 확인하였다. 또한 SHQA 처리로 NF-κB 및 COX-2 단백질의 과발현이 억제되었다. 또한 SHQA 처리로 TNF-α, IL-6 mRNA 단백질 발현 수준은 감소하였으며, 이의 상위기전으로 SHQA 처리가 p-ERK 발현을 저해하고 JNK의 활성화를 증가시켜 고농도 글루코오스로 처리한 대장암 HCT116 세포의 성장을 감소시키고 세포자연사를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. 종합하면 본 연구에서는 SHQA 처리에 따라 고농도 글루코오스로 처리한 HCT116 세포에서 세포자연사를 통한 암세포 증식억제가 유도됨을 확인하였다. 이 연구 결과에 기초하여 SHQA가 인간 암세포에 대한 화학적 예방 및 가능한 치료제로서 개발에 대한 강력한 잠재력을 가질 수 있음을 제안하고자 한다.