염증은 세균 및 바이러스 감염, 손상된 세포, 독성 화합물 등과 같은 유해한 자극에 대한 신체의 필수적인 생물학적 보호 반응이다(Chen 등, 2018; Zhao 등, 2023). 그러나 염증반응의 조절이 제대로 이뤄지지 않는다면 심장, 간, 폐, 장관, 피부 등 신체 전반에서 급성 및 만성 염증 반응이 일어나고 잠재적으로 조직 손상이나 질병이 유발될 수 있다(Chen 등, 2018).

이러한 과도한 염증은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 같은 염증 매개체의 통제되지 않는 생성을 유도하여 산화 스트레스를 일으키고, 이는 염증과 관련된 다양한 전사인자들을 활성화한다(Sul과 Ra, 2021). 그중 nuclear factor-kappa B(NF-κB) 전사인자의 과도한 활성은 전염증성 유전자 발현에 중요한 역할을 한다(Wright와 Christman, 2003). p65와 p50으로 이루어진 NF-κB는 I kappa B(IκB)와 결합하여 세포질에서 비활성 상태로 존재하다가(Tak과 Firestein, 2001), 유해한 자극에 의해 노출되어 ROS 생성이 증가하면, I kappa B kinase(IKK)가 활성화되어 NF-κB와 IκB 복합체의 분해가 유도된다(Tak과 Firestein, 2001). 활성화된 IKK로부터 인산기를 전달받은 IκB는 degradation 되고, 활성화된 NF-κB는 핵으로 이동하여 inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2)와 같은 염증 매개체를 생성한다(Khan과 Khan, 2018). iNOS와 COX-2는 대식세포에서 산화질소(nitric oxide, NO), prostaglandin E₂(PGE₂)를 합성하지만 과도한 발생은 비정상적인 염증을 유도한다(Hwang 등, 2019). 따라서 과도한 염증을 억제하기 위해서는 산화 스트레스를 비롯하여 NF-κB 전사인자의 활성으로 인해 유도되는 염증 신호 전달 경로를 저해하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 이러한 NF-κB 전사인자의 활성과 그로 인해 생성되는 염증 인자의 발현을 확인하기 위한 모델로 마우스 유래 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하였다.

염증성 질환은 최근 전 세계 사망률 및 질병률 통계에 큰 비율을 차지하고 있다(Olajide와 Sarker, 2020). 하지만 현재 처방 가능한 항염증제는 효능이 입증되었음에도 여러 가지 생리학적 부작용을 유발한다는 한계점을 갖는다(Olajide와 Sarker, 2020). 이러한 한계를 대처하기 위해 안전하게 섭취가 가능한 천연 항염증제의 필요성이 더욱더 대두되고 있다.

Zanthoxylum myriacanthum Wall. ex Hook. f.는 동부 히말라야, 중국 남부, 서부 및 중앙 말레이시아에 자생하며, 주로 아열대 기후에서 자라는 목본 식물이다. Z. myriacanthum Wall. ex Hook. f.는 중국 및 동남아시아 국가에서 약용 또는 요리 조미료로 광범위하게 활용되고 있다(Li 등, 2014). Z. myriacanthum의 변종 중 하나인 Z. myriacanthum var. pubescens의 경우 중국의 전통 약초로 사용되어 왔으며, 잎, 줄기 및 나무껍질의 추출물은 항염증 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Zhang 등, 2017). 그러나 Z. myriacanthum Wall. ex Hook. f.의 항염증 및 항산화 활성에 대해서는 여전히 보고된 바 없으며, 국내에서의 채집 및 활용 사례 또한 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 소재의 효능 규명 및 건강기능식품으로서의 활용 가능성에 대한 입증이 필요한 실정이다.

본 연구는 Z. myriacanthum Wall. ex Hook. f. 추출물(ZME)이 RAW264.7 쥐 대식세포에서 LPS에 의해 증가한 산화 스트레스, NF-κB 전사인자의 활성, iNOS 발현, NO의 생성을 억제할 수 있는 항염증 및 항산화 건강기능식품 소재로써 활용될 수 있는지 평가하였다.

재료 및 시약

Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM) 배지, 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 항생제(penicillin/streptomycin solution)는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. β-Actin 1차 항체는 Santa Cruz Biotech에서 구입하였다. iNOS, COX-2, IκBα, phospho-IκBα(Ser32), IKKα, phospho-IKKα/β(Ser176/180), NF-κB p65, phospho-NF-κB p65(Ser536) 1차 항체는 Cell Signaling Technologies에서 구입하였다. Pierce Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Pierce Goat Anti-Mouse IgG(H+L) 2차 항체는 Thermo Fisher Scientific Inc.에서 구입하였다.

샘플 준비 및 추출

본 연구에 사용된 식물 추출물(FBM076-019)은 베트남 Cao Bằng Nguyên Bình Phan Thanh에서 분양받았으며, 식물 샘플은 Institute of Ecology and Biological Resources의 Tran The Bach 박사가 수집하고 검증했다. VK 2290으로 기록된 바우처 표본은 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology) 식물표본관에 기탁되었다. 수집된 Z. myriacanthum Wall. ex Hook. f.의 잎, 줄기, 꽃 부분을 분쇄한 후 그늘에서 건조하여 분말화한 식물(65 g)을 99.9% 메탄올(MeOH, HPLC grade) 1 L에 첨가하였다. 초음파 추출기(SDN-900H, SD-Ultrasonic Co., Ltd.)를 사용하여 상온에서 120분 정치/사이클의 30사이클(40 kHz, 1,500 W, 15분 초음파)을 거쳐 추출하였고, 여과(Qualitative Filter No.100, Hyundai Micro Co., Ltd.) 후 감압 건조하였다. 65 g의 분쇄 시료 중 최종 추출물의 양은 2.73 g이었으며, 추출 수율은 4.2%였다.

세포 배양

마우스 유래 대식세포인 RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Research Foundation)에서 구입하였다. RAW264.7 대식세포는 10% FBS와 1% streptomycin/penicillin이 보충된 DMEM 배지에 배양하였으며, 37°C, 5% CO₂의 배양 조건을 유지해 주었다.

세포 독성 평가

RAW264.7 대식세포를 96-well plate에 3×10⁵ cells/mL 농도로 well당 100 μL씩 분주한 뒤, 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후 ZME를 25, 50, 100 μg/mL 농도로 well당 100 μL씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포에 10 μL의 thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT, Sigma Aldrich)를 5 mg/mL 농도로 처리하고 2시간 동안 배양하였다. MTT 시약을 2시간 동안 처리한 후, well당 80 μL의 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide(Sigma Aldrich) 시약을 well당 100 μL 분주하였다. 빛을 차단하여 30분 동안 암반응 시켜준 뒤 microplate reader(Molecular Devices)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Nitric oxide 측정

그람 음성균의 세포벽에서 유래된 LPS는 대표적인 염증 유발 인자이다(Wang 등, 2014). LPS는 RAW264.7 대식세포에서 과도한 NO 생성을 유도함으로써 염증반응을 일으킨다(Kim 등, 2020). RAW264.7 대식세포를 96-well plate에 3×10⁵ cells/mL 농도로 well당 200 μL 분주한 뒤, 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후 ZME를 25, 50, 100 μg/mL 농도로 well당 200 μL씩 처리하여 1시간 동안 배양하였다. ZME를 1시간 전처리한 후, 1 μg/mL 농도의 LPS를 well당 200 μL 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상층액 100 μL와 농도별(0~100 μM)로 희석한 sodium nitrite(Sigma Aldrich)에 0.2% N-(1-naphthyl)-ethylenediaminedihydrochloride(Tokyo Chemical Industry Co.)와 5% phosphoric acid(Sigma Aldrich) 속 1% sulfanilamide(Sigma Aldrich)가 포함된 griess 시약을 100 μL 처리하였다. 이를 30분 동안 반응시킨 후 microplate reader(Molecular Devices)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별 sodium nitrite의 흡광도는 NO의 표준 곡선으로 이용하였다.

Western blot을 통한 단백질 발현 분석

RAW264.7 대식세포를 6-well plate에 3×10⁵ cells/mL 농도로 well당 3 mL 분주한 뒤, 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 ZME를 25, 50, 100 μg/mL 농도로 1시간 전처리한 뒤 LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

배양 후에는 plate를 얼음 위에 올려 두고 배지를 제거하였다. 멸균된 phosphate-buffered saline(PBS)으로 두 번 씻어준 뒤 well당 100 μL의 lysis buffer(Cell Signaling Technologies)를 분주하였다. Lysis buffer로 인해 용해된 세포들을 약하게 긁어내어 각각 microcentrifuge-tube에 담아주었다. 이후 15초간 vortexing 하고 10분 동안 얼음에 꽂아 두기를 세 번 반복한 뒤, 4°C, 13,572×g, 15분 조건에서 원심분리하였다. 원심분리로 얻어진 상층액을 회수하여 DC Protein Assay kit(Molecular Devices)으로 단백질을 정량하였다.

정량된 만큼의 세포 상층액, 멸균 증류수, 5× SDS-loading buffer를 혼합하여 10% acrylamide gel에 loading 하였고, 전기영동을 통해 단백질을 크기별로 분리하였다. Gel에 분리된 단백질을 1시간 동안 4°C, 230 mA 조건에서 polyvinylidene difluoride membrane(Millipore, Immobilon®-P transfer membrane)으로 이동시켰다. Membrane에서 확인하고자 하는 단백질 부분을 자른 뒤, 5% skim milk가 포함된 tris-buffered saline tween-20(TBST)으로 상온에서 1시간 동안 blocking 시켰다. 이후 단백질에 특이적인 1차 항체를 4°C에서 밤새도록 반응시켰고, 1차 항체에 특이적인 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 2차 항체와 결합하는 EzWestLumi plus 시약을 1분 이상 처리하여 단백질 발현을 측정하였다. 단백질 band는 chemiluminescence detection kit (ATTO)과 GeneGnome XRQ NPC(Syngene)를 이용해 시각화하였다.

LPS에 의해 유도된 ROS 생성 억제 활성 평가

RAW264.7 대식세포를 96-well plate에 3×10⁵ cells/mL 농도로 well당 100 μL 분주한 뒤, 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후 ZME를 25, 50, 100 μg/mL 농도로 well당 100 μL 처리하여 1시간 동안 배양하였다. ZME를 1시간 전처리한 후 1 μg/mL 농도의 LPS를 well당 100 μL 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 전체 well을 두 번 세척하였고, serum free media에 DCF-DA를 20 μM 농도로 희석하여 well당 200 μL 처리한 후 30분 동안 배양하였다. PBS로 전체 well을 한 번 세척하고 well당 200 μL의 PBS를 분주하여 microplate fluorometer(Molecular Devices)로 485~535 nm에서 형광을 측정하였다. 또한 fluorescence microscopy(Leica)와 LAS X microscope software(Leica)로 세포 내 ROS 생성 정도를 확인하였다.

ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능 측정

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS) 측정을 위해 농도별(0.0625~10 μg/mL)로 PBS에 희석한 ascorbic acid(Sigma Aldrich)와 농도별(25, 50, 100 μg/mL)로 PBS에 희석한 ZME를 각각 96-well plate에 well당 100 μL 분주하였다. 또한 ABTS 용액을 PBS에 16배 희석하여 750 nm에서의 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 한 후 전체 well에 100 μL 분주하였다. 이를 은박지로 감싼 후 상온에서 30분 반응시켰고 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 용액은 5 mg의 ABTS tablet을 7 mM 농도가 되도록 멸균 증류수에 희석한 뒤 2.45 mM 농도가 되도록 K₂S₂O₈을 첨가하여 제조하였다. 제조한 ABTS 용액은 빛 차단 후 상온에서 12~16시간 반응시킨 뒤 사용하였다. DPPH 측정을 위해 농도별(0.125~16 μg/mL)로 MeOH에 희석한 ascorbic acid와 농도별(25, 50, 100 μg/mL)로 MeOH에 희석한 ZME를 각각 96-well plate에 well당 100 μL 분주하였고, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma Aldrich)을 MeOH에 40 μg/mL로 희석한 DPPH 용액을 well에 100 μL 분주하였다. 이를 빛 차단 후 상온에서 30분 반응시켰고, microplate reader로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 ascorbic acid의 흡광도는 ABTS 및 DPPH의 표준 곡선으로 이용하였다. 또한 ABTS 및 DPPH의 라디칼 소거능은 ascorbic acid equivalent antioxidant activity(AEAC)로 나타냈고, 100 mg의 소재에 대한 ascorbic acid의 당량으로 표현하였다. AEAC는 다음과 같은 방정식으로 계산되었다.

AEAC＝(ΔA_sample/ ΔA_aa)×C_aa×V×(100/W_sample)

여기서 ΔA_sample은 ZME에 의한 흡광도 변화, ΔA_aa는 ascorbic acid 표준액에 의한 흡광도 변화, C_aa는 ascorbic acid 표준액의 농도(mg/mL), V는 ZME의 부피(mL), W_sample은 ZME의 질량(g)이다.

통계 분석

본 연구의 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타냈고 GraphPad Prism 9 software(Graph Pad)를 이용하여 표현되었다. 또한 대조군과 실험군 간의 비교는 one-way ANOVA (analysis of variance)와 t-test를 통해 수행되었으며, 통계적 유의성은 대조군과 비교하였을 때 P<0.05를 기준으로 설정하였다.

RAW264.7 대식세포에서 ZME가 NO 생산에 미치는 영향

NO는 면역 세포 및 염증 세포의 기능, 성장, 사멸을 조절하는 역할을 수행하지만(Coleman, 2001), 다량의 NO 생산은 염증을 비정상적으로 유발한다(Laroux 등, 2001). 본 연구에서는 RAW264.7 대식세포에서 1 μg/mL의 LPS에 의해 유도된 NO 생산에 대한 ZME의 효과를 평가하였다. ZME의 농도별(25, 50, 100 μg/mL) 전처리는 LPS에 의한 NO 생산을 농도 의존적으로 감소시켰다(Fig. 1A). 이를 통해 ZME는 RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증을 저해할 수 있는 소재임을 확인하였다. 또한 MTT assay 분석 결과, ZME는 처리된 모든 농도(25, 50, 100 μg/mL)에서 세포 생존능을 유의적으로 변화시키지 않았다. 따라서 25, 50, 100 μg/mL의 ZME는 RAW264.7 대식세포에 독성을 나타내지 않는다고 판단하였다(Fig. 1B).

Fig 1. The effects of ZME on LPS-induced nitrite production and cell viability in RAW 264.7 cells. (A) ZME significantly inhibited LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells in a dose-dependent manner. NO production was measured by using Griess reagent. (B) ZME did not show cytotoxicity in RAW 264.7 cells. Cell viability was measured by using MTT assay. The RAW 264.7 cells were treated with ZME at 25, 50, and 100 μg/mL in the presence or absence of LPS at 1 μg/mL for 24 h. The data represent the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 shows a significant difference compared with the control group. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 show significant differences compared with the LPS group.

RAW264.7 대식세포에서 ZME가 iNOS, COX-2 발현 수준에 미치는 영향

염증의 주요 매개체인 다량의 NO는 iNOS에 의해 합성되며(Kubes와 McCafferty, 2000), PGE₂는 COX-2에 의해 합성된다(Coon 등, 2007). 우리는 앞서 LPS 자극을 통해 NO 생산이 증가함으로써 염증반응이 유도되었음을 확인하였고, ZME의 NO 생산 저해 효능을 확인하였다. 따라서 western blot을 통해 iNOS와 COX-2 단백질 발현에 대한 ZME의 효과를 평가하였다. RAW264.7 대식세포에서 LPS 처리로 iNOS와 COX-2 발현 수준이 유의적인 차이로 증가하였으며, ZME의 전처리는 LPS 단독 처리군과 비교하였을 때 iNOS 발현 수준을 농도 의존적으로 감소시켰다. 그러나 ZME는 COX-2 발현은 증가시켰다(Fig. 2). 이러한 결과는 LPS에 의해 NF-κB 전사인자가 활성화되었을 때 iNOS와 COX-2 발현을 조절하는 promoter의 차이로 인해 나타났을 것으로 예상된다. 따라서 ZME는 RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 COX-2의 발현보다는 iNOS의 발현을 억제함으로써 염증반응을 저해하는 것으로 결론지었다.

Fig 2. The effects of ZME on LPS-induced iNOS and COX-2 expression in RAW 264.7 cells. (A) ZME significantly inhibited LPS-induced iNOS expression in RAW 264.7 cells in a dose-dependent manner. (B) Quantification of iNOS/β-actin expression. Expression of iNOS, COX-2, β-actin was detected by western blot assay. The RAW 264.7 cells were treated with ZME at 25, 50, 100 μg/mL in the presence or absence of LPS at 1 μg/mL for 24 h. The data represent the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 shows a significant difference compared with the control group. ^**P<0.01, ^***P<0.001 shows a significant difference compared with the LPS group.

RAW264.7 대식세포에서 ZME가 NF-κB 전사인자 활성에 미치는 영향

NF-κB 계열 단백질은 면역, 염증, 스트레스, 종양 발생을 비롯한 다양한 생물학적 과정을 담당하는 유전자 발현에 기여한다(Kim 등, 2010). NF-κB는 비활성 시 세포질에서 IκB와 결합된 상태로 존재하며(Ren 등, 2019), LPS에 노출되면 IKK에 의해 인산화되고 이후 분해된다(Kim 등, 2010). 이때 핵으로 들어간 NF-κB는 COX-2, iNOS와 같은 염증 매개체의 전사를 조절한다(Kumar 등, 2021). ZME가 iNOS 단백질의 발현 수준을 감소시킴을 확인하였으므로, western blot을 통해 ZME가 NF-κB 전사인자의 활성에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과, ZME는 RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 p65, IκBα, IKKα의 인산화를 유의적으로 억제하였고, LPS 처리에 의해 IκBα가 분해되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig 3. The effects of ZME on LPS-induced phosphorylation of p65, IκB, IKK in RAW 264.7 cells. (A) ZME significantly inhibited LPS-induced phosphorylation of p65 in RAW 264.7 cells. (B) ZME significantly inhibited LPS-induced phosphorylation of IκBα in RAW 264.7 cells. (C) ZME significantly inhibited LPS-induced phosphorylation of IKKα in RAW 264.7 cells. Expression of phospho-form and whole-form of p65, IκB, IKK and expression of β-actin were detected by western blot assay. The RAW 264.7 cells were treated with ZME at 25, 50, and 100 μg/mL in the presence or absence of LPS at 1 μg/mL for 30 min. The data represent the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 shows a significant difference compared with the control group. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 show significant differences compared with the LPS group.

따라서 ZME는 RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 NF-κB 전사인자의 활성을 저해하고 그로 인한 iNOS, NO의 생성을 억제함으로써 잠재적인 항염증 효능을 나타내는 것으로 사료된다.

RAW264.7 대식세포에서 ZME가 ROS 생산 및 라디칼 소거에 미치는 영향

산화 스트레스와 염증은 밀접하게 연관되어 있으며, ROS의 제거 활성이 높은 식물화학물질은 항염증 활성 또한 나타내는 것으로 알려져 있다(Sittisart와 Chitsomboon, 2014). 따라서 RAW264.7 대식세포에 DCF-DA를 처리하여 ZME가 ROS 생산에 미치는 영향을 평가하였다. LPS에 의해 유의적으로 증가한 ROS 생산은 ZME 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4A). 이는 형광 분석을 통해서도 확인할 수 있었다(Fig. 4B). 한편, 자유 라디칼은 매우 불안정한 분자로써 다른 전자와 짝을 이뤄 안정한 형태가 될 때까지 세포를 공격한다(Lee, 1999). 이러한 자유 라디칼을 소거시키는 능력이 있는 물질들은 세포 내 연쇄적인 산화반응을 억제할 수 있다(Lee, 1999). ABTS, DPPH 분석은 자유 라디칼 소거 능력을 평가하는 방법으로(Christodouleas 등, 2015), RAW264.7 대식세포에서 ABTS, DPPH 라디칼 소거능을 확인함으로써 ZME의 항산화 효능을 평가하였다. ZME는 처리된 농도에서 ascorbic acid 2~10 μg/mL만큼의 ABTS 라디칼 소거능을 나타냈으며, ascorbic acid 0.125~2 μg/mL만큼의 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈다(Fig. 5). 또한 AEAC 값은 각각 8.46±0.13 mg/100 mg, 1.77±0.15 mg/100 mg이었다(Table 1). 결과적으로 ZME는 RAW 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 증가한 ROS와 자유 라디칼을 감소시킴으로써 항산화 효능을 나타내는 소재임을 증명하였다.

Table 1 . The effects of ZME on total antioxidant activity (AEAC) in RAW 264.7 cells.

	ABTS	DPPH
AEAC (mg/100 mg)	8.46±0.13	1.77±0.15

Fig 4. The effects of ZME on LPS-induced ROS production in RAW 264.7 cells. ZME inhibited LPS-induced production of ROS in RAW 264.7 cells in a dose-dependent manner. ROS production was detected by using DCF-DA probe. The RAW 264.7 cells were treated with ZME at 25, 50, 100 μg/mL in the presence or absence of LPS at 1 μg/mL for 24 h. The data represent the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 shows a significant difference compared with the control group. ^*P<0.05 shows a significant difference compared with the LPS group.

Fig 5. The effects of ZME on radical scavenging activity in RAW 264.7 cells. ZME has significant ABTS and DPPH radical scavenging activities in dose-dependent manner. The RAW 264.7 cells were treated with ZME at 25, 50, and 100 μg/mL in the presence or absence of LPS at 1 μg/mL for 24 h. The data represent the mean±SD of three independent experiments. ^*P<0.05, ^***P<0.001 show significant differences compared with the LPS group.

우리는 LPS에 의해 과도한 염증이 유도된 RAW264.7 대식세포에서 ZME가 염증 발현 매커니즘 및 산화 스트레스에 어떤 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 특히 대표적인 염증 매개 단백질인 iNOS의 발현이 ZME 처리에 의해 상당히 감소한 것으로 나타났다. Verma 등(2012)의 연구에 따르면 100 μg/mL 농도의 소재 처리 시 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현이 약 1.5배 감소하였으나, 본 연구에서는 100 μg/mL 농도의 ZME가 그보다 더 높은 수준인 2.3배를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Nguyen 등(2020)의 연구에서 LPS에 의해 유도된 ROS 생성이 100 μg/mL 농도의 소재 처리 시 약 1.5배 감소했으나, 본 연구 결과에서는 2.1배 감소하는 경향을 보였다. 따라서 상대적으로 우수한 항산화 활성을 나타낸다고 평가하였다.

Z. myriacanthum Wall. ex Hook. f.는 중국 및 동남아시아 국가에서 전통적인 치료제 및 조미료로 사용되어 왔으나 그 효능의 과학적 증거는 불충분하였다. 이에 대해 본 연구에서는 ZME가 NF-κB 전사인자 활성으로 인해 생성되는 염증과 ROS 및 라디칼로 인한 산화 스트레스를 저해할 수 있는 소재임을 증명하였고, 나아가 건강기능식품 소재로서의 활용 가능성을 제시하고 있다.

RAW264.7 대식세포에서 ZME가 LPS에 의해 유도된 NF-κB 전사인자의 활성을 저해함으로써 iNOS 발현 및 NO 생산을 하향 조절하였다. 또한 ZME의 ROS 생산 저해와 라디칼 소거능을 확인함으로써 해당 소재가 항산화 효능을 가짐을 입증하였다. 이는 ZME가 LPS에 의해 비이상적으로 증가한 산화 스트레스와 염증을 억제하는 것으로 판단된다. 따라서 본 연구 결과는 ZME가 항염증 및 항산화 활성을 갖는 유망한 건강기능식품 소재가 될 수 있음의 근거를 제공한다. 향후 동물모델을 이용하여 ZME의 항산화 및 항염증 활성평가가 연구가 진행된다면, 더 우수한 항염증 및 항산화 소재가 될 수 있을 것이라 예상된다.

이 연구는 대한민국의 KRIBB Initiative Program과 베트남의 project đTđL.CN-72/22의 지원을 받았습니다.