인간의 신체에서 피부는 가장 바깥쪽에 존재하는데 이는 물리, 화학적 및 미생물로 인한 외부 자극에 의한 해로운 영향으로부터 인체 내 기관과 세포를 보호하는 장벽 역할을 수행하며, 혈류 조절과 수분 배출을 통해 체온 유지를 위한 기능을 수행한다(Jablonski, 2004). 하지만 지속적인 외부의 자외선 조사와 자극으로 인한 세포 내부의 미토콘드리아, 퍼옥시좀, 소포체, 막과 세포질 등에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 과도하게 발생하고 축적되어 산화적 스트레스를 유발하게 된다. 이는 피부의 자체적인 항산화 작용을 초과하여 DNA, 단백질 및 지질이 손상을 입게 된다(Rinnerthaler 등, 2015).

HaCaT 세포는 인간 피부에서 유래된 세포주이며, 각질세포(keratinocyte)의 모든 주요 표면마커와 기능 활성화가 가능하다. 자극 시 K10, K14 및 involucrin 같은 특정 마커를 분화하고 발현하며 불멸화된 세포로 피부 질환 연구 등에 다양하게 활용되고 있다(Colombo 등, 2017).

ROS는 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, O₂^-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항 산소(singlet oxygen, ¹O₂) 등을 포함하는 물질이다(Bayr, 2005). 이러한 ROS는 홀전자로 존재하여 반응성이 매우 높으므로 세포막을 구성하고 있는 지질과 단백질을 산화시키며 DNA를 손상하는 데 관여하여 노화, 세포손상을 가속화하고 여러 종류의 질병 원인이 되기도 한다(Bickers와 Athar, 2006; Imlay, 2003). 최근 이러한 ROS와 같은 산화 스트레스를 감소시켜 다양한 질병 원인을 예방하기 위한 연구가 이루어지고 있다(Shahidi와 Zhong, 2015).

식용 곤충은 오래전부터 중국, 인도 등 아시아권을 비롯한 다양한 국가에서 오랜 시간 동안 식량 또는 약용으로 활용해 왔다고 보고된다(Feng 등, 2018). 최근 지구온난화와 인구 증가로 인한 식량문제를 해결하기 위해 동물단백질을 대체하기 위한 식품 중 하나로 식용 곤충이 제시되었다(Lange와 Nakamura, 2021). 농촌진흥청과 식품의약품안전처에서 식용으로 허가한 국내의 곤충은 총 10가지가 있으며, 고단백질 소재인 식용 곤충은 다양한 아미노산을 포함하는 것으로 알려져 있다(Rumpold와 Schlüter, 2013). 식용 곤충 중 하나인 갈색거저리 유충은 곤충류 딱정벌레목 거저리과에 속하는 갈색거저리의 애벌레로 색상은 암갈색, 길이는 2.5~3.5 cm이고 무게는 ~0.2 g이다(Aguilar-Miranda 등, 2002). 갈색거저리 유충 열수 추출물은 동물단백질(닭, 달걀, 소, 돼지, 무지개송어)과 무게 단위(100 g)로 비교하였을 때 단백질 함량이 2배 이상 풍부한 아미노산을 함유하며, 다양한 미네랄과 지방산을 함유하는 것으로 알려져 있다(Siemianowska 등, 2013). 이를 기능성 소재로 활용하기 위해 유효성분 분석과 생리활성을 검증하는 등 연구들이 진행되고 있지만(Baek 등, 2017; Hong 등, 2020; Kim 등, 2022), 갈색거저리 유충 추출물이 산화 스트레스가 유도된 인간 각질세포에 미치는 영향에 관한 연구는 아직 보고된 바 없다.

따라서 본 연구에서는 갈색거저리 유충 추출물의 HaCaT 세포에서 H₂O₂로 인해 유도된 세포 사멸 보호 효과의 평가를 통하여 산화 방지 및 피부 질환 기능성 소재로서의 가능성을 확인하고자 한다.

Tenebrio molitor larvae extract 추출

실험에 사용된 갈색거저리 유충은 (주)퓨처푸드랩에서 구매하였다. 갈색거저리 유충을 동결 건조한 후 분말화하였으며, 분말 10 g에 100 mL의 ascorbic acid를 함유한 증류수(0.16% ascorbic acid)를 가하고 교반 및 가열하여 추출하였다. 추출물을 30분간 원심분리(1,977×g, 5°C)하고 추출물을 거름종이(No. 4, Whatman)로 여과한 후 동결 건조하였다. Tenebrio molitor larvae extract(TME)는 phosphate-buffered saline(PBS)으로 희석하여 실험에 사용하였다.

HaCaT 세포 배양

본 실험에 사용한 인간 피부 각질세포인 HaCaT 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium 배지(Welgene)를 세포 배양액으로 사용하였고, 10% fetal bovine serum(Gibco)과 1% antibiotics(100 unit/mL penicillin, 100 unit/mL strep-tomycin)를 첨가하여 37°C, 5% CO₂ incubator(Thermo Fisher)에서 배양하였다.

HaCaT 세포 생존율 평가

96-Well plate에 HaCaT 세포를 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주하고 37°C, 5% CO₂ 환경에서 세포를 부착시키기 위해 24시간 배양하였다. 세포가 부착된 후 TME(50, 100, 200 μg/mL)와 H₂O₂(50, 100, 200, 300, 1,000 μM)를 처리하였다. 그 후 media를 제거한 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich)를 0.5 mg/mL로 희석하여 well당 100 μL씩 첨가하고, formazan crystal이 생성되면 MTT 시약을 제거한 후 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich)로 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능

TME의 DPPH(Sigma-Aldrich) 라디칼 소거능을 측정하여 항산화 활성을 확인했다. 96-Well plate에 농도별 TME(62.5, 125, 250, 500 μg/mL)를 100 μL씩 분주한 후 메탄올을 이용하여 희석한 0.3 mM의 DPPH 용액을 100 μL씩 추가해 주었다. 20분 동안 암실에서 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 517 nm에서 흡광도 값을 측정하였다.

A_sample은 sample과 DPPH의 반응 후 흡광도를 의미하고, A_blank1와 A_blind는 각각 sample과 DPPH 용액의 단독 흡광도 값이며 A_blank2는 공시료를 나타낸다. 대조군으로 1 mM의 ascorbic acid를 이용하였다.

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거능

TME의 ABTS(Sigma-Aldrich) 라디칼 소거능을 이용하여 항산화 활성을 분석하였다. 7 mM ABTS와 140 mM potassium persulfate(Sigma-Aldrich)를 5 mL:88 μL로 섞어 암실에서 16시간 방치하여 라디칼을 형성하고, 760 nm에서 흡광도 값이 0.6~0.8이 되도록 증류수에 희석했다. 희석된 ABTS 용액 100 μL에 농도별 TME(62.5, 125, 250, 500 μg/mL)를 100 μL씩 첨가하여 30분 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 760 nm에서 흡광도 값을 측정하였다.

A_sample은 sample과 ABTS 용액이 반응하여 나타낸 흡광도를 의미하고, A_blind는 ABTS 용액의 단독 흡광도 값이며 대조군으로 ascorbic acid(1 mM)를 이용하였다.

항산화 효소 활성

HaCaT 세포에서 산화적 스트레스에 대한 TME의 항산화 효과를 catalase(CAT) assay kit(Calbiochem, EMD Millipore Corp.)을 이용하여 측정하였다. 세포를 6-well plate에 분주하고 완전히 부착시킨 후 TME(100, 200 μg/mL)를 처리하였다. 2시간 후 H₂O₂(300 μM)를 2시간 처리하고 cell lysis buffer(RIPA buffer)로 세포 용해액을 획득하였다. BCA protein detection kit(Thermo Fisher)을 이용하여 정량한 1 mg/mL 농도의 cell lysate로 제조사가 제시한 지침에 따라 측정하였다.

Western blot

6-Well plate에 HaCaT 세포를 분주하여 37°C, 5% CO₂ 환경에서 24시간 동안 부착시키고 TME(100, 200 μg/mL)와 H₂O₂(300 μM)를 처리하였다. Incubator(37°C, 5% CO₂)에서 배양한 후 세포를 수집하여 PBS로 2회 세척하고, NP 40 cell lysis buffer(Biosource)와 RIPA buffer를 20분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 원심분리(16,000×g, 30분) 하여 cell lysate를 분리하고 BCA protein detection kit으로 정량하였다. 10% polyacrylamide gel을 이용하여 동량의 단백질을 loading 하여 전기영동 하였다. Gel를 다시 polyvinylidene difluoride membrane(Milipore, Merck KGaA)으로 60분간 전이시키고 blocking solution(5% skim milk) 10 mL를 처리하여 비특이적 단백질이 붙지 않도록 blocking을 실시하였다. TBST(20 nM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5)로 세척한 뒤, 분석할 1차 antibody(β-actin, Bax, Bcl-2, caspase 3, caspase 9, cleaved-caspase 3, cleaved-caspase 9, cytosol Nrf2, HO-1)를 처리하여 4°C 냉장고에서 overnight 후 TBST로 5분간 3회 세척하였다. 그 후 1:3,000 농도로 2차 antibody(goat-anti rabbit IgG, Calbiochem)를 희석하여 1시간 반응시키고, chemilluminescence detection solution(EZ-western Lumi Femto, DoGen)을 사용하여 단백질 발현을 측정하였다.

통계 처리

3회 이상 측정값을 GraphPad Prism version 8.0(Graph Pad Prism Software)을 이용하여 one-way ANOVA test로 분석하였다. 이후 Tukey’s multiple comparisons test를 실시하여 P<0.05 수준에서 시료 간 유의성을 검정하였다.

TME의 전자공여능 및 항산화 측정

TME의 전자공여능과 환원력을 ABTS, DPPH 라디칼 소거능을 통해 평가하였다. 강력한 항산화제로 알려진 ascorbic acid(1 mM)를 양성 대조군으로 사용하였다(Njus 등, 2020). 자유라디칼은 불안정한 상태로 생체 내에서 반응성이 높고 산소와 반응하게 될 경우, 산화가 과도하게 유발되어 세포에 손상을 일으킨다(Dizdaroglu와 Jaruga, 2012). 항산화 물질은 자유라디칼을 안정화시켜 독성을 줄일 수 있으며, 라디칼 제거 정도를 측정하여 항산화능을 평가할 수 있다(Gulcin, 2020). DPPH 라디칼 소거능이 높을수록 항산화 활성이 증가하고, 이에 따라 산화를 방지하며 인체 내 활성산소를 제어할 수 있다(Kedare와 Singh, 2011). 따라서 TME의 라디칼 소거능을 DPPH assay를 통해 측정한 결과, Fig. 1A와 같이 TME의 농도가 62.5, 125, 250, 500 μg/mL로 증가할수록 농도 의존적으로 TME의 라디칼 소거 활성이 2.26%, 8.79%, 22.15%, 63.42%로 증가하였다.

Fig 1. DPPH radical (A), ABTS radical scavenging activities (B) from Tenebrio molitor larvae water extracts (TME). Different letters above bars indicate significantly different (P<0.05).

ABTS는 과황산 포타슘과 결합해 ABTS 양이온 라디칼을 생성하며, 생성된 라디칼이 항산화 효과를 가진 시료와 반응하면 소거되어 탈색된다(Miller와 Rice-Evans, 1997). 따라서 TME의 ABTS 라디칼 소거능에 대해 측정한 결과, TME 처리군(62.5, 125, 250, 500 μg/mL)은 각각 4.97%, 14.38%, 20.57%, 47.66%로 나타났으며(Fig. 1B), TME의 농도가 증가할수록 ABTS 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 확인을 통하여 TME의 농도가 증가할수록 활성산소를 제거하는 항산화 활성이 증가하였음을 확인하였으며, 이와 같은 항산화 활성의 증가는 갈색거저리 유충의 플라보노이드와 폴리페놀 성분을 통한 효과라고 보고된바 있다(Jeong 등, 2021). 따라서 TME의 항산화 활성을 기반으로 H₂O₂로 유도된 산화 스트레스로부터 세포 보호 효과를 가질 가능성이 있다고 사료된다.

TME의 H₂O₂로 유도된 HaCaT 세포 사멸 보호

Han 등(2023)에 따르면 H₂O₂에 의해 HaCaT 세포의 사멸이 유도되었으며, 항산화 활성으로 인해 세포 사멸이 감소하는 것으로 보고되었다. 따라서 본 실험을 통해 항산화 효능을 갖는 TME가 HaCaT 세포 생존율에 끼치는 영향에 대해 측정하였다. 우선 TME가 HaCaT 세포에서 독성을 나타내지 않는 적정농도를 확인하기 위하여 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 검토하였다(Kamiloglu 등, 2020). TME를 농도별(50, 100, 200 μg/mL)로 처리하였을 때 HaCaT 세포에 대한 세포 독성이 확인되지 않았다(Fig. 2A). 이후 세포에 산화적 손상을 유도하는 H₂O₂의

Fig 2. Tenebrio molitor larvae water extracts (TME) rescued H₂O₂-induced loss of cell viability. Cells were treated with various concentrations of H₂O₂ for 12 h (A). HaCaT cells were preincubated with different concentrations of TME (100 to 1,000 μg/mL) for 12 h (B) and then treated with 300 μM H₂O₂ for 12 h (C). MTT assay was taken to measure cell viability. Different letters above bars indicate significantly different (P<0.05).

농도를 설정하기 위해 H₂O₂를 농도별(50, 100, 200, 300, 1,000 μM)로 처리하고 세포 독성을 측정하였다. 실험 결과, H₂O₂ 처리군의 경우 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하는 경향을 보였으며, 이후 실험에서 H₂O₂의 농도를 80% 생존율을 나타낸 300 μM 농도로 고정하여 진행하였다(Fig. 2B). 먼저 독성을 나타내지 않는 TME 농도(50, 100, 200 μg/mL)의 처리가 H₂O₂로부터 유도된 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는지 확인하였다. 그 결과, TME와 H₂O₂ 병행처리군에서 H₂O₂ 단독 처리군과 비교해 보았을 때 HaCaT 세포 생존율이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(Fig. 2C). 이는 갈색거저리 유충 추출물이 활성산소에 의한 세포의 손상 및 DNA 파괴를 막아 HaCaT 세포 사멸을 방지하는 것으로 판단된다. 특히 100, 200 μg/mL 농도의 TME를 처리하였을 때 세포 생존율이 두드러지게 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 이후 실험에서 TME의 농도를 100, 200 μg/mL로 고정하여 실험을 진행하였다.

TME의 세포 사멸 신호 발현에 미치는 영향

세포의 apoptosis는 여러 가지 외부 및 내부 요인에 의한 과도한 스트레스로 인해 세포가 손상되어 발생하며(Riedl과 Shi, 2004), 내인성 경로에서 Bcl-2, Bax 단백질은 서로 dimer 한 형태를 이루는데 균형이 깨지면 미토콘드리아 내막에서 cytochrome c가 방출되고 이는 caspase 9을 활성화한다. Caspase 9이 활성화되면 caspase 3가 활성화되어 apoptosis가 일어난다(Bagci 등, 2006; Kuida, 2000). 외인성 경로를 통해 세포 표면에서 death ligand와 death receptor가 결합하여 death receptor 복합체가 형성되는 경우 caspase 8이 활성화되며, caspase 8은 caspase 3를 활성화시켜 apoptosis가 일어난다(van Raam과 Salvesen, 2012). 따라서 caspase의 활성화 형태인 cleaved caspase와 Bax, Bcl-2 cytochrome c의 발현량을 측정하기 위해 western blot assay를 활용하여 단백질량을 확인하였다(Taylor와 Posch, 2014). 본 연구 결과에 따르면 H₂O₂(300μM) 단독 처리군에서는 Bax의 발현이 증가하였고 Bcl-2의 발현이 감소한 것을 확인하였으며, TME(100, 200 μg/mL) 병행처리군에서는 Bax의 발현이 H₂O₂ 단독 처리군 대비 감소하는 것을 확인하였고, Bcl-2의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 caspase 3, 8, 9의 활성화 형태인 cleaved caspase 3, 8, 9의 발현과 cytochrome c의 발현이 H₂O₂ 단독 처리군 대비 감소하였으며, CON 수준으로 감소한 것을 확인하였다(Fig. 3). 따라서 TME가 Bcl-2/Bax 균형이 깨지는 것을 방지하여 caspase 9의 활성화를 억제하고 caspase 8의 활성화를 억제하여 apoptosis를 방지하는 것으로, 갈색거저리 유충 추출물의 HaCaT 세포 보호 효과는 intrinsic, extrinsic pathway 모두에서 산화 스트레스를 억제하여 apoptosis를 방지하는 것으로 사료된다.

Fig 3. Tenebrio molitor larvae water extracts (TME) modulated apoptosis related protein. HaCaT cells pretreated with/without TME (100, 200 μg/mL) for 3 h and then incubated with 300 μM H₂O₂ of for 3 h. The level of β-actin was determined as an internal control. Different letters above bars indicate significantly different (P<0.05).

TME의 HaCaT 세포 내 항산화 효소 활성

TME의 세포 생존 향상능이 항산화 효소와 관련이 있는지 확인하기 위하여 세포 내 항산화 효소(CAT) 활성을 측정하였다. CAT는 과산화수소를 물과 산소로 분해하여 산화 스트레스로부터 세포를 보호하기 위하여 활성화되는 세포 내 방어기작이다(Claiborne, 1985). 정상적인 상태일 경우 세포 내부에서 과산화수소는 안정한 상태로 존재하며, 세포 내 항산화 효소인 CAT에 의하여 독성이 없는 H₂O로 분해되지만 세포 내 항산화 효소에 의해 조절하지 못할 정도의 과산화수소가 생성되면 이 상태에서 과산화수소가 전자를 한 개 더 제공받게 되어 OH 라디칼이 생성된다. 이 OH 라디칼은 독성이 매우 강하며 DNA를 산화하여 DNA 부가물을 생성하고 지질을 산화하여 과산화지방질을 생성함으로써 세포 내 독성을 유발한다고 알려져 있다(Rhee, 2006; Siddique 등, 2012). 본 실험에서는 이와 같은 세포 내 항산화 효소만으로 조절하지 못할 정도의 산화 스트레스를 받아 세포 내 방어기작만으로 산화 스트레스를 조절하지 못할 경우 TME의 항산화 효소 증진 효과를 알아보기 위하여 실험을 진행하였다. H₂O₂ 단독 처리군과 TME(100, 200 μg/mL)와 H₂O₂(300 μM) 병행처리군을 비교하여 분석하였다. 비교 분석한 결과 H₂O₂ 단독 처리군은 CAT 활성이 CON군 대비 감소한 것을 확인하였고, TME 병행처리군은 농도가 증가함에 따라 CAT 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, CON군과 비슷한 수준으로 회복시킨 것으로 확인하였다(Fig. 4).

Fig 4. Examination of the antioxidant enzyme activities (CAT) of Tenebrio molitor larvae water extracts (TME) induced by H₂O₂-treated HaCaT cells. HaCaT cells were pretreated with two concentrations of TME (100, 200 μg/mL) and then exposed to 300 μM H₂O₂ for 2 h. Different letters above bars indicate significantly different (P< 0.05).

이러한 결과를 통해서 TME가 과도한 산화 스트레스를 받게 되었을 때 세포 내에서 항산화 효소 시스템을 활성화시켜 세포 보호 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

TME의 Nrf2/HO-1 신호 발현에 미치는 영향

TME의 항산화 효과를 통한 세포 사멸 보호 효과가 주요 전사 인자 메커니즘으로 알려진 nuclear factor erythropoietin-2-related factor 2(Nrf2)/heme oxygenase-1(HO-1) pathway를 통해 발생한 것인지 알아보기 위하여 western blot assay를 통해 확인하였다. HO-1은 생체 내에서 Nrf2로 인해 유도되며 다양한 스트레스와 염증으로부터 세포를 방어하는 역할을 수행한다(Ryter 등, 2006). Nrf2는 HO-1과 같은 다양한 항산화 유전자를 활성화하여 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는 역할을 수행한다고 알려져 있다(Kaspar 등, 2009). 본 연구에서 HO-1과 cytosolic Nrf2를 관찰한 결과 HO-1은 H₂O₂ 단독 처리군에 비해 TME 병행처리군에서 농도 의존적으로 HO-1의 양이 증가한 것으로 확인하였다(Fig. 5). Cytosolic Nrf2에서는 H₂O₂ 단독 처리군에 비해서 TME 병행처리군이 농도 의존적으로 cytosolic Nrf2의 발현을 억제한 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 TME가 HO-1의 발현 억제를 감소시키며, cytosolic Nrf2의 발현을 억제시켜 세포 보호 효과가 이루어진 것으로 사료된다.

Fig 5. Nrf2/HO-1 pathways according to Tenebrio molitor larvae water extracts (TME) treatment in H₂O₂-induced HaCaT cell death. HaCaT cells pre-exposed with/without TME (100, 200 μg/mL) for 3 h and then administered with 300 μM H₂O₂ of for 3 h. The level of β-actin was analyzed as an internal control. Different letters above bars indicate significantly different (P<0.05).

TME의 MAPKs 신호전달계에 미치는 영향

Mitogen-activated protein kinase(MAPKs) 신호 전달계는 세포 바깥으로부터의 반응을 세포 내부의 신호로 전달하며, 세포 분열, 전사, 사이토카인 활성을 조절하는 12개 이상의 MAPKs 효소가 있다고 알려져 있다(Cargnello와 Roux, 2011). 12개 이상의 MAPKs 신호 전달 효소 중 3개의 효소가 MAPKs 신호 전달계의 특징을 잘 표현하고 있으며, 이 3개의 효소는 3가지 단백질 키나제가 서로 인산화 및 활성화되는 특징적인 phosphorelay system에 의해 조절되어 진다고 알려져 있다(Johnson과 Lapadat, 2002). 3개의 효소는 extracellular signal-regulated kinase(ERK), Jun N-terminal kinase(JNK), p38로 불린다. ERK는 세포 사멸, 자가포식 및 노화와 같은 다양한 항증식에 관여하며, ERK의 활동은 cytochrome c 방출 또는 caspase 8 활성화, 세포주기 정지 또는 자가포식 등을 통하여 내인성 또는 외인성 세포 사멸 경로를 촉진할 수 있다(Xia 등, 1995). JNK는 세포 사멸과 신호전달에 작용하며, 세포 사멸은 미토콘드리아에서 cytochrome c를 방출하여 일어나게 된다(Davis, 2000). p38은 세포 외 자극을 통해 활성화되며, 염증, 세포 사멸 및 손상, 세포주기와 같은 과정을 조절하는 역할을 한다고 알려져 있다(Ono와 Han, 2000; Zarubin과 Han, 2005). 또한 MAPKs 신호전달계에서 ERK, JNK, p38이 자극을 받으면 활성화 상태인 인산화 형태가 된다(Liu 등, 2007). TME가 산화적 손상에 대한 방어 효과가 ERK, JNK, p38 인산화의 억제에 관여하는지 확인하기 위하여 ERK, JNK, p38의 인산화 형태인 P-ERK, P-JNK, P-p38을 western blot assay를 통하여 단백질량을 확인하였다. 본 연구 결과에 따르면 H₂O₂ 단독 처리군에 비해 TME 병행처리군에서 인산화된 단백질 발현량이 농도 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 이러한 실험 결과는 TME가 MAPKs의 하위군인 ERK, JNK, p38의 인산화를 효과적으로 억제하여 H₂O₂에 의해 유도된 산화 스트레스로부터 염증과 세포 사멸을 감소시키는 것으로 사료된다.

Fig 6. Effects of Tenebrio molitor larvae water extracts (TME) on the activation of the MAPK pathway in H₂O₂-treated HaCaT cells. HaCaT cells were pre-processed with TME at different concentrations (100 and 200 μg/mL) for 3 h prior to exposure to H₂O₂ (300 μM) for 3 h. The level of β-actin was analyzed as an internal control. Different letters above bars indicate significantly different (P<0.05).

본 연구는 갈색거저리 유충 추출물(TME)의 항산화능에 의한 인간 피부 각질세포 보호 효과를 알아보기 위하여 먼저 DPPH, ABTS assay를 통해 TME의 항산화 효과가 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. MTT assay를 통하여 세포 사멸 보호 효과를 측정하기 위해 HaCaT 세포에 TME를 처리 후 H₂O₂를 분주하였다. H₂O₂에 의한 스트레스로부터 TME가 세포를 보호하는 것을 확인하였다. 세포 내 항산화 효소(CAT)가 TME에 의해 증가하며, 이는 cytosol Nrf2의 억제와 HO-1 발현에 의한 것임을 관찰하였다. 또한 TME가 Bcl-2 활성을 증가시키고, Bax, cytochrome c, cleaved-caspase 3, 8, 9의 활성을 감소시켜 세포 사멸을 억제하는 효과를 보여주었으며, MAPKs 하위군인 ERK, JNK, p38의 인산화를 억제하여 세포 사멸을 억제하는 효과를 보여주었다. 따라서 TME는 항산화능을 바탕으로 HaCaT 세포 내 항산화 효소를 발현시켜, ROS 제거 및 세포 사멸을 내인성과 외인성 경로를 통해 억제하는 것으로 판단된다. 이러한 결과를 통해 TME가 항산화 효능을 통해 피부 관련 질환에서의 생리활성 소재로서의 가능성이 있을 것으로 사료된다. 하지만 TME의 생리활성을 나타내는 지표 성분을 규명할 수 없으므로 지표 성분을 파악하는 후속 연구가 필요한 실정이다.

본 연구는 2022년도 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기본연구사업(No. NRF-2022R1F1A1063850)으로 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.