면역 체계는 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등의 감염으로부터 우리 몸을 보호하기 위한 방어 수단이다. 코로나바이러스 19는 2019년 발생 이후 전 세계로 퍼져 나갔으며, 세계보건기구(WHO)는 2020년 3월에 코로나바이러스를 세계적인 대유행(pandemic)으로 선언했다(Chen 등, 2021). 코로나바이러스는 이전에 세계적인 대유행을 일으켰던 중증급성호흡기증후군(SARS)과 중동호흡기증후군(MERS)과 유사한 발병 메커니즘을 지니고 있다. 이들은 모두 바이러스에 의한 감염성 질병으로 기침과 발열 증상 등을 보이며 특히 노인과 면역력이 약한 사람들에게는 높은 치사율을 기록하고 있다(Das, 2020). 이러한 감염성 질환을 막기 위해선 면역 체계가 중요한데, 면역 체계는 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등의 감염으로부터 우리 몸을 보호하기 위한 방어 수단이며 그중에서 초기 방어 체계를 담당하는 선천성 면역 체계(innate immune system)가 이러한 질병들을 초기에 방어하는 데 중요한 역할을 한다(Aw 등, 2007; Hosseini 등, 2020).

선천성 면역에 관여하는 세포에는 대식세포(macrophages), 호중구(neutrophils), 수지상 세포(dendritic cells), 비만세포(mast cells) 그리고 자연살해세포(natural killer cells) 등이 있다(Marshall 등, 2018). 이러한 세포들은 침입한 병원체를 제거하는 항균 능력을 지닌 활성산소(reactive oxygen species, ROS), 일산화질소(nitric oxide, NO) 같은 항균물질을 생산하는 데 관여하며, 향후 인플루엔자 바이러스 감염에 더 잘 반응하도록 기억 세포를 생성하는 데 중요한 역할을 하는 다양한 사이토카인(cytokine)을 생산하는데 관여한다(Mifsud 등, 2021). 비장(spleen)은 림프계에서 가장 큰 기관이며, 체액성 및 세포성 면역에 중요한 역할을 한다(Guan 등, 2010). 하지만 비장에서 염증반응이나 자가면역질환 등에 의해 기능 장애가 일어나게 되면 면역체계의 불균형을 일으킨다(Park 등, 2020). 소나무(Pinus densiflora)는 소나무과(Pinaceae)에 속하는 침엽수이며 한국 침엽수림의 67%를 차지한다. 동아시아에서 소나무의 잎, 꽃가루, 송진, 껍질 등 모든 부위가 민간요법과 건강기능식품으로 사용되었다(Kim 등, 2020; Lim 등, 2002). 소나무의 성분에는 α-pinene, β-pinene, camphene 등의 정유 성분과 quercetin, kaempferol 등 플라보노이드류, 수지 등이 있으며 이들은 항균 효과와 미생물 생장 억제에 효과가 있다(Lim 등, 2002). 또한 송화가루(Pinus densiflora pollen)는 천연 미량 영양소 저장고(natural micronutrient storeroom)로 알려져 있으며 신체에 필요한 다양한 종류의 아미노산, 비타민, 미네랄, 효소 및 플라보노이드가 풍부하다(Liang 등, 2020). 하지만 쥐의 비장세포에서 송화가루 열수 추출물의 단독 처리로 인한 선천성 면역 개선에 관한 연구 결과는 보고된 바 없다.

본 연구팀은 이전 연구에서 RAW 264.7 세포에서 송화가루 추출물이 NO, ROS 및 사이토카인의 생성을 유의적으로 증가시키고, NF-kB 신호전달 경로인자인 IKKα/β, IκBα, p65의 인산화를 증가시켜, p65의 세포질에서 핵 안으로의 이동을 촉진시킨 것을 입증했다(Jang 등, 2024). 본 연구에서는 정상적인 6주령 BALB/c 마우스에서 복강대식세포를 분리하여 송화가루 추출물의 NO 생성능 효과를 조사하였으며, 비장 세포를 분리한 후 덱사메타손을 처리하여 송화가루 추출물의 면역 증강 효과를 조사하고자 하였다.

재료 및 시약

Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), RPMI-1640 배지, 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 항생제(penicillin/streptomycin solution)는 Thermo Fisher Scientific으로부터 구입하였다.

시료준비

Pinus densiflora pollen은 농업회사법인 (주)한농으로부터 구입하였으며, 한국 울진에 있는 소나무로부터 수집되었다. 송화가루를 증류수와 1:30(g/mL)의 비율로 혼합한 후 항온수조(shaking water bath, VS-1205SW1, Vision Scientific)에서 80°C, 4시간 동안 추출하였다. 그 후 추출한 혼합물을 7,749×g, 30분간 원심분리(CR22N, Eppendorf Himac Technologies Co., Ltd.)하였다. 원심분리를 통해 얻은 상등액을 RKTS-22060-SNN 농축기(Genevac Ltd.)를 사용하여 40°C에서 농축시킨 후 FDU-7024 동결건조기(Operon Co., Ltd.)를 사용하여 48시간 동안 -15°C에서 30°C까지 온도를 천천히 올리면서 수분함량이 5% 미만이 되도록 동결 건조하였다. 증류수 추출물의 수율은 20.54%였으며, 얻은 Pinus densiflora pollen extract(PDE) 분말은 멸균한 증류수에 희석하여 시료로 사용하였다.

실험용 동물

연구에 사용된 실험동물은 6주령 암컷 BALB/c 마우스로 JABIO로부터 얻었다. 마우스는 4마리씩 하나의 cage에 넣어 온도 및 습도 조절이 가능한 쿼터에서 온도(25°C)와 습도(50%), 조명(12/12시간; light-dark cycle)을 유지한 채로 1주간 사육하였다. 이 연구는 경북대학교의 동물 사용 및 관리 지침에 따라 연구 프로토콜(KNU 2022-0386)이 승인된 후에 진행되었다.

실험 디자인

6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 1주일간 안정화(acclimation)시켰다. 1주일 후 마우스를 마취시킨 후 복막액을 얻었고, isolation을 진행하여 복강 대식세포를 96-well plate에 배양하였다. 그 후 PDE를 단독 처리하고 NO 생성량을 확인하였다. 또한 적출한 비장을 으깬 후에 isolation을 진행하여 96-well plate에 배양하였다. 비장세포에 concanavalin A(Con A), dexamethasone(DEX), PDE를 처리한 후 PDE가 DEX에 의해 억제된 비장세포 증식능을 개선하는지 확인하였으며, PDE가 DEX에 의해 억제된 사이토카인 생성을 개선하는지 확인하였다(Fig. 1).

Fig 1. Ex vivo study design. The peritoneal macrophages and splenocytes obtained from 6-weeks-old female BALB/c mice. Peritoneal macrophages were treated with Pinus densiflora pollen extract (PDE) (50 and 100 μg/mL) for 48 h. Splenocytes were treated with concanavalin A (Con A), dexamethasone (DEX) and PDE (50 and 100 μg/mL) for 48 h. Con A was used to induce an immune response, and DEX was used to induce immunosuppression.

복강대식세포 준비

복막액을 채취하기 위해 마우스를 마취한 후 복강 위의 피부를 제거하였다. 그 후 phosphate-buffered saline (PBS) 10 mL를 복강 내로 주입하고, PBS를 퍼트리기 위해 복부를 마사지하였다. 이후 20 mL 주사기를 이용하여 복막액을 복강으로부터 회수하였고, 216×g, 4°C에서 10분 동안 원심분리(1236R, GYROZEN Co., Ltd.)하였다. 가라앉은 pellet을 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에 재현탁시키고 hemacytometer를 이용하여 세포수/mL를 세어 37°C CO₂ 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 후 plate를 데운 PBS로 세척하고 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다.

일차 배양된 비장세포 준비

마우스에서 비장을 적출하여 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에 보관하였고 그 후 비장을 분쇄하여 40 μm 기공 크기의 세포 스트레이너(cell strainer, SPL Life Sciences)를 통과시켜 세포를 수집하였다. 수집한 세포를 365×g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 가라앉혔고, 4°C에서 3분 동안 적혈구 용해 buffer(Sigma Aldrich)에 재현탁하여 적혈구를 제거하였다. 다시 원심분리하여 가라앉힌 후, pellet을 재현탁하고 trypan blue와 hemacytometer를 이용하여 세포 수/mL를 세었다.

Nitric oxide 측정

96-Well plate에 복강 대식세포를 1×10⁷ cells/mL로 배양하고, PDE(50, 100 μg/mL)를 처리하여 37°C CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각 well의 상등액 100 μL에 Griess A[0.2% of N-(1-naphthyl)-ethylenediaminedihydrochloride]와 Griess B(1% of sulfanilamide와 5% of phosphoric acid)를 1:1 비율로 혼합하여 동량(100 μL)을 처리하였고 잘 용해되도록 교반기에서 100 rpm으로 15분 동안 교반시켰다. 그 후에 SpectraMax ID3 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, sodium nitrite를 농도별로 희석하여 NO의 표준곡선으로 이용하였다.

비장세포 증식능 측정

96-Well plate에 비장세포를 5×10⁶ cells/mL 농도로 100 μL/well로 배양 후 2시간 동안 안정화를 시켰다. 그 후 Con A(5 μg/mL), DEX(0.1 μM), PDE(50, 100 μg/mL)를 혼합하여 100 μL/well 처리하고, 37°C CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 시간이 지난 후 배양된 세포에 5 mg/mL 농도의 thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT) 시약(Sigma Aldrich)을 20 μL씩 분주하여 2시간 동안 배양하였다. 그 후 96-well plate를 원심분리하여 상등액 190 μL를 제거하고, dimethyl sulfoxide(Sigma Aldrich)를 100 μL씩 분주하여, 은박지로 감싼 채로 교반기에서 100 rpm으로 15분간 교반하였다. SpectraMax ID3 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

사이토카인 생성 측정

BALB/c 마우스에서 유래한 비장세포에서 사이토카인[interleukin-6(IL-6), IL-1β, tumor necrosis factor-alpha(TNF-α)] 생성을 측정하기 위해 Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 방법을 이용하였다. 48-Well plate에 비장세포를 5×10⁶ cells/mL 농도로 500 μL/well로 배양하고 2시간 동안 안정화시킨 후, Con A(5 μg/mL), DEX(0.1 μM), PDE(50, 100 μg/mL)를 처리하여 37°C CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 상층액을 이용하여 사이토카인 생성을 측정하였으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 Mouse IL-6, IL-1β, TNF-α uncoated ELISA kit(Invitrogen)을 사용하여 실험을 진행하였다. SpectraMax ID3 microplate reader를 이용하여 450 nm와 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

BALB/c 마우스 복강 대식세포에서 PDE에 의한 NO 생성 영향평가

본 연구팀은 이전에 RAW264.7 대식세포에서 PDE의 NO 생성능을 확인하였다(Jang 등, 2024). NO는 대식세포 매개 면역, 항염증 반응, 혈관 확장 등 많은 생물학적 반응에 관여한다. 또한 높은 수준의 NO는 DNA를 손상시키고 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 중간 수준의 NO는 병원균들로부터 세포를 보호하며, 병원균들의 세포 사멸을 촉진할 수 있다(Hays와 Bonavida, 2019). 따라서 본 연구에서 전임상 모델 수준에서도 NO 생성능을 확인하기 위해 6주령 암컷 BALB/c 마우스에서 적출한 복강대식세포에 PDE 단독 처리가 NO 생성에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, PDE의 처리가 복강 대식세포에서 NO 생성량을 유의적으로 증가시켰음을 확인하였다(Fig. 2). Gajic 등(2020)은 Aronia melanocarpa 추출물이 마우스의 복강 대식세포에서 NO 생성량을 증가시켜 선천 면역 증강 효능을 지녔다고 보고했으며, Li 등(2012)은 chicken embryo 추출물이 마우스의 복강 대식세포에서 NO 생성량을 증가시켜 면역증강 효능을 지녔다고 보고했다. 이를 통해 PDE 또한 NO 생성을 증가시켰기 때문에 면역증강 효능을 지니고 있다고 할 수 있다.

Fig 2. The effects of Pinus densiflora pollen extract (PDE) on nitric oxide (NO) production in peritoneal macrophages derived from naïve BALB/c mice. Peritoneal macrophages were treated with PDE (50 and 100 μg/mL) for 48 h. PDE increased NO production in peritoneal macrophages derived from BALB/c mice. Nitrite production was measured by using Griess reagent. Data are presented as mean±standard deviation of three independent experiments. ^***P<0.001 represents a significant difference compared with the control group.

BALB/c 마우스 비장세포에서 덱사메타손에 의한 비장세포 증식억제와 PDE 영향평가

PDE가 면역 억제된 비장세포 증식능과 사이토카인 생성능을 개선하는지 확인하기 위해 면역증강 유도제로 Con A를, 면역억제제로 DEX를 이용하였다. 비장세포는 T 세포, 대식세포, 수지상 세포 등 다양한 면역세포들로 구성되어 있으며, 병원체가 침입하면 이러한 면역세포들이 활성화되고 증식한다. 비장세포 증식은 사이토카인 발현 증가 등을 통해 잠재적으로 세포 매개 면역 반응을 개선하여 궁극적으로 면역력을 강화시킨다고 알려져 있다(Noh 등, 2019). Con A는 림프구 등 다양한 세포 표면에 위치한 당단백질이나 당지질 같은 탄수화물 그룹에 비공유적으로 결합할 수 있는 콩과 렉틴이다. Con A와 림프구가 결합하면 칼슘 유입 속도를 증가시켜 DNA 합성 증가를 촉진하고, 그로 인해 세포 증식을 하는 것으로 알려져 있다(McCole 등, 1998). 자주 활용되는 면역억제모델은 cyclophosphamide(CPP)와 methotrexate(MTX)가 있다. 하지만 CPP와 MTX는 세포 사멸을 유도하여 면역억제를 유도하는 단점이 있으며, 특히 CPP는 조혈계에 작용하여 백혈구감소증, 혈소판감소증, 출혈, 빈혈 등의 증상을 나타내고 종양을 일으키는 부작용이 있다. 백혈구 및 호중구의 감소는 면역 반응에 장애를 일으켜 문제를 유발한다고 알려져 있으며, MTX는 임상실험에서 많은 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다(Oaklander 등, 2017; Yang과 Kim, 1998). 하지만 이번 실험에서 사용한 DEX는 면역 기능에 대해 강력한 억제 효과를 지닌 글루코코르티코이드 중 하나이며, CPP나 MTX와 달리 대식세포, 림프구 등의 면역세포의 증식과 분화를 차단하여 면역 억제를 유도하는 것으로 알려져 있다(Giles 등, 2018; Jeklova 등, 2008). 또한 본 연구팀에서 강황추출물의 면역증강 효과를 확인하기 위해 CPP를 마우스에 복강 투여하여 면역억제모델을 설정하였는데, CPP의 복강 투여는 혈류를 통한 면역억제 전달로 면역억제 효과가 낮게 관찰되어(Kim 등, 2024) 면역억제 효과가 높은 모델이 필요하다고 생각하였다. 따라서 본 연구팀은 6주령 암컷 BALB/c 마우스에서 적출한 비장세포에 Con A, DEX, PDE를 처리한 후 MTT assay를 통해 PDE가 DEX에 의해 억제된 비장세포 증식능을 개선하는지 확인하였다(Fig. 3). Con A에 의해 비장세포의 증식능이 증가함을 확인하였고, DEX를 처리하였을 때 비장세포의 증식능이 감소하는 것을 확인하였다. 그리고 PDE 처리가 DEX에 의해 감소한 비장세포의 증식능을 완화시켰음을 확인하였다.

Fig 3. The effects of Pinus densiflora pollen extract (PDE) on cell proliferation in splenocyte derived from naïve BALB/c mice. Splenocytes were treated with concanavalin A (Con A), dexamethasone (DEX) and PDE (50 and 100 μg/mL) for 48 h. PDE alleviated DEX-induced reduction of splenocyte proliferation in Con A-stimulated splenocytes. Data are presented as mean±standard deviation of three independent experiments. ^#P<0.05 represents a significant difference compared between the control (Con A-treated) group and the DEX-treated group. ^**P<0.01 represents a significant difference compared with the DEX-treated group.

Li 등(2017)은 Yupingfeng powder 추출물이 DEX에 의해 감소한 비장세포 증식능을 회복시킴으로써 소재의 면역증강 효능을 입증했다. 또한 Jiao 등(2024)은 lentinan이 DEX에 의해 감소한 비장세포 증식능을 회복시킴으로써 소재의 면역증강 효능을 입증했다. 이를 통해 PDE 또한 DEX에 의해 억제된 비장세포 증식능을 회복시켰기 때문에 면역증강 효능을 지니고 있다고 할 수 있으며, 더 나아가 면역증강 기능성 식품의 소재가 될 수 있음을 시사한다.

BALB/c 마우스 비장세포에서 덱사메타손에 의한 사이토카인 생성억제와 PDE 영향평가

사이토카인은 선천성 면역세포에서 분비되는 반감기가 짧고 저분자량의 가용성 단백질이다. 사이토카인은 면역세포의 성장 및 성숙에 관여하고, 건강 상태를 판단할 때 필요한 중요한 결정 요인 중 하나이다(Liu 등, 2021). 그중 IL-6는 naïve CD4⁺ T 세포의 특이적 분화를 촉진하여 선천적 면역 반응과 후천적 면역 반응을 연결하는 데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Tanaka 등, 2014). IL-1β는 병원균에

감염되었을 때 선천성 면역 및 염증의 중추적인 역할을 하는 사이토카인으로, NF-κB 의존성 유전자 전사의 강력한 유도제 역할을 하며 염증 전파, 면역세포 모집, 적응면역반응 조절 등이 가능하다고 알려져 있다(Aarreberg 등, 2019). TNF-α는 TNF 수용체에 결합함으로써 세포 사멸을 유도하고 선천성 면역 반응을 조절하여 병원균의 증식을 억제하며 면역세포의 침투를 촉진하여 영향을 받은 부위의 감염을 제거한다고 알려져 있다(Gonzalez Caldito, 2023; Mohd Zawawi 등, 2023). 본 연구에서 BALB/c 마우스에서 유래한 비장세포에서 PDE의 면역증강 효과를 확인하기 위해 배양한 비장세포에 Con A를 처리하여 면역증강 효과를 유도하였고, 덱사메타손을 처리하여 면역억제를 유도하였다. Con A에 의해 사이토카인(IL-6, IL-1β, TNF-α)의 생성이 증가함을 확인하였고, 덱사메타손에 의해 사이토카인의 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 그리고 PDE 처리가 덱사메타손에 의해 감소한 사이토카인 생성능을 완화시켰음을 확인하였다(Fig. 4). Noh 등(2019)은 Platycodon grandiflorum 추출물이 비장세포에서 면역억제제에 의해 감소한 사이토카인 생성능을 회복시킴으로써 추출물의 면역증강 효능을 입증했다. 대식세포 활성화 및 비장세포 증식이 목표일 수 있지만 특정 상황에서 과도하게 생산된 사이토카인은 오히려 신체 조직에 해로운 영향을 미칠 수 있다(Quan 등, 1999). Lin 등(2008)은 비장세포의 10 μg/mL lipopolysaccharide 처리가 IL-6, IL-1β, TNF-α의 발현량을 각각 1,168±350.0, 16.5±5.4, 357±51.0 pg/mL만큼 증가시켜 염증을 유발했다고 보고했다. 하지만 100 μg/mL PDE는 IL-6, IL-1β, TNF-α의 발현량을 각각 168.6±10.0, 3.3±1.0, 237.6±5.3 pg/mL만큼 증가시켜 숙주의 신체 조직에 손상을 끼치지 않고 면역증강 효능을 지니고 있으며, 면역증강 기능성 식품의 소재가 될 수 있음을 시사한다. 또한 다른 질병마다 숙주 손상을 최소화하면서 이상적인 생성 수준을 달성할 수 있는 적절한 활성화 수준을 찾는 것이 중요하다고 생각된다.

Fig 4. The effects of Pinus densiflora pollen extract (PDE) on cytokine production in splenocyte derived from naïve BALB/c mice. Splenocytes were treated with concanavalin A (Con A), dexamethasone (DEX) and PDE (50 and 100 μg/mL) for 48 h. PDE alleviated DEX-induced reduction of cytokine production in Con A-stimulated splenocytes. Data are presented as mean±standard deviation of three independent experiments. ^#P<0.05 represents a significant difference compared between the control (Con A-treated) group and the DEX-treated group. ^***P<0.001 represents a significant difference compared with the DEX-treated group. N.D: not detected.

본 연구는 이전에 PDE가 RAW264.7 대식세포에 이어 BALB/c 마우스로부터 유래한 복강대식세포와 비장세포에서도 면역증강 효능이 있는지 확인하기 위해 진행되었다. 그 결과, 복강대식세포에서 PDE가 NO 생산을 증가시켰으며, DEX에 의해 억제된 비장세포 증식능과 사이토카인 발현 회복을 통해 전임상 모델 수준에서도 면역증강 효능이 있음을 증명하였다.

본 연구실에서 개발한 면역억제모델은 비장세포에 직접적인 면역억제제 처리로 인한 높은 면역억제능과 DEX 처리로 면역세포 사멸보다는 면역 활성능 저하로 인한 면역억제 효과 유도로 메커니즘 연구에 더 효과적으로 적용될 것으로 기대된다. 향후 PDE의 지표성분의 동정 및 정량화 등에 관한 추가적인 연구가 진행된다면, PDE를 건강기능식품으로 개발하는 데 좋은 정보가 될 것으로 생각된다.

본 연구에서 PDE가 RAW264.7 대식세포에 이어 BALB/c 마우스로부터 유래한 복강 대식세포에서 NO 생성을 증가시켰으며, DEX에 의해 억제된 비장세포 증식능과 사이토카인 생성도 회복시킴으로써 전임상 모델 수준에서도 면역증강 효능이 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 PDE가 면역증강 기능성 식품 소재가 될 수 있는 근거를 제공한다. 향후 PDE의 지표성분의 동정 및 정량화 등 추가 연구가 진행된다면, PDE를 건강기능식품으로 개발하는 데 좋은 정보가 될 것으로 생각된다.

이 연구는 2022년 경상북도기술원 1팀 1교수 책임제 공동연구 ‘경북 식재료 활용K-면역 농식품 기술개발’(과제번호: LP0048882022) 연구비 지원과 한국연구재단의 중견연구(NRF-2022R1A2C1010923) 지원을 받아 수행되었습니다.