산업 및 경제의 발전과 의료기술의 발달로 인하여 인간의 생활 수준 및 식생활은 높은 수준으로 변화하고 있으며, 이러한 발전과 함께 비만, 환경오염도 동반하여 증가하였다. 이로 인한 각종 스트레스 및 오염물질 등으로 인해 비염, 아토피성 피부염, 대상포진 등의 만성염증질환이 증가하고 있다(Lee 등, 2013). 따라서 항산화제에 관한 천연 식물에 관한 연구가 진행되고 있으며, 식물로부터 항염증 효과가 있는 천연 물질을 연구 및 동정하고 이를 섭취함으로써 만성염증, 암 및 기타 질병과의 상호작용을 예방하려는 시도가 이루어지고 있다(Kim, 2006; Lee 등, 2010).

염증반응(inflammation response)은 생체조직의 물리적인 외상, 화학적 작용제, 미생물 감염 등의 외부 자극에 의하여 손상된 부위를 재생하려는 회복 및 복구기전으로 손상을 국소화하거나 제거하기 위해 면역세포가 활성화되면서 일어나는 반응이다. 하지만 염증의 회복 및 복구기전에도 불구하고 염증반응이 과도하거나 장기간 지속적으로 과발현되는 경우, 과민성 면역반응을 일으키거나 그로 인한 조직 및 장기의 손상과 기능 소실 등을 초래할 수 있으며, 만성염증의 경우 퇴행성 관절병, 알레르기 질환, 심혈관 질환, 류마티스 관절염, 노인성 치매 등의 다양한 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2014; Lee 등, 2016; Ryu 등, 2011).

염증반응은 주로 macrophage와 같은 면역 관련 세포에 의해 발생한다(Lundberg, 2000). Macrophage는 lipopolysaccharide(LPS)나 tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-1 beta(IL-1β), IL-6, interferon-gamma(IFN-γ)와 같은 cytokine에 의해 자극되어 활성화된다(Xie 등, 1993). 활성화된 macrophage는 prostaglandin E₂(PGE₂), nitric oxide(NO) 및 cytokine을 포함한 다양한 유형의 염증반응 물질을 분비하며, 이러한 염증반응 물질은 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생충 종양에 대항하기 위한 필수 면역 반응을 매개하는 것으로 알려져 있다(Nathan, 1992).

현재까지 개발된 항염증제로는 arachidonic acid, indomethacin, aspirin 등이 있다. 이들은 주로 COX 효소의 억제를 통하여 항염증, 진통, 해열 등의 효과를 나타내나 장기간 복용 시 혈소판 응집반응 감소, 위산 분비 증가, 점액 보호 감소 등의 부작용을 나타낸다고 알려져 있다(Dogné 등, 2006; Makins와 Ballinger, 2003). 따라서 보다 효과적이며 안전한 천연물 유래의 항염증제 개발이 필요한 실정이다.

소인제(Aeonium sedifolium)는 아프리카 북부 카나리제도를 원산지로 하는 돌나물과(Aeonium속) 식물로 주로 가을에서 봄에 성장하며 늦봄부터 노란색의 꽃을 틔운다. 외형으로 줄기는 얇고 진한 갈색을 띠며, 잎은 원통형으로 2 cm 정도의 길이를 가지며 끈적거린다. Aeonium속 식물은 대부분 중앙에 줄기가 있으며 줄기 끝에 잎이 달린 모양을 하고 있다. 줄기는 목질화되어 있고 뿌리의 일부는 공중에 노출되어 있다(Kim 등, 2023). 국내에서는 다육식물로 전국적으로 재배되고 있으며, 관상용 및 화장품의 원료로 사용되고 있다. 현재 소인제의 선행 생리활성 연구로는 항산화, 주름개선, 항염증, 모공수축 효과에 관한 연구(Kim 등, 2023)가 보고되고 있으나 macrophage cell line에서의 염증 작용에 관한 연구는 미비한 실정이다.

천연물의 유용성분을 효율적으로 추출하기 위해서는 다양한 방법이 있으나, 추출 방법을 통하여 조절하는 것이 가장 효율적인 방법이라 할 수 있다(Lee 등, 2011). 수증기 증류법, 환류 추출법, 압착법, 초임계 유체 추출법 등이 많이 사용되고 있으나(Lee 등, 2000a), 수율이 낮고 비용이 높아 더욱 효율적인 추출 방법의 확보가 요구되고 있다(Lee 등, 2000b). 마이크로웨이브 추출법은 천연물에 직접적으로 작용하며, 단기간에 적은 용매와 에너지를 사용하여 목적 성분을 추출할 수 있기 때문에(Lopez-Avila 등, 1994; Paré 등, 1994) 효율적인 추출 방법으로 고려된다.

따라서 본 연구에서는 소인제의 생리활성 유용성분을 효율적으로 추출하고자(Lee와 Kwon, 2006) 마이크로웨이브 추출과 일반 추출의 추출물 특성을 비교하여 최적 추출 조건을 설정하였으며, 염증 억제 효과를 확인하고자 하였다. 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 cell에 LPS를 이용하여 염증반응을 유도한 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenultetrazolium bromide(MTT)를 통한 세포독성 평가, NO, inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), cytokine 발현에 미치는 영향을 확인하여 천연 항염증 소재로서의 가능성을 알아보고자 하였다.

실험 재료

본 연구에 사용된 소인제(Aeonium sedifolium)는 2022년 경기도 고양시에서 재배한 것을 구매하여 사용하였다. 시료는 50°C dry oven(FO600M, Jeiotech)에서 건조한 뒤, 고속분쇄기(RT-08, Rong Tsong Precision Technology)를 사용하여 40 mesh로 분쇄하여 분말로 제조하였다. 제조된 시료는 4°C에서 저온저장하며 실험에 사용하였다.

추출물 제조

시료의 일반 추출(conventional extraction)은 물 추출물의 경우 소인제 분말 5 g에 증류수 200 mL를 가한 뒤, stirring hotplate(SHMS-3, Jeiotech)에서 300°C의 조건으로 용액이 100 mL가 될 때까지 가열 및 증발시킨 후 shaking incubator(SI-600R, Jeiotech)에서 25°C, 18시간 동안 교반 추출하였으며, 에탄올 추출물은 시료에 농도별 에탄올 100 mL를 가하여 shaking incubator에서 25°C, 18시간 교반 추출하였다. 추출액은 Whatman No. 1 filter paper (Whatman)를 이용하여 여과한 다음 4°C에서 냉장 보관하며 시료로 사용하였다. 동결건조물은 추출액을 동결건조기(Ilshin Biobase)를 이용하여 분말화하였으며 -18°C 냉동고에서 보관하며 시료로 사용하였다.

마이크로웨이브 추출(microwave extraction)은 24 KHz 주파수의 실험실용 마이크로웨이브(BKUP-900K, Biokonvision)를 이용하여 programmable power(max 900 W)와 time control이 가능한 추출장치를 사용하여 시행하였다. 시료 추출은 플라스크에 소인제 분말 2 g에 각각 100 mL의 증류수 및 에탄올을 가한 후 추출 공정 변수를 조절하여 추출하였다. 추출액은 Whatman No. 1 filter paper를 이용하여 여과한 다음 4°C에서 냉장 보관하며 시료로 사용하였다. 동결건조물은 추출액을 동결건조기하여 분말화한 뒤, -18°C 냉동고에서 보관하며 시료로 사용하였다.

Total phenolic compounds(TPC) 함량 측정

TPC 함량은 Folin과 Denis의 방법(1912)에 준하여 측정하였다. 증류수 5 mL에 100% 에탄올 1 mL를 넣은 후, 시료 추출물 1 mL를 넣고 잘 섞어준 뒤, 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣은 후 1분간 voltexing 하였다. 그 후 5% Na₂CO₃ 1 mL를 가하여 1시간 동안 암실에서 방치한 뒤 UV-vis photospectrometer(Optizen 3220 UV, Merasys Co., Ltd.)를 이용하여 725 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 이를 gallic acid를 이용한 표준곡선을 이용하여 추출물의 TPC 함량을 정량하였다.

Hyaluronidase(HAase) 저해 효과 측정

HAase 저해 활성은 Dorfman과 Ott의 방법(1948)에 준하여 측정하였다. 20 mM sodium phosphate buffer(pH 6.9)에 녹인 hyaluronidase(200 U/mL) 0.5 mL와 시료 추출물 0.5 mL를 혼합한 뒤 38°C로 설정한 water bath에서 5분간 예비 반응시켰다. 그 후 0.3 M phosphate buffer(pH 5.3)에 hyaluronic acid(0.4%)를 녹여 제조한 기질 용액 0.5 mL를 예비 반응시킨 용액에 첨가한 뒤 38°C water bath에서 45분간 반응시켰다. 반응 후 0.04 M acetate buffer(pH 3.7)에 녹인 알부민 용액 5 mL를 첨가하여 반응을 종료시키고 5분간 상온에 방치한 뒤 600 nm에서 투과율(%)을 측정하여 저해 활성을 산출하였다. 이때 positive control로 tannic acid를 사용하였으며, 저해율(%)은 (1－반응구의 transmittance/대조구의 transmittance)×100으로 계산하여 나타내었다.

세포 배양

Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행에서 분양받았으며, 세포 배양을 위해 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에 fetal bovine serum과 penicillin streptomycin(100 U/mL)을 각각 10%, 1%가 되도록 혼합하여 media로 사용하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. Cell 배양 dish에 cell의 밀도가 1~2×10⁶/mL 정도가 되도록 계대 배양하여 cell 상태를 유지하며 실험에 사용하였다.

MTT assay에 의한 세포 독성 측정

세포 독성은 Carmichael 등의 방법(1987)에 준하여 측정하였다. Raw 264.7 cell을 48-well plate에 5×10³ cells/well이 되도록 분주하고, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 그 뒤 시료를 농도별로 조제하여 50 μL씩 첨가한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 18시간 배양하며 반응시켰으며, 여기에 MTT 용액 50 μL를 가하여 4시간 배양하였다. 그 뒤 배양액을 제거하고 각 well에 dimethyl sulfoxide 300 μL를 가하여 상온에서 30분간 반응시켜 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) reader(SPECTROstar Nano, BMG Labtech)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군(대조군)의 흡광도 감소율로 나타내었으며, 대조군은 시료와 동량의 DMEM을 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 세포 생존율(%)은 (1−시료의 absorbance/대조구의 absorbance)×100으로 계산하여 나타내었다.

NO 생성률 측정

NO 생성률은 cell의 supernatant에서 NO의 양을 nitrite and nitrate로 측정하였다. Griess reagent system’s kit 시약(1% sulfanilamide＋0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1)(Promega) 반응을 이용하여 배양액 중에 존재하는 NO₂^-의 형태로 측정하였다. Raw 264.7 cell을 96-well plate에 5×10⁴ cells/well이 되도록 분주하고 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였으며 그 후 normal군을 제외한 모든 well에 최종농도가 1 μg/mL가 되도록 LPS를 첨가하고 농도별로 제조한 시료를 처리하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 18시간 반응시켰다. 반응 종료 후 supernatant를 모아 griess reagent system’s kit 시약으로 10분간 차광반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 생성률은 LPS만 첨가하여 자극한 군(대조군)에서 생성된 NO의 양을 100%로 하여 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다. 무처리군은 시료 및 LPS와 동일한 양의 DMEM을 첨가하여 동일한 조건으로 실험하였다. NO 생성률(%)은 (시료첨가군의 absorbance/대조군의 absorbance)×100으로 계산하여 나타내었다.

Western blot을 통한 iNOS, COX-2 protein 발현량 측정

iNOS, COX-2 protein 발현량은 western blotting 분석을 통하여 측정하였다. Raw 264.7 cell을 100×20 mm dish에 2×10⁶ cells/dish가 되도록 분주하고 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였으며 그 후 normal군을 제외한 모든 dish에 최종농도가 5 μg/mL가 되도록 LPS를 첨가하고 농도별로 제조한 시료를 처리하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 18시간 반응시켰다. 그 후 cell을 모아 M-PER (Thermo Fisher Scientific)와 protease inhibitor(Thermo Fisher Scientific)를 섞은 혼합액을 각 dish 당 200 μL 첨가한 뒤 4°C에서 lysis 시켰으며, 그 후 원심분리(10,867×g, 4°C, 20 min)한 뒤 supernatant를 수거하여 세포막 성분들을 제거하였다. 수득한 supernatant는 BCA kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 protein의 양을 정량하였으며, 20 μL의 protein이 함유된 샘플을 10%의 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 통하여 110 V로 1시간 20분간 전기 영동한 뒤 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane에 60 V, 2시간 30분의 조건으로 protein을 transfer 하였다. Transfer된 membrane은 tris-buffered saline tween 20(TBST)에 녹인 5% skim milk 용액으로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였으며 그 후 1차 antibody(1:1,000)를 사용하여 4°C에서 overnight 한 뒤, TBST를 이용하여 10분씩 3회 세척하였다. 세척된 membrane은 2차 antibody(1:500)를 이용하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 뒤, enhanced chemiluminescence(ECL) kit(Millipore Corp.) 용액과 반응시켜 band를 확인하였다. 나타난 band는 Image J(Wayne Rasband) 프로그램을 이용하여 정량화하였다.

Real-time PCR을 이용한 pro-inflammatory factors(TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1, PTGES2) 발현량 측정

Pro-inflammatory factors 발현량은 real-time PCR(Eco48 real-time PCR system, PCRmax)을 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell을 100×20 mm dish에 2.5×10⁶ cells/dish가 되도록 분주하고 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였으며 그 후 normal군을 제외한 모든 well에 최종농도가 5 μg/mL가 되도록 LPS를 첨가하고 농도별로 제조한 시료를 처리하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 18시간 반응시킨 뒤 phosphate buffer saline으로 2회 세척하였다. Pro-inflammatory factors의 mRNA 발현량을 측정하기 위해 우선 TRI-Solution™ RNA extraction kit(BioScience Technology)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 그 후 추출한 total RNA는 nano drop(OPTIZEN NanoQ, Mecasys)을 이용하여 DNA 양을 1,000 ng으로 동일하게 맞춘 후, qPCRBIO cDNA synthesis kit(PCR Biosystems)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 real time PCR master mix(PCR Biosystems), forward and reverse primer, RNase-free water를 넣고 real-time PCR을 이용하여 유전자별 mRNA 발현량을 실시간 분석하였다. Primer sequence와 real-time PCR condition은 Lee 등의 방법(2020)에 준하여 측정하였다. Primer sequence와 real-time PCR condition은 Table 1, 2에 표기하였다.

Table 1 . The primers sequence of real-time PCR for pro-inflammatory activity.

Factors	Accession	Primer	Sequence (5’-3’)	Amplicon (b.p.)
TNF-α	NM_001278601.1	Forward Reverse	5′-TCTACTGAACTTCGGGGTGA-3′ 5′-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3′	87
IL-1β	NM_008361.4	Forward Reverse	5′-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3′ 5′-GATCCACACTCTCCAGCTGCA-3′	152
IL-6	NM_031168.2	Forward Reverse	5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′ 5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′	76
MCP-1	NM_011333.3	Forward Reverse	5′-TTCCTCCACCACCATGCAG-3′ 5′-CCAGCCGGCAACTGTGA-3′	64
PTGES2	NM_133783.2	Forward Reverse	5′-CCGTGAGAAGGACTGAGATC-3′ 5′-AAGTGATGACCTCTTCCAGG-3′	162
β-Actin	NM_007393.4	Forward Reverse	5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3′ 5′-GCTCGTTGCCAATAGTGATGA-3′	137

Table 2 . Real-time PCR conditions for pro-inflammatory factors.

Factors	Real-time PCR condition
TNF-α	95°C for 5 min, followed by 40 cycles of 95°C for 10 s, 60°C for 20 s, followed by 95°C, 55°C, 95°C for 15 s, each
IL-1β	95°C for 5 min, followed by 40 cycles of 95°C for 10 s, 60°C for 20 s, 70°C for 15 s, followed by 95°C, 55°C, 95°C for 15 s, each
IL-6	95°C for 5 min, followed by 40 cycles of 95°C for 10 s, 60°C for 20 s, followed by 95°C, 55°C, 95°C for 15 s, each
MCP-1	95°C for 5 min, followed by 40 cycles of 95°C for 10 s, 60°C for 20 s, followed by 95°C, 55°C, 95°C for 15 s, each
PTGES2	95°C for 5 min, followed by 40 cycles of 95°C for 10 s, 60°C for 20 s, followed by 95°C, 55°C, 95°C for 15 s, each
β-Actin	95°C for 5 min, followed by 40 cycles of 95°C for 10 s, 60°C for 20 s or 95°C for 10 s, 60°C for 20 s, 70°C for 15 s, followed by 95°C, 55°C, 95°C for 15 s, each

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였으며, 통계처리는 SPSS Statistics ver. 25 for Window(IBM Corp.)를 이용하여 평균±표준편차로 표시하였고, Student’s t-test를 실시하여 시료 간의 유의차를 P<0.05 수준으로 비교하였으며, 다중범위 검정에서는 Duncan’s multiple range test one way ANOVA를 실시하여 시료 간의 유의차를 P<0.05 수준으로 비교 분석하였다.

일반 추출 최적 조건 설정

식물에는 천적으로 인한 피해나 자외선에 의한 산화로부터 자신을 보호하기 위하여 다양한 폴리페놀류의 항산화 물질을 함유하고 있다. 그중에서도 phenolic compounds는 phenolic hydroxyl기를 포함하고 있어 단백질과 같은 분자들과 결합하는 성질을 띤다. 이로 인하여 항산화, 항염증, 항당뇨, 주름 개선, 미백 등의 다양한 생리활성을 지니고 있는 것으로 알려져 있다(Cheon, 2015; Farag 등, 1989; Jo 등, 2016). 식물의 phenolic compounds는 재배 및 수확시기, 종류, 부위에 따라 성분과 함량의 차이를 보이며, 추출 시 추출용매, 추출 방법, 추출 시간에 따라 추출 효율이 다르게 나타난다고 보고되고 있다(Kim 등, 2009). 따라서 본 연구에서는 소인제(A. sedifolium)의 TPC를 효율적으로 용출하기 위하여 추출용매의 종류, 용매의 농도, 추출 방법 및 시간을 다양하게 하여 최적의 추출 조건을 확인하였다.

먼저 추출용매를 달리하여 소인제 추출물의 TPC의 함량을 측정한 결과 Fig. 1A와 같이 소인제를 물 추출하였을 때 26.4 mg GAE/g으로 사용한 용매 중 가장 높은 함량을 나타냈으며, 메탄올, 에탄올, butanol, acetone 순으로 각각 23.5, 20.9, 12.9, 9.6 mg GAE/g의 함량을 나타내었다. 때문에 용출량이 가장 높은 물과 메탄올을 용매로 사용하고자 하였으나 식품과 화장품에 적용하기 위하여 인체에 유해한 물질을 제외하여 물과 에탄올을 추출용매로 선정해 이후 실험을 진행하였다.

Fig 1. The content of phenolic compounds in extracts from Aeonium sedifolium. (A) Various solvents, (B) Ethanol concentration, (C) Extraction time, (D,E) Solvent ratio. Means with different letters (a-i) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test (n=3).

효과적인 phenolic compounds의 추출을 위하여 물과 10~100%의 에탄올 농도로 소인제를 추출하여 비교하였다. 그 결과 Fig. 1B와 같이 열수 추출에서는 24.5 mg GAE/g으로 나타났으며, 에탄올 농도의 추출에서는 50%, 60% 에탄올에서 각각 60.4, 60.1 mg GAE/g으로 유의적인 차이 없이 가장 높은 phenolic compounds 함량을 보여 수치상으로 가장 높게 나타난 물과 50% 에탄올을 추출용매로 선정해 다음 실험을 진행하였다.

다음으로 추출 시간에 따른 phenolic compounds의 용출량을 확인하기 위하여 물과 50% 에탄올을 추출용매로 3시간 간격으로 측정한 뒤, 비교하여 효율적인 추출 시간을 선정하였다. 그 결과 Fig. 1C와 같이 물 추출물은 12시간 추출했을 때 32.5 mg GAE/g으로 가장 높게 나타났으나 시간의 효율을 고려하여 30.3 mg GAE/g의 추출량을 나타낸 3시간을 적정시간으로 선정하였으며, 50% 에탄올 추출물의 경우에도 12시간 추출했을 때 70.9 mg GAE/g으로 가장 높게 나타났으나 시간의 효율을 고려하여 62.8 mg GAE/g의 추출량을 나타낸 1시간을 적정시간으로 선정하여 다음 실험을 진행하였다.

마지막으로 시료에 대한 용매의 비율에 따른 phenolic compounds의 용출량을 비교하기 위하여 시료 1 g에 1:5, 1:10, 1:20, 1:50의 비율로 용매를 첨가하여 물의 경우 3시간 추출하였으며, 50% 에탄올의 경우 1시간 추출하였다. 그 결과 Fig. 1D, 1E와 같이 물 추출물과 50% 에탄올 추출물 모두 1:50의 용매 비율로 추출하였을 때 각각 34.8 mg GAE/g, 68.0 mg GAE/g으로 가장 높게 나타났다. 따라서 추출 효율성을 고려하여 시료에 대한 용매의 비를 1:50으로 결정하였다.

위 결과를 바탕으로 일반 추출의 최적 조건은 물과 50% 에탄올을 추출용매로 하여 시료와 용매의 비를 각각 1:50으로 하였고, 물은 3시간, 50% 에탄올은 1시간 동안 추출하는 것을 최적으로 결정하였으며, 해당 조건으로 추출하여 sample로 사용하였다.

마이크로웨이브 추출 최적 조건 설정

마이크로웨이브를 이용하여 소인제의 TPC를 효율적으로 용출하기 위하여 마이크로웨이브 파워(225, 450, 675, 900 W)와 추출 시간(0분, 0.5분, 1분, 3분, 6분) 별로 다양하게 비교하여 최적의 추출 조건을 확인하였다. 우선 앞서 선정한 일반추출의 조건인 물과 50% 에탄올을 추출용매로 하여 시료와 용매의 비를 각각 1:50으로 하였고, 그 후 마이크로웨이브 파워와 추출 시간별로 조절하여 TPC의 함량을 측정하였다. 그 결과 Fig. 2와 같이 마이크로웨이브를 처리한 물 추출물의 경우 0.5분 이후부터 추출 수율이 상승하였으며 추출 시간이 길어짐에 따라 phenolic compounds의 함량이 증가하는 경향을 나타내었고, 마이크로웨이브 파워가 증가함에 따라 phenolic compounds의 함량이 감소하는 경향을 확인하였으며 450 W, 3분의 조건으로 추출하였을 때 38.2 mg GAE/g의 phenolic compounds 함량을 가지며 가장 높게 나타났다. 마이크로웨이브를 처리한 50% 에탄올 추출물의 경우 물 추출물과 같이 추출 시간이 길어짐에 따라 phenolic compounds의 함량이 증가하는 경향을 확인하였으며 450 W, 1분의 조건으로 추출하였을 때 72.1 mg GAE/g의 phenolic compounds 함량을 가지며 가장 높게 나타났다. 물 추출물은 3분, 50% 에탄올 추출물은 1분을 경과하면서 boiling point에 도달하였는데, 열처리를 통한 화학적 변화에 의해 폴리페놀을 비롯한 다양한 생리활성 물질의 추출이 증가하는 것으로 추측되었다(Nicoli 등, 1999).

Fig 2. Effect of microwave extraction time and power on total phenolics content in extracts from Aeonium sedifolium. (A) Water extracts, (B) 50% Ethanol extracts. Means with different letters (a-d) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test (n=3).

위 결과를 바탕으로 마이크로웨이브 추출의 최적조건은 물과 50% 에탄올을 추출용매로 하여 시료와 용매의 비를 각각 1:50으로 한 뒤, 마이크로웨이브에서 각각 450 W의 파워로 물은 3분, 50% 에탄올은 1분 동안 추출하는 것을 최적으로 결정하였으며, 해당 조건으로 추출하여 sample로 사용하였다.

일반 추출과 마이크로웨이브 추출의 추출 수율 비교

유용성분을 효율적으로 추출하기 위해 새로운 추출 방법을 적용한 마이크로웨이브 추출과 일반 추출을 비교하기 위하여 소인제 물 추출물과 50% 에탄올 추출물의 TPC 함량을 측정하여 추출 수율을 비교하여 Table 3에 나타내었다. 소인제 물 추출물과 50% 에탄올 추출물에서의 추출방법에 따른 phenolic compounds의 함량은 유의적인 차이를 보였다. 물 추출물의 경우 일반 추출의 최적조건에서는 34.82 mg GAE/g으로 나타났으나, 마이크로웨이브 추출의 최적조건에서는 38.19 mg GAE/g으로 나타나 마이크로웨이브를 이용한 추출에서 추출 수율이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 50% 에탄올 추출물의 경우에도 일반 추출의 최적조건에서는 67.97 mg GAE/g으로 나타났으며, 마이크로웨이브 추출의 최적조건에서는 72.09 mg GAE/g으로 나타나 마이크로웨이브를 이용한 추출에서 추출 수율이 상대적으로 더 높은 것을 확인하였다.

Table 3 . Total phenolics content in Aeonium sedifolium extracts depending on different conditions of conventional extraction and microwave extraction.

Solvent	Contents of total phenolics (mg GAE/g)
	Conventional extraction	Microwave extraction
Water 50% Ethanol	34.82±0.03 67.97±0.09	38.19±0.43 72.09±0.81*

The data were expressed as the mean±SD..

An asterisk indicates a significant difference at P<0.05 as determined by Student’s t-test (n=3)..

대류에 의해 에너지 및 열을 전달하는 일반적인 가열추출방법과는 달리 마이크로웨이브 추출은 시료 및 용액 전체에 에너지를 노출함으로써 천연물의 특정 성분이 국소적으로 가열되어 유리되기 때문에 마이크로웨이브 추출법이 특정성분을 추출하는 데 있어 효과적이라는 연구 결과가 보고되고 있어(Pare 등, 1991) 본 실험의 결과도 이와 유사한 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

일반 추출과 마이크로웨이브 추출의 HAase 저해 효과 비교

Hyaluronic acid(HA)는 N-acetyl-D-glucosamine과 D-glucuronic acid가 β(1→4) 결합을 이루고 있는 고분자 다당류로서 신체의 피부, 태반 연골 등에 존재한다. 고분자 HA는 대식세포의 식작용을 억제하는 기능을 가지나 염증으로 활성화된 HAase에 의하여 저분자 HA로 가수분해되면 대식세포의 염증반응을 촉진하고 fibrosis와 collagen을 증가시켜 상처치유에 기여하게 된다(Girish와 Kemparaju, 2007; Kakehi 등, 2003; Meyer, 1947; Meyer와 Palmer, 1934). 따라서 HAase를 저해하는 것으로 HA의 고분자 형태를 유지함으로써 항염증 효과를 기대할 수 있다.

앞에서 설정한 최적조건의 일반 추출법과 마이크로웨이브 추출법을 이용하여 제조한 소인제 동결건조물의 HAase 저해 활성을 측정한 결과 Fig. 3과 같이 나타났다. 일반 추출한 물 추출물(conventional extraction in water, CEW)과 일반 추출한 50% 에탄올 추출물(conventional extraction in 50% ethanol, CEE)의 경우 50~400 μg/mL 농도에서 각각 6.28~17.08%, 7.23~36.50%의 HAase 저해 효과를 나타내었으며, 마이크로웨이브 추출한 물 추출물(microwave extraction in water, MEW)과 마이크로웨이브 추출한 50% 에탄올 추출물(microwave extraction in 50% ethanol, MEE)의 경우 동일한 50~400 μg/mL 농도에서 각각 7.67~25.88%, 9.25~52.56%의 HAase 저해 효과를 가지는 것으로 나타났다. Positive control로 사용한 tannic acid의 경우 동일한 농도 구간에서 10.93~96.15%의 HAase 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과를 통하여 물과 50% 에탄올 용매 모두에서 일반 추출보다 마이크로웨이브 추출의 HAase 저해 활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

Fig 3. Inhibition activity of conventional extraction and microwave extraction on hyaluronidase in extracts from Aeonium sedifolium. (A) Water extracts, (B) 50% Ethanol extracts. CEW: conventional extraction in water, MEW: microwave extraction in water, CEE: conventional extraction in 50% ethanol, MEE: microwave extraction in 50% ethanol. Means with different letters (a-c) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test (n=3).

Macrophage cell(Raw 264.7)의 세포 생존율 측정

Macrophage cell(Raw 264.7)에서의 세포 생존율을 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하여 소인제 추출물의 세포 독성을 확인하였다. 소인제 추출물을 농도별(5, 10, 20, 25, 50, 100 μg/mL)로 처리하여 세포 생존율을 측정한 결과는 Fig. 4와 같이 나타났다. CEW의 경우 5~100 μg/mL의 농도에서 69.85~95.88%의 세포 생존율을 보이며 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 50 μg/mL의 농도에서 81.18%로 80% 이상의 생존율을 보였다. MEW의 경우 5~100 μg/mL의 농도에서 72.05~96.27%의 세포 생존율을 보이며 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 50 μg/mL의 농도에서 82.30%로 80% 이상의 생존율을 보였다. CEE의 경우 5~100 μg/mL의 농도에서 47.27~93.96%의 세포 생존율을 보이며 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 20 μg/mL의 농도에서 80.69%로 80% 이상의 생존율을 보였다. MEE의 경우 5~100 μg/mL의 농도에서 52.47~96.33%의 세포 생존율을 보이며 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 20 μg/mL의 농도에서 84.20%로 80% 이상의 생존율을 보였다. 이상의 결과로 50% 에탄올 추출물보다 물 추출물의 세포독성이 적은 것을 확인할 수 있었으며, 이후 실험에서는 80% 이상의 생존율을 보이는 CEW와 MEW는 50 μg/mL, CEE와 MEE는 20 μg/mL 이하의 농도에서 실험을 진행하였다.

Fig 4. Cell viability of Aeonium sedifolium extracts on Raw 264.7 cells. (A) Water extracts, (B) 50% Ethanol extracts. CEW: conventional extraction in water, MEW: microwave extraction in water, CEE: conventional extraction in 50% ethanol, MEE: microwave extraction in 50% ethanol. Means with different letters (a-g) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test (n=3).

NO 생성률 측정

NO는 L-arginine으로부터 생성되는 세포 내 반응성 자유라디칼로써 세포독성 및 면역반응에 관여한다. NO는 cytokine의 분비를 조절해 macrophage, T-cell 등의 면역세포에 활성을 억제하거나 유도하는 데 관여하기 때문에 면역반응의 주요한 지표 물질로 사용된다(Maeng 등, 2002; Willeaume 등, 1995).

Raw 264.7 cell에서의 NO 생성률을 측정하기 위해 소인제 추출물을 농도별(CEW, MEW: 5, 10, 20, 25, 50 μg/mL, CEE, MEE: 5, 10, 20 μg/mL)로 처리하여 생성되는 NO의 양을 측정한 결과는 Fig. 5와 같이 나타났다. CEW와 MEW의 경우 5~50 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 56.7~96.2%, 38.6~94.1%의 NO 생성률을 보이며 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며 각각 무처리군의 33.0%, 29.7%에 근접하는 양상을 보였다. CEE와 MEE의 경우 5~20 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 65.8~80.0%, 57.0~77.0%의 NO 생성률을 보이며 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 물 추출물과 50% 에탄올 추출물 모두 일반 추출보다 마이크로웨이브 추출이 NO 생성억제에 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 소인제 추출물이 NO 생성을 억제하여 항염증 작용의 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

Fig 5. Production rate of Aeonium sedifolium extracts on NO. (A) Water extracts, (B) 50% Ethanol extracts. CEW: conventional extraction in water, MEW: microwave extraction in water, CEE: conventional extraction in 50% ethanol, MEE: microwave extraction in 50% ethanol. Means with different letters (a-e) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test (n=3).

Western blot을 통한 iNOS, COX-2 protein 발현량 측정

iNOS는 다양한 염증성 질환, 순환 장애 및 암에 대한 방어 반응으로 인하여 형성되며 NO의 생성을 촉진시켜 염증반응을 유도한다(Denlinger 등, 1996; Willeaume 등, 1995). 그리고 COX-2는 염증자극에 의하여 발현되어 PGE₂와 같이 염증을 일으키는 매개체를 생성한다(Liao 등, 2004). 때문에 LPS에서 유도된 Raw 264.7 cell에서 iNOS와 COX-2 protein의 발현을 감소시켜 항염증 효과를 기대할 수 있다.

소인제 추출물의 iNOS, COX-2 protein 발현량을 확인하기 위하여 LPS로 유도된 Raw 264.7 cell에 소인제 추출물을 농도별(CEW, MEW: 10, 25, 50 μg/mL, CEE, MEE: 5, 10, 20 μg/mL)로 처리하여 발현되는 protein의 양을 측정한 결과는 Fig. 6, 7과 같이 나타났다. Fig. 6에 나타낸 iNOS protein expression에서 CEW와 MEW의 경우 10~50 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 57.49~70.79%, 46.73~54.85%의 iNOS protein 발현율을 보였으며, CEE와 MEE의 경우 5~20 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 54.48~78.97%, 26.66~82.16%의 iNOS protein 발현율을 나타내었다. 따라서 LPS에서 유도되어 생성된 iNOS는 소인제 추출물에 의하여 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Fig. 7에 나타낸 COX-2 protein expression에서는 CEW와 MEW의 경우 10~50 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 87.71~91.31%, 88.68~94.03%의 COX-2 protein 발현율을 보였으며, CEE와 MEE의 경우 5~20 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 79.93~83.53%, 68.99~89.69%의 iNOS protein 발현율을 보였다. 따라서 LPS에서 유도되어 생성된 COX-2는 소인제 추출물에 의하여 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig 6. Protein expression rate of Aeonium sedifolium extracts on iNOS. (A) Water extracts, (B) 50% Ethanol extracts. CEW: conventional extraction in water, MEW: microwave extraction in water, CEE: conventional extraction in 50% ethanol, MEE: microwave extraction in 50% ethanol.

Fig 7. Protein expression rate of Aeonium sedifolium extracts on COX-2. (A) Water extracts, (B) 50% Ethanol extracts. CEW: conventional extraction in water, MEW: microwave extraction in water, CEE: conventional extraction in 50% ethanol, MEE: microwave extraction in 50% ethanol.

이상의 결과를 통하여 소인제 추출물이 iNOS, COX-2 protein 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 물 추출물과 50% 에탄올 추출물 모두 일반 추출보다 마이크로웨이브 추출이 iNOS, COX-2 protein 발현 억제에 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 또한 iNOS protein의 발현양상은 앞서 실험한 NO 생성과 유사한 결과를 나타낸 것을 확인하였으며, COX-2 protein의 발현양상 또한 COX-2에 의하여 유도되는 prostaglandin E synthase 2(PTGES2)에 영향을 미칠 것으로 사료된다.

Real-time PCR을 이용한 pro-inflammatory factors 발현량 측정

염증반응이 발생하게 되면 염증 부위로 macrophage가 모여 LPS를 인식하고, LPS 수용체인 toll-like receptor 4로부터 신호를 핵으로 전달하여 다양한 cytokine 유전자의 활성을 증가시킨다. 이때 증가하는 cytokine의 종류로는 IL-1β, IL-6, TNF-α가 있으며(Takeuchi 등, 1999), 그로 인하여 염증반응을 촉진하는 cytokine이 합성 및 분비됨으로써 감염 부위에 백혈구가 집중하게 된다. Monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)은 면역세포에서 분비되는 chemokine이라 불리는 cytokine의 한 종류로서 염증반응 초기에 monocyte와 같은 염증세포를 모으는 역할을 한다(Wada 등, 1996). 이렇게 모인 monocyte는 macrophage로 분화하여 TNF-α, IL-6, interferons와 같은 염증성 cytokine을 분비하여 염증반응을 촉진하게 된다. PTGES2는 arachidonic acid로부터 COX에 의하여 생합성되는 주요 염증매개인자인 PGE₂의 생성에 촉매하는 역할을 하며 조직의 발적 및 부종을 유도하는 것으로 알려져 있다(Lee와 Rhee, 2015; Liao 등, 2004). 때문에 LPS에서 유도된 Raw 264.7 cell에서 cytokine의 발현을 감소시키는 것으로 항염증 효과를 기대할 수 있다.

소인제 추출물의 pro-inflammatory factors의 발현량을 확인하기 위하여 LPS로 유도된 Raw 264.7 cell에 소인제 추출물을 농도별(CEW, MEW: 10, 25, 50 μg/mL, CEE, MEE: 5, 10, 20 μg/mL)로 처리하여 발현되는 양을 측정한 결과는 Fig. 8과 같이 나타났다. TNF-α의 발현량에서는 CEW와 MEW의 경우 10~50 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.69~0.92, 0.63~0.92의 발현율을 보이며 무처리군의 0.38에 근접하는 양상을 보였다. CEE와 MEE의 경우 5~20 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.50~1.01, 0.48~0.90의 발현율을 보이며 각각 무처리군의 0.40에 근접하는 양상을 보였다. IL-1β의 발현량에서는 CEW와 MEW의 경우 10~50 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.61~0.97, 0.59~0.93의 발현율을 보이며 무처리군의 0.52에 근접하는 양상을 보였다. CEE와 MEE의 경우 5~20 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.68~0.92, 0.61~0.96의 발현율을 보이며 각각 무처리군의 0.45에 근접하는 양상을 보였다. IL-6의 발현량에서는 CEW와 MEW의 경우 10~50 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.35~0.94, 0.30~1.02의 발현율을 나타내었으며, CEE와 MEE의 경우 5~20 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.66~0.88, 0.57~0.87의 발현율을 나타내었다. MCP-1의 발현량에서 CEW와 MEW의 경우 10~50 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.68~0.98, 0.60~0.90의 발현율을 나타내었으며, CEE와 MEE의 경우 5~20 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.43~1.04, 0.34~0.84의 발현율을 보이며 각각 무처리군의 0.19에 근접하는 양상을 보였다. PTGES2의 발현량에서 CEW와 MEW의 경우 10~50 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.94~0.98, 0.85~0.90의 발현율을 나타내었으며, CEE와 MEE의 경우 5~20 μg/mL의 농도에서 LPS 처리한 대조군에 비해 각각 0.82~1.01, 0.67~1.03의 발현율을 보이며 각각 무처리군의 0.52에 근접하는 양상을 보였다. 따라서 LPS에서 유도되어 생성된 pro-inflammatory factors는 소인제 추출물에 의하여 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig 8. mRNA expression of Aeonium sedifolium extracts on pro-inflammatory factors TNF-α (A,B), IL-1β (C,D), IL-6 (E,F), MCP-1 (G,H), PTGES2 (I,J). CEW: conventional extraction in water, MEW: microwave extraction in water, CEE: conventional extraction in 50% ethanol, MEE: microwave extraction in 50% ethanol. Means with different letters (a-e) are significantly different at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test (n=3).

이상의 결과를 통하여 소인제 추출물이 pro-inflammatory factors의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1, PTGES2의 발현 억제 양상은 앞서 실험한 iNOS, COX-2 protein 발현과 유사한 pattern을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 일반 추출물과 마이크로웨이브 추출물의 항염증 효과가 동일한 처리농도에서 마이크로웨이브 추출물이 다소 우수한 효과를 나타내는 것은 소인제를 추출할 때 마이크로웨이브 처리에 의해 용출되는 phenolic의 profile이 달라지기 때문으로 추측하며, 향후 물질 분석에 관한 확인 연구는 필요한 것으로 판단된다.

본 연구에서는 소인제의 유용성분을 효율적으로 추출하기 위하여 일반 추출법과 마이크로웨이브 추출법을 사용하여 최적 추출조건을 확립하고, 페놀성 성분의 함량과 항염증 효과를 측정하여 비교하였다. 일반 추출의 최적 추출조건은 물과 50% 에탄올을 용매로 시료와 1:50의 비율로 혼합한 뒤 각각 3시간, 1시간 동안 교반 추출하였을 때 phenolic compounds의 함량이 가장 높게 나타났다. 마이크로웨이브 추출의 최적 조건은 물과 50% 에탄올을 용매로 시료와 1:50의 비율로 혼합한 뒤 마이크로웨이브에서 450 W의 파워로 각각 3분, 1분간 추출하였을 때 phenolic compounds의 함량이 가장 높게 나타났다. 각각의 최적 추출조건으로 페놀성 성분의 함량과 항염증 효과를 비교한 결과, 용매의 경우 물보다 50% 에탄올에서, 추출방법의 경우 일반 추출보다 마이크로웨이브 추출에서 phenolic compounds 함량과 HAase 저해 활성이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. Raw 264.7 cell에서의 세포독성을 확인한 결과 CEW와 MEW에서는 50 μg/mL 이하의 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 보였으며, CEE와 MEE에서는 20 μg/mL 이하의 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. Cell line에서 항염증 효과를 확인하기 위하여 Raw 264.7 cell을 LPS로 유도하여 염증관련 인자를 ELISA, western blot, real-time PCR을 사용하여 측정하여 염증 억제효과를 확인하였다. NO 생성률을 확인한 결과 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, CEW와 MEW는 50 μg/mL 농도에서 각각 56.7%, 38.6%, CEE와 MEE는 20 μg/mL 농도에서 각각 65.8%, 57.0%로 나타나 LPS 처리한 대조군에 비해 NO 생성이 크게 억제되었다. NO의 생합성 효소인 iNOS와 PGE2의 생합성 효소인 COX-2 protein 발현을 확인한 결과, iNOS와 COX-2 모두 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었다. iNOS는 CEW와 MEW 50 μg/mL 농도에서 각각 57.49%, 46.73%, CEE와 MEE는 20 μg/mL 농도에서 각각 54.48%, 26.66%로 나타나 iNOS protein의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었고, COX-2는 CEW와 MEW 50 μg/mL 농도에서 각각 87.71%, 88.68%, CEE와 MEE는 20 μg/mL 농도에서 각각 79.93%, 68.99%로 나타나 COX-2 protein의 발현억제에 영향을 끼치는 것을 확인할 수 있었다. 추출방법에 따른 비교로는 마이크로웨이브 추출이 일반 추출보다 iNOS와 COX-2 protein의 억제 활성이 높게 나타나 항염증 활성이 더욱 우수할 것으로 판단된다. Pro-inflammatory factor인 TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1, PTGES2의 발현율도 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 마이크로웨이브로 추출한 MEW, MEE 각각 최고 농도에서 TNF-α는 0.69, 0.63, IL-1β는 0.61, 0.59, IL-6은 0.35, 0.30, MCP-1은 0.68, 0.60, PTGES2는 0.94, 0.85의 발현율을 보이며 일반 추출한 CEW, CEE보다 더 우수한 항염증 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이상의 결과를 통해 소인제 추출물이 항염증 활성이 우수하다는 것을 확인하였으며, 일반 추출법에 비하여 마이크로웨이브를 이용한 추출법이 상대적으로 더욱 우수한 항염증 활성을 가지는 것으로 판단되었다. 따라서 소인제 추출물이 새로운 항염증 소재로써 활용될 수 있을 것으로 예상되며, 효율적인 생리활성 물질의 용출방법 등에 관한 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되었다.