최근 들어 미세먼지 등의 외부 오염원들로 인해 각종 알레르기 질환이 급증하고 있으며, 바이러스 및 만성 대사성 질병들이 증가하고 있어 건강기능식품의 이용을 통하여 질병을 사전 예방하고 삶의 질을 향상시키려는 소비자들의 욕구가 증가하고 있다(Díaz 등, 2020; Hwang, 2020).

녹용(Cervi Parvum Cornu)은 매화록(Cervus nippon T.) 또는 마록(Cervus elaphus L.) 및 동속 근연동물의 골질화되지 않은 어린 뿔로 동양의학의 중요 약재로 중국 및 일본 등의 동양권 국가에서 오래전부터 활용되고 있는 양록산업의 주 생산물이다. 녹용은 전 세계 생산량의 80%를 한국에서 소비한다고 알려져 있다(Choi 등, 2005). 녹용의 약리 활성 성분으로는 ganglioside, pantocrin(70% 에탄올 추출물), 아미노산, 인산칼슘, 탄산칼슘, 콜라겐, 인지질, chondroitin, glucosamine, hyaluronic acid 등이 알려졌지만(Ha와 Yoon, 1996; Hong 등, 1991; Tsujibo 등, 1987), 이들 대부분은 녹용에만 특이하게 함유된 성분이 아니며 pantocrin 역시 구성 화합물이 구명되지 않아 다양한 약리 효능을 대변하기 어렵다. 녹용은 인삼과 더불어 오래전부터 가장 대표적인 강장 생약재로, 현대 과학적으로도 혈압강하, 조혈기능, 고콜레스테롤 혈증 개선, 항스트레스 효과가 있다고 밝혀지고 있다(Kang과 Kim, 1989; Kim과 Park, 1982; Yong, 1976). 녹용과 같은 강장 효과가 있는 생약재의 약성은 특정 장기에만 선택적으로 작용하여 강한 효과를 나타내는 것이 아니라 그 효과는 단일 성분 의약품에 비해 약하나 신체 전반에 걸쳐 복합적으로 효능을 나타내는 것이 특징이다(Kim 등, 1994). 그러나 녹용은 설사 등의 부작용이 있어 한방에서 수렴작용이 있는 한약과 병용하여 사용하게 되는데, 이 경우 기대했던 효과가 상실되거나 감소할 수 있다. 또한 녹용은 한약에 이용하기 위해 알코올에 담근 후 이를 세절하여 사용하게 되는데, 이 과정에서 녹용의 많은 유효성분이 소실되고 있다. 이러한 문제를 해결하고자 Chi와 Ji(2005)는 녹용을 Bacillus licheniformis를 이용하여 발효하였을 때 발효물의 면역 활성이 증가한다고 보고하였다. 발효과정을 거치게 되면 유용성분의 증가(Choi 등, 2007), 새로운 생리활성 부여(Chi와 Ji, 2005), 흡수율 증가(Cabras와 Angioni, 2000), 잔류농약의 감소 또는 제거(Kosakai와 Yosizawa, 1979), 유용한 장내 미생물의 증가(Chi와 Ji, 2005) 등 다양한 이점을 지니고 있어 최근 들어 발효를 이용한 생물학적인 전환 방법이 산업체에 널리 사용되고 있다.

한편 버섯은 다양한 생리활성이 있다고 알려져 있으며, 특히 세포벽성분 중 fungal polysaccharides는 면역 활성 및 항암 활성이 우수하다고 보고되는데 표고버섯(Lentinus edodes), 영지버섯(Ganoderma lucidum) 및 잎새버섯(Grifola frondosa) 등이 그 대표적 사례이다. 특히 표고버섯의 다당체인 lentinan은 C(O)-6에서 분지 구조를 갖는 β-1,3-glucan으로 구성되어 있으며 현재 항암보조제로 시판되고 있다. 버섯의 약리활성은 버섯의 종류와 이들을 구성하고 있는 β-glucan의 함량 및 분지 비율 등에 의해 활성의 차이를 나타내는 것으로 보고되어 있다(Giavasis, 2014; Wasser, 2002). 버섯류 중 Cordyceps속의 동충하초균은 겨울철에는 곤충의 몸속에 자생하다가 여름에는 곤충을 숙주로 삼아 자실체를 형성하는 약용버섯의 일종으로(Sung 등, 1993), 세계적으로 800여 종이 알려져 있으며 한국에서도 80여 종이 채집 및 연구되고 있다고 보고되어 있다(Lee 등, 2017). 그중 가장 많은 연구가 진행된 것은 Cordyceps sinensis로 균사체 내에 여러 약리 활성 성분을 함유하고 있는데(Winkler, 2008; Zhang 등, 2008), cordycepin, cordycepic acid, 아미노산, 다당류 및 비타민 등이 활성 성분으로 알려져 있다(Ng과 Wang, 2005; Wang 등, 2017b). 이 중 다당류는 가장 풍부한 성분 중 하나로 자실체, 배양된 균사체 및 발효액으로부터 추출 및 분리되며(Yan 등, 2014), 항산화, 항종양 및 면역 조절 효과와 같은 광범위한 약리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Wang 등, 2017a). 하지만 우리나라 식품으로 등록된 동충하초는 눈꽃동충하초/누에동충하초(Paecilomyces japonica/Paecilomyces tenuipes/Isaria japonica)와 번데기동충하초(Cordyceps militaris)로 이에 상세한 약리활성 및 활성 본체에 관한 연구는 여전히 제한된 실정이다. 따라서 본 연구에서는 전통약재의 하나인 녹용을 C. militaris로 발효하여 추출물을 제조하고 이들의 면역 활성을 in vitro 및 in vivo 평가함으로써 이들을 기능성 식품소재로 개발하기 위한 가능성을 제시하고자 하였다.

실험 재료 및 동물

본 실험에 사용한 녹용은 한약규격집 기준에 적합한 마록을 2021년 10월 약재상(경동시장)으로부터 구입하여 열풍건조하고, 건조녹용의 분골, 상대, 중대, 하대를 마쇄기로 분쇄하여 혼합 후 사용하였다. 분쇄한 녹용 혼합물은 냉동 보관하면서 실험 재료로 사용하였다.

실험에 사용한 inbred BALB/c 마우스(6주령, 암컷)는 (주)새론바이오에서 구입하였으며 일주일의 순화 기간을 거친 후 실험을 진행하였다. 사육을 위한 조건으로 온도는 23±3°C로 하였고 습도는 55~70%를 유지하였으며 자유 급식 형태로 사료와 물을 공급하고 인공조명 아래 1일 12시간 간격으로 명암 교대 하였다. 모든 동물실험은 경기대학교 동물실험윤리위원회의 승인(2022-005)을 받은 후 규정에 따라 동물실험을 진행하였다.

C. militaris에 의한 녹용의 발효

C. militaris 균주를 이용한 녹용의 발효는 top-driven 형식의 7L(Kobiotech) 배양기를 이용하여 working volume 4 L로 하여 배양하였다. 녹용 분말 400 g을 50 mM phosphate buffer(pH 6.0) 4 L에 첨가하여 현탁한 후 살균하였으며 여기에 potato dextrose broth(BD Pharmingen) 배지에서 전배양한 동충하초 배양액 400 mL를 접종하여 25°C에서 5일간 발효한 것을 시료로 하였다. 녹용 비발효물은 동일 양의 녹용 분말에 4 L의 물을 가하고 100°C에서 3시간 동안 환류 추출한 후 8,690×g에서 20분간 원심분리한 상징액을 회수하였다. 각 시료의 잔사에는 물 1 L를 가하여 재차 3시간 환류 추출하였고 동 과정을 2회 반복하여 회수한 추출물을 함께 농축하여 농축물을 얻었으며, 이를 동결건조하여 각각 발효녹용 추출물과 비발효녹용 추출물로 하여 이후 실험의 시료로 사용하였다.

발효 전후의 성분 변화

녹용 발효 전후의 성분 변화를 측정하고자 protein, 총당, uronic acid, sulfated glycosaminoglycan(S-GAG), sialic acid 함량을 각각 측정하였다. 각각의 성분 분석은 Bradford 법(1976), phenol-sulfuric acid 법(Dubois 등, 1951), m-hydroxybiphenyl 법(Blumen krantz와 Asboe-Hansen, 1973), dimethylmethylene blue dye-binding 법(Farndale 등, 1982) 및 Warren 법(1959)을 실험 여건에 맞게 일부 변형하여 진행하였다. 특히 sialic acid 측정 시에는 Warren 법이 적용된 시판 분석용 kit(MAK314, Sigma Aldrich)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다.

항보체 활성 측정

항보체 활성은 시료에 의한 보체의 소비(complement consumption) 후 남아있는 보체에 의한 적혈구 용혈량을 측정하는 complement fixation test(Kim 등, 2010)로 측정하였다. 다양한 농도로 증류수에 용해한 시료를 gelatin veronal buffer(GVB, pH 7.4, 0.1% gelatin, 0.15 mM Ca 이온, 0.5 mM Mg 이온 함유) 및 정상 성인의 혈청을 50 μL씩 혼합하여 37°C에서 30분간 1차 반응하였다. 이에 GVB 350 μL를 가하고 10~160배 연속 희석한 후 750 μL의 GVB와 양의 감작적혈구(IgM-sensitizated sheep erythrocyte, EA cell, 1×10⁸ cells/mL)를 250 μL 가해 37°C에서 60분간 2차 반응하였다. 이후 2.5 mL의 phosphate-buffered saline(PBS)을 가하여 반응을 종결하였다. 이후 반응액을 원심분리(4,480×g, 10 min, 4°C) 하여 얻어진 상등액의 흡광도를 SpectraMax 190 Microplate Reader(Molecular Devices)를 사용해 412 nm에서 측정함으로써 잔존하는 용혈 활성을 확인하였다. 항보체 활성은 정상 성인의 혈청과 GVB 및 증류수만 반응시킨 음성대조군의 총보체용혈(50% total complement hemolysis, TCH₅₀, %)에 대한 저해율(inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH₅₀, %)로 나타내었다. 양성대조군은 운지버섯 유래의 시판 중인 면역증강제 polysaccharide-K를 사용하여 비교 분석하였다(Tsukagoshi 등, 1984). 또한 금속이온 존재에 의한 보체계(complement system) 활성화 경로를 확인하고자 GVB, Ca 이온이 제거된 Mg-EGTA-GVB, 그리고 Ca과 Mg 이온이 모두 제거된 EDTA-GVB를 사용해 앞서 제시한 방법과 동일하게 실험을 진행한 후 비교 분석하였다.

교차 면역전기영동(Cross-immunoelectrophoresis)

보체계 활성화 경로의 검토를 위한 2차원 면역전기영동은 Shimura 등(1983)이 제시한 방법에 따라 실시하였다. GVB, Mg-EGTA-GVB 그리고 EDTA-GVB에 증류수에 용해한 시료와 정상 성인의 혈청을 각각 50 μL씩 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 냉각하였다. 이후 barbital buffer(pH 8.6)에 용해하여 만든 1% agarose gel plate(5×5 cm)의 well에 앞서 제조한 반응액을 5 μL씩 loading 하였으며, 4°C에서 3시간 동안 1차 전기영동(75 mA/plate)을 행하였다. 그 후 1%의 anti-human C3(Sigma Aldrich)가 함유된 agarose gel plate 상에서 4°C, 15시간 동안 2차 전기영동(25 mA/plate)을 행하였다. 전개된 gel을 bromophenol blue를 사용해 약 10분간 염색 및 탈색하여 침강선(precipitate line)을 확인함으로써 C3의 활성화 여부를 확인하였다.

비장에서 획득한 림프구 세포의 증식 활성

BALB/c 마우스를 경추탈구법으로 치사시킨 후 무균적으로 비장(spleen)을 적출하여 100 mesh의 stainless steel mesh를 이용하여 PBS 상에서 마쇄하고, 200 mesh의 stain steel mesh를 사용해 여과하여 림프구 세포를 획득하였다. 이에 0.2% NaCl을 5 mL 가하여 30초간 반응시켜 혼입된 적혈구를 파괴하고 RPMI 1640(without FBS, Welgene)을 가해 세포를 현탁하였다. 그 후 0.2% trypan blue(Sigma Aldrich)로 염색해 살아있는 세포만을 계수하여 1×10⁶ cells/mL의 농도가 되도록 희석하였다. 이렇게 획득한 세포현탁액 50 μL, RPMI 1640(with FBS)을 이용해 연속 희석된 시료, lipopolysaccharide(LPS from E. coli O127:B8, Sigma Aldrich) 1 μg/mL, concanavalin A(ConA) 5 μg/mL를 100 μL 가하고 50 μL의 RPMI 1640(with FBS)을 가하여 전체 부피가 200 μL가 되도록 flat-bottomed 96-well plate에 분주하였다. 이때 LPS는 B cell의 mitogen으로, ConA는 T cell의 mitogen으로 사용되었다. 이를 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 72시간 동안 배양하였으며, 배양 종료 후 EZ-cytox(Dogen)를 well당 10 μL씩 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 1~4시간 반응시켜 spectrophotometer를 사용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대식세포(macrophage)의 cytokine 분비능 측정

BALB/c 마우스의 복강에 5% thioglycollate medium 1 mL를 주입하고 96시간 동안 유도된 macrophage(2.0×10⁶ cells/mL) 100 μL를 96-well microplate에 분주한 후, 배양기(37°C, 5% CO₂)에서 2시간 배양하였다. 이후 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)으로 희석된 시료와 면역 활성 양성대조군인 1 μg/mL의 LPS를 96-well microplate에 100 μL씩 분주 후 배양기에서 24시간 배양하였다(Janeway, 1968). 배양 종료 후 원심분리(4,480×g, 5 min, 4°C) 하여 세포 배양액 150 μL를 회수하고 회수된 상등액은 mouse interleukine(IL)-6, IL-12(p40) ELISA kit(BD Biosciences) 및 mouse tumor necrosis factor(TNF)-α ELISA kit(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 분비된 cytokine의 함량을 측정하였다.

정맥 투여에 의한 자연살해세포(NK cell)의 종양세포 살해능 활성

시료를 PBS에 투여 농도 별로 용해한 뒤, 마우스에 실험 3일 전, 1일 전에 정맥 주사하였다. 실험 당일 경추탈구법으로 치사시켜 무균적으로 비장을 적출한 뒤 PBS 상에서 stainless steel mesh를 이용하여 마쇄(100 mesh) 및 cell strainer(100 μm)로 여과하여 비장세포를 회수하였다. Target cell로 MHC class I이 결여되어 natural killer(NK) cell에 대해 감수성이 높은 것으로 알려진 림프종 유래 세포주 YAC-1을 사용하였으며, target cell의 수는 5×10⁵ cells/mL로 하고 이에 대한 effector cell의 비율(E/T ratio)이 25:1, 50:1, 100:1이 되도록 현탁하여 96-well plate에 100 μL씩 분주하였다. 5% CO₂, 37°C 배양기에서 6시간 동안 세포를 배양한 뒤, effector cell의 종양세포 살해능으로 인해 유리되는 target cell의 lactate dehydrogenase(LDH) 발생량을 EZ-LDH kit(Dogen)을 사용하여 측정하였으며, NK 세포의 종양세포 살해능 활성은 하단의 식에 의해 계산하였다.

NK cell activity (%)＝[(experimental-effector spontaneous)/ (target maximum-target spontaneous)]×100

경구투여에 의한 혈청 중 cytokine 분비능 측정

경구투여에 의한 혈청 중 cytokine 분비량을 측정하고자 1일 1회 총 21일간 150 및 500 mg/kg 농도의 시료를 각 group당 10마리의 BALB/c 마우스에 경구투여하였다. 경구투여 후 마우스의 안와정맥으로부터 채혈하여 군별 전혈을 얻었으며, 이를 원심분리한 후 상등액을 회수하여 혈청만을 얻었다. 회수한 혈청으로부터 IL-6 및 IL-12의 분비량을 측정하기 위해 제조사의 지침에 따라 ELISA kit을 사용하여 위와 같은 방법으로 분석하였다.

경구투여에 의한 NK 세포의 종양세포 살해능 측정

시료의 경구투여에 의한 NK 세포의 종양세포에 대한 살해 활성을 평가하기 위해 BALB/c 마우스에 21일간 1일 1회 경구투여한 후 마우스를 희생하였다. 무균적으로 비장을 적출한 후 세포를 조제하고 위에서 언급한 방법으로 종양 살해 활성을 측정하였다.

통계 분석

모든 실험 결과는 측정 항목에 대해 평균과 표준편차로 나타내었으며, 실험군 간의 차이는 SPSS Statistics version 21.0(IBM Corp)을 이용하여 Student’s t-test, 일원배치 분산분석 및 Duncan’s multiple range test를 통해 분석하였다. 유의차는 P<0.05 수준에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

C. militaris에 의한 녹용 발효 및 성분 변화

C. militaris에 의한 녹용 발효물의 최적 제조 조건을 확립하기 위해 배양 시간별로 배양물을 채취하여 성분 및 면역 활성 변화를 측정하였다. 배양 중의 총당의 변화를 측정한 결과(Fig. 1), 배양시간이 증가할수록 증가하는 경향을 보였다. 특히 배양 5일 차까지 증가하다가 이후 변화가 없거나 약간 감소하는 경향을 보였다. 한편 시간별로 채취한 건조 배양물의 면역 활성 변화를 1,000 μg/mL 동일 농도에서의 항보체 활성으로 확인한 결과, 배양 전에는 ITCH₅₀값 12%의 낮은 활성에서 배양 1일 차 활성의 분명한 증가가 관찰되었으며 이후 배양시간에 따라 꾸준히 증가하는 경향을 보였다. 하지만 배양물의 수율 및 활성을 고려하였을 때 배양 5일 차가 최적으로 판단되어 이후의 모든 실험은 녹용을 C. militaris로 5일간 배양하여 녹용발효 추출물을 제조하여 실험에 사용하였다. 배양 후 얻은 건조 발효녹용 추출물과 비발효 녹용 추출물의 화학성분 변화를 측정한 결과(Table 1), 발효물의 단백질 함량은 발효 전 54.22%에서 42.50%로 유의적으로 감소하는 경향을 보였으나, 총당, uronic acid, S-GAG 및 sialic acid의 발효 전후 함량은 각각 9.56%에서 29.79%, 3.43%에서 5.56%, 1.48%에서 2.21% 및 0.13%에서 0.40%로 통계적인 유의차를 나타내며 증가하는 양상을 보였다. 이러한 사실은 발효에 의해 유용성분의 생성 또는 추출 효율의 증가에 기인한 것으로 사료되었다.

Table 1 . Chemical properties of non-fermented and fermented deer antler extract by C. militaris (%).

Chemical properties	Non-fermented antler extract	Fermented antler extract
Protein	54.22±3.84	42.50±2.55*
Total sugar	9.56±0.64	29.79±1.45*
Uronic acid	3.43±0.38	5.56±0.90*
S-GAG	1.48±0.10	2.21±0.04*
Sialic acid	0.13±0.00	0.40±0.04*

Standard materials: total sugar as glucose, uronic acid as galacturonic acid, S-GAG (sulfated glycosaminoglycan) as chondroitin sulfate, sialic acid as N-acetylneuraminic acid. Asterisks indicate significant differences versus the non-fermented antler extract group determined using the Student’s t-test..

Fig 1. Changes of anti-complementary activity and total sugar during fermentation of deer antler by C. militaris. PSK, a known immuno-active polysaccharide, was used as a positive control. ITCH₅₀: inhibition of 50% total complement hemolysis. All data are presented as the mean±standard deviation (n=3); the different letters (a-e) indicate statistical significance (P<0.05).

많은 연구에서 건조된 녹용은 수분 12%와 무기물 34% 그리고 유기물 약 54%로 구성되어 있다고 보고되며, 유기물 중에 약리 활성 성분으로 ganglioside, 아미노산, 인산칼슘, 탄산칼슘, 콜라겐, 인지질, chondroitin, glucosamin 및 hyaluronic acid 등이 함유되었다고 보고되고 있다(Ha와 Yoon, 1996; Hong 등, 1991). 녹용의 활성 물질로 알려진 gangliosides(GM3, GM1, GD1a)는 sialic acid를 함유한 glycosphingolipids로, sialic acid 함량 측정은 gangliosides 함량을 간접적으로 알 수 있는 지표 물질이다. 한편 결합조직 중 복합단백질의 대부분을 차지하는 GAG는 중심단백질에 음으로 하전된 구성당쇄(uronic acid 등)에 기인한 반발력으로 펼쳐진 나뭇가지 형태의 구조로 공유 결합되어 있으며, 충격 흡수, 수분의 유지 및 전해질로서 생리학적으로 중요한 역할을 하고 있다. 이 중 80% 이상이 황산기로 치환된 S-GAG(chondroitin sulfate 등)로 구성되어 있으며 강력한 항염증 작용으로 관절염의 치료에 탁월한 효과가 있으며, hyaluronic acid 등은 관절액의 성분으로 관절의 윤활에 좋은 영향을 주며, keratan, heparan, heparin의 구성당인 glucosamine sulfate는 연골의 구성성분으로 관절염 치료에 긍정적인 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Park 등, 2005).

발효녹용 추출물의 항보체 활성

보체계는 C1부터 C9까지의 활성 단백질과 조절인자를 포함하여 20여 개의 혈중 순환 단백질들로 이루어져 있으며, 외부 감염 병원체와 같은 인자를 항체의 존재 여부와 무관하게 비특이적으로 제거하는 생체의 주요한 면역반응이다. 보체계의 활성화는 일련의 연속적인 반응에 의해 보체 단백질이 활성 인자로 분해되고 이들이 감염체 또는 병원체의 표면에 부착되어 최종적으로 membrane attack complex를 형성하여 세균 및 바이러스와 같은 병원체의 삼투용혈을 유도하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 보체계의 활성화 과정 중 생성되는 보체 단백질의 분해 산물은 대식세포와 림프구의 활성화 또는 면역증강 등과 밀접한 상관관계를 갖는 것으로 알려져 있다.

발효녹용 추출물의 보체계 활성화를 확인하기 위하여 complement fixation test 법(Kim 등, 2010)으로 항보체 활성을 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성대조군의 활성을 ITCH₅₀ 0%로 하여 시료의 활성화 정도를 확인한 결과, 양성대조군의 약 63%에 준하는 농도 의존적인 항보체 활성을 확인할 수 있었으며(Fig. 2A), 발효녹용 추출물은 우수한 보체계 활성능을 소유함이 인정되었다.

Fig 2. Complement activation by fermented deer antler extract by C. militaris. (A) Anti-complementary activity. (B) Anti-complementary activity under the conditions with/without Ca and Mg ions. (C) Images of crossed immuno-electrophoresis with goat anti-human C3 antibody. PSK, a known immuno-active polysaccharide, was used as a positive control. ITCH₅₀: inhibition of 50% total complement hemolysis. All data are presented as the mean±standard deviation (n=3); the different letters (a-g) indicate statistical significance (P<0.05).

보체가 활성화됨에 있어서 중추적인 역할을 하는 C3 단백질이 C3a와 C3b로 분해되는 과정에 따라 고전경로(classical pathway), 부경로(alternative pathway) 또는 렉틴 경로(lectin pathway)로 분류한다. 고전경로에 의한 C3 단백질의 활성화는 면역복합체(immune complex)의 존재로 인해 개시되는 반응임에 반해 부경로에 의한 활성화는 고전경로와는 다르게 특이 항체에 의한 면역복합체 형성 없이 C3 단백질이 활성화되는 것으로 알려져 있다. 따라서 부경로는 항체에 의해 항원 특이적 면역반응이 작동되기 전에 활성화되기 때문에 항원에 의해 감작되지 않은 인체의 중요한 면역방어기작으로 작동할 수 있다. 한편 고전경로의 활성화에는 Ca 및 Mg 이온이 모두 관여하고 부경로에는 Mg 이온만이 선택적으로 관여하는 것으로 보고되어 있는데(Janeway, 1968), 이를 통해 이상의 특정 금속이온이 제거된 반응계와 기본반응계의 활성화 정도를 비교할 경우 시료의 보체계 활성화 경로를 예상할 수 있게 된다. 따라서 발효녹용 추출물을 대상으로 항보체 활성 경로를 확인하고자 기본반응계인 GVB, Ca 이온이 제거된 Mg-EGTA-GVB 그리고 Ca과 Mg 이온이 모두 제거된 EDTA-GVB 반응계로 나누어 항보체 활성을 재차 측정하였다. 그 결과, Fig. 2B에서 나타낸 바와 같이 Ca 이온이 선택적으로 제거된 반응계에서는 Ca과 Mg 이온이 모두 존재하는 기본반응계에 비해 크게 감소한 활성이 나타났으나, 두 반응계 모두 농도 의존적인 활성 경향을 확인할 수 있었다. 한편 Ca 및 Mg 이온이 모두 제거된 반응계에서는 활성이 완전히 소실된 것을 확인할 수 있었다. 본 결과를 통해 발효녹용 추출물의 보체계 활성화는 고전경로와 부경로 모두를 경유하여 나타나는 것임을 추정할 수 있었다. 한편 이상의 결과는 2차원 면역전기영동을 이용해 C3 단백질의 활성화 경로를 재차 확인하고자 하였다. 발효녹용 추출물을 기본반응계와 특정금속이온이 제거된 반응계에서 각각 반응시킨 후 C3 단백질의 분해 여부를 확인한 결과, Ca과 Mg 이온이 모두 존재하는 정상반응계에서는 well로부터의 두 번째 침강선이 더 큰 비율로 나타남을 확인할 수 있었다(Fig. 2C). Well(오른쪽 아래 위치)로부터 첫 번째 침강선은 C3 단백질, 두 번째 침강선은 C3a와 C3b에 기인하는 것을 고려했을 때, 이는 발효녹용 추출물이 보체계의 강력한 활성화 인자로 작용함을 뒷받침할 수 있다. 반면 Ca 이온만이 선택적으로 제거된 반응계에서는 정상 반응계에서보다 두 번째 침강선의 비율이 상대적으로 낮아진 것을 확인할 수 있었다. 한편 Ca과 Mg 이온이 모두 제거된 반응계에서는 첫 번째 침강선만이 뚜렷하게 나타났고 두 번째 침강선은 관찰되지 않음으로써 활성화가 진행되지 않음이 확인 가능하였다. 이상의 결과를 종합하면 발효녹용 추출물에 의한 보체계 활성화는 고전경로 및 부경로 모두를 경유하여 나타남을 재차 확인할 수 있었다.

발효녹용 추출물의 림프구 증식 활성

비장은 혈액으로부터 항원을 수집하여, B 및 T 림프구의 성숙과 항원에 의해 자극받은 후 림프구의 분화가 이루어지는 주요 림프기관으로 비장 내 림프구의 증식은 면역시스템에 있어 매우 중요한 의미가 있다. BALB/c 마우스의 비장으로부터 획득한 림프구에 C. militaris로 발효한 녹용 추출물을 가한 경우에는 농도 의존적으로 림프구 증식이 증가하는 효과를 보여주었으며 500 μg/mL에서는 무첨가 대조군에 비해 약 30% 이상의 증식 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 LPS 및 ConA와 함께 첨가 시 더욱 뚜렷한 양상을 보였다(Fig. 3). 이상의 결과는 발효녹용 추출물이 성숙된 면역세포를 직접 증식시키는 mitogen 활성이 있음을 보여주는 것으로 따라서 발효 녹용의 투여가 외부로부터 항원에 노출 시, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 작동세포의 수를 증가시킴으로써 항원에 대한 효과적인 방어 효과를 유도할 수 있을 것으로 사료되었다.

Fig 3. Splenocyte proliferation activity of fermented deer antler extract by C. militaris. Splenocyte (1×10⁶ cells/mL) were treated with various concentrations of sample with lipopolysaccharide (LPS) or concanavalin A (Con A) in 96-well plate for 72 h. NC was used as a negative control. All data are presented as the mean±standard deviation (n=3); the different letters (a-c, A-D, Ⅰ-Ⅳ) indicate statistical significance (P<0.05). NC, negative control; LPS, lipopolysaccharide; ConA, concanavallin A.

발효녹용 추출물의 대식세포 활성화

대식세포는 선천 면역을 대표하는 세포 중 하나로, 세균 등 여러 병원체와 항원에 대하여 1차적인 방어 역할을 수행한다. 또한 외부 감염원에 대하여 여러 cytokine을 생산하여 제거할 뿐만 아니라 식세포 활동을 통해 다양한 염증을 매개하는데, 이러한 대식세포의 활성은 표면에 노출된 다양한 수용체를 자극함으로써 일련의 신호전달 과정을 거쳐 진행된다. 활성화된 대식세포는 여러 종류의 cytokine을 분비함으로써 다른 면역 세포를 자극하는 등의 신호 전달 역할을 수행하여 면역 반응의 전체적인 network를 형성하는데 기여한다. 대표적으로 IL-6, TNF-α와 같은 염증성 cytokine 및 T cell과 NK 세포의 활성화를 유도하는 IL-12를 생성함으로써 면역 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다. IL-6는 면역 체계 및 대사의 조절에 영향을 미치는 전염증성 cytokine으로 대식세포가 분비한 IL-6는 면역 반응 초기에 빠르게 생성되며 호중구의 모집, 증식 등을 조절하는 역할을 한다. 또한 IL-12는 감염에 대한 초기 염증반응과 T cell 및 NK 세포를 자극해 활성화하는 역할을 하며, TNF-α는 염증 과정의 주요 매개체로 IL-6 및 IL-12와 같은 다른 cytokine의 분비를 유도하여 종양세포에 대한 사멸을 유도한다.

C. militaris로 발효한 녹용 추출물의 직접적인 자극에 의한 대식세포의 cytokine 생산을 in vitro에서 측정한 결과, IL-6의 경우 0.48 μg/mL 농도부터 증가하기 시작하여 7.81 μg/mL의 저농도에서 높은 생산량을 보였으며 이후 농도 증가에 따른 완만한 생산 증가를 나타내었다(Fig. 4A). 이러한 사실은 C. militaris로 발효한 녹용추출물이 상대적으로 탁월한 IL-6 생산 유도능을 소유하였음을 시사하였다. 또한 TNF-α의 경우에도 녹용추출물의 경우 약 7.81 μg/mL 이상의 농도에서 농도 의존적으로 생산 유도능이 증가하는 경향을 보였다. 이러한 결과들로 미루어 발효녹용 추출물은 면역 활성화에 있어서 유효한 활성을 가질 것이라 사료되며 이러한 활성을 갖기 위한 최소 시료의 농도는 약 7.81 μg/mL일 것이라 추측된다(Fig. 4B). IL-12의 경우 발효녹용 추출물은 약 7.81 μg/mL 이상의 농도에서부터 농도의 증가에 따라 급격한 IL-12 생산의 증가를 했으며 500 μg/mL에서는 대조군인 LPS 생산량의 2.2배에 이르는 많은 생산량이 관찰되었다(Fig. 4C). 특히 IL-12의 분비가 확인됨에 따라 대식세포뿐만 아니라 NK 세포 또한 활성화할 수 있을 것으로 기대되었다.

Fig 4. Effect of fermented antler extract by C. militaris on IL-6 (A), TNF-α (B), and IL-12 (C) secretion in murine peritoneal macrophages in vitro. Murine peritoneal macrophages (2.5×10⁶ cells/mL) were treated with various concentrations of sample. The medium and LPS (1 μg/mL) represent the negative and positive controls, respectively. All data are presented as the mean±standard deviation (n=3); the different letters (a-f) indicate statistical significance (P<0.05). NC, negative control; LPS, lipopolysaccharide.

발효녹용 추출물의 정맥투여에 의한 NK 세포의 활성화

NK 세포는 체내 림프구의 약 5~10%를 차지한다고 알려져 있으며 바이러스, 외부항원과 같은 비자기(non-self) 세포뿐만 아니라 감염세포, 노후세포 및 종양세포를 파괴하는 기능을 갖는 것으로 알려져 있다(Funk 등, 2003). 이러한 NK 세포는 세포막에 MHC I형 분자(major histocompatibility complex class I molecule)의 발현이 정상적으로 이루어지지 않은 세포를 비자기 세포로 인식하여 직접 공격하기 때문에 cytotoxic T lymphocyte(CTL)가 공격하지 못하는 MHC I형 분자의 발현이 억제된 종양세포나 감염세포를 제거할 수 있는 경로 및 기전을 제공하여 체내에서 CTL과 상보적인 역할을 수행하는 것으로 밝혀져 있다(Farag 등, 2002). 또한 NK 세포는 정상세포가 아님을 감지할 경우 perforin을 분비해 target cell의 세포막에 구멍을 뚫고 그 구멍을 통해 granzyme이라는 단백질 분해효소를 분비해 세포 내부를 용해･사멸시키는 것으로 알려져 있다. 이외에도 IFN-γ 등의 cytokine을 분비해 대식세포뿐만 아니라 CTL과 같은 적응면역계 또한 활성화하는 것으로 알려져 있다(Smyth 등, 2005).

앞선 대식세포의 cytokine 생산 활성 실험 결과에서 예상되었던 C. militaris로 발효한 녹용 추출물의 NK 세포 자극활성의 결과는 Fig. 5와 같다. 발효녹용 추출은 target 세포 (YAC-1)에 대한 effect cell(splenocytes)의 비율(E/T ratio) 의존적인 종양세포에 대한 살해능을 나타내었다. 발효녹용 추출물의 경우 5 mg/kg과 25 mg/kg의 투여 농도에서 대조군에 비해 높은 활성이 확인되었고, 특히 5 mg/kg에서 최대 활성을 보였다. 이로써 발효녹용 추출물은 종양세포에 대한 살해능을 가지는 NK 세포의 활성화에 기여함을 확인할 수 있었으며, 또한 이 결과는 NK 세포 자극활성에 의한 항암활성도 발현할 가능성이 있음을 시사하였다.

Fig 5. Effects of intravenous administration of fermented antler extract by C. militaris on the cytolytic activity of NK cells. Sample-administered NK cells were co-cultured with the YAC-1 lymphoma in a CO₂ incubator (36.5°C) for 6 h. NC (saline) represents the negative control. All data are presented as the mean±standard deviation (n=3); the different letters (a-b, A-C, Ⅰ-Ⅲ) indicate statistical significance (P<0.05).

발효녹용 추출물의 경구투여에 의한 혈중 cytokine의 변화

발효녹용 추출물의 경구투여에 의한 실험동물 혈청 중 cytokine 함량 변화를 관찰하였다. 그 결과, Fig. 6A에 나타난 바와 같이 혈중 IL-6의 경우 투여농도 의존적으로 함량 증가 경향을 나타냈으며 특히 150 mg/kg 투여군에서는 무투여 대조군에 비해 약 1.6배, 500 mg/kg 투여군에서는 1.9배 증가한 결과를 보여 주었다. 또한 혈중 IL-12의 경우에는 각 투여군에서 혈중 함량이 급격히 증가하는 경향을 보였으며 500 mg/kg 투여군에서 3.1배, 150 mg/kg 투여군에서는 최대 5.3배 증가한 것으로 평가되었다(Fig. 6B). 이러한 사실은 발효녹용 추출물의 면역세포 활성화가 in vitro뿐 아니라 경구투여를 통한 in vivo에서도 유효함을 반증하는 결과이다.

Fig 6. Effects of oral administration of fermented antler extract by C. militaris on production of IL-6 (A) and IL-12 (B) in sera. The concentrations of IL-6 and IL-12 in sera were determined by ELISA kits. All data are presented as the mean±standard deviation; the different letters (a-c) indicate statistical significance (P<0.05). NC (saline) represents the negative control.

발효녹용 추출물의 경구투여에 의한 NK 세포의 활성화

이전 실험에서 발효녹용 추출물의 정맥투여에 의한 NK 세포 활성화 효과가 확인된바, 경구투여를 통한 효과를 검증하고자 하였다. 21일 동안 1일 1회 발효녹용 추출물을 0, 150, 500 mg/kg의 농도로 경구투여하였으며, 투여 종료 후 다음 날 마우스를 희생하여 비장을 적출하고 비장세포를 분리하여 effector cell로 사용하였고 혈액암세포주인 YAC-1 lymphoma를 target cell로 하여 target cell에 대한 effector cell의 비율(E/T ratio)을 100:1, 50:1 및 25:1로 설정하고 그 살해 활성을 확인하였다. 그 결과 Fig. 7에 나타난 바와 같이 투여농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며 가장 높은 살해 활성을 나타낸 500 mg/kg 투여군의 경우 E/T ratio 100:1 기준으로 대조군 대비 약 1.33배의 활성임을 확인하였다. 위 결과를 통해 C. militaris로 발효한 녹용 추출물은 정맥투여뿐 아니라 경구투여 시에도 NK 세포와 같은 선천면역계를 효과적으로 활성화할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Fig 7. Effects of oral administration of fermented antler extract by C. militaris on the cytolytic activity of NK cells. Sample-administered NK cells were co-cultured with the YAC-1 lymphoma in a CO₂ incubator (36.5°C) for 6 h. NC (saline) represents the negative control. All data are presented as the mean±standard deviation (n=3); the different letters (a-b, A-C, Ⅰ-Ⅲ) indicate statistical significance (P<0.05).

본 연구는 동충하초균, Cordyceps militaris로 발효한 녹용(Cervi Parvum Cornu) 추출물의 면역자극 활성을 규명하기 위해 수행되었다. 발효녹용 추출물은 비발효 추출물에 비해 총당(29.79%), 우론산(5.56%), sulfated glycosaminoglycan(S-GAG)(2.21%) 및 시알산(0.40%)의 함량이 상대적으로 높았으며, C. militaris에 용량 의존적으로 강력한 항보체 활성을 나타냈다. 또한 Ca 이온이 없는 상태에서 anti-human C3를 활용한 교차 면역전기영동 결과 및 항보체 활성 실험 결과로부터 발효녹용 추출물에 의한 보체계 활성화는 고전적 경로 및 부경로를 모두 경유함을 확인할 수 있었다. 발효녹용 추출물은 복강 대식세포에 의한 IL-6, IL-12 및 TNF-α와 같은 다양한 cytokine의 생성을 증가시켰으며 발효녹용 추출물의 정맥 투여(i.v.)는 YAC-1 림프종에 대한 자연살해(NK) 세포의 살해능을 강화하는 것으로 확인되었다. 한편, 발효녹용 추출물의 경구투여는 혈청 내 사이토카인 수준의 증가를 유도하였을 뿐 아니라, 용량 의존적으로 종양세포에 대한 NK 세포 매개 세포독성을 크게 향상시켰다. 위의 결과로부터 C. militaris로 발효한 녹용 추출물은 면역 체계를 강력히 자극시킬 수 있음이 확인되었으며, 따라서 본 소재는 인체 건강에 유익한 기능 물질로 개발 가능한 잠재성이 큰 소재로 사료된다.

본 연구는 2021학년도 경기대학교 학술연구비(일반 연구과제) 지원에 의해 수행되었음.