현대 사회에서 수명이 늘어나면서 운동 부족, 건강에 해로운 식습관, 정신적 스트레스 등은 동반 질환 위험을 증가시킨다. 골관절염(osteoarthritis, OA)과 같은 근골격계 질환은 전 세계적으로 가장 흔한 연령 관련 질병으로 간주되며, 장애를 동반할 뿐만 아니라 사회경제적 비용 증가에 큰 영향을 미친다(Mobasheri 등, 2015). OA는 관절 연골의 손상, 윤활막 염증, 심한 통증, 강직을 특징으로 하며, 대부분의 퇴행성 및 연령 관련 질병과 마찬가지로 산화 스트레스가 발병의 중요한 원인임이 확인되었다(Riegger 등, 2023). 또한, 염증(inflammation)이 관절염 및 근골격계 질환의 발병과 진행에 기여하게 된다(Woolf와 Pfleger, 2003).

반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 자유 라디칼의 일종으로, 세포 내에서 다양한 생물학적 과정에서 생성되며, 적절한 양은 세포 신호 전달 및 면역 반응에 필수적이다. 내적으로 생성된 ROS의 약 90%는 adenosine triphosphate 생산 과정에서 전자 누출로 인해 미토콘드리아 전자 전달 사슬에서 유래된다(Balaban 등, 2005). 그러나 불규칙한 대사과정이나 미토콘드리아 기능의 이상, 염증과 면역반응의 과도한 활성화, 그리고 항산화 방어 시스템의 손상은 과도한 ROS 생성을 유발하고(Lepetsos와 Papavassiliou, 2016) 궁극적으로는 산화적 스트레스를 초래하게 된다. 산화적 스트레스는 세포의 DNA, 단백질, 지질 등을 손상시켜 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 항상성을 파괴한다(Domazetovic 등, 2017). ECM은 다양한 세포와 조직 사이에서 구조적 지지뿐만 아니라 신호 전달, 세포 운동, 세포 분열 등 다양한 생리적 기능을 담당하고 있으며 주요한 구성 요소는 섬유 모양의 단백질인 콜라겐(collagen)이다. ECM의 전환은 matrix metalloproteinases(MMPs)와 tissue inhibitors of metalloproteinases에 의해 조절되지만 다양한 요인에 의한 조직 손상은 ECM의 collagen 분해를 유발하여 염증을 더욱 강화시킨다(Schwarz 등, 2022). 따라서 염증이 있는 조직의 ECM의 분해 억제는 잠재적인 OA 치료 방향이 될 수 있다.

구주소나무(Pinus sylvestris L.)는 중국, 러시아, 몽골의 일부 지역에 자생적으로 분포한다. 저온과 가뭄에 대한 저항성이 높고 낮은 토양 비옥성에 적응성이 강하고 생장이 빠르다(Gao 등, 2022). 구주소나무는 다 자라면 25~45 m, 몸통 지름 1~1.7 m까지 자라는 상록 침엽수로 병원체에 대해 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Fayemiwo 등, 2014). 또한, 폴리페놀이 풍부한 구주소나무의 껍질 추출물이나 바늘에서 추출한 폴리프레놀은 항종양 효과가 있음이 보고되었다(Amalinei 등, 2014; Murazov 등, 2021). 이전 선행 연구에서 우리는 150 mM HCl/60% 에탄올로 유발한 급성위염 동물 모델에 구주소나무 추출물이 산화적 스트레스를 억제하고, 염증성 사이토카인 억제를 통해 염증을 개선함을 보고하였다(Lee 등, 2022).

본 연구에서는 인간 골육종 세포 라인 U2OS 및 monosodium iodoacetate(MIA)로 유발된 골관절염 쥐 모델에서 구주소나무의 약리학적 효과 및 그 기전을 조사하였다. 구주소나무는 항산화 및 항염증 효과를 발휘하여 이러한 결과를 아래와 같이 보고하고자 한다.

시료 추출

200 g의 구주소나무에 10배수의 증류수를 가하여 2시간 추출 후 농축과 건조가 진행되었으며, 제조된 구주소나무 추출물(이하, PS)을 Traditional Medical Research Institute에서 파우더 형태로 공급받아 -80°C에서 냉동 보관하였다가 실험 직전 증류수에 녹여 사용하였다.

시약

Alfa Aesar에서 aluminium chloride를 구입하여 사용하였다. Gallic acid, monosodium iodoacetate, quercetin, sodium carbonate, diethylene glycol 및 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent는 Sigma Aldrich에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체인 NF-κB, Cox-2, TNF-α, MMP-2, -3, -13, histone, β-actin은 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하여 사용하였다. 2차 항체는 GeneTex, Inc.에서 구입하여 사용하였다. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 구입하였으며, nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare에서 구입하였다. ECL Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였으며, 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit은 Thermo Scientific에서 구입하였다.

DPPH 및 ABTS 소거능 측정

PS의 DPPH 자유라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능은 이전에 보고된 방법으로 측정하였다(Jeong 등, 2023). 양성대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하였으며, PS의 항산화 활성은 the half maximal inhibitory concentration (IC₅₀)으로 표시하였다.

세포 생존율 측정

세포 생존율 실험에서는 각 well 당 4×10³ cells/200 μL/well을 사용하고, 24시간 동안 배양하였다. PS는 4시간 동안 전처리하였으며, 그 후 H₂O₂ 500 μM을 처리하고 하룻밤 동안 유지하였다. 세포 생존율은 CCK-8(Dojindo Molecular Technologies Inc.)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

MitoSox 및 MitoTracker 분석

미토콘드리아의 ROS 측정 및 integrity는 MitoSox(Invitrogen^TM)와 MitoTracker(MitoTracker^TM Red CMX Ros, Invitrogen^TM)를 이용하여 분석하였다. PS는 4시간 동안 전처리하였으며, H₂O₂ 500 μM 처리 후 overnight 하였다. MitoSox가 처리된 세포는 인큐베이터에서 20분 동안 유지하였다. 4% paraformaldehyde를 이용하여 세포를 고정하였고, Red signal은 형광 필터 장비(ZEISS, LSM 700)를 이용하여 200배 조건에서 분석하였다.

면역조직화학 염색

U2OS 세포에서 Sirt1, MTF1 및 4-hydroxynonenal(4-HNE)를 분석하기 위해 면역조직화학 염색을 시행하였다. 각 이미지는 광학 현미경(Olympus BX51)을 사용하여 촬영하였다. 각 이미지의 양성 신호의 정량 분석은 Image J 1.52 software(NIH)를 사용하였다.

골관절염 실험동물

7주령의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 흰쥐를 대한바이오링크에서 구입하여 물과 고형사료(조단백질 18% 이상, 조회분 8.0% 이하, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 나트륨 0.25% 이상, 인 0.85% 이상, 칼륨 0.55% 이상, 마그네슘 0.15% 이상, NIH-41, Zeigler Bros., Inc.)를 충분히 공급하며 일주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실 환경조건은 명암 주기는 12시간 주기이며, 온도는 22±2°C, 습도는 50±5%로 조절하였다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인(번호: DHU2022-117)을 얻어 실험을 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다.

실험군은 총 4군으로 정상군(Normal), 대조군(Control), indomethacin 2 mg/kg으로 경구 투여한 양성대조군(INDO), 구주소나무 열수추출물 200 mg/kg으로 경구 투여한 실험군(PS)으로 각 군당 8마리씩 나누어 실험을 진행하였다. 정상군을 제외한 모든 동물은 골관절염 유발을 위해 오른쪽 무릎 관절낭 주변을 깨끗이 제모한 후 골관절염 유도 물질인 MIA를 31G insulin 주사기(Becton Dickinson)를 사용하여 오른쪽 무릎 관절강 안에 50 μL(80 mg/mL)씩 투여하였다. MIA 투여 일주일 후에 뒷다리 체중 부하를 측정하였고 양쪽 다리의 수치에 차이가 크지 않을 경우 유발되지 않았다고 판단하였으며, 골관절염이 유발된 rat만을 선별하여 사용하였다. INDO군과 PS군은 증류수에 녹여 매일 일정한 시간에 해당 약물을 2주간 경구 투여하였다.

2주간의 투여 후, isoflurane을 사용해 흡입 마취하여 혈액을 복대정맥에서 채취하였으며, 관절 조직을 적출하였다. 그 후 채취한 혈액은 1,508×g로 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었으며, 혈청과 관절 조직은 실험에 사용하기 직전까지 -80°C에 보관하였다.

혈청 내 염증성 사이토카인 분석

혈청 내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β assay kit(Koma Biotech)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

관절조직 western blotting

관절조직에서 분리된 세포질과 핵 내의 단백질 발현을 측정하기 위해 일정량의 단백질을 10~12% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동한 후 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 그 후 membrane에 측정하고자 하는 1차 항체(PBS-T 1:1,000으로 희석)를 처리하여 4°C에서 overnight 24시간 반응시킨 다음 PBS-T를 사용하여 세척하였다. 그다음 각각의 1차 항체에 맞는 2차 항체(PBS-T 1:3,000으로 희석)에 2시간 상온에서 반응시킨 후 PBS-T로 세척하였다. Membrane을 ECL 용액에 노출한 후 Sensi-Q2000 Chemidoc을 사용하여 단백질 발현을 band의 형태로 촬영하여 확인하였으며, ATTO Densitograph Software(ATTO Corporation) 프로그램을 사용하여 각각의 단백질의 발현량을 정량하여 실험군 간 비교하였다(Fold of Normal).

통계분석

실험 데이터는 평균(Mean)과 표준오차의 평균(SEM)으로 표시하였다. SPSS(Version 26.0, IBM)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 사용한 후, least-significant differences(LSD) test로 사후검정을 하여 유의수준을 P<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성

OA의 병인과 기저 메커니즘은 복잡하지만, 산화 스트레스 및 염증 인자 네트워크와의 유의미한 연관이 많은 보고가 되어있다(Lepetsos와 Papavassiliou, 2016). 대부분의 천연 항산화제는 다기능성을 보유하고 있기에 항산화 특성은 다양한 방법으로 평가된다. 이러한 평가법에는 분광법을 이용한 DPPH와 ABTS 분석법이 존재한다(Wang 등, 2018a). DPPH는 유리 라디칼과의 항산화 반응을 평가하며, 실험 수행의 용이성, 경제성, 재현성 등의 이점으로 널리 이용된다. 또한 ABTS는 넓은 pH 범위에서 평가되며, 물과 유기 용매에 용해되므로 친유성 및 친수성 화합물의 항산화 능력을 측정하는 데 이용된다. PS의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 분석 결과, 우수한 라디칼 소거 가능성이 나타났다(DPPH, IC₅₀＝31.14±0.85 μg/mL; ABTS, IC₅₀＝35.02±0.38 μg/mL)(Fig. 1).

Fig 1. DPPH and ABTS radical scavenging activities of Pinus sylvestris L. water extract (PS). Ascorbic acid was used as a positive control. All values are expressed as means±SEM.

세포 생존율 측정

PS 처리에 의한 U2OS 세포의 세포 생존율은 농도 의존적으로 증가하는 것을 나타냈다. 또한 H₂O₂를 처치한 후 세포 생존율을 확인하였을 때 Normal 대비 H₂O₂ Control이 43.1%가량 유의하게 감소하였고(P<0.001), 이는 PS 처치에 의해 PS50은 1.5배(P<0.05), PS100은 1.6배(P<0.01), PS200은 1.6배(P<0.01)로 유의하게 증가하였다(Fig. 2).

Fig 2. Cell viability of Pinus sylvestris L. water extract (PS) with or without H₂O₂ treatment. Cell viability in U2OS cells detected by CCK-8 assay. PS was pretreated for 4 h, followed by treatment with 500 μM H₂O₂ and incubation overnight. Data are shown as means±SEM of three independent experiments. ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared with normal group, ^*P<0.05, ^**P<0.01 compared with H₂O₂-treated control group.

LIVE/DEAD 세포, MitoSox 및 MitoTracker 분석

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity kit은 세포의 생존 여부를 plasma membrane 무결성과 esterase 활동을 기반으로 하는 간단하고 빠른 이중 색상 분석 방법이다(Liu와 Fang, 2022). Fig. 3과 같이 U2OS 세포에서 PS가 DEAD 세포에 미치는 영향을 확인하였다. H₂O₂ Control에서의 DEAD 세포는 Normal 대비 6.8배 탁월하게 증가하였으나(P<0.001), PS 처리에 의해 42.6% 현저하게 감소하였다(P<0.001). MitoSox는 세포 내 미토콘드리아에 존재하는 ROS를 감지하는 데 사용되며, ROS는 세포 손상 및 미토콘드리아의 기능 이상과 연관된 다양한 생리적 및 병리학적 상황에서 생성될 수 있다(Kauffman 등, 2016). 따라서 MitoSox 분석은 미토콘드리아 내 ROS의 양을 측정하고 세포 미토콘드리아의 산화 스트레스 상태를 평가하는 데 사용된다. U2OS 세포에 H₂O₂로 세포 손상을 야기한 후 MitoSox를 분석한 결과, H₂O₂만 처리한 Control은 Normal 대비 3.57배 유의하게 증가하였고(P<0.001), 이는 PS 처리에 의해 50.32% 유의하게 감소하였다(P<0.001). 그다음 미토콘드리아의 무결성에 대한 MitoTracker 평가를 실시하였다. MitoTracker Red는 음으로 하전된 분극화된 미토콘드리아에 흡수되기에 미토콘드리아 막전위에 의존한다(Buckman 등, 2001). H₂O₂만을 처리한 Control은 Normal 대비 62.73 % 유의하게 감소하였고(P<0.001), 이는 PS 처리에 의해 1.85배 유의하게 증가하였다(P<0.05).

Fig 3. Live/dead cell, MitoSox, and MitoTracker analysis after Pinus sylvestris L. water extract (PS) pretreatment. in U2OS cells. After treating PS (200 μg/mL) in U2OS cells for 4 h and then H₂O₂ was treated at 500 μM and incubation overnight. Normal, non-treated group; H₂O₂ Control, only H₂O₂-induced group; PS200, H₂O₂-induced and group treated with PS 200 μg/mL. Data are shown as means±SEM (n=4/each group). Significance: ^###P<0.001 compared with normal group and ^*P<0.05, ^***P<0.001 compared with H₂O₂-induced control group.

조직 내 항산화 관련 인자 분석

Sirtuin 1(Sirt1)은 산화 스트레스 반응에 관여하는 NAD⁺ 의존성 deacetylase로 ROS의 과잉 생산을 억제하는 역할을 한다(Ferrara 등, 2008). 또한 MTF1은 아연 항상성과 관련된 유전자의 발현을 조정하고, 금속 독성 및 산화 스트레스로부터 보호하는 세포 아연 센서 역할을 한다(Andrews, 2001). 특히 과잉 생산된 ROS에 의한 지질과산화는 OA의 발병과 깊은 연관성이 있으며, 4-HNE는 OA 발달 과정에서 연골 변성과 연골하골 재형성에 미치는 역할을 수행한다. U2OS 세포에 H₂O₂로 세포 손상을 야기한 후, 면역조직 화학 염색을 통하여 Sirt1, MTF1 및 4-HNE를 분석하였다. H₂O₂만을 처리한 Control에서는 Sirt1과 MTF1의 발현이 Normal 대비 각각 67.0%, 66.2%로 유의하게 감소하였고(P<0.01), 이는 PS 처리에 의해 Sirt1은 2.14배 증가하는 경향을 보였으며, MTF1은 2.12배로 유의하게 증가하였다(P<0.05). 반면에 4-HNE는 H₂O₂만을 처리한 Control이 Normal 대비 26.7배 유의하게 증가하였고(P<0.001), 이는 PS 처리에 의해 50.3%로 유의하게 감소하였다(P<0.001)(Fig. 4).

Fig 4. Pinus sylvestris L. water extract (PS) regulated antioxidant related to factors in U2OS cells after treating PS (200 μg/mL) in U2OS cells for 4 h and then H₂O₂ was treated at 500 μM and incubation overnight. Normal, non-treated group; H₂O₂ Control, only H₂O₂-induced group; PS200, H₂O₂-induced and group treated with PS 200 μg/mL. Data are shown as means±SEM (n=4/each group). Significance: ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared with normal group and ^*P<0.05, ^***P<0.001 compared with H₂O₂-induced control group.

체중 변화 및 뒷다리 체중 부하 측정

MIA의 관절강 내 주사는 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase를 억제하여 연골세포 해당 작용을 방해하고 염증뿐만 아니라 연골세포 사멸, 혈관신생, 연골하골 괴사 및 붕괴를 초래한다(Zhang 등, 2023). 또한 MIA 주사는 서있는 동안 동측 뒷다리의 정적 체중 부하 결손의 기계적 민감도를 유발하게 되며 이는 통증의 지표로 사용된다(Nakazato-Imasato와 Kurebayashi, 2009). 실험 기간에 측정된 체중 변화는 Normal 60.1±6.4, Control 65.6±4.3, INDO 61.1±14.2, PS 62.3±8.9로 나타났다(Fig. 5A). MIA 유발 후 2주간의 체중 측정에서 모든 군에서 체중이 유의하게 증가하였으며(P<0.001), 각 군 간의 유의성은 없었다. 골관절염을 유발한 후 뒷다리 체중 부하를 측정하였을 때, Control이 Normal에 비해 유의하게 감소하였고(P<0.001), 주 수가 증가함에 따라 뒷다리 체중 부하가 개선되었으나 약물군보다 낮았다. 특히 PS의 투여는 7일부터 Control 대비 유의하게 증가하였고(7일, P<0.01; 14일, P<0.001), 이를 통해 MIA 처리에 의해 유도된 연골조직의 통증이 PS 보충으로 유의하게 완화하였다(Fig. 5B).

Fig 5. Body weight change of the experimental groups (A) and the relative changes of hindpaw weight distribution (B). The drugs were orally administered for two weeks after the induction of osteoarthritis (OA). Data are shown as means±SEM (n=8/each group). ^###P<0.001 compared with normal group, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared with monosodium iodoacetate (MIA)-treated control group. PS, Pinus sylvestris L. water extract; INDO, indomethacin.

혈청 내 염증성 사이토카인 분석

OA 환자의 혈액, 활액, 활액막, 연골하골 및 연골에서 TNF-α, IL-1 및 IL-6의 수준이 상승하는 것으로 나타났으며, 이는 OA 병인에서 중요한 역할을 담당한다. TNF-α는 염증 세포의 염증 부위로의 유입과 부착을 모두 향상시키고, OA 환자의 관절 연골과 윤활액 모두에서 농도가 증가한 IL-1β는 IL-6의 합성에 영향을 미친다(Wang 등, 2018b). 질병이 진행되는 동안 IL-1은 과산화물과 수산화 자유라디칼을 생성하는 ROS의 생성을 증가시키며, 이는 관절 연골을 직접적으로 손상시킨다. TNF-α는 IL-6의 생성을 자극할 수 있으며, IL-1과 TNF-α는 모두 iNOS, COX-2 등의 생성을 유도하여 연골 파괴를 유발한다(El Mansouri 등, 2011). 혈청 내 염증성 사이토카인을 분석한 결과(Fig. 6), MIA를 처치한 Control은 Normal 대비 각각(TNF-α 1.28배, P<0.05; IL-6 2.09배, P<0.001; IL-1β 3.50배, P<0.001) 유의하게 증가하였다. 반면에 PS의 처리는 Control 대비 각각(TNF-α 25.78%, P<0.01; IL-6 24.47%, P<0.05; IL-1β 61.08%, P<0.001) 유의하게 감소하였다. 특히 IL-1β의 경우 INDO군보다 20.94% 더 효과적으로 감소시켰다.

Fig 6. Pinus sylvestris L. water extract (PS) inhibited the secretion of pro-inflammatory cytokines. Data are shown as means±SEM (n=8/each group). ^#P<0.05, ^###P<0.001 compared with normal group, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared with MIA-treated control group. INDO, indomethacin.

Western blotting

관절조직 내 염증 관련 인자 발현량: NF-κB는 다양한 병리학적 및 생리학적 과정, 특히 OA의 염증 발생과 관련된 유전자 전사를 조정하는 데 중요한 역할을 하는 이량체 전사인자이다. NF-κB 신호 전달 경로의 활성화는 전염증성 표적 유전자를 활성화하기에 NF-κB 신호전달 경로를 차단하는 것이 OA 치료에 선호되는 전략이다(Wang 등, 2023). 관절조직에서 NF-κB 관련 단백질인 NF-κB, COX-2 및 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현을 확인하였다(Fig. 7A). NF-κB의 활성은 Normal 대비 Control에서 1.67배 유의하게 증가하였고, 이는 약물 처치에 의해 유의하게 감소하였다(INDO 22.97%, P<0.01; PS 16.14%, P<0.05). 또한 NF-κB의 활성은 COX-2와 TNF-α 같은 염증성 단백질 발현을 증가시켰다. 본 연구에서 두 인자는 Control에서 각각 1.51배, 1.30배로 유의하게 상승시켰으며, 이는 PS 처치에 의해 각각 24.65%, 11.19%로 유의하게 감소하였다.

Fig 7. Pinus sylvestris L. water extract (PS) inhibited the protein expressions of inflammatory proteins (A) and matrix metalloproteinases (MMPs) (B). Data are shown as means±SEM (n=7/each group). ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared with normal group, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared with monosodium iodoacetate (MIA)-treated control group. INDO, indomethacin.

관절조직 내 MMPs 관련 인자 발현량: 염증의 존재는 연골세포의 표현형 분화에 관여하는 수많은 유전자의 발현을 억제하며, 이는 연골세포의 신진대사, 변형 및 재생에 부정적인 영향을 미쳐 질병의 진행을 초래한다(Burrage 등, 2006). 따라서 전염증성 사이토카인은 MMPs 및 프로스타글란딘의 생성을 유도하고 프로테오글리칸 및 제2형 콜라겐의 합성을 억제할 수 있다. 따라서 이들은 OA에서 연골 기질 분해와 뼈 재흡수에 중추적인 역할을 한다(Łęgosz 등, 2020). MMPs는 결합 조직에 널리 존재하며 효소 활성이 아연 이온에 의존하는 protease superfamily이며, 주로 조직 리모델링 및 세포 외 기질 분해를 담당한다. MMP-2와 MMP-3는 골관절염에서 증가하며 이 효소들은 관절의 비콜라겐 기질 성분을 분해한다. 반면에 MMP-13은 콜라겐 외에 proteoglycan 분자인 aggrecan을 분해하여 기질 파괴에 이중 역할을 한다. 관절조직 내 MMPs를 분석한 결과(Fig. 7B), MIA를 처치한 Control은 Normal 대비 각각 MMP-2 1.32배, MMP-3 1.47배, MMP-13 1.35배로 유의하게 증가하였다(P<0.001). 반면에 PS의 처리는 Control 대비 각각 MMP-2 16.35%(P<0.01), MMP-3 17.43%(P<0.05), MMP-13 13.86%(P<0.05) 유의하게 감소하였다.

조직병리학적 관찰

관절조직의 proteoglycan 소실 정도를 관찰하기 위해 safranin-O 염색을 실시한 결과(Sa 등, 2020), Control에서는 골관절염이 유발되어 관절조직이 변형되고, proteoglycan의 대부분이 파괴되어 연골의 형태학적 변화를 야기시켰다. 반면에 PS 처치는 Control 대비 관절 조직의 변형과 proteoglycan의 소실이 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 8).

Fig 8. Histopathoological analysis using safranin O staining. Pinus sylvestris L. water extract (PS) treatment alleviated rat osteoarthritis through the reduction of proteoglycan destruction. INDO, indomethacin.

본 연구에서는 U2OS 골육종 세포주 및 MIA의 관절강 내 투여로 유발한 골관절염 흰쥐 모델에서 구주소나무의 약리학적 효과 및 그 기전을 조사하였다. 구주소나무는 H₂O₂로 유발한 미토콘드리아의 ROS를 탁월하게 억제했으며, 미토콘드리아의 막 전위 변화를 유의적으로 개선하였다. 또한, 지질과산화의 최종 산물인 4-HNE를 현저하게 감소시켰다. 골관절염을 유발한 흰쥐의 혈청 및 관절조직을 분석한 결과, 구주소나무 경구 투여는 혈청 내 염증성 사이토카인 억제 및 관절조직 내 NF-κB 관련 염증성 단백질과 MMPs 단백질 발현 조절을 통하여 염증을 개선하였다. 따라서 구주소나무는 추후 항산화 및 항염증 효과를 통해 다양한 염증성 질환을 완화할 것으로 사료된다.

본 성과물은 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ015272012022) 및 정부(과학기술정보통신부, No.2018R1A5A2025272; 교육부, 2021R1I1A1A01059605)의 재원을 받아 수행된 연구이다.