초고령 사회로 진입함에 따라 다양한 만성 질환이 급격히 증가하고 있으며, 이를 예방하고 치료하기 위한 영양 보충제, 건강식품으로 활용할 수 있는 새로운 식량자원에 관한 관심이 높아지고 있다(Baek 등, 2017). 특히 오메가-3 지방산에 관한 관심이 증가하면서 소비자들은 어류, 크릴새우와 같은 천연물 유래 오일 등 다양한 오일 제품의 영양적 가치를 선호하고 있다(Bester 등, 2010). 대표적 새로운 식량자원인 식용 곤충은 단백질이 풍부하고 식물성 단백질에 비해 높은 소화율을 나타내어 대체 단백질 소재로 각광받고 있으며 불포화지방산과 구리, 철, 마그네슘과 같은 다양한 무기질이 다량 함유되어 있어 영양가가 매우 높다(Gravel과 Doyen, 2019; Rumpold와 Schlüter, 2013). 그뿐만 아니라 동물성 단백질 소재임에도 불구하고 육류에 비해 토지, 물 및 사료 등의 자원 투입과 온실가스 배출이 적어 환경문제 및 식량 부족 문제를 해결하는 데 좋은 급원으로 주목받고 있어 곤충자원의 식･약용 소재화를 위한 연구들이 활발히 이루어지고 있다(Wade와 Hoelle, 2020).

식용 곤충 중 갈색거저리(Tenebrio molitor) 유충인 밀웜은 2010년부터 식품위생법 제7조 1항에 따라 식품 원료로 인정하고 있어 스낵, 식품첨가물 등 다양하게 활용되고 있다(Korean Law Information Center, 2023). 밀웜은 필수아미노산이 풍부한 양질의 단백질로 구성되어 있으며 불포화지방산이 많고 비타민, 무기질을 함유하고 있어 단백질 대체 소재로 각광받고 있다(Hong 등, 2020). 곤충 섭취에 대한 거부감으로 인해 밀웜은 주로 대체 단백질 분말로 많이 활용되는데 밀웜을 건조 후 바로 분쇄할 경우 높은 지방함량으로 인한 응집성과 낮은 분쇄 효율, 산패로 인한 품질 저하와 저장성 감소 등의 문제가 발생하므로 탈지 과정을 거친다(Bußler 등, 2016). 이때 수득된 밀웜오일은 주로 폐기되는데, 최근에는 이를 이용한 품질특성과 기능성 연구들이 수행되고 있다. 밀웜오일은 식물성유지와 유사하게 불포화지방산과 γ-토코페롤과 같은 생리활성 영양소를 함유하고 있다고 알려져 있으며 상처 회복, 혈중 지질 감소 등이 보고되고 있으나, 현재까지 밀웜 유래 단백질에 비해 오일에 관한 연구는 미비한 실정이다(Jeon 등, 2016; Kim 등, 2021; Lee 등, 2022).

현재 보편화된 밀웜의 탈지 공정은 주로 용매 추출 또는 압착 추출법을 사용하고 있는데, 이는 갈변, 잔존 용매에 따른 독성, 환경오염, 낮은 효율 등이 보고되어 있다(Kim과 Kim, 2020). 초임계유체 추출은 화학적 반응과 독성 등이 없고 재활용이 가능하며 비극성을 띠고 있어 친환경적 기술로 알려져 있으며, 확산계수, 용해도, 점도 등의 상태가 쉽게 조절될 뿐만 아니라 물질 내부의 효과적 침투로 인해 유효성분 추출에 적합하여 최근 기존 방법의 대안으로 활용되고 있다(Martínez와 de Aguiar, 2014). 따라서 본 연구에서는 밀웜단백질 생산 가공 과정 시 발생하는 지질을 고부가가치화하기 위하여 추출 방법(압착, 용매, 초임계유체)을 달리한 밀웜오일을 생산한 뒤 이에 따른 이화학적 특성과 항산화 활성을 비교･분석하고자 하였다.

밀웜오일 제조

밀웜은 (주)명품에서 9주간 사육 후 48시간 절식한 것을 2022년 10월에 제공받아 추출하였다. 압착 추출(TmoP)은 세척 후 1차로 5분간 1,000 W로 마이크로웨이브(LG Electronics) 건조를 하였으며, 균일한 건조를 위하여 교반과정을 거친 뒤 2차로 6분간 추가 건조하였다. 건조된 밀웜 분말은 (주)풍진식품기계에서 구입한 디지털 전자동 압착착유기를 이용해 700 kgf/cm² 압력으로 25분간 착유하여 오일을 획득하였다. 헥산 추출(TmoH)과 초임계유체 추출(TmoS)은 밀웜을 3일간 동결건조 후 200 mesh로 분쇄하여 실험하였으며, 헥산 추출 시 10배수의 n-hexane(Dongsung Co.)을 첨가하여 실온에서 48시간 동안 교반하여 지방을 용출하고 여과하였다. 이 과정을 2회 반복 후 여과한 용액은 감압 농축하여 헥산을 제거한 뒤 오일로 사용하였다. 초임계유체 추출은 초임계유체 추출기(ISA-SEFE-0500-0700-080, Ilshin Autoclave)를 이용하여 추출하였다. 추출 수율은 압착 추출(TmoP)법이 20%, 헥산 추출(TmoH)법이 30%, 초임계유체 추출(TmoS)법이 32%로 TmoS> TmoH> TmoP 순이었다.

품질 안전성 및 색도 평가

품질 안전성 평가를 위해 Association of Official Analytical Chemists 분석법(AOAC, 2019)을 기준으로 산가(AV), 과산화물가(PV) 및 아니시딘가(p-AV)를 측정하였다. 총 산화가는 TOTOX＝2×과산화물가+아니시딘가 공식에 대입하여 산출하였다. 또한 오일의 색도를 분석하기 위해 각 오일을 5 mL씩 Petri dish(60×15 mm)에 취한 뒤 색도계(CR-400, Konica Minolta)를 이용하여 L^*값(명도), a^*값(+적색도/-녹색도), b^*값(+황색도/-청색도)을 측정하였다.

토코페롤 함량 분석

토코페롤은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, LC-20AD, Shimadzu)와 UV 형광 검출기(Shimadzu), HPLC용 컬럼[Lichrosphere Diol 100(250×4 mm, 5 μm), Merck]을 이용해 분리 및 검출하였다. 이동상은 0.9% isopropanol(Daejung)을 함유한 n-hexane이 사용되었고, 이동상 유량은 1 mL/min으로 설정하였다. 시료 내 토코페롤의 농도는 표준 토코페롤(Sigma-Aldrich)과 샘플 간의 평균 피크 면적을 비교하여 mg/100 g으로 계산하였다.

총 폴리페놀, 플라보노이드 및 항산화 활성 분석

총 폴리페놀 함량은 Folin과 Denis(1912)의 방법을 적용하여 측정하였으며, tannic acid(Sigma-Aldrich)를 이용한 표준곡선으로부터 오일 g당 mg tannic acid equivalent(TAE)로 값을 산출하였다. 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등(2000)의 방법을 수정･보완하여 측정하였으며, rutin(Sigma-Aldrich)을 이용하여 표준곡선을 생성 후 오일 g당 mg rutin equivalent(RE)로 값을 산출하였다. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능과 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS+) 라디칼 소거 활성은 Hong 등(2012)의 실험 방법을 인용하여 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 DPPH의 환원력을 적용하여 517 nm에서 microplate reader(Versamax, Molecular Devices)로 측정하였으며, ABTS+ 라디칼 소거능은 대조군에 대한 흡광도의 감소 비율을 측정하고 산출하였다. 철 환원력(ferric reducing antioxidant power, FRAP)은 Thaipong 등(2006)의 방법을 수정･보완하여 오일과 FRAP 시약을 혼합한 뒤 37°C에 반응하였으며, 이후 593 nm에서 환원력을 측정하고 표준곡선에 대입하여 값을 산출하였다.

통계 분석

모든 실험 결과는 SPSS software(v26, SPSS Inc.)를 이용하여 실험군당 평균±표준오차로 표시하였다. 각 군의 평균치의 통계적 유의성 검정은 one-way ANOVA를 실시한 후 실험군 간의 사후 검증은 P<0.05 수준에서 Tukey Honestly Significant Difference test로 하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.

밀웜오일 품질 안정성

추출 방법에 따른 밀웜오일의 품질 안정성을 측정하고자 산가, 아니시딘가, 과산화물가와 총산화가를 측정하였다. 본 실험에서 산가는 TmoH 군이 가장 높게 측정되었으며 TmoP, TmoS 순이었다(Fig. 1). 유지의 정제가 완전하지 못하거나 사용 및 보관 상태가 적합하지 않을 경우 유지의 가수분해로 인해 유리지방산의 양이 증가하는데 이는 산화 및 산패를 촉진한다(Shin 등, 2014). 따라서 산가는 유지의 품질평가에 중요한 지표이며 산가 0.6 meq/kg 이하 시 식품공전 상 식용유지로서 적합하다(Lee와 Oh, 2022). 본 연구 시 TmoH를 제외한 TmoS와 TmoP는 각각 0.200 meq/kg, 0.298 meq/kg으로 식용유지 산가 기준에 적합하였으며, 이는 추출 방법에 따른 유리지방산의 용해도 차이에 영향을 받은 것으로 판단된다. 산가와 더불어 유지의 초기 산화 정도를 나타내는 과산화물가 역시 TmoH가 가장 높았으며 TmoS와 TmoP는 TmoH에 비해 유의적으로 낮았다(Fig. 1). Khattab 등(2012) 역시 카놀라유 초임계유체 추출 시 용매추출 방법에 비해 과산화물가 수치가 유의적으로 낮았는데 이는 초임계유체 추출 시 산소를 차단하여 산화반응이 최소화된 결과라 보고하였다. 2차 산화 생성물을 분석하는 아니시딘가와 총 산화가는 산가 및 과산화물가와 동일한 경향으로 TmoH에 비해 TmoS와 TmoP가 유의적으로 낮았다(Fig. 1). 추출 과정에서 오일이 열과 대기 산소에 장기간 노출될 경우 아니시딘가가 상승하며 이는 과산화수소의 형성과 2차 산화물 생성 분해에 영향을 미쳐 총 산화가 증가하게 된다(Franklin 등, 2020). 본 연구 결과 TmoP와 TmoS가 품질 안정성이 우수한 것으로 판단된다.

Fig 1. Acid, peroxide, anisidine, and Totox values of TmoP, TmoH, and TmoS. Values are expressed as mean±SE (n=3). Values not sharing a common letter (a,b) are significantly different among groups (P<0.05). TmoP: pressed extraction of mealworm, TmoH: hexane extraction of mealworm, TmoS: supercritical fluid extraction of mealworm.

밀웜오일 색도 분석

소비자의 식품 구매 여부 판단 시 색상, 질감 등의 외관이 중요한 영향을 미치며, 소비자는 색상에 따라 특정 오일을 거부하기도 한다(Moyano 등, 2010). 특히 오일의 색상은 소비자가 식품의 질을 결정할 때 중요한 고려 요인 중 하나이므로 추출 방법에 따른 오일의 색도를 분석하였다. 추출 방법에 따른 밀웜오일의 색상 중 L^*값은 TmoH가 가장 밝고 TmoS, TmoP 순이었으며, a^*값은 TmoH가 다른 군에 비해 유의적으로 높았다. b^*값은 TmoS가 가장 높았으며 TmoH, TmoP 순이었다(Table 1). 국제 표준 색상변수인 L^*, a^*, b^* 중 L^*값은 밝기(명도)를 나타내며 +/-L^*값은 각각 흰색과 검정색, a^*값은 빨간색/녹색, b^*값은 노란색/파란색을 의미한다(Kim 등, 2020). 따라서 추출 방법에 따른 오일은 색상의 차이를 보였으며, 그중 TmoH는 밝고 붉은빛을 띠며 TmoS는 진한 노란빛을 띠는 것으로 해석된다.

Table 1 . Analysis of color parameter in TmoP, TmoH, and TmoS.

	TmoP	TmoH	TmoS
L*	23.17±0.35a	27.39±0.07b	25.41±0.22ab
a*	0.14±0.48a	0.79±0.16b	0.23±0.14a
b*	0.71±2.64a	2.24±0.09b	4.23±0.43c

Values are expressed as mean±SE (n=3). Means in the same row not sharing a common superscript letter (a-c) differ significantly at P<0.05. L^*: lightness, a^*: redness/greenness, b^*: yellowness/ blueness, TmoP: pressed extraction of mealworm, TmoH: hexane extraction of mealworm, TmoS: supercritical fluid extraction of mealworm..

밀웜오일 토코페롤 함량

지질의 중요한 영양소 중 하나인 토코페롤은 지용성 식품에서 자유라디칼과 하이드로퍼옥사이드로 인한 라디칼의 산화 생성물을 방지하는 천연 항산화제로 오일의 산화안정성을 향상한다(Barouh 등, 2022). 밀웜은 식물성 원료보다는 낮으나 동물성 지질보다 높은 토코페롤을 함유하고 있다고 알려져 있다(Son 등, 2020). 본 연구에서 추출 방법에 따른 밀웜오일 토코페롤 함량을 비교한 결과 α와 γ-토코페롤은 TmoP와 TmoS가 각각 0.42 mg/100 g 검출되었으며, TmoH는 검출되지 않거나 매우 소량 검출되었다(Table 2). β-토코페롤은 TmoP에 가장 많이 함유되어 있으며 δ-토코페롤은 TmoS가 가장 높은 수치를 나타냈다(Table 2). Huang 등(2023)은 오일 추출 온도가 높아지면 γ-토코페롤이 증가한다고 보고하였다. 우리의 연구에서 TmoS와 TmoP의 γ-토코페롤 함량이 높았는데, 이는 추출 공정에서 압착추출은 마이크로 건조 시 높아지는 온도에 의한 것으로 보이며, 초임계유체 추출은 임계상태에 따라 온도가 상승하므로 γ-토코페롤이 높아졌을 것이라 사료된다. Karrar 등(2019)은 Gurum 씨에서 추출 방법별 오일을 제조한 뒤 토코페롤을 비교하였는데, α, β, γ, δ 토코페롤 모두 헥산 추출 오일에 비해 초임계유체 추출 오일의 함량이 높아 우리의 결과와 유사하였다.

Table 2 . Analysis of tocopherol (α, β, γ, and δ) contents of TmoP, TmoH, and TmoS (mg/100 g).

	TmoP	TmoH	TmoS
α-Tocopherol	0.42±0.02b	0.00±0.00a	0.42±0.04b
β-Tocopherol	0.27±0.01b	0.22±0.00a	0.20±0.01a
γ-Tocopherol	1.87±0.09b	0.02±0.00a	2.07±0.09b
δ-Tocopherol	0.00±0.00a	0.01±0.00b	0.02±0.00b

Values are expressed as mean±SE (n=3). Means in the same row not sharing a common superscript letter (a,b) differ significantly at P<0.05. TmoP: pressed extraction of mealworm, TmoH: hexane extraction of mealworm, TmoS: supercritical fluid extraction of mealworm..

밀웜오일 항산화 활성

총 폴리페놀은 항산화능을 높이는 주요 요소 중 하나이며, 플라보노이드는 전자 방출에 의해 추출물의 항라디칼 및 환원 활성에 관여한다(Dibacto 등, 2021). 본 연구 결과 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 TmoS가 다른 군에 비해 유의적으로 높았다(Fig. 2). 밀웜오일은 미량영양소가 풍부하고 동물성 유지에 비해 포화지방산 함량이 낮고 n-6, n-3 등 불포화지방산의 함량이 높아 식물성 유지의 특징을 가지며, 이는 항산화 물질인 폴리페놀 함량과 상관성이 있다고 보고되었다(Son 등, 2020). 우리의 결과에서도 밀웜오일은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높았으며, 그중에서도 TmoS가 더욱 높아 추후 미량영양소와 지방산 조성의 비교 연구가 필요할 것으로 판단된다.

Fig 2. The total flavonoid content, phenolic content, and antioxidant activities of TmoP, TmoH, and TmoS. Values are expressed as mean±SE (n=3). Values not sharing a common letter (a-c) are significantly different among groups (P<0.05). TmoP: pressed extraction of mealworm, TmoH: hexane extraction of mealworm, TmoS: supercritical fluid extraction of mealworm.

밀웜오일의 항산화 활성 지표 측정 결과 DPPH 라디칼 소거능, ABTS+라디칼 소거능과 FRAP 활성도 역시 TmoS가 가장 높았다(Fig. 2). 페놀성 화합물 함량과 항산화 활성(DPPH 라디칼 소거능, ABTS+ 라디칼 소거능 및 FRAP 활성)은 유의한 상관관계가 있으며, 이는 페놀성 화합물 함량이 항산화 능력에 기여하는 것으로 보고되었다(Dudonne 등, 2009). 그뿐만 아니라 대표적 항산화제인 토코페롤 함량 역시 TmoS의 α, γ, δ-토코페롤의 함량이 가장 높아 항산화 활성능을 높인 것으로 보인다. 초임계유체 오일 추출 시 첨가된 에탄올의 극성은 용매의 극성을 증가하여 극성 화합물의 용해력을 높이며 페놀 화합물의 용매화를 증가시킨다고 알려져 있으며, 이에 따른 결과로 사료된다(Santos 등, 2016).

본 실험에서는 추출 방법(압착, 용매, 초임계유체)을 달리하여 수득한 밀웜오일의 품질 안정성, 색도, 토코페롤 함량 및 항산화 활성을 비교･분석하였다. 품질 안정성 지표인 산가, 과산화물가, 아니시딘가와 총 산화가 모두 TmoH에 비해 TmoP와 TmoS가 낮아 식용 유지 기준에 적합하였으며, 색도 역시 추출 방법 간의 차이를 보였다. α와 γ-토코페롤 함량은 TmoP와 TmoS 추출 시 TmoH에 비해 높았으며, β-토코페롤은 TmoP, δ-토코페롤은 TmoS가 가장 높은 함유량을 나타냈다. 항산화 물질인 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 TmoS가 다른 추출 방법에 비해 유의적으로 높았으며, 이에 따라 항산화 활성 지표인 DPPH 라디칼 소거능, ABTS+ 라디칼 소거능 및 FRAP 활성 역시 같은 경향을 보였다. 따라서 본 연구에서는 다양한 지질 추출 방법 중 초임계유체 추출 방법이 품질 안정성 및 항산화적 측면에서 가장 효율적으로 판단하였다.

이 논문은 2022년 한국연구재단 기초 연구 사업(RS-2022-00166994)과 순천시 지방대학 및 지역 인재 육성 지원 사업에 의해 지원을 받아 수행되었으며, 이에 감사드립니다.