Stellaria속 식물들은 전통적으로 피부 질환과 상처 치유에 사용되어 왔으며, 여러 가지 유용한 생리활성을 가지고 있을 가능성을 시사하고 있다. 그러나 Stellaria속 중 Stellaria media에 관한 연구만 존재하며, 이 식물은 항산화, 항균, 항염, 진통, 항당뇨 및 불안 완화 활성을 포함한 다양한 약리 활성을 보여주었다(Oladeji와 Oyebamiji, 2020). 그러나 아직 벼룩나물(Stellaria alsine var. undulata)에 대한 현대의학적인 연구는 전무하다. 벼룩나물은 석죽과(Caryophyllaceae)에 속하는 한두해살이풀로, 기온이 온화하며 습도가 높은 곳에서 발견되고 우리나라, 중국, 일본 등 아시아 지역에서 자생한다(Yahara 등, 2021). 봄철에 새순을 채취하여 나물로 먹으며, 쌈 채소, 볶음, 국, 나물 김치 등으로 활용된다. 벼룩나물은 건조 중량 기준으로 약 20%의 단백질 함량을 가지고 있으며, 비타민 A, C, E, K, 루테인, 베타카로틴 등 다양한 기능성 성분을 함유하고 있다(Oladeji와 Oyebamiji, 2020). 의학적으로는 옛날부터 민간에서 소화기계, 순환기계, 간염, 감기, 치루, 고열 등에 사용해왔으며, 중약대사전에서는 상풍감모(傷風感冒), 이질, 치루, 타박상을 치료한다고 적혀 있고, 본초강목습유(本草綱目拾遺)에서도 치루에 바른다고 쓰여 있다.

현대 사회는 산화적 스트레스와 관련된 질환이 급증하고 있으며, 항산화제의 중요성이 대두되고 있다. 자유 라디칼(free radical)은 세포를 손상해 암, 심혈관계질환, 신경병리적 상태 및 노화 과정을 포함한 다양한 질병을 유발할 수 있는데, 항산화제는 이러한 자유 라디칼로 인한 손상으로부터 세포를 보호할 수 있다(Bourgonje 등, 2020). 또한 자유 라디칼은 피부 노화를 일으키는 주요 원인으로 알려져 있으며, 세포 손상, 콜라겐 분해, 멜라닌 생성 증가 등을 유발한다. 항산화 물질은 이러한 활성 산소를 제거하여 피부 노화를 방지하고 주름, 기미, 염증 등을 개선하는 데 효과적이며, 피부 재생, 면역력 강화 등의 효과를 나타낸다(Sies, 2015). 본 연구에서는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 및 superoxide dismutase(SOD) 측정법을 이용하여 벼룩나물의 잠재적인 항산화 능력을 알아보았다.

화장품은 피부 미용과 관련된 다양한 목적을 가지고 개발되며, 특히 미백, 항노화, 항염 효과가 있는 제품들은 여러 연구 및 개발의 중점이 되고 있다. 그중 미백 효과를 연구하고 화장품에 적용하기 위해 효과적인 미백 활성 성분을 찾는 연구가 활발히 진행되고 있다. 피부의 색조를 결정하는 주요 인자 중 하나는 멜라닌(melanin)이며, 멜라닌의 생성 및 적정 수준의 조절은 피부 색조의 조절 및 미백에 큰 영향을 끼친다. 티로시나아제(tyrosinase)는 멜라닌 합성의 속도 결정 단계에 관여하는 효소이며, 티로신(tyrosine)을 L-3, 4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)로 산화시키고, L-DOPA는 도파퀴논(dopaquinone)으로 산화된다. 도파퀴논은 멜라닌의 전구체인 도파크롬(dopachrome)으로 전환되며, 이는 최종적으로 eumelanin과 pheomelanin으로 분해된다(Kim과 Uyama, 2005; Singh 등, 2021; Yamauchi와 Mitsunaga, 2018). 티로시나아제는 자외선, 염증, 호르몬, 유전적 요인 등에 의해 활성화될 수 있으며, 이 효소의 활성을 억제하거나 멜라닌의 합성이나 이동을 방해함으로써 미백 효과를 평가할 수 있다(Pillaiyar 등, 2017; Zolghadri 등, 2019).

항노화는 노화의 진행을 늦추거나 노화의 증상을 완화하는 것을 말한다. 이와 관련하여 엘라스타제(elastase)는 피부의 노화를 촉진하는 주요 요인 중 하나로, 탄성 섬유의 핵심 단백질인 엘라스틴(elastin), 콜라겐(collagen) 등을 분해하여 피부의 주름과 탄력을 초래한다(Im 등, 2019; Lall 등, 2017). 그러므로 엘라스타제 활성을 억제하고 엘라스틴 합성을 촉진하는 연구를 통해 피부의 탄력을 유지하고 주름 형성을 감소시키는 방법을 탐구할 수 있다. 현재 주름 개선 기능성 화장품에 주로 들어가는 성분은 레티놀(retinol), 비타민 C, 녹차 등이 있다(Kong 등, 2016; Prasanth 등, 2019; Yokota와 Yahagi, 2022). 그러나 가장 많이 사용하는 레티놀의 경우 쉽게 산화되며 빛에도 약해 밤에만 사용해야 하며, 비타민 C 역시 자외선 조사로부터 완전하게 차단되어야 하고, 반드시 밀폐 용기에 보관해야 하는 불편함이 있다(Burke, 2007; Dhaliwal 등, 2019; Johnson, 2017; Temova Rakuša 등, 2021). 그러므로 벼룩나물과 같은 천연 성분을 이용한 주름 개선 화장품을 개발함으로써 화학적인 성분 및 피부의 부작용을 최소화한 제품을 개발하는 것이 중요하다.

이에 더해 nitric oxide(NO)는 생리학적 및 병리학적 과정에서 다양한 역할을 하는 분자이다. NO는 L-아르기닌을 산화시키는 nitric oxide synthase(NOS)에 의해 생성되며, 혈관 확장, 혈액순환 조절, 뉴런 간 신호 전달과 같은 다양한 기능을 한다(Moncada와 Higgs, 1993). 또한 염증의 조절과 관련된 중요한 인자이며, 이는 주로 감염 또는 염증 매개 물질에 의해 유도되는 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 관련이 있다(Palmer 등, 1987). 염증은 면역 시스템의 자연적인 방어 작용으로 감염 등에 대하여 초기에 반응한다. 그러나 지나친 염증 반응은 다양한 질병과 관련이 있으며, 이러한 질병들의 발병 및 진행에 중요한 역할을 한다(Medzhitov, 2008). iNOS는 염증 단계에서 유도되며, 특히 면역세포나 염증세포에 의해 활성화된다. iNOS는 염증성 상황에서 NO를 과도하게 생성하며, 이렇게 생성된 NO는 염증을 악화시키고 조직 손상을 유발할 수 있다(Hibbs 등, 1988; Xie 등, 1992). 그러므로 NO 조절을 통해 염증을 효과적으로 제어함으로써 피부 질환 및 염증 관련 질환 개선을 기대할 수 있다.

따라서 본 연구에서는 전통적으로 다양한 생리활성을 가진 것으로 알려진 벼룩나물 추출물 및 분획물의 항산화, 항노화, 미백, 항염 효과를 확인하여 화장품 소재로서의 가능성을 알아보고자 한다.

실험재료

국내산 벼룩나물은 (주)그린에스텔에서 제공했으며, 전라남도 장성군 북하면에서 2022년 4월에 채취하여 초음파 세척기를 이용해 5~10분 세척 후 45°C에서 24시간 건조하고, 분쇄기를 이용하여 건초 분말을 제조하였다. 벼룩나물 시료는 (주)그린에스텔에서 주정(Green EtOH ext.), 초임계(supercritical) CO₂(Green SFE CO₂ ext.), 초임계 주정(Green SFE EtOH ext.) 등 추출물 총 세 가지를 제공했다. Green EtOH ext.는 Soxhlet 장치에서 건초 분말 20 g을 에탄올과 증류수(8:2) 200 mL를 사용하여 120°C에서 2시간 추출한 후 회전증발농축기(Rotavapor R-100, Buchi)를 이용하여 용매를 분리하였다. Green SFE CO₂ ext.는 초임계 추출장비(SC-CO₂ Extraction System, Ilshin Autoclave)에서 이산화탄소만을 이용하여 추출했으며, 200 g의 벼룩나물 건초를 주입한 후 400 bar, 50°C에서 120분간 추출하여 얻었다. Green SFE EtOH ext.는 초임계 추출장비에서 이산화탄소를 이용하여 추출할 시 보조 용매로 EtOH 5 mL를 주입했으며, 400 bar, 50°C에서 120분간 추출하여 얻었다.

또한 순천대학교 약학대학 이민아 교수 연구팀에서 주정 추출물(80% EtOH ext.)과 증류수(distilled water, DW), 헥산(hexane, HX), 메틸렌클로라이드(methylene chloride, MC), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EA), 부탄올(butanol, BU) 분획물을 제공하였다. 80% EtOH ext.는 건초를 10 mL 바이알에 담아 80% EtOH를 가해 초음파 기기로 37°C에서 90분간 2차 추출 및 여과를 반복해서 진행한 후, 감압 농축 및 질소 농축을 통해 건조하였다. 건조된 샘플 추출물을 1,900×g, 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 0.2 μm PTFE 필터로 필터링하였다. 각 분획물의 경우 감압 농축 및 질소 농축을 통해 건조하여 80% EtOH ext.를 극성이 다른 용매를 이용하여 단계적으로 분획하였다. 즉, 80% EtOH ext.와 헥산, 증류수를 1:10:9(v/v/v)로 혼합하여 추출 분획한 후 회전증발농축기로 농축하여 헥산 분획물을 얻었고, 수층 분획은 다시 메틸클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올로 용매 분획한 후 각각 메틸클로라이드층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 증류수층 분획물을 얻어 농축하고 이를 동결건조하였다.

총 페놀 함량 측정

시료를 농도별로 희석한 후 Folin & Ciocalteau’s phenol reagent(Sigma-Aldrich) 1 mL를 넣고 5분간 혼합하였다. 탄산나트륨 포화용액 1 mL를 넣은 후 혼합하여 실온에서 1시간 방치한 후 분광광도계(Sunrise, Tecan)로 흡광도를 측정하였다. 양성대조군인 퀘르세틴(quercetin, Sigma-Aldrich)은 농도별로 증류수에 용해하여 640 nm에서 검량곡선을 작성하고 총 페놀 함량을 산출하였다.

DPPH 라디칼 저해 활성(전자공여능) 측정

항산화제의 항산화 활성을 측정하는 한 가지 방법은 DPPH 분석법을 사용하는 것인데, DPPH는 안정된 자유 라디칼로 항산화제가 전자나 수소 원자를 받아들이면서 색 변화를 일으키게 되고, 이 색 변화를 측정하는 방법이다(Dudonné 등, 2009). 각 시료를 일정 농도가 되도록 메탄올에 넣어 200 μL로 맞추고 메탄올에 녹인 0.1 mM DPPH solution(Sigma-Aldrich)을 200 μL씩 가한 후, 교반하고 실온에서 30분 동안 방치한 다음 519 nm에서 흡광광도계(Sunrise, Tecan)로 흡광치를 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid, Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

SOD 유사 활성도 측정

SOD는 과산화물 라디칼로 인한 손상으로부터 세포를 보호하는 데 도움이 되는 효소로, SOD 활성을 측정하여 항산화 능력을 알아볼 수 있다(Bellere 등, 2023). SOD 활성은 pyrogallol의 자가 산화를 저해하는 정도를 측정하였다. 1 mM diethylenetriamine pentaacetic acid가 포함된 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.2)에 0.2 mM pyrogallol을 넣고 420 nm에서 3분 동안 흡광도 변화를 흡광광도계(Sunrise, Tecan)로 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산(Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

티로시나아제 저해 활성 측정

시료에 100 mM sodium phosphate(pH 6.8)에 녹인 2 mg/mL L-DOPA(Sigma-Aldrich) 80 μL를 넣고 37°C에서 반응시킨 후, 490 nm에서 티로시나아제에 의해 DOPA로부터 형성되는 DOPA chrome의 양을 흡광광도계(Sunrise, Tecan)로 흡광치를 측정하여 상대적 티로시나아제 활성으로 나타냈다. 양성대조군으로는 아스코르브산(Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

엘라스타제 저해 활성 측정

시료를 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 mL씩 시험관에 취하고, 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase(2.5 U/mL, Sigma-Aldrich) 용액 0.5 mL를 가한 후 기질로 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(0.5 mg/mL)를 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. 엘라스타제 저해 활성은 흡광광도계(Sunrise, Tecan)를 이용하여 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타냈다. 양성대조군으로는 우르솔산(ursolic acid, Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

세포 배양 및 세포 생존율 측정

쥐 유래 대식세포인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포에는 10% fetal bovine serum(GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin(GibcoBRL)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Gibco BRL) 배지를 사용하였으며, CO₂ incubator(Sanyo, 5% CO₂, 95% air, 37°C)에서 배양하였다. 세포 생존율을 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolim bromide(MTT) assay를 사용하였다. 96-well plate(Nunc)에 1×10⁴ cells/well씩 seeding 한 후 시료를 다양한 농도로 200 μL씩 분주하여 48시간 배양하였다. 이후 well에 MTT solution(3 mg/mL, Sigma-Aldrich)을 50 μL씩 넣고 incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 상등액을 제거한 뒤 dimethylsulfoxide(DMSO) 150 μL씩 넣고 570 nm에서 흡광광도계(Sunrise, Tecan)로 흡광치를 측정하였다.

NO 생산량 측정

RAW264.7 세포를 100 ng/mL lipopolysaccharide(LPS)로 염증을 유도한 뒤, 0.22 μm 멤브레인 필터로 필터링한 벼룩나물 추출물 및 분획물 샘플을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. NO 생산 정도는 Griess reagent system을 이용하여 배양된 배지에서 nitrite 농도를 측정함으로써 알 수 있다. 시료를 Griess reagent(0.1% N-(1-naphtyl)ethylenediamine, 1% sulfanilamide, 5% phosphoric acid)와 혼합한 후 10분간 상온에 방치하였다. 이후 570 nm에서 흡광광도계(Sunrise, Tecan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

통계처리

결과 통계처리는 Minitab Express 1.5.2(State College)를 이용했으며, 유의차 검증은 Dunnet’s test에 따라 분석하였다.

총 페놀 함량 측정

항산화 효과를 규명할 수 있는 함량 측정 기법으로 페놀, 플라보노이드, 카로틴과 같은 항산화 능력이 있는 성분의 함량을 측정하는 방법이 있다. 방향족 고리에 직접 결합한 hydroxyl 그룹을 가진 페놀 화합물은 다양한 종류의 식물에서 발견된다. 페놀 화합물은 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 그중 항산화 효과는 여러 연구를 통해 이미 입증되었다(Amensour 등, 2009; Aryal 등, 2019; Qader 등, 2011; Torey 등, 2010). 따라서 총 페놀 함량을 측정하는 것은 벼룩나물의 항산화 효과를 예측할 수 있는 한 가지 방법이 될 것이다. 추출물의 경우 80% EtOH ext.가 25.16 mg TAE/g extract로 가장 많은 페놀 화합물을 함유하였다(Fig. 1A). 분획물의 경우 EA가 93.88 mg TAE/g extract로 가장 많은 페놀 화합물을 함유하였고, BU, MC, DW, HX가 각각 43.15, 31.15, 21.78, 10.57 mg TAE/g extract로 그 뒤를 이었다(Fig. 1B). EA에서 페놀 함량이 에탄올 추출물보다 높은 이유는 에틸아세테이트 분획 과정에서 페놀과 같은 비극성 화합물이 에탄올 추출물보다 더 높은 농도로 분리되었기 때문으로 보인다.

Fig 1. Total phenolic contents of Stellaria alsine var. undulata (A) extracts and its (B) fractions. The results are represented as the mean±standard deviation. 80% EtOH ext, 80% EtOH extract; Green EtOH ext, Green Estelle-manufactured 80% EtOH extract; Green SFE CO₂ ext, Green Estelle-manufactured supercritical extraction; Green SFE EtOH ext, Green Estelle-manufactured supercritical ethanol extraction; DW, water fraction; HX, hexane fraction; EA, ethylene acetate fraction; BU, butanol fraction; MC, methylene chloride fraction.

DPPH 라디칼 저해 활성 측정을 통한 항산화능 검증

DPPH 라디칼 저해 활성 측정은 항산화 활성을 측정하는 방법의 하나로, DPPH는 매우 강한 친전자성을 가진 라디칼이다. DPPH 용액은 짙은 자주색이지만 항산화 물질이 존재하면 무색으로 변하기 때문에 그 정도를 측정함으로써 항산화 물질의 활성을 평가할 수 있다(Nicklisch와 Waite, 2014; Prevc 등, 2013; Zhu 등, 2018). 천연물의 DPPH 라디칼 저해 활성은 식품, 화장품, 의약품 개발 분야에서 활발하게 연구되고 있으며, 화장품의 경우 항산화 활성이 높은 천연물은 피부 노화를 방지하고 피부 건강 개선에 도움이 될 수 있다. 식품이나 의약품의 경우 항산화 활성이 높은 천연물은 식품의 부패 방지, 건강 증진, 질병 예방 및 치료 등에 도움이 될 수 있다(El-Beltagy와 Alharthi, 2021; Ganie 등, 2012; Gomathi 등, 2015). 본 실험에서는 벼룩나물 추출물 및 분획물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였으며, 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였다(Table 1). 그 결과, 80% 에탄올 추출물인 80% EtOH ext.가 500과 1,000 μg/mL에서 각각 17.5%와 24.5%의 소거능을 보여, 추출물 중 가장 높은 라디칼 소거능을 나타내었다(Fig. 2A). 분획물의 경우 EA와 BU가 1,000 μg/mL에서 각각 46.30%와 42.86%의 소거능을 나타내어 분획물 중 가장 우수한 활성을 보였다(Fig. 2B). 벼룩나물 추출물 중 80% EtOH ext.와 분획물 중 EA와 BU의 총 페놀 함량이 가장 많기 때문에 항산화 활성 역시 이와 비례하여 높게 나온 것으로 보인다.

Table 1 . DPPH radical scavenging activity of ascorbic acid.

Concentration (μg/mL)	Free radical scavenging activity (%)
0	0
20	19.89
40	42.09
60	60.99
80	78.84
100	83.47

Fig 2. DPPH radical scavenging activities of Stellaria alsine var. undulata (A) extracts and its (B) fractions and superoxide dismutase (SOD)-like activities of its (C) extracts and (D) fractions. The results are represented as the mean±standard deviation. The P-value indicates significant differences between the control and S. alsine var. undulata-treated group (^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001). 80% EtOH ext, 80% EtOH extract; Green EtOH ext, Green Estelle-manufactured 80% EtOH extract; Green SFE CO₂ ext, Green Estelle-manufactured supercritical extraction; Green SFE EtOH ext, Green Estelle-manufactured supercritical ethanol extraction; DW, water fraction; HX, hexane fraction; MC, methylene chloride fraction; EA, ethylene acetate fraction; BU, butanol fraction.

SOD 유사 활성도 측정을 통한 항산화능 검증

대표적인 항산화 효소 중 하나인 SOD는 생체에 매우 유해한 super anion radical(･O₂-)과 반응하여 hydrogen peroxide(H₂O₂)를 생성하는 효소로, 생체 내에서 활성 산소 장애에 대한 방어 작용을 하는 대표적인 활성 산소 저해제이다(Choi와 Koh, 2017; Yahfoufi 등, 2018). 또한 독성이 가장 강한 hydroxyl 라디칼의 생성을 예방하는 작용을 하여 현재 항염증 소재나 피부 노화 방지를 위한 미용 소재로 화장품 등의 첨가제로 사용되고 있다(Zheng 등, 2023). 본 실험에서는 벼룩나물 추출물의 용매별 추출물이 세포 내의 예방적 항산화제인 SOD의 활성에 미치는 영향을 확인하였고 양성대조군으로 아스코르브산을 사용하였다(Table 2). 그 결과 추출물 중 80% EtOH ext. 1,000 μg/mL에서 23.98 %의 가장 높은 SOD 유사 활성을 보였으며, Green SFE EtOH ext. 1,000 μg/mL에서 19.44%의 유의한 SOD 유사 활성을 보였다(Fig. 2C). 또한 벼룩나물 분획물도 동일하게 농도별로 처리한 후 SOD 유사 활성을 측정하였는데, EA 분획물 처리군 1,000 μg/mL에서 22.81%의 가장 높은 SOD 유사 활성이 나타났고, BU 및 DW 분획물 처리군 1,000 μg/mL에서 각각 20.12%와 19.84%의 유의한 SOD 유사 활성을 보였다(Fig. 2D). SOD 유사 활성은 DPPH 라디칼 소거능과 경향이 일치하였으며, 각각의 추출물 및 분획물의 SOD 유사 활성 차이는 추출물의 용매 차이인 것으로 보이고, 총 페놀 함량이 높은 추출물 및 분획물이 SOD 유사 활성도 높게 나타났다. 각 추출물 및 분획물에 용출된 항산화 물질의 함량 차이인 것으로 추정되는 바 성분에 관한 자세한 연구가 필요하다고 생각된다.

Table 2 . Superoxide dismutase (SOD)-like activity of ascorbic acid.

Concentration (μg/mL)	SOD-like activity (%)
0	0
50	5.49
100	9.70
200	13.64
400	42.13
600	59.81
800	72.62
1,000	80.60

티로시나아제 저해 활성 측정

티로시나아제는 티로신을 멜라닌으로 변환시키는 주요 효소이며, 피부의 멜라닌양이 늘어나면 피부가 어둡게 변하게 되므로 티로시나아제는 피부의 색도 조절 및 미백에 관련된 핵심적인 효소로 간주한다(Saeedi 등, 2021). 벼룩나물 추출물이 티로시나아제 활성도에 미치는 영향을 알아보기 위해 추출물을 농도별로 처리한 후 티로시나아제 활성을 측정하였으며 양성대조군으로 아스코르브산을 사용하였다(Table 3). 그 결과 추출물 중 80% EtOH ext. 250, 500, 1,000 μg/mL에서 각각 22.70%, 28.28%, 36.78%의 유의한 티로시나아제 저해 활성을 보였다(Fig. 3A). 또한 벼룩나물 분획물도 동일하게 농도별로 처리한 후 티로시나아제 활성을 측정하였는데, EA 분획물 1,000 μg/mL 처리군에서 35.66%의 가장 높은 티로시나아제 저해 활성이 나타났으며, BU 분획물 1,000 μg/mL 처리군에서는 24.08%의 유의한 티로시나아제 저해 활성이 나타났다(Fig. 3B). 결과적으로 벼룩나물의 추출물 및 분획물에서 티로시나아제 활성이 억제되었는데, 이러한 활성 억제는 미백 화장품 및 미백 관련 제품의 효능을 평가하는 중요한 지표로 사용되므로, 벼룩나물은 피부 미백에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다고 사료된다.

Table 3 . Tyrosinase inhibition activity of ascorbic acid.

Concentration (μg/mL)	Tyrosinase inhibition activity (%)
0	0
50	9.41
100	21.42
200	44.02
400	62.57
600	76.34
800	81.82
1,000	89.26

Fig 3. Tyrosinase inhibition activities of Stellaria alsine var. undulata (A) extracts and its (B) fractions. The results are represented as the mean±standard deviation. The P-value indicates significant differences between the control and S. alsine var. undulata-treated group (^*P<0.05, ^**P< 0.01, ^***P<0.001). 80% EtOH ext, 80% EtOH extract; Green EtOH ext, Green Estelle-manufactured 80% EtOH extract; Green SFE CO₂ ext, Green Estelle-manufactured supercritical extraction; Green SFE EtOH ext, Green Estelle-manufactured supercritical ethanol extraction; DW, water fraction; HX, hexane fraction; MC, methylene chloride fraction; EA, ethylene acetate fraction; BU, butanol fraction.

엘라스타제 저해 활성 측정

벼룩나물 추출물의 엘라스타제 저해 활성을 조사한 결과 전반적으로 농도가 증가함에 따라 저해 활성이 증가한 것을 볼 수 있었다. 특히 80% EtOH ext. 1,000 μg/mL에서 엘라스타제 저해 활성이 14.05%로 추출물 중 가장 높은 활성을 나타냈다(Fig. 4A). 벼룩나물 분획물의 경우 EA 분획물 1,000 μg/mL 처리군에서 39.95%의 가장 높은 엘라스타제 저해 활성이 나타났으며, BU와 MC, DW 분획물 1,000 μg/mL에서 각각 34.925%, 27.675%, 20.65%의 유의한 엘라스타제 저해 활성이 나타났다(Fig. 4B). 엘라스타제는 진피 내 피부 탄력을 유지하는 기질 단백질인 엘라스틴의 분해에 관여하며 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다(Tsuji 등, 2001; Tsukahara 등, 2006). 또한 체내의 엘라스틴을 분해하는 백혈구 과립 효소 중 하나로 이상 조직에서는 활성이 높아져 조직 파괴의 직접적인 원인이 되며, 피부의 주름 및 탄력성 소실 등을 유발한다(Choi 등, 2020; Zofia 등, 2020). 따라서 벼룩나물 추출물 및 분획물처럼 엘라스틴의 활성을 저해할 수 있는 물질은 피부의 주름을 개선하는 효과가 있다고 말할 수 있다.

Fig 4. Elastase inhibition activities of Stellaria alsine var. undulata (A) extracts and its (B) fractions. The results are represented as the mean±standard deviation. The P-value indicates significant differences between the control and S. alsine var. undulata-treated group (^*P<0.05, ^**P< 0.01, ^***P<0.001). 80% EtOH ext, 80% EtOH extract; Green EtOH ext, Green Estelle-manufactured 80% EtOH extract; Green SFE CO₂ ext, Green Estelle-manufactured supercritical extraction; Green SFE EtOH ext, Green Estelle-manufactured supercritical ethanol extraction; DW, water fraction; HX, hexane fraction; MC, methylene chloride fraction; EA, ethylene acetate fraction; BU, butanol fraction.

세포 독성 측정

RAW264.7 세포에 다양한 농도의 벼룩나물 추출물 및 분획물을 처리한 후 24시간 동안 배양하여 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다(Fig. 5A와 B). 그 결과 벼룩나물 추출물을 RAW264.7 세포주에 24시간 처리했을 때 80% EtOH ext., Green EtOH ext., Green SFE CO₂ ext., Green SFE EtOH ext. 62.5 μg/mL에서 각각 90.28%, 82.42%, 83.41%, 98.86%의 생존율이 나타나, 80% 이상의 세포가 생존하였다. 또한 벼룩나물 분획물들을 24시간 처리했을 때 DW, HX, MC, EA, BU 분획물 31.3 μg/mL 처리군에서 각각 92.31%, 97.20%, 94.06%, 103.01%, 84.33%의 생존율이 나타나, 80% 이상의 세포가 생존하였다. 그래서 이후 세포를 이용하는 NO 생산량 실험에는 추출물의 경우 62.5 μg/mL 이하, 분획물의 경우 31.3 μg/mL 이하의 농도를 사용하였다.

Fig 5. Cytotoxic effects of Stellaria alsine var. undulata extracts for (A) 24 h and its fractions for (B) 24 h and the effect of S. alsine var. undulata (C) extracts and its (D) fractions on nitric oxide (NO) production in RAW264.7 murine macrophages. Cells were exposed to various concentrations of S. alsine var. undulata extracts and fractions. Cell viability was assessed using the MTT assay. For NO production, cells were treated with 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) with or without various concentrations of S. alsine var. undulata extracts and fractions. The results are represented as the mean±standard deviation. The P-value indicates significant differences between the control and S. alsine var. undulata-treated group (^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001). 80% EtOH ext, 80% EtOH extract; Green EtOH ext, Green Estelle-manufactured 80% EtOH extract; Green SFE CO₂ ext, Green Estelle-manufactured supercritical extraction; Green SFE EtOH ext, Green Estelle-manufactured supercritical ethanol extraction; DW, water fraction; HX, hexane fraction; MC, methylene chloride fraction; EA, ethylene acetate fraction; BU, butanol fraction.

NO 생산량 측정

염증은 산화 스트레스를 유발하며 자유 라디칼의 생성을 촉진한다. 이러한 자유 라디칼들은 세포 손상을 일으키고 다시 염증 진행에 기여한다(Arulselvan 등, 2016). 이때 NO는 활성 산소에 의해 생성될 수도 있으며, 지나치게 높은 NO 농도는 세포 손상 및 염증 상태의 악화를 초래할 수 있다. NO의 생성을 억제하면 염증 반응을 완화할 수 있는데(Guzik 등, 2003), NO의 생성을 억제하는 물질에는 항산화제(i.e. 비타민 C, E, 코엔자임 Q10), 항염증제(i.e. 스테로이드, 아스피린, 이부프로펜), 천연물(i.e. 녹차 추출물, 커피 추출물, 마늘 추출물) 등이 알려져 있다(Al-Megrin 등, 2020; Hwang 등, 2016; Rabe 등, 2015; Rao와 Knaus, 2008; Traber와 Stevens, 2011; Wang 등, 2017; Wang 등, 2023). 벼룩나물 추출물 및 분획물의 항염증 효과를 확인하기 위해 100 ng/mL LPS로 자극한 RAW264.7 세포에 벼룩나물 추출물 및 분획물을 24시간 동안 처리하고 NO의 생산량을 알아보았다. 그 결과 벼룩나물 추출물 중 80% EtOH ext. 62.5 μg/mL에서 NO 생산량이 16% 감소하여 추출물 중 가장 좋은 효능을 나타내었다(Fig. 5C). 벼룩나물 분획물의 경우 EA 분획물 31.3 μg/mL 처리군에서 NO 생산량이 65% 감소하여 가장 좋은 효능이 나타났으며, MC 및 BU 분획물 31.3 μg/mL 처리군에서 NO 생산량이 각각 31% 및 37% 유의하게 감소하였다(Fig. 5D). 항산화 물질들은 NO의 과도한 생성을 억제하고 안정적인 농도를 유지할 수 있다(Lee 등, 2014). 본 실험에서 나타난 NO 억제는 벼룩나물의 항산화 작용과 관련이 있을 것으로 사료되며, 앞서 수행한 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD 유사 활성 실험 결과와 일치하는 경향을 보였다. 이와 관련된 작용 기전에 관한 후속 연구가 필요하다.

벼룩나물 추출물 및 분획물의 다양한 농도에서 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 80% EtOH ext.와 EA, BU 분획물이 농도 의존적으로 높은 항산화력을 보였으며, SOD 유사 활성을 측정한 결과 유사한 결과가 나왔다. 미백 효과를 알아보기 위해 티로시나아제 억제 활성을 알아본 결과, 80% EtOH ext. 및 EA와 BU 분획물에서 억제 활성이 나타났다. 또한 항노화 효과를 알아보았는데, 벼룩나물 추출물 중 80% EtOH ext.가 가장 우수한 엘라스타제 저해 효과를 나타냈으며, 분획물 중 EA, BU, MC, DW 분획물이 엘라스타제 저해 효과를 나타냈다. 염증성 자극이 있으면 iNOS는 염증 반응의 중요한 매개체로 알려진 NO를 생성한다. 그러므로 NO 생성을 감소시킬 수 있다면 항염증 효과를 확인할 수 있는 좋은 방법이 된다. 본 연구에서는 벼룩나물 추출물 중 80% EtOH ext., 분획물 중 EA, MC, BU 분획물이 NO 생성을 억제한다는 것을 보여주었다. 위 연구 결과는 벼룩나물 추출물 및 분획물이 항산화, 미백, 항노화, 항염증 효과를 나타낸다는 것을 보여주고 있으며, 벼룩나물이 화장품 소재로 활용될 가능성을 시사하고 있다.

본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원의 스마트특성화 기반구축사업으로 수행된 연구결과입니다(P0017660).