비만은 에너지 섭취와 소비 불균형으로 체내에 지방이 과도하게 축적되는 질병으로, 고혈압, 당뇨, 심혈관질환 등 만성질환을 유발하는 요인으로 보고되고 있다(Bessesen과 Van Gaal, 2018; Ezenwaka 등, 2014; Romieu 등, 2017). 비만은 식습관, 신체활동, 유전 등 다양한 요인으로 발생하고 최근까지 전 세계적으로 비만 유병률이 증가하고 있어 세계비만연맹(World Obesity Federation, 2023)에서는 2035년에 과체중 또는 비만 인구가 세계 인구의 절반을 넘을 것으로 전망하였다. 한국질병관리청에 따르면(Kindicator, 2024) 성인의 비만율이 2019년 33.8%(남자 41.8%, 여자 25%)에서 2020년 38.3%(남자 48%, 여자 27.7%)로 1년 동안 4.5%가 증가하였다고 보고하였다. 따라서 현대인들은 비만을 예방하고 치료하기 위해 식이 조절, 운동, 약물 등으로 관리에 노력하지만, 이 문제를 단시간에 해결하기가 쉽지 않다. 특히 장기간 복용 가능한 비만 치료제의 종류는 제한되어 있고 부작용을 초래할 수 있어 체지방을 감소시킬 수 있는 기능성 천연소재를 활용한 치료제 개발에 많은 연구가 진행되고 있다.

일반적으로 비만은 지방전구세포(preadipocyte)의 분화로 지방세포 비대 및 증식에 의해 성숙 지방세포(mature adipocyte)로 변화되어 체내에 축적되며 유발된다(Chen 등, 2017). 지방전구세포를 분화시키는 전사인자 및 하위인자에는 CCAAT/enhancer-binding protein alpha, beta(C/EBPα, β), peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ), sterol-regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c), fatty acid synthase(FAS), fatty acid binding protein 4(FABP4)가 존재한다(Jeong, 2016; Park 등, 2020). C/EBPβ는 분화 초기 단계에 C/EBPα와 PPARγ의 발현을 유도하며, 이후 하위인자 SREBP-1c, FAS, FABP4 발현을 활성화한다(Ho 등, 2013; Park, 2014; Williams 등, 2020). 따라서 비만을 예방하는 데 있어 지방분화를 조절하는 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ 활성을 억제하는 것이 중요한 것으로 알려져 있다.

또한, 비만 예방 및 개선을 위한 방법으로써 에너지 대사, 열 생성, β-oxidation(지방산화) 등 지방분해 기전에 관여하는 인자들의 활성을 촉진하는 연구가 다양하게 수행되고 있다(Kim 등, 2023; Wang 등, 2020). 에너지 대사 조절에서 가장 중요한 역할을 하는 AMP-activated protein kinase(AMPK)는 지방세포분화를 촉진하는 PPARγ, C/EBPα의 발현을 억제하고 acetyl-CoA가 malonyl-CoA로 되는 것을 촉진하는 acetyl-CoA carboxylase(ACC)의 활성을 억제하여 지방합성을 억제한다. 그리고 AMPK는 열 생성 기전에서 필수 인자인 PPARγ coactivator-1 alpha(PGC-1α)와 상호작용을 통해 지방이 열로 소비되어 지방을 분해하므로 체지방 조절에서 중요한 역할을 한다(Chang 등, 2018; Cheng 등, 2018). β-Oxidation 기전에서는 핵 호르몬 수용체(nuclear hormone receptor)로 지방 조직과 근육에서 지방의 이화작용(catabolism)을 촉진하는 PPARα, 활성화된 지방산(acyl CoA)이 세포질에서 미토콘드리아 내부로 이동하기 위해 필요한 효소 carnitine palmitoyltransferase-1 alpha(CPT-1α)가 존재한다(Stern 등, 2016).

지방 조직은 성장 인자, 호르몬, adipokine 등을 합성하고 방출하는 기능이 있으나, 과도한 내장 지방 축적은 지방세포 비대 및 증식, 염증 증가, adipokine 분비 이상, 섬유증 등의 합병증을 유발하여 지방 조직 기능 장애를 발생시킨다(Zorena 등, 2020). 지방 조직에서 생성되는 다양한 adipokine 중 adiponectin과 leptin은 지방 축적의 지표로 사용된다. Adiponectin은 체내에 지방이 과량 축적된 경우 발현량 및 농도가 감소하고 지방합성 억제 기능을 상실하게 된다. 특히, adiponectin은 근육에서 지방산의 β-oxidation을 촉진하고 인슐린 저항성을 개선하는 것으로 알려져 있다(Pham과 Park, 2022). 이와 반대로 leptin은 체내 지방 축적 시 분비량이 증가하여 식욕 감퇴, 에너지 섭취 감소, 지방산화 촉진, 에너지 소비 증가로 지방 축적 억제 역할을 한다(William 등, 2002). 이 두 adipokine은 AMPK 활성에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(Goransson 등, 2023).

쑥부쟁이는 한국, 시베리아 등 아시아에 널리 분포하는 국화과 다년생 식물로 기관지염, 천식, 해열, 소염 등 치료 식품 및 전통 약재로 사용되어 왔다(Lee 등, 2019). 또한, 항암(Jung 등, 2005), 항산화(Kim 등, 2018), 멜라닌 생성 억제(Lee 등, 2021), 항비만(Kim 등, 2022a) 등 쑥부쟁이의 다양한 생리활성에 관한 연구가 보고되었다.

쑥부쟁이는 최근 식품의약품안전처로부터 ‘과민면역 완화 코상태 개선’ 건강기능식품 개별인정형 기능성 원료로 인정받아 알레르기 증상 개선 및 예방 소재로 주목받고 있는 소재이다. 현재까지 다양한 연구가 보고되어 있지만, 건강기능식품 기능성 원료 추출물을 이용한 기능성 연구는 항알레르기 효능에만 제한되어 있다. 따라서 본 논문에서는 건강기능식품 기능성 원료 쑥부쟁이 추출물의 다양한 활용을 위해 항비만 효능 및 작용기전을 구명하여 쑥부쟁이 추출물의 새로운 복합기능성을 발굴하고자 하였다.

재료 및 시약

본 연구에 사용된 실험재료 및 시약은 다음과 같다. 세포 배양을 위해 Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(P/S), phosphate buffered saline(PBS), trypsin은 Gibco에서 구입하여 사용하였다. 지방세포분화 시약 및 쑥부쟁이 추출물의 항비만 효능 평가를 위해 Sigma-Aldrich Co.의 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), dexamethasone, insulin, troglitazone, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO), formalin, Oil Red O solution, sodium chloride, sodium deoxycholate, NP-40, triton X-100, Tris-HCl, EDTA, 2-mercaptoethanol 시약을 사용하였고 triglyceride, adiponectin, leptin 생성량은 Abcam사의 ELISA kit을 구입하여 실험에 사용하였다.

쑥부쟁이 추출물 제조

본 연구에 사용된 쑥부쟁이는 전라남도 구례에서 재배 및 수확한 원료를 받아 사용하였다. 원료는 깨끗이 세척하여 이물질을 제거하고 60°C에서 18시간 열풍건조한 후 건조물을 회수하였다. 쑥부쟁이 추출물을 얻기 위해 건조물 중량의 15배수에 해당하는 50% 에탄올을 넣고 80°C에서 4시간 교반추출(SMHS-6, DAIHAN Co.)하였고 추출액을 여과한 잔량의 용질에 7배수의 50% 에탄올을 첨가하여 동일한 조건으로 2차 추출을 진행하였다. 추출이 완료된 1, 2차 추출액은 여과한 후 감압회전농축기(EYELA CCA-1110, Rikakikai Co.)로 농축하여 inlet 180°C, outlet 85°C 조건으로 분무 건조하였다. 분무건조 추출 분말은 -20°C 냉동 보관하며 실험에 사용하였다.

세포배양

실험에 사용된 C3H10T1/2 세포는 C3H 마우스의 배아 중간엽 줄기세포로 배양조건에 따라 미성숙 섬유모세포에서 조골세포 혹은 지방세포 등으로 분화되는 특징을 지닌다. C3H10T1/2 세포는 RPMI 1640 배지에 10% FBS와 1% P/S을 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 배양기(Heraeus BB15, Thermo Fisher)에서 배양하였다. 세포를 유지 배양하기 위해 세포 밀도가 80~90% 상태일 때 계대배양 하였고 세포의 지방분화를 위해 gelatin으로 코팅된 12-well plate에 4일간 배양한 후 분화를 유도하였다. 세포 분화는 배양 배지에 0.5 mM IBMX, 1 μM dexamethasone, 5 μg/mL insulin, 1 μM troglitazone을 첨가하여 2일간 배양하였다. 그 후 2일마다 insulin과 troglitazone이 포함된 배지로 교체해주었으며, 분화유도 6일차 및 8일차에 쑥부쟁이 추출물을 24시간 처리하였다(Fig. 1).

Fig 1. Scheme of C3H10T1/2 differentiation and treatment of Aster yomena extracts. MDI, 3-isobutyl-1-methylxanthine, dexamethasone, insulin; Tro, troglitazone; ORO, Oil Red O; TG, triglyceride.

세포독성 측정(MTT)

쑥부쟁이 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 세포 생존 및 생장을 확인하는 MTT assay를 수행하였다. MTT를 이용한 세포 생존율 측정은 살아있는 세포 미토콘드리아의 succinate dehydrogenase에 의해 MTT가 불수용성 결정인 formazan으로 환원되는 원리이다. 쑥부쟁이 추출물의 지방전구세포에 대한 세포독성 측정은 C3H10T1/2 세포를 96-well plate에 분주하여 2시간 안정화한 후 농도별(10, 200, 500 μg/mL)로 추출물을 처리하여 24시간 배양하여 측정하였다. 또한, 지방분화세포에 대한 세포독성 측정은 6일 동안 분화시킨 지방분화세포에 추출물을 농도별로 처리한 후 24시간 배양하여 측정하였다. 배양 완료 후 MTT(5 mg/mL)를 첨가하여 4시간 재배양하고 DMSO를 첨가하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

지방구 Oil Red O 염색

C3H10T1/2 세포의 지방구(lipid droplet) 생성 정도 및 쑥부쟁이 추출물의 지방구 축적 억제 정도를 측정하기 위해 Oil Red O 염색법을 이용하였다. Oil Red O는 지질에만 특이하게 결합하는 염색법으로 지방분화세포의 지방구 상태 및 양을 확인할 수 있다. 8일 동안 분화된 C3H10T1/2 세포에 쑥부쟁이 추출물을 처리하고 24시간 배양한 후 상등액 제거 및 PBS로 2회 세척하여 10% formalin으로 30분간 고정시켰다. 이후 증류수로 3회 세척하고 Oil Red O 염색 시약을 첨가하여 30분 동안 염색시켰다. 염색 완료 후 세척하여 지방구 염색 정도를 위상차 현미경(Leica DMi8, Leica)으로 관찰하고 100% 2-propanol로 세포 내 염색된 Oil Red O를 용출시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

중성지방(triglyceride) 생성량 측정

쑥부쟁이 추출물을 처리한 지방분화세포 내 중성지방 함량을 측정하기 위해 triglyceride(TG) assay kit을 이용하여 제조사 매뉴얼에 따라 TG 함량을 측정하였다. 8일간 분화시킨 C3H10T1/2 세포에 쑥부쟁이 추출물을 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 상등액을 제거한 세포는 PBS로 세척하고 세포를 회수하여 5% NP-40 용액으로 균질화한 후 원심분리(24,000×g, 2 min)하여 상층액을 TG 함량 측정에 사용하였다. 이후 제조사 매뉴얼에 따라 TG assay를 수행하였으며, 570 nm에서 흡광도를 측정하고 표준물질의 검량선을 기준으로 계산하여 결괏값을 나타내었다.

mRNA 발현량 측정

지방세포분화 전사인자(C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ) 및 하위인자(SREBP-1c, FAS, FABP4)와 β-oxidation 활성 관련 인자 AMPK, ACC, CPT-1α, SIRT1, PGC-1α, PPARα의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위해 6일간 분화된 C3H10T1/2 세포에 쑥부쟁이 추출물을 24시간 배양한 후 RNA를 추출하였다. RNA 추출은 RNeasy mini kit(Qiagen)을 사용하였으며, 추출된 RNA는 정량 후 reverse transcription system kit(Promega)을 이용하여 제조사 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 CFX96^TM(Bio-Rad) 장비를 사용하였고 β-actin을 internal house keeping gene으로 사용하여 보정했으며, 실험에 사용된 primer의 염기서열은 Table 1과 같다.

Table 1 . Primer sequence used for real time PCR.

Target gene	Primer	Sequences (5’→3’)
C/EBPα	Forward	GCAAAGCCAAGAAGTCGGTG
	Reverse	TCACTGGTCAACTCCAGCAC
C/EBPβ	Forward	GAAGACGGTGGACAAGCTGA
	Reverse	GCTTGAACAAGTTCCGCAGG
PPARγ	Forward	GGGGATGTCTCACAATGCCA
	Reverse	GATGGCCACCTCTTTGCTCT
SREBP-1c	Forward	GAGCCAAAAGGGTCATCATC
	Reverse	TAAGCAGTTGGTGGTGCAGG
FABP4	Forward	CACCGCAGACGACGACAGGAAG
	Reverse	GCACCTGCACCAGGGC
FAS	Forward	GAGCCAAAAGGGTCATCATC
	Reverse	TAAGCAGTTGGTGGTGCAGG
AMPK	Forward	CCAACACAATGGCATTCCAG
	Reverse	TATCCATAGAGATGCGCGGC
ACC	Forward	TGGTGCAGAGGTACCGAAGTG
	Reverse	CTGCGGCAGCAGATCCAT
CPT1α	Forward	CCAGGCTACAGTGGGACATT
	Reverse	GAAGAGCCGAGTCATGGAAG
SIRT1	Forward	GGAACCTTTGCCTCATCTACA
	Reverse	CACCTAGCCTATGACACAACTC
PGC-1α	Forward	CATTTGATGCACTGACAGATGGA
	Reverse	GTCAGGCATGGAGGAAGGAC
PPARα	Forward	GGTTCCTGGTGCCGATTTAT
	Reverse	CACAGACTAGCATCCCACTTAAT
β-actin	Forward	GTCAAGGCTGAGAACGGGAA
	Reverse	AAATGAGCCCCAGCCTTCTC

단백질 발현량 측정

쑥부쟁이 추출물의 지방합성 억제 및 지방분해 효능을 확인하기 위해 지방세포분화 전사인자(C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ) 및 하위인자(SREBP-1c, FAS, FABP4)와 AMPK/SIRT1/PGC-1α 신호전달 인자(p-AMPK, p-ACC, PGC-1α, PPARα)의 단백질 발현량을 western blot으로 측정하였다. 6일간 분화된 C3H10T1/2 세포에 쑥부쟁이 추출물을 처리하고 24시간 배양한 후 세포를 회수하였다. 회수된 cell pellet에 RIPA buffer(0.5% NP-40, 0.5% TritonX-100, 0.1% sodium deoxycholate, 50 mM Tris-HCl, 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA)를 첨가하고 40분 동안 ice에 방치한 후 원심분리(4°C, 13,000×g, 20 min)하여 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 Bicinchoninate 방법으로 정량하였다. 정량된 단백질은 well당 10 μL씩 loading 한 후 200 V에서 30분 동안 전기영동으로 분리하고 PVDF membrane으로 transfer 시켰다. 이후 antibody의 비특이적 반응을 억제하기 위해 membrane을 5% skim milk에 2시간 동안 blocking하고 1차 antibody는 4°C에서 overnight 시켰다. 1차 antibody와 반응을 종결시킨 후 1×TBST로 membrane을 세척하여 2차 antibody를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 ECL solution(Pierce) 기질과 반응시킨 후 ChemiDoc image(Bio-Rad)를 사용하여 단백질 발현량 검출 및 분석을 하였다.

Adipokine 생성량 측정

Adiponectin, leptin은 지방 조직에서 분비되는 사이토카인인 adipokine의 일종으로 지방분화 촉진에 의해 생성량이 조절된다. Adiponectin, leptin의 생성량은 ELISA kit을 이용하여 측정하였다. 지방분화세포에 쑥부쟁이 추출물을 24시간 처리한 후 배양이 완료된 상등액을 회수하여 실험에 사용하였다. Leptin과 adiponectin의 생성량 측정은 제조사 매뉴얼에 따라 수행되었으며 각 물질의 함량은 표준물질의 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

통계분석

모든 통계분석은 SPSS(ver. 25, IBM Co.)로 분석하였으며, 결과를 평균±평균오차(mean±SEM)로 나타내었다. 두 그룹 간(지방분화세포군 vs. 쑥부쟁이 추출물 처리군)의 유의적인 차이는 Student’s t-test로 분석하였으며 P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.

쑥부쟁이 추출물의 세포독성 평가

쑥부쟁이 추출물의 지방전구세포 및 지방분화세포에 대한 세포독성 결과는 Fig. 2에 나타내었다. Fig. 2A는 지방분화 전 C3H10T1/2 세포에 쑥부쟁이 추출물을 24시간 처리한 후 세포독성 결과를 나타낸 것으로 대조구 생존율(100%) 대비 Aster yomena(AY) 10, 200, 500 μg/mL 농도에서 각각 103.5%, 99.8%, 100.7% 생존율을 보였다. 또한, 6일 동안 지방분화를 시킨 세포에 24시간 쑥부쟁이 추출물 처리 후 세포 생존율을 측정한 결과, 지방전구세포(100%)와 지방분화세포(96.6%) 간 세포 생존율의 유의적인 차이는 없었으며 추출물의 농도별 처리에 따른 세포 생존율도 지방전구세포 및 지방분화세포와 유사한 수준임을 확인하였다(Fig. 2B). 따라서 쑥부쟁이 추출물은 500 μg/mL 농도까지 세포독성이 없는 것이 확인되어 이후 실험에서는 10, 200, 500 μg/mL 농도로 항비만 효능 평가를 수행하였다.

Fig 2. Effects of AY on C3H10T1/2 (A) preadipocyte and (B) adipocyte cell viability. Cell were treated with AY for 24 h and viability was evaluated by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay after incubation with extracts for 24 h. Data are expressed as means±SEM. AY, Aster yomena; DM, differentiation media.

쑥부쟁이 추출물의 지방구 축적 및 중성지방 생성 억제 효과

쑥부쟁이 추출물의 지방구 축적 및 중성지방 생성 억제 효능을 확인하기 위해 8일 동안 분화시킨 지방분화세포에 추출물을 농도별로 처리하고 Oil Red O 염색 및 TG 함량을 측정하였다. 그 결과, 지방분화세포와 달리 지방전구세포에서는 지방구가 생성되지 않아 Oil Red O 염색이 되지 않은 것을 관찰할 수 있었고, 추출물의 처리에 따라 지방분화세포 대비 농도 의존적으로 지방구 형성이 억제되었다(Fig. 3A). 이후 염색 정도를 정량화하기 위해 2-propanol로 Oil Red O를 용출시켜 흡광도를 측정한 결과, 지방분화세포 대비 AY10에서 2.3%, AY200은 19.1%, AY500은 38.2% 정도의 억제 효능이 있는 것을 확인하였다(Fig. 3B). 이러한 결과는 지방분화세포 3T3L-1에 섬쑥부쟁이 및 쑥부쟁이 열수, 70% 에탄올 추출물이 지방구 형성을 억제했다는 연구 결과(Lee 등, 2019)와 쑥부쟁이 70% 에탄올 추출물 처리 농도에 의존적으로 지방구가 감소한 결과(Lee 등, 2017)와 일치한다.

Fig 3. Effects of AY on lipid accumulation in C3H10T1/2 cells. (A) Morphology of Oil Red O stained was visualized by 200× magnification microscopy and (B) quantification of lipid accumulation was measured using Oil Red O resolved in isopropanol. (C) Triglyceride contents was evaluated by quantification kit in differentiation C3H10T1/2 cells. Data are expressed as means±SEM. ^*P<0.05, relative of adipocyte. AY, Aster yomena; DM, differentiation media.

세포 내 중성지방 함량 역시 쑥부쟁이 추출물에 의해 유의적으로 감소하였다(Fig. 3C). 특히 AY500에서 TG 함량은 37.1 mM로 지방분화세포(81.9 mM)보다 54.7% 감소한 결과를 보여주었다. 이러한 결과는 지방분화 시약에 의해 세포 내 형성된 지방구가 쑥부쟁이 추출물에 의해 축적되는 것을 억제하고 그 결과 TG의 함량까지 감소시켜 지방세포분화를 효과적으로 억제한 것으로 생각된다.

지방구는 TG, sterol 및 ester를 저장하는 세포질 소기관으로 지방 생성과 분해를 균형적으로 조절하여 에너지 대사에 중요한 역할을 한다. 하지만 열량, 지질, 알코올 등 지나친 섭취는 지방구의 기존 기능을 상실하게 만들어 에너지 대사 항상성의 불균형으로 인해 중성지방 및 콜레스테롤이 체내에 과도하게 축적돼 비만, 당뇨, 심혈관질환 등 질환을 유발한다(de la Rosa Rodriguez와 Kersten, 2020). 따라서 쑥부쟁이 추출물은 TG의 함량을 적절하게 조절하여 지방구의 에너지 대사 항상성을 유지할 수 있게 도움을 줌으로써 비만, 심혈관질환 등을 예방 및 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

쑥부쟁이 추출물의 지방세포분화 촉진 유전자 및 단백질 발현 억제 효과

지방세포분화는 지방 전구세포가 지방분화세포로 분화되는 과정으로 지방분화에 관여하는 전사인자와 하위인자로는 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ, SREBP-1c, FAS, FABP4가 있다. C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ는 지방세포분화 전사인자로 에너지와 지방 대사를 조절하고 지방분화 초기 단계에 C/EBPβ가 PPARγ를 활성화해 지방분화 후기 단계에 C/EBPα의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다(An과 Lim, 2023). 또한, PPARγ는 SREBP-1c에 의해 전사활성이 증가하며 SREBP-1c는 지방산 대사와 지방 생합성에 주로 관여하여 지방합성 효소 FAS와 FABP4의 발현을 유도한다(Williams 등, 2020). 이처럼 지방분화에 관여하는 인자들의 발현에 쑥부쟁이 추출물이 미치는 영향을 real-time PCR, western blot 분석을 통해 평가하였다. 그 결과, 지방전구세포를 분화시킴에 따라 지방분화 전사인자 및 하위인자의 유전자 및 단백질 발현량이 증가한 것을 확인하였다(Fig. 4). 이때 쑥부쟁이 추출물을 농도별로 처리함에 따라 지방분화세포구 대비 추출물 최고 농도 500 μg/mL 처리구에서 C/EBPα, C/EBPβ, PPARγ, SREBP-1c, FAS, FABP4 유전자가 각각 11.8, 4.2, 5.2, 1.6, 1.5, 8.5배 유의적인 감소 효과를 나타내었다(Fig. 4A). 이 결과와 동일하게 단백질 발현량도 쑥부쟁이 추출물 처리 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 4B). Lee 등(2017)은 쑥부쟁이 70% 에탄올 추출물 100, 250, 500 μg/mL에서 지방합성 전사인자 PPARγ와 하위인자 FAS의 발현이 유의적으로 억제되어 지방산 및 중성지방 합성을 억제했다고 보고하였는데, 본 연구 결과에서도 유사한 결과를 나타내었다.

Fig 4. Effects of AY on differentiation factors in C3H10T1/2 cells. (A) mRNA and (B) protein expression of adipocyte differentiation factors upstream (CEBPα, CEBPβ, and PPARγ) and downstream (SREBP1c, FAS, and FABP4) were detected by real time PCR and western blotting, respectively. Data are expressed as means±SEM. ^*P<0.05, relative of adipocyte. AY, Aster yomena; DM, differentiation media.

쑥부쟁이 추출물의 AMPK/SIRT1 신호전달 활성에 의한 β-oxidation 활성 유전자 및 단백질 발현 촉진 효과

Serine/threonine kinase인 AMPK는 AMP/ATP 비율이 증가하면 AMPK 인산화 및 효소 활성이 향상된다. 이는 β-oxidation을 유도하고 지방세포분화와 합성에 관련된 유전자 발현을 억제해 지질 및 콜레스테롤 항상성을 유지하는 역할을 한다. 인산화된 AMPK는 ACC의 활성을 억제해 지방산 산화를 증가시키는 CPT1의 활성을 촉진함으로써 지방 연소를 유발한다(Lee와 Park, 2017). 또한, AMPK는 nicotinamide adenine dinucleotide(NAD⁺)/ NAD hydride 비율을 증가시켜 NAD⁺ 의존적 탈아세틸화 효소인 sirtulin(SIRT1)의 활성화로 PGC-1α와 PPARα가 핵으로 이동하면서 지방분해를 촉진하는 역할을 유도한다(Canto 등, 2009). 이처럼 AMPK 활성에 따라 조절되는 지방 대사 신호전달에 쑥부쟁이 추출물이 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과, 쑥부쟁이 추출물은 AMPK, ACC 유전자 발현을 농도 의존적으로 감소시켰고, 농도 의존성은 없었으나 모든 쑥부쟁이 추출물의 농도에서 SIRT1, CPT-1α, PGC-1α, PPARα의 유전자 발현을 지방분화세포구 대비 유의적으로 증가시켰다(Fig. 5A). 또한, AMPK/SIRT 신호전달 관련 인자의 단백질 발현 결과에서도 쑥부쟁이 추출물 처리에 의해 AMPK와 ACC의 인산화가 활성화되어 PGC-1α, PPARα의 발현이 증가한 것을 확인하였다(Fig. 5B). Kim 등(2022b)은 4주간 쑥부쟁이 추출물을 경구투여한 비만 마우스의 간 조직에서 p-AMPK, p-ACC의 발현이 증가했다고 보고하였고 Han 등(2017)은 지방분화세포 3T3L-1에 쑥부쟁이 추출물 처리 시 p-ACC의 발현이 유의적으로 증가했다고 보고하였다. 이러한 결과는 쑥부쟁이에 다양하게 함유되어 있는 기능성분인 플라보노이드, 폴리페놀에 의한 것으로 생각된다. 쑥부쟁이 에탄올 추출물에서 플라보노이드, 폴리페놀 성분은 각각 34.12, 26.14 GAE mg/g으로 열수 추출물보다 높은 함량을 나타냈으며, 항비만과 항산화 효능도 성분함량과 유사하게 에탄올 추출물에서 우수한 효능을 나타내었다(Lee 등, 2019). 특히 쑥부쟁이에는 rutin, isoquercitrin 및 apigenin 등과 같은 기능성분이 다량 함유된 것으로 알려져 있으며, 이들은 지방 대사를 조절하는 데 우수한 효능이 있는 것으로 보고되고 있다. Rutin은 비만 마우스의 지방비대증 감소, PPARγ 발현 억제 및 AMPK 활성화로 비만을 개선하고(Tung 등, 2021), isoquercitrin은 AMPK/SREBP-1c 신호경로 조절을 통해 항비만 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Manzoor 등, 2022). 마지막으로 apigenin은 고지방식이로 비만을 유도한 마우스에 경구 투여한 결과 인슐린 저항성, 이상지질혈증 등을 개선하는 효과를 나타내었다(Jung 등, 2016). 따라서 이들 기능성분에 의한 쑥부쟁이 추출물이 체지방감소에 효능을 보인 것으로 생각된다.

Fig 5. Effects of AY on AMPK/SIRT1 signaling in C3H10T1/2 cells. (A) mRNA and (B) protein expression of AMPK/SIRT1 signal related factors were detected by real time PCR and western blotting, respectively. Data are expressed as means±SEM. ^*P<0.05, relative of adipocyte. AY, Aster yomena; DM, differentiation media.

쑥부쟁이 추출물의 leptin 및 adiponectin 생성 평가

에너지 항상성 조절에 핵심인 adipokine에는 비만유전자로 알려진 leptin과 식욕억제 호르몬 adiponectin이 존재한다. Leptin은 중성지방이 축적되면 합성이 촉진되고 음식 섭취를 촉진하는 물질 생성을 억제하는 것으로 보고되었다(Goransson 등, 2023; Miyamoto 등, 2012). 이 두 adipokine은 지방 조직에서 에너지 항상성을 조절함으로써 체지방 조절에 주요한 인자로 알려짐에 따라 쑥부쟁이 추출물이 두 adipokine 생성량에 미치는 영향을 평가하였다. 6일 동안 지방분화를 유도한 지방분화세포에 쑥부쟁이 추출물 처리 후 adipokine의 생성량을 측정한 결과, 지방전구세포 대비 지방분화세포구에서 leptin의 생성량은 증가하였고 adiponectin의 생성량은 감소한 결과를 확인하였다. 이때 쑥부쟁이 추출물 처리에 의해 leptin과 adiponectin이 효과적으로 조절되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).

Fig 6. Effects of AY on adiponectin and leptin production in C3H10T1/2 cells. (A) Adiponectin and (B) leptin were measured using ELISA in cell culture media. Data are expressed as means±SEM. ^*P<0.05, relative of adipocyte. AY, Aster yomena; DM, differentiation media.

Adiponectin은 지방 조직에서만 분비되고 혈중에 높은 농도로 존재하는데, 혈중 농도가 낮을 때 당뇨병, 인슐린 저항성, 면역기능 장애 등이 유발되며 특히 비만인에게서 혈중 농도가 낮게 나타난다(Park, 2005).

Adiponectin은 AMPK와 PPARα 활성화를 통해 지방 생성을 감소시키고 β-oxidation을 증가시킨다고 보고되었다(Awazawa 등, 2009; Goransson 등, 2023). 이는 앞선 연구에서 쑥부쟁이 추출물에 의해 AMPK, PPARα 활성 및 β-oxidation 관련 유전자와 단백질이 증가하는 것을 확인한 것과 동일한 결과이다. 이러한 결과를 종합했을 때, 쑥부쟁이 추출물에 의해 adiponectin이 AMPK/SIRT 신호전달 관련 인자의 발현을 조절시킴으로써 β-oxidation을 촉진해 체지방감소를 유도하고 관련 인자들의 발현량이 지방전구세포와 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 쑥부쟁이 추출물이 체지방감소에 효과적인 기능성 소재로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구에서는 건강기능식품 기능성 원료인 쑥부쟁이(Aster yomena) 추출물의 항비만 효과를 평가하기 위해 C3H10T1/2 세포를 지방세포로 분화시켜 지방합성 억제 및 분해 효능을 측정하였다. 쑥부쟁이 추출물을 지방분화세포에 처리하여 세포 내 지방구 및 중성지방을 측정한 결과 처리 농도 의존적으로 지방구 축적과 중성지방 생성량이 억제되었다. 이러한 결과는 지방구 축적과 중성지방 생성에 주요하게 작용하는 지방합성 전사인자(CEBPα, CEBPβ, PPARγ) 및 하위인자(SREBP-1c, FAS, FABP4)의 유전자, 단백질 발현량이 쑥부쟁이 추출물에 의해 유의적으로 감소함에 따라 나타난 것으로 생각된다. 또한, 쑥부쟁이 추출물은 β-oxidation을 촉진하는 인자(AMPK, ACC, CPT-1α, SIRT1, PGC-1α, PPARα)의 발현을 지방분화세포군 대비 유의적으로 증가시킴으로써 지방분해를 촉진하는 것을 확인하였다. 이는 에너지 항상성 조절 및 AMPK 활성 조절 사이토카인 adiponectin과 leptin의 생성이 쑥부쟁이 추출물에 의해 조절되어 β-oxidation을 활성화하는 데 관여한다는 것을 확인하였다. 종합하면, 쑥부쟁이

추출물은 β-oxidation 조절 AMPK/SIRT1 작용기전을 활성화하여 지방분해를 촉진하고 지방합성 전사인자 C/EBPα, PPARγ 등을 억제해 지방구 형성 및 중성지방 합성 유도 하위인자를 억제하여 항비만 효능을 보이는 것으로 생각된다. 이러한 효능은 쑥부쟁이에 함유된 rutin, isoquercitrin 등 다양한 생리활성 성분에 의한 것으로 생각되며 이를 명확히 구명하기 위해서는 기능성분 분석과 동물모델을 이용한 추가 연구가 필요하다고 생각된다. 따라서 추가적인 연구 수행을 통해 쑥부쟁이가 체지방감소 기능성 원료 등록 및 복합기능성 원료로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술 연구개발사업(과제번호: PJ01725901)의 지원을 받아 연구되었음.