인체는 환경 변화에 의한 스트레스와 생체 내에서의 화학반응으로 산화적 스트레스가 발생하여 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성되고 신체 내 항상성과 항산화 유지 반응을 붕괴시킨다(Jin 등, 2017). ROS는 자유라디칼과 산소 화합물을 말하며, 생체 내에서 생성된 ROS는 DNA를 손상해 부착 단백질 및 염증 관련 cytokine의 발현을 증가시키고 염증 반응을 촉진한다(Yoo와 Lee, 2020). 염증 반응은 대식세포(macrophage)에서 주로 관여하며 세균과 바이러스의 침입으로 활성화된 대식세포는 다양한 pro-inflammatory cytokine을 분비하여 초기 염증에 중요한 작용을 일으키고 있다(Shin 등, 2022). 염증 반응 과정에서 내재 면역에 관여하는 막단백질인 toll-like receptor 4에 대식세포의 활성 인자로 그람 음성균의 세포막에서 분리한 내 독소인 lipopolysaccharide(LPS)가 결합하게 된다(Yun 등, 2009). LPS로 유도된 과도한 염증 반응은 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-6(IL-6) 등의 염증 매개 cytokine을 생산하며, 이들은 자유라디칼, prostaglandin, lysosomal enzyme 등과 같은 물질에 관여한다고 알려져 있다(Lee 등, 2021). 또한 선천적 면역 등 다양한 숙주 반응에 작용하여 항상성 유지에 관여하는 대식세포는 inducible nitric oxide synthase(iNOS)에 의해 nitric oxide(NO)를 생성시키며 과도하게 생성된 NO는 염증 반응을 발생시킨다(Jung 등, 2013). 또한 cyclooxygenase(COX)는 COX-1과 COX-2 두 그룹으로 존재하며, COX-1은 일정 수준으로 항상성을 유지에 관여하지만, COX-2는 prostaglandin E₂(PGE₂) 등의 염증 촉진 인자들을 생성시켜 염증 반응을 일으킨다고 보고되어 있다(Jung 등, 2013; Min 등, 2003).

틸란드시아 이오난사(Tillandsia ionantha)는 파인애플과 착생식물로 ‘air plant’라 불리는 틸란드시아의 일종이다. 착생식물이란 공기 중에 수분과 영양분을 흡수하여 주로 나무와 다른 식물 위에 자라는 식물을 말하며, 전 세계 식물 중 10%가 착생식물로 분포되어 있다(Kang, 2010). 틸란드시아 이오난사는 멕시코 및 중미 등의 건조한 지역에 널리 분포되어 있고, 길이는 최대 20 cm로 다른 틸란드시아 종보다 상대적으로 작은 특징을 가지고 있다. 초록색 잎에 은색의 솜털이 덮여 있으며 개화기에 붉게 변하고 보라색 꽃잎에 노란색 암술머리가 존재한다(Ancona 등, 2022). 이러한 틸란드시아 이오난사는 관상용으로 대중적인 큰 관심을 받고 있어, 전 세계적으로 개인 소장용이나 식물원에 널리 분포되어 있다(Ancona 등, 2021). 또한, 틸란드시아 이오난사는 높은 수분 흡수능력을 가지고 있어 공기 내 수분 조절이 가능하고, 거친 피붓결 개선 및 수분 유지에 도움을 준다고 알려져 있다(Estrella-Parra 등, 2019; Ohrui 등, 2007). 최근 연구에서 몇몇 틸란드시아 종들은 강한 항암 활성이 나타나 유방암, 뇌암 등 다양한 종류의 암 억제 및 백혈병 세포의 증식 활성을 억제한다고 보고되어 있다(Sadhu와 Naika, 2021). 결국 틸란드시아 이오난사의 생태학적인 특징에 관한 연구는 이루어지고 있으나 기능성 천연 소재로의 생리활성에 관한 연구는 미비한 실정이다.

기능성 소재를 활용한 nutricosmetics의 발전으로 건강보조식품, 기능성 식품, 미용 식품 등으로 활용을 높이기 위한 천연물 연구가 진행되고 있다(Jeon 등, 2012; Kim 등, 2012; Lee 등, 2017). 특히 천연 식물을 이용한 항산화 및 항염 등의 성분과 효능 검증을 통한 안전한 식품을 찾는 소비자들의 관심 기회로 작용할 수 있다. 이에 본 연구에서는 틸란드시아 이오난사의 생리활성 연구를 통해 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인하고자 본 연구를 수행하였다.

재료 및 시료 추출

틸란드시아 이오난사는 세척하여 열풍 건조한 후 파쇄한 것을 사용하였다. 열수 추출은 시료 10배의 증류수를 첨가하여 100°C에서 3시간 환류 냉각 추출해 부직포로 1차 여과하여 상등액과 침전물을 분리하였으며, 이와 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 70% 에탄올 추출은 시료 10배의 70% 에탄올을 첨가하여 24시간 동안 교반한 후 상등액과 침전물을 부직포를 이용해 분리하고 이와 같은 방법을 3회 반복하였다. 각 추출물의 상등액은 진공펌프와 여과지(Whatman No. 4, No. 2, No. 5)를 이용하여 여과한 후 용매를 제거하기 위해 rotary vacuum evaporator로 감압 농축하였다. 농축이 완료된 추출물은 동결건조하여 -20°C에 보관하며 본 실험의 시료로 사용하였다.

시약 및 기기

항산화 활성 측정에 사용한 Folin-Ciocalteu reagent (Folin), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 등은 Sigma Chemical Co.에서 구입하였고, Na₂CO₃은 Kanto Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율 측정에 사용한 시약인 LPS, Griess reagent는 Sigma Chemical Co.에서 구입하였고, cytokine의 억제율을 측정하기 위해 사용한 TNF-α ELISA kit은 R&D System Inc., PGE₂ ELISA kit은 LifeSpan BioSciences, Inc.에서 구입하여 사용하였다. 또한, positive control로 사용한 indomethacin은 Sigma Chemical Co.에서 구입하였다. 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator(EYELA), micro refrigerated centrifuge(Hanil Scientific Inc.), microplate reader(Molecular Devices), CO₂ incubator(Pantasonic Healthcare Co.), vortex(Scientific Industries Inc.)를 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Singleton 등, 1999)을 변형하여 실험을 진행하였다. 추출물을 증류수로 희석한 50% Folin 용액 500 μL를 넣고 혼합하여 실온에서 3분간 반응하였다. 반응 후 10% Na₂CO₃ 500 μL를 혼합하고 상온에서 1시간 동안 차광하여 반응시킨 뒤 흡광도 734 nm에서 반응액을 측정하였다. Tannic acid를 표준물질로 사용하여 표준곡선을 작성하고 100 g당 mg으로 총 폴리페놀 함량을 나타내었다.

전자공여능 측정

전자공여능(electron donating abilities)은 Blois의 방법(1958)을 변형하여 측정하였다. 농도별로 추출물을 30 μL씩 넣고 99.9% 에탄올로 희석한 180 μM DPPH 시약 180 μL를 추가로 혼합한 후 15분 동안 암실 상태로 반응시켜 microplate reader를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거능 측정은 Re 등의 방법(1999)을 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS에 2.45 mM potassium persulfate를 혼합한 후 실온에서 암실 상태로 24시간 동안 반응하여 ABTS 양이온 라디칼을 형성시킨다. 제조된 ABTS 시약은 에탄올로 희석하여 사용했으며, 농도별 추출물 100 μL에 희석된 ABTS 시약 100 μL를 넣고 1분간 암실 상태로 반응 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포주 및 세포 배양

본 실험에는 세포 생존율 및 항염증 관련 효능 검증을 위해 대식세포인 RAW 264.7(KCIB40071)을 세포주로 사용했으며, 한국세포주은행에서 구입하였다. 세포를 배양하기 위해 Dulbecco’s modified Eagle’s medium 배지에 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가하여 사용하였다. RAW 264.7 세포는 37°C, 5% CO₂ incubator에서 90% 정도 자란 후 계대 배양하였다.

MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

세포 생존율 측정은 Carmichael 등의 방법(1987)에 따라 측정하였다. RAW 264.7 세포를 1×10⁴ cells/well을 96-well plate에 분주하고, 이후 추출물 및 indomethacin을 농도별(5, 10, 50, 100, 500, 1,000 μg/mL)로 희석하여 첨가한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 용액을 2.5 mg/mL 농도로 제조한 후 40 μL를 첨가하여 3~4시간 배양한 후 상층액을 제거하고 dimethyl sulfoxide 100 μL를 각 well에 분주하여 실온에서 10분 동안 교반하여 반응시킨 뒤 microplate reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료를 첨가하지 않은 무첨가군을 대조군으로 하여 첨가군의 흡광도를 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

NO 생성억제 활성 측정

RAW 264.7 세포 내 생성된 NO의 생성량은 Green 등의 방법(1982)을 변형하여 세포 배양액에 존재하는 NO를 측정하였다. 6-well plate에 RAW 264.7 세포를 3×10⁵ cells/well로 분주하고 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한다. 이후 LPS를 10 μg/mL 농도로 무처리군을 제외한 단독처리군 및 농도 구간에 처리 후 2시간 동안 배양하였다. 농도별(50, 100, 500 μg/mL)로 조제한 추출물 및 100 μg/mL 농도의 indomethacin을 처리하여 18시간 배양한 후, 96-well plate에 상층액 100 μL씩 넣은 뒤 Griess 시약을 100 μL 혼합하여 10분 동안 교반시킨 후 microplate reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 생성억제 활성 측정은 무첨가군과 첨가군을 비교하여 백분율로 표시하였다.

PGE₂ 생성량 측정(PGE₂ ELISA)

염증을 유발하는 PGE₂의 생성량을 측정하기 위해 RAW 264.7 세포를 6-well plate에 3×10⁵ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 자극제로 LPS(10 μg/mL) 무처리군을 제외한 단독처리군 및 농도 구간에 처리한 후 2시간 뒤 농도별(50, 100, 500 μg/mL)로 조제한 추출물 및 100 μg/mL 농도의 indomethacin을 처리하여 18시간 배양하였다. 이후 상등액을 회수하여 PGE₂ ELISA kit의 제조사 매뉴얼에 따라 분석하였으며 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Pro-inflammatory cytokine 생성량 측정(TNF-α ELISA)

염증을 매개하는 것에 관련된 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α의 생성량을 측정하기 위해 RAW 264.7 세포를 이용하였다. 6-well plate에 RAW 264.7 세포를 3×10⁵ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 이후 LPS를 10 μg/mL 농도로 무처리군을 제외한 단독처리군 및 농도 구간에 처리한 후 2시간 동안 배양하였다. 농도별(50, 100, 500 μg/mL)로 조제한 추출물 및 100 μg/mL 농도의 indomethacin을 처리하고 18시간 배양한 상등액을 회수하여 cytokine을 측정하였다. 회수한 상등액의 TNF-α ELISA kit의 제조사에서 제시한 매뉴얼을 이용해 분석하였으며 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot을 통한 단백질 발현 측정

항염증 활성을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 사용하여 세포 내 염증 관련 인자의 단백질 발현량을 western blot으로 측정하였다. RAW 264.7 세포(1×10⁶ cells/well)를 100 mm tissue culture dish에 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. RAW 264.7 세포에 LPS 10 μg/mL 농도로 처리하고 2시간 후 농도별로 추출물을 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거한 후 PBS로 2회 세척하였다. RIPA buffer와 protease & phosphatase single-use inhibitor cocktail 100×를 100:1로 lysis buffer를 제조하여 세포를 용해하고 4°C, 13,200×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 이후 상등액을 BCA protein assay kit을 이용하여 단백질을 정량하였으며, 40 μL의 단백질을 10% acrylamide gel에서 전기영동 하여 분리하였다. Transfer 기기를 사용하여 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride membrane에 이전시켜주고 tris-buffered saline & tween 20(TBST)에 녹인 5% skim milk를 실온에서 1시간 동안 blocking 하였다. Primary antibody를 첨가하여 4°C에서 overnight 한 다음 TBST로 10분 3회 세척하였다. 이후 secondary antibody를 첨가하여 실온에서 1.5시간 반응시킨 뒤 TBST로 10분 3회 세척하고 암실에서 ECL 용액으로 반응시켜 ChemiDoc^TM MP Imaging System을 이용하여 단백질 발현량을 확인하였다.

통계처리

모든 실험은 동일 조건에서 3회 반복하였으며, 평균 및 표준편차(means±standard deviation, SD)로 나타내었다. 또한 결과 통계처리는 대조군과 각 시료에서 얻은 실험 자료로부터 SPSS Statistics 23을 이용하여 t-test 실시 후 유의 값(P<0.05, P<0.01, P<0.001)을 나타내었고, 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 사용해 Duncan’s multiple range test에 의하여 P<0.05 수준에서 나타내었다.

총 폴리페놀 함량 측정 결과

천연 폴리페놀성 화합물은 2차 대사산물의 하나로 다양한 구조와 분자량을 가지고 식물계에 널리 분포되어 있다(Lee와 Lee, 2016). 단백질 등과 결합하는 성질을 가지고 있는 phenolic hydroxyl(OH)기는 항암 및 항균, 항산화 효과 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2012). 또한 연쇄반응 과정에서 페놀성 항산화제들은 alkylperoxy radical이나 alkyl radical에 수소를 공여하여 라디칼을 제거해 산화를 억제하는 것으로 보고되어 있다(Lee 등, 2006).

틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과는 Table 1과 같이 나타내었다. Tannic acid를 표준물질로 사용하여 추출물 100 g당 함유한 tannic acid 양(tannic acid equivalent, TAE)으로 환산하여 표시하였다. 틸란드시아 이오난사 열수 추출물은 326.33±0.88 mg TAE/100 g이 나타났으며, 틸란드시아 이오난사 70% 에탄올 추출물은 325.48±0.78 mg TAE/100 g의 폴리페놀 함량을 확인하여 열수 추출물이 70% 에탄올 추출물보다 폴리페놀 함량이 높은 것을 확인하였다. Kim(2019)의 감태 열수 추출물은 168.50 mg TAE/100 g의 폴리페놀 함량을 나타내었으며, Kim과 Ryu(2017)의 연구에서 감초 70% 에탄올 추출물은 65.15 μg TAE/mL의 폴리페놀 함량을 나타내었다. 이와 비교했을 때, 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량이 더 높은 것을 확인하였다.

Table 1 . Total polyphenol contents in Tillandsia ionantha.

Sample	Total polyphenols (mg TAE/100 g)
TID	326.33±0.88
TIE	325.48±0.78***

TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract. TAE: tannic acid equivalent. Results are mean±SD from triplicate experiments (^***P< 0.001, TID vs. TIE)..

전자공여능 측정 결과

DPPH는 phenolic 화합물과 같이 수소에 전자 제공을 할 수 있는 전자공여체와 반응할 때 hydrogen radical이나 전자를 받아 phenoxy radical을 생성한다(Seo 등, 2002). DPPH가 가지고 있는 자유라디칼이 항산화 효과를 가진 시료와 반응하여 소거되었을 경우, 보라색이 노란색으로 변화하는 특징을 사용하는 실험으로 항산화를 확인하기 위해 보편적으로 사용되고 있는 실험이다(Joo, 2022).

틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물의 전자공여능을 측정한 결과는 Fig. 1과 같이 나타내었다. 농도가 증가함에 따라 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물의 전자공여능이 증가하는 것을 확인하였으며, 열수 추출물은 1,000 μg/mL에서 87.11%의 효과를 보였고 70% 에탄올 추출물은 1,000 μg/mL에서 89.69%의 높은 효과를 나타내었으며, 대조군인 비타민 C와 비교했을 때 유사한 활성을 나타냈다. 비타민 C는 대표적인 수용성 항산화제로 활성산소에 의해 손상된 DNA를 회복시켜 산화 방지 역할을 한다고 보고되었다(Kim, 2005). 결국 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물 모두 높은 항산화 능력을 가진 것으로 확인하였다.

Fig 1. Electron donating activity of extracts from Tillandsia ionantha. Vit. C: ascorbic acid, TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract. Results of all data were mean±SD of three independent measurement and expressed in different letters by one-way ANOVA (P<0.05).

ABTS 라디칼 소거능 측정 결과

ABTS 라디칼 소거능 시험은 potassium persulfate와 ABTS의 반응으로 ABTS⁺ 라디칼이 생성되어 항산화 효능을 가진 시료와 반응하면 환원되고 특유의 청록색으로 탈색되어 연한 녹색으로 띠는 것을 이용한 방법이다(Chae 등, 2021). ABTS⁺ 라디칼은 비교적 안정적인 자유라디칼로 hydrophilic과 lipophilic 모두 측정이 가능하다. DPPH는 음이온 라디칼을, ABTS는 양이온 라디칼을 생성한다는 차이가 있어 두 방법은 반응물질과 기질의 결합 정도가 달라 측정 결과가 다를 수 있다고 알려져 있다(Kwak과 Choi, 2015).

틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Fig. 2와 같이 나타내었다. ABTS 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 활성이 증가함을 확인하였으며, 500 μg/mL 농도 이상에서 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물 모두 99% 이상의 소거능을 보여 대조군인 비타민 C와 비교하였을 때, 유사한 항산화 활성을 보여 두 추출물 모두 ABTS 라디칼 소거능이 우수함을 확인하였다. ABTS 라디칼 소거 활성 증가는 DPPH 라디칼 소거 활성과 유의한 상관관계를 가진 것으로 보고되었으며, 이는 폴리페놀의 활성 증가와 관련이 있는 것으로 보고되었다(Lee 등, 2005). 본 연구에서도 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물의 항산화 활성을 확인하였으며 유용한 기능성 식품 소재로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Fig 2. ABTS radical scavenging activity of extracts from Tillandsia ionantha. Vit. C: ascorbic acid, TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract. Results of all data were mean±SD of three independent measurement and expressed in different letters by one-way ANOVA (P<0.05).

MTT assay에 의한 세포 생존율 측정 결과

MTT는 미토콘드리아 내막에 있는 oxidoreductase의 효소 작용으로 환원되어 보라색의 불용성 formazan을 생성하고 살아있는 세포를 용해해 흡광도를 이용하여 용해액의 발색 정도를 측정하는 방법이다(Kim 등, 2009).

틸란드시아 열수 및 70% 에탄올 추출물과 indomethacin을 RAW 264.7 세포에서의 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과는 Fig. 3과 같이 나타내었다. 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물은 500 μg/mL 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어, 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물은 세포 독성이 낮은 것을 확인하였다. 또한 indomethacin은 100 μg/mL 이하의 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 보여주어 이후 RAW 264.7 세포를 이용한 항염증 관련 실험은 90% 이상의 생존율을 보이는 농도 구간에서 진행하였다.

Fig 3. Cell viability of extracts from Tillandsia ionantha on RAW 264.7 cells. Con (Control): Extract-free group to RAW 264.7 cells, TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract, Indo: indomethacin. After culturing RAW 264.7 cells for one day in 96-well plate, they were treated with 5, 10, 50, 100, 500, and 1,000 μg/mL of TID, TIE, and Indo for 24 h. Then, it was measured using the MTT assay. Results of all data were mean±SD of three independent measurement and expressed in different letters by one-way ANOVA (P<0.05).

NO 생성억제 활성 측정 결과

NO는 L-arginine으로부터 NOS에 의해 L-citruline과 같이 생성되어 신경독성의 기능을 나타내고, 면역계, 신경계 등에 있어서 중요 전달 물질로 쇼크 및 신경 퇴행성 질병 발생에 관여하고 있다(Han 등, 2009). 또한 NO는 라디칼을 가진 가스성 물질로 다량의 NO 생성은 염증 반응이나 COX의 활성을 심화시키므로 NO 생성억제는 항염증제를 연구하는 부분에서 좋은 타깃이 될 수 있다(Lee와 Rhee, 2015).

RAW 264.7 세포를 LPS로 활성화한 후, 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물과 indomethacin을 처리하여 NO 생성 측정 결과를 Fig. 4와 같이 나타내었다. LPS 단독 처리군 대비 최종농도 500 μg/mL 농도에서 틸란드시아 이오난사 열수 추출물은 23.09%의 억제 효과를 보여주었으며, 틸란드시아 이오난사 70% 에탄올 추출물은 25.74%로, 열수 및 70% 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 NO 생성억제 효과가 나타났다. Indomethacin은 100 μg/mL 농도에서 LPS 단독 처리군 대비 56.05%의 NO 생성억제 효과를 보여주었다.

Fig 4. Inhibition effects of extracts from Tillandsia ionantha on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) NO production was determined in RAW 264.7 cells treated with TID and Indo, (B) NO production was determined in RAW 264.7 cells treated with TIE and Indo. TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract, Indo: indomethacin. After culturing RAW 264.7 cells (3×10⁵ cells/well) for one day in 6-well plate. LPS (10 μg/mL) was treated for 2 h, the TID, TIE, and Indo were treated at each concentration and measured 18 h later. Results are means±SD from three determination (^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. LPS alone treatment group).

PGE₂ 생성량 측정(PGE₂ ELISA) 결과

대부분의 조직에서 염증을 매개하는 PGE₂는 주요 염증성 prostanoid로 LPS 등의 자극에 노출된 유도 효소인 COX-2에 의해 발현이 증가하며, 이는 통증, 발열 및 혈관 확장을 유발할 수 있다(Aroonrerk 등, 2007; Kim, 2017).

PGE₂ ELISA kit을 사용하여 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서의 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물과 indomethacin을 처리하여 염증 매개물질인 PGE₂의 억제율을 측정한 결과는 Fig. 5에 나타내었다. LPS 단독 처리군 대비 두 추출물은 전 농도 구간(50, 100, 500 μg/mL)에서 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었으며, 500 μg/mL 농도에서 틸란드시아 열수 및 70% 에탄올 추출물은 각각 11.35%와 11.73%의 유사한 억제 효과를 보여주었다.

Fig 5. Inhibition effects of extracts from Tillandsia ionantha on PGE₂ production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) PGE₂ production was determined in RAW 264.7 cells treated with TID and Indo, (B) PGE₂ production was determined in RAW 264.7 cells treated with TIE and Indo. TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract, Indo: indomethacin. After culturing RAW 264.7 cells (3×10⁵ cells/well) for one day in 6-well plate. LPS (10 μg/mL) was treated for 2 h, the TID, TIE, and Indo were treated at each concentration and measured 18 h later. It was measured using the PGE₂ ELISA kit. Results are means±SD from three determination (^***P<0.001 vs. LPS alone treatment group).

Pro-inflammatory cytokine 생성량 측정(TNF-αELISA) 결과

Pro-inflammatory cytokine으로는 TNF-α, IL-6, IL-1β 등이 존재하며 다양한 염증 반응을 매개해 NO와 PGE₂ 생성을 유도하여 염증을 유발한다(Lee 등, 2011). 그중 TNF-α는 여러 염증성 질환과 숙주 방어에서 가장 중요한 조절 인자로 세포의 성장 및 분화를 조절한다(Jeong 등, 2012). 하지만 자극받은 대식세포에서 과잉 분비될 경우 염증과 같은 질병을 일으키는 주요 cytokine으로 세포사멸을 일으킬 수 있다(Choi, 2011).

ELISA kit을 사용하여 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에서의 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물과 indomethacin을 처리하여 pro-inflammatory cytokine 인자인 TNF-α의 억제율을 측정한 결과는 Fig. 6에 나타내었다. LPS 단독 처리군 대비 두 추출물은 전 농도 구간(50, 100, 500 μg/mL)에서 유의적인 억제 효과를 확인할 수 있었으며, 500 μg/mL 농도에서 틸란드시아 열수 및 70% 에탄올 추출물은 각각 26.01%와 14.8%로 열수 추출물이 70% 에탄올 추출물보다 우수한 억제 효과를 보여주었다.

Fig 6. Inhibition effects of extracts from Tillandsia ionantha on TNF-α production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) TNF-α production was determined in RAW 264.7 cells treated with TID and Indo, (B) TNF-α production was determined in RAW 264.7 cells treated with TIE and Indo. TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract, Indo: indomethacin. After culturing RAW 264.7 cells (3×10⁵ cells/well) for one day in 6-well plate. LPS (10 μg/mL) was treated for 2 h, the TID, TIE, and Indo were treated at each concentration and measured 18 h later. It was measured using the TNF-α ELISA kit. Results are means±SD from three determination (^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. LPS alone treatment group).

Western blot을 통한 단백질 발현 억제 효과 측정 결과

대표적인 염증세포인 대식세포는 LPS로 자극받아 세포 내전사인자인 nuclear factor-κB를 활성화해 대식세포의 핵 안으로 이동해 염증 관련 유전자인 iNOS와 COX-2의 발현을 유도한다(Shao 등, 2013). COX-2의 촉매적 활성 증가는 signaling cascade를 촉발하고, COX-2의 급성적인 발현 유도로 PGE₂의 생성이 증가하여 다양한 난치성 질환을 유발한다고 보고되어 있다(Hong 등, 2021). 또한, iNOS의 염증 매개물질의 생성 증가는 NO의 과도한 발현으로 염증 유발을 야기하기에 iNOS와 COX-2의 유전자 발현 억제에 대한 소재 발굴 연구가 활발히 이루어지고 있다(Min과 Jhoo, 2013).

틸란드시아 열수 및 70% 에탄올 추출물의 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현을 western blot을 통해 측정한 결과를 Fig. 7, 8에 나타내었다. 틸란드시아 열수 및 70% 에탄올 추출물의 iNOS 단백질 발현 측정 결과, 500 μg/mL 농도에서 LPS 단독 처리군 대비 각각 48.58%와 57.88%의 억제 효과를 보여주었다. 또한, COX-2 단백질 발현 측정 결과, 500 μg/mL 농도에서 LPS 단독 처리군 대비 각각 22.59%와 56.27%의 억제 효과를 나타내었다.

Fig 7. iNOS protein expression levels of extracts from Tillandsia ionantha in RAW 264.7 cells. (A) iNOS protein expression levels was determined in RAW 264.7 cells treated with TID and Indo, (B) iNOS production was determined in RAW 264.7 cells treated with TIE and Indo. TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract, Indo: indomethacin. After culturing RAW 264.7 cells (1×10₆ cells/well) for one day in 100 mm culture dish. LPS (10 μg/mL) was treated for 2 h, the TID, TIE and Indo were treated at each concentration and measured 18 h later. Results are means±SD from three determination (^***P<0.001 vs. LPS alone treatment group).

Fig 8. COX-2 protein expression levels of extracts from Tillandsia ionantha in RAW 264.7 cells. (A) COX-2 protein expression levels was determined in RAW 264.7 cells treated with TID and Indo, (B) COX-2 production was determined in RAW 264.7 cells treated with TIE and Indo. TID: Tillandsia ionantha hot distilled water extract, TIE: Tillandsia ionantha 70% ethanol extract, Indo: indomethacin. After culturing RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells/well) for one day in 100 mm culture dish. LPS (10 μg/mL) was treated for 2 h, the TID, TIE, and Indo were treated at each concentration and measured 18 h later. Results are means±SD from three determination (^***P<0.001 vs. LPS alone treatment group).

본 연구는 틸란드시아 이오난사의 다양한 생리활성 연구를 통해 기능성 소재의 가능성을 확인하였다. 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 각각 326.33±0.88 mg TAE/100 g과 325.48±0.78 mg TAE/100 g으로 두 추출물은 유사한 폴리페놀 함량을 지니고 있음을 확인하였다. 항산화 활성을 확인하고자 전자공여능 및 라디칼 소거 활성 측정 결과 대조군인 비타민 C와 유사한 효능을 나타내어 항산화 효과를 확인하였다. 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물은 500 μg/mL 이하 농도에서 세포 생존율을 기반으로 LPS에 유도된 NO 생성억제 및 염증성 cytokine인 TNF-α 및 PGE₂의 분비에 농도 의존적으로 활성 억제를 확인하였다. Western blot을 통해 항염증 관련 인자인 iNOS 및 COX-2 단백질 발현량을 측정한 결과 유의적으로 발현 저해가 나타났다. 이를 통해 틸란드시아 이오난사 열수 및 70% 에탄올 추출물은 항산화 및 항염 효과가 우수하다고 판단되며, 건강기능식품 등을 개발하기 위한 천연소재로의 활용 가치가 있을 것으로 사료된다.

본 과제는 2023년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 지자체-대학 협력기반 지역혁신 사업의 결과입니다(2021RIS-001).