호프(Hop, Humulus lupulus L.)는 삼과(Cannanaceae)에 속하는 유럽 원산의 다년생 덩굴성 식물로 6~9 m 이상 높게 자라며, 암수딴그루로 성숙한 암꽃만을 호프라는 용어로 통용되고 있다. 호프는 맥주에 독특한 향과 쓴맛을 부여하고 저장성을 증가시켜 맥주 산업에 없어서는 안 될 중요한 원료로 미국, 독일, 체코, 중국 등에서 널리 재배되고 있다. 우리나라의 호프 재배는 1970~80년대에 강원도를 중심으로 재배되어 1988년 기준 524톤의 호프가 생산되었다(Kim, 1989; Lyu 등, 2022). 하지만 1990년대 FTA에 의해 수입농산물이 전면 개방됨에 따라 가격경쟁력에서 밀리면서 국내 호프 재배 농가는 사라지게 되었다(Ha 등, 2023).

최근 강원도 홍천군 내촌면에서 자생하는 호프가 발견되었고, 홍천군 농촌 신활력플러스사업을 통해 야생 호프의 대량 증식에 성공해 홍천군 서석면을 중심으로 호프 재배가 재개되고 있다. 대량 증식에 성공한 호프의 품종 확인을 위해 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 분석법으로 100종 이상의 품종과 비교하였으나 SNP 조합이 일치하지 않는 신규 품종으로 판별되어 ‘홍천홉’이란 명칭으로 특허(Yeon 등, 2023)를 등록하고 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁(기탁번호: KCTC18919P)하였다.

호프는 예로부터 불면증, 불안, 긴장, 발열 등의 치료를 위한 목적으로 널리 사용되어 왔으며(Alonso-Esteban 등, 2019; Zanoli와 Zavatti, 2008), 최근 항산화, 항염증, 항당뇨, 항비만, 에스트로겐 활성, 기억력 및 인지력 개선 등과 같은 호프의 다양한 생리활성에 관한 연구가 보고되고 있어 건강기능식품과 의약품 소재로서의 관심도가 점차 증가하고 있다(Astray 등, 2020; Carbone과 Gervasi, 2022; Lin 등, 2019). 호프의 주요성분은 특유의 고미 성분으로 알려진 phloroglucinol형의 대표 화합물로 α-acid류에 속하는 humulone, β-acid류에 속하는 lupulone이 있으며, 정유(essential oils) 성분은 myrcene, humulene의 함량이 높다(Abiko 등, 2022; Kim 등, 2018). 또한 호프에만 특이하게 존재하는 prenylated flavonoid계 화합물이 있으며 그중 xanthohumol이 가장 풍부하게 함유되어 있어 호프 건조중량의 대략 1%에 이르는 것으로 알려져 있다(Hrnčič 등, 2019). Xanthohumol은 GABA_A 수용체에 결합해 신경을 안정시켜 수면을 유도한다고 보고(Meissner와 Häberlein, 2006)되는 등 다양한 생리활성이 존재하는 것으로 알려져 호프의 지표성분(marker compound)으로 이용 가치가 높다.

건강기능식품 개발은 과학적 근거를 토대로 기능성과 안전성이 입증되어야 할 뿐만 아니라 해당 원료를 특정할 수 있는 표준화가 요구된다. 표준화(standardization)란 생물자원으로부터 유래한 고유성분의 변동을 최소화하여 생산되는 배치(batch)에 상관없이 일정한 품질을 유지하기 위해 원재료의 생산에서부터 제조과정 전반에 걸쳐 사용된 기술과 정보를 관리하는 것을 뜻하며, 이를 위한 가장 일반적인 방법은 지표성분을 확인하는 것이다(Hong 등, 2021; KFDA, 2008). 지표성분 분석을 위해서는 분석법을 설정하는 과정이 필요하며, 설정된 분석법의 타당성과 재현성, 그리고 신뢰성이 있는 결과를 얻을 수 있는지에 대한 과학적인 검증으로 분석법의 유효성 검증이 필요하다(Jeon 등, 2016; Jo 등, 2018). 현재 xanthohumol 분석법에 관한 연구 결과들이 보고되었으나 대부분 맥주 내 xanthohumol 분석법의 유효성 검증에 관한 연구(Bernal 등, 2011; Dhooghe 등, 2010; Goncalves 등, 2013; Loureiro 등, 2019)로 호프 추출물에 관한 분석법 연구는 미비한 실정이며, xanthohumol 분석법에 대한 국내 연구는 전무하다.

따라서 본 연구에서는 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료를 개발할 목적으로 국내 고유 품종 호프를 소재로 원료 표준화를 위해 지표성분으로 xanthohumol을 선정하고, HPLC를 이용하여 지표성분 xanthohumol의 분석법을 확립하고 분석법의 유효성 검증을 실시하였다.

재료 및 시약

본 실험에 사용된 호프는 강원도 곡산농원에서 재배, 채취 및 건조한 원물(GAP No.1022245)을 (주)케이홉스유통지원센터로부터 제공받아 사용하였다. 건조된 호프 50 g을 50~70% 주정을 이용하여 추출한 후 여과 및 농축하고 동결건조하여 분말로 제조한 것을 시료(호프 추출물, NHCK-HOP®)로 사용하였다. 지표성분으로 사용된 표준물질 xanthohumol은 TCI Chemicals에서 purity가 97% 이상인 물질(Fig. 1)을 구입하여 사용하였으며, 메탄올과 acetonitrile은 J.T. Baker, formic acid는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.

Fig 1. Chemical structure of xanthohumol.

표준용액 및 시험용액 제조

Xanthohumol 표준물질 5 mg을 정밀히 달아 메탄올 5 mL에 녹여 1 mg/mL가 되도록 표준용액 stock을 제조하였다. 조제된 stock solution은 4°C에 보관하면서 사용 전에 메탄올로 희석하여 5, 12.5, 25, 37.5, 50 μg/mL로 한 액을 검량선용 표준용액으로 사용하였다. 호프 추출물 250 mg을 취하여 메탄올 50 mL를 가한 후 30분간 초음파 추출하고, 0.22 μm PTFE membrane syringe filter(Whatman)로 여과한 것을 시험용액으로 사용하였다.

HPLC 분석

Xanthohumol을 분석하기 위해 다중파장 검출기(photodiode-array detector, PDA)가 장착된 HPLC(1260, Agilent Technologies) 시스템을 사용하였다. 분석에 사용된 컬럼은 Capcell pak C₁₈(4.6×250 mm, 5 μm, Shiseido)을 사용하였고, 이동상은 0.1% formic acid가 포함된 증류수(A)와 0.1% formic acid가 포함된 95% acetonitrile(B)을 사용하여 1 mL/min의 유량으로 하고 컬럼 온도는 40°C를 유지하였다. 검출파장은 370 nm로 설정하였으며 gradient condition으로 시료 20 μL를 주입하여 Table 1과 같은 조건으로 분석하였다.

Table 1 . HPLC conditions for the quantitative analysis of xanthohumol.

Items	Conditions
Instrument	HPLC 1260 Infinity (Agilent Technologies)
Mobile phase	A: 0.1% formic acid in water
	B: 0.1% formic acid in 95% acetonitrile
	Gradient	Time (min)	A (%)	B (%)
		0	80	20
		3	50	50
		6	30	70
		15	0	100
		20	0	100
		25	80	20
		30	80	20
Column	Capcell pak UG120 C18 (4.6×250 mm, 5 μm)
Injection volume	20 μL
Flow rate	1 mL/min
Column temp.	30°C
Detector	370 nm
Run time	30 min

지표성분 분석법 유효성 검증

분석법의 유효성 검증(method validation)은 식품의약품 안전처의 건강기능식품 기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성 가이드(MFDS, 2022)와 ICH 가이드라인(ICH, 2005)을 근거로 하여 지표성분에 대한 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ)를 평가하여 분석법을 검증하였다.

특이성: 특이성은 추출물, 불순물, 분해물 등이 혼합되어 있는 시료에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력을 말하는 것으로 표준물질과 시험용액의 HPLC 크로마토그램을 비교하여 xanthohumol의 머무름시간을 확인하였으며, PDA에 의한 UV spectrum을 비교 분석하였다.

직선성: 직선성이란 분석 대상인 특정 성분의 농도 또는 양에 비례하여 일정 범위 내에 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 말하는 것으로 표준물질을 5, 12.5, 25, 37.5, 50 μg/mL의 5 point 농도로 제조하여 HPLC를 이용하여 3회 반복 측정한 후 검출성분의 피크 면적과 표준용액 농도 간의 검량선을 작성하여 상관계수(correlation coefficient, R²)를 계산하였다.

정확성: 정확성은 분석물질의 이론값과 분석법에 의해 얻은 측정값의 근접한 정도를 확인하는 방법으로, 농도를 알고 있는 시험용액에 표준용액을 저농도(5 μg/mL), 중농도(25 μg/mL), 고농도(50 μg/mL)로 첨가하여 HPLC로 농도별 5회 반복 측정하였다. 시험용액에 첨가된 표준용액의 이론값과 실측값에 대한 회수율(recovery, %)을 구하여 정확성을 평가하였다.

정밀성: 정밀성이란 하나의 시료로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성을 의미하는 것으로, 일정 농도로 조제한 시험용액에 대해 HPLC로 5회 반복 측정하여 반복성(repeatability)을 확인하였으며, 재현성(reproducibility)은 서로 다른 시험자가 단일 농도의 시험용액을 각각 5회 반복 측정하고 그에 대한 상대표준편차(relative standard deviation, %RSD)로 정밀도를 판단하였다.

검출한계 및 정량한계: 시료 중에 존재하는 분석대상물질의 검출 가능한 최소량 또는 최저농도의 검출한계와 정밀성과 정확성을 담보하는 분석대상물질의 정량 가능한 최소량 또는 최소농도의 정량한계는 직선성을 통해 산출된 검량선의 기울기(S)와 y-절편의 표준편차(σ)에 근거하여 다음 식을 이용하여 확인하였다.

σ: The standard deviation of the response

S: The slope of the calibration curve

특이성 검증

호프의 유효성분인 xanthohumol을 지표성분으로 제안하고 이의 분석법을 개발하였다. 특이성 검증을 위해 표준용액과 호프 추출물 시험용액의 크로마토그램을 비교하여 피크 분리 여부를 확인한 결과, xanthohumol은 다른 성분과 간섭 없이 명확하게 분리되어 단일 피크로 검출되었고 표준용액과 시험용액의 피크 머무름시간(retention time, RT)은 각각 11.322분과 11.300분으로 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 2). 또한 표준용액과 시험용액의 UV/visible spectrum에서도 200~400 nm 범위에서 동일한 spectrum을 나타내어 분석법의 특이성을 확인할 수 있었다(Fig. 3). Loureiro 등(2019)은 HPLC를 이용하여 UV detector 370 nm, 0.1% formic acid와 acetonitrile을 이용하여 gradient로 분석한 결과, xanthohumol은 RT 10.03분에 단일 피크로 검출되었다고 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다.

Fig 2. HPLC chromatograms of xanthohumol standard solution (A) and hop extract (B).

Fig 3. UV/visible spectra of xanthohumol standard solution and hop extract.

직선성 검증

Xanthohumol 표준용액을 5, 12.5, 25, 37.5, 50 μg/mL 농도로 단계적으로 희석하여 HPLC로 3회 반복 분석하였다. 검출된 xanthohumol 피크 면적을 통하여 검량선을 작성하였으며, 상관계수(R²)는 각각 1.0000, 0.9999, 1.0000 이상으로 높은 직선성이 나타나 분석의 적합함이 확인되었다(Fig. 4). Loureiro 등(2019)은 xanthohumol 분석방법 검증에서 0.05~20 μg/mL 농도에서 상관계수 0.9999로 높은 직선성이 보였으며, Dhooghe 등(2010)은 검량선 18.50~73.99 μg/mL 범위에서 0.9993의 상관계수가 나타나 본 연구와 유사한 수준을 보였다.

Fig 4. Calibration curves of xanthohumol standard solution.

정확성 검증

대조군에 해당하는 호프 추출물 시험용액의 xanthohumol 농도는 28.78±0.20 μg/mL였으며, 표준용액을 각각 저농도(5 μg/mL), 중농도(25 μg/mL), 고농도(50 μg/mL)로 첨가한 뒤 HPLC로 분석한 결과, 회수율은 96.76%, 102.93%, 100.27%였으며, 회수율 평균은 99.99%였다(Table 2). 이는 건강기능식품 기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성 가이드(MDFS, 2022)의 회수율 시험기준인 시료의 지표물질 함량 0.1~1%(1~10 mg/g, w/w) 범위에 해당하는 회수율 기준(90~108%)에 부합하는 결과로 본 시험법의 정확성을 확인할 수 있었다. Dhooghe 등(2010)이 호프 추출물의 xanthohumol 회수율은 92.33~104.85%로 나타났다고 보고한 결과와 유사하였으며, Loureiro 등(2019)의 연구에서는 호프를 함유한 식품보조제(food supplement)의 경우 xanthohumol 회수율은 72.6~109.6%로 양호했던 반면, xanthohumol이 미량 함유된 맥주의 경우 제품별로 회수율의 편차가 크다고 보고하였다.

Table 2 . Accuracy (recovery) of analytical method for xanthohumol in hop extract.

Spiked amount (μg/mL)	Recovery (%)					Mean±SD	RSD (%)
	n=1	n=2	n=3	n=4	n=5
5	104.59	93.7	92.52	97.83	95.13	96.76±4.81	4.97
25	104.12	101.76	103.03	103.58	102.16	102.93±0.97	0.95
50	101.93	99.16	99.57	100.02	100.68	100.27±1.09	1.08

정밀성 검증

시료량의 변화에 따른 반복정밀도를 확인하기 위해 호프 추출물 125, 250, 500 mg을 취하여 전처리한 후 HPLC로 5회 반복 측정한 결과, RSD는 각각 0.32%, 0.85%, 0.56%로 나타나 1% 이하의 우수한 반복성을 확인하였다(Table 3). 실험실 내 실험자를 변동요인으로 재현성을 확인하기 위해 두 명의 실험자가 호프 추출물 250 mg을 취하여 동일한 조건으로 전처리한 후 HPLC로 5회 반복 측정한 결과, RSD는 0.70%, 0.18%로 나타나 실험자 간 RSD 편차가 미미한 것으로 확인되어 재현성이 우수한 것으로 판단되었다(Table 4). 이상의 결과는 Dhooghe 등(2010)이 호프 추출물에 함유된 xanthohumol을 분석한 결과, 반복성의 RSD는 농도별로 1.74%, 1.56%, 1.58%, 일내(intra-day) 재현성은 2.87~3.99%, 일간(inter-day) 재현성은 1.44~4.04%로 보고한 결과보다 낮은 RSD를 나타낸 것이며, 또한 지표물질 함량 1%(10 mg/g, w/w) 이내 범위의 반복성 RSD 3% 이내, 재현성 RSD 6% 이내인 건강기능식품 기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성 가이드(MFDS, 2022)의 기준에 부합하여 신뢰성이 높은 시험법임을 확인하였다.

Table 3 . Precision (repeatability) of analytical method for xanthohumol in hop extract.

Samples (mg)	Xanthohumol (mg/g)					Mean±SD	RSD (%)
	n=1	n=2	n=3	n=4	n=5
125	5.75	5.73	5.74	5.78	5.76	5.75±0.02	0.32
250	5.88	5.89	5.88	6	5.91	5.91±0.05	0.85
500	5.89	5.97	5.9	5.9	5.91	5.91±0.03	0.56

Table 4 . Precision (within-laboratory reproducibility) of analytical method for xanthohumol in hop extract.

Samples (mg)	Operator	Xanthohumol (mg/g)					Mean±SD	RSD (%)
		n=1	n=2	n=3	n=4	n=5
250	A	5.96	5.95	5.93	6.04	5.94	5.90±0.04	0.7
	B	5.97	5.96	5.99	5.97	5.97	5.97±0.01	0.18

검출한계와 정량한계

직선성 확인을 위해 표준용액 3개 농도를 HPLC로 분석하고, 그 결과로 검량선을 작성하여 검량선의 기울기와 y-절편을 산출하고 반응의 표준편차에 근거하여 검출한계와 정량한계를 계산하였다. Xanthohumol의 검출한계와 정량한계 값은 각각 0.26 μg/mL와 0.80 μg/mL로 나타났다(Table 5). 이 값은 HPLC-DAD를 사용한 호프 추출물에 대해 Dhooghe 등(2010)이 보고한 값보다 우수하며, HPLC-DAD로 호프 함유 식품보조제와 맥주를 분석한 Loureiro 등(2019)이 설명한 값보다는 다소 낮은 수준이었다. 또한 Goncalves 등(2013)은 MEPS(microextraction in packed sorbent)/UHPLC-PDA를 사용한 맥주 분석에서 0.0009 μg/mL와 0.003 μg/mL의 매우 낮은 검출한계와 정량한계를 보고하였다.

Table 5 . Linearity, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of xanthohumol.

Analyte	Range (μg/mL)	Slope	Intercept	Correlation coefficient (R2)	LOD (μg/mL)	LOQ (μg/mL)
Xanthohumol	5∼50	119.0414	0.5881	0.9999	0.26	0.80

호프 추출물의 xanthohumol 함량 분석

본 연구로 확립된 분석법을 이용하여 국내산 건조 호프를 50~70% 주정으로 추출하고 동결건조한 호프 추출물의 xanthohumol 함량을 분석하였다. 호프 추출물 250 mg을 정밀하게 취하여 메탄올 50 mL를 가한 후 30분간 초음파 추출하고 여과한 시험용액을 3회 반복하여 분석한 결과는 Table 6과 같다. 호프 추출물의 xanthohumol은 평균 함량이 6.40±0.75 mg/g으로 건강기능식품 기능성 원료 인정규격에 따라 80~120%의 지표성분 함량 범위를 고려 시 5.12~7.68 mg/g 범위로 나타났다. 이는 Min 등(2023)이 해외에서 주로 재배되는 호프 품종인 Cascade, Centennial, Saaz, Saphir 70% 주정 추출물의 xanthohumol 함량이 각각 1.51±0.04 mg/g, 1.95±0.06 mg/g, 2.51±0.13 mg/g, 4.23±0.14 mg/g으로 보고한 결과와 비교했을 때 국내 고유 품종 호프의 xanthohumol 함량이 높은 것으로 확인되었다.

Table 6 . Contents of xanthohumol in hop extracts.

Sample No.	Xanthohumol (mg/g)			Mean±SD
1	6.55	6.31	6.33	6.40±0.13
2	6.5	6.52	6.85	6.62±0.20
3	6.9	7.01	6.94	6.95±0.05
4	5.43	5.41	5.41	5.42±0.01
5	5.22	5.33	5.17	5.24±0.08

본 연구는 호프 추출물을 건강기능식품 개별인정원료로 개발하기 위해 원료 표준화를 위한 지표성분으로 xanthohumol을 설정하고 이에 대한 HPLC 분석법 유효성 검증을 실시하였다. 분석법의 유효성 검증은 식품의약품안전처 건강기능식품 기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성 가이드와 ICH 가이드라인에 근거하여 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계를 통해 신뢰성 및 타당성을 검증하였다. 지표성분 xanthohumol 분석을 위해 0.1% formic acid가 첨가된 water 및 95% acetonitrile을 이동상으로 사용하였고 컬럼은 Capcell pak C₁₈을 사용하여 HPLC를 이용하여 분석하였다. 표준용액과 호프 추출물의 지표성분 xanthohumol의 피크 머무름시간은 일치하고 다른 물질의 간섭을 받지 않는 것을 확인했으며, UV/visible spectrum이 일치하므로 특이성을 확인하였다. Xanthohumol 검량선의 상관계수(R²)는 0.9999 이상으로 나타나 높은 직선성을 보여 분석에 적합한 것으로 확인되었다. 호프 추출물에 xanthohumol 표준용액을 5, 25, 50 μg/mL의 3개 수준으로 첨가하고 분석한 회수율은 96.76~102.93%로 나타나 높은 정확성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 정밀성은 반복성과 재현성으로 확인했으며, 호프 추출물 125~500 mg 범위에서 시료량의 변화에 따른 반복성은 RSD 0.32~0.85%로 나타났고 실험자를 달리한 재현성 검증 결과 RSD는 0.18~0.70%로 확인되어 본 분석법은 정밀성이 있음을 확인하였다. 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거한 검출한계는 0.26 μg/mL였고 정량한계는 0.80 μg/mL로 호프 추출물의 xanthohumol 함량 분석을 위한 적합한 한계수준으로 확인되었다. 이상의 결과로 호프 추출물의 지표성분인 xanthohumol의 HPLC 분석법은 국내외 가이드라인에 적합한 시험법으로 검증되었다. 또한 검증된 분석법을 이용하여 호프 추출물의 xanthohumol 함량을 분석한 결과 6.40±0.75 mg/g으로 분석되었다. 본 시험법은 호프 추출물의 건강기능식품 개별인정원료 개발을 위한 표준화의 기초자료로 활용될 것으로 사료된다.

본 연구는 중소벤처기업부와 중소기업기술정보진흥원의 “지역특화산업육성+(R&D, S3364595)” 사업의 지원을 받아 수행된 연구결과입니다.