고혈당(hyperglycemia) 증상을 특징으로 하는 심각한 대사성 질환인 당뇨병은 우리나라에서 유병률이 지속해서 증가하고 있다(Korean Diabetes Association, 2022). 특히 현대인의 운동부족, 식습관의 변화 및 이로 인한 과체중으로 인슐린 저항성(insulin resistance) 및 상대적인 인슐린 부족에 의한 제2형 당뇨병이 증가하고 있으며 당뇨병 환자의 90%를 차지하고 있다(Oguntibeju, 2019). 제2형 당뇨병에 의해 만성 고혈당 증상은 심장질환, 뇌졸중 및 당뇨망막병증의 합병증을 유발하므로(Korean Diabetes Association, 2022), 제2형 당뇨병을 예방하고 치료하는 것은 건강한 삶을 위해 매우 중요하다.

현재 임상에서는 혈당 강하를 위해 인슐린 분비촉진제, 인슐린 저항성 개선제, 포도당 생성 억제제 및 포도당 재흡수 억제제 등의 약물 제제가 단독 또는 병용요법으로 사용되고 있다. 이들 약물 제제는 효과적으로 혈당을 낮추나 저혈당 및 유산증을 초래하고, 장기간 복용 시 심장, 신장 및 간 등의 부작용이 대두되고 있다(Padhi 등, 2020). 이에 기존 약물 제제의 부작용을 줄이고 체내 당대사와 인슐린 저항성 및 민감성을 개선해 항당뇨 효과를 가지는 천연물에 관한 관심이 증대되고 있으며, 많은 연구가 활발히 진행되고 있다(Kumar 등, 2021; Salimifar 등, 2013).

마르멜로(Cydonia oblonga Miller)는 장미과에 속하는 과실나무로 동유럽과 지중해 부근에 분포한다. 마르멜로 열매는 퀸스 또는 유럽모과로 불리는데 생김새가 모과와 유사하며, 딱딱하고 황색을 띤다(Abdollahi, 2019). 마르멜로 열매는 주로 잼 및 젤리 형태의 식품으로 섭취되고 있다. 또한 예로부터 마르멜로 열매는 당뇨, 고혈압, 심장질환, 호흡기 질환 및 궤양 치료를 위한 민간요법으로 사용되어 왔다(Ashraf 등, 2016).

마르멜로 열매는 chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, neochlorogenic acid, isochlorogenic acid, quercetin 3-rutinosides, quercetin 3-galactoside, quercetin 3-glucoside, kaempferol 3-glucoside 및 kaempferol 3-rutinoside 등 다양한 폴리페놀 성분을 함유하고 있으며, 건강에 이로운 다양한 생리활성을 나타낸다(Silva 등, 2002; Wojdylo 등, 2013). 다양한 세포실험과 동물실험에서 여러 종류의 마르멜로 열매 추출물은 항산화(Wojdylo 등, 2013) 및 항염(Essafi-Benkhadir 등, 2012) 효과를 나타내었고, 또한 고혈압(Zhou 등, 2014) 및 고지혈(Umar 등, 2015) 개선 효과를 나타내었다. Aslan 등(2010)은 streptozotocin으로 유도한 당뇨 동물모델에서 마르멜로 잎 에탄올 추출물이 혈당 저하 효과를 나타냄을 보고하였고, Mirmohammadlu 등(2015)은 streptozotocin 유도 당뇨 동물모델에서 마르멜로 열매 물 추출물이 혈청 지질을 개선함을 보고하였다. 고지방식이로 유도한 비만 동물모델에서 마르멜로 열매 물 추출물은 인슐린 저항성을 감소시키고 인슐린 민감성(insulin sensitivity)을 증가시켰다(Lee 등, 2022). 이 결과들은 마르멜로 열매 추출물이 당대사를 조절하여 당뇨병을 예방 및 치료할 가능성을 제시하고 있으나 현재까지 그 작용 기전에 대해 알려진 바가 없어 작용 기전을 규명하는 연구가 필요하다.

본 연구에서는 마르멜로 열매 추출물의 당뇨 예방 및 치료를 위한 기능성 소재로의 이용 가능성을 평가하기 위해 rat에서 유래한 근육세포인 L6 세포에서 마르멜로 열매 추출물이 포도당 이용, 포도당 유입(uptake) 및 당대사 조절 신호전달 경로에 미치는 영향을 조사하였다.

마르멜로 추출물의 제조

본 연구에서는 Lee 등(2022)이 제시한 방법에 따라 (주)비엔지에서 제조하여 제공한 마르멜로 추출물(COME)을 시험물질로 사용하였다. 마르멜로 과실을 압착하여 즙을 제거하고 얻은 펄프에 30%(v/v) 에탄올을 첨가하여 2회 추출하였다. 이후 추출액을 여과하고 감압농축 후 분무 건조하여 COME을 제조하였다.

세포배양 및 분화 유도

Rat의 골격조직에서 유래한 근원세포(myoblast)인 L6 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. L6 세포는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에 10%(v/v) fetal bovine serum(FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37°C 습윤한 CO₂ 배양기(5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때 phosphate buffer saline(pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA를 처리하여 세포를 계대 배양하였고, 세포배양액은 2일마다 교환하였다.

L6 세포를 근세포(myotube)로 분화하기 위해 DMEM에 2%(v/v) FBS를 첨가한 근세포 분화배양액으로 교환하여 L6 세포를 4일 배양하였으며, 근세포 분화배양액은 2일마다 교환하였다.

세포 생존율 측정

L6 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 배양하였다. 24시간 동안 세포를 배양한 후 다양한 농도의 COME을 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환하여 세포를 24시간 배양하였으며, 이후 MTT assay 방법(Denizot과 Lang, 1986)으로 세포 생존율을 측정하였다.

포도당 소비량 측정

L6 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 24시간 세포를 배양하였다. 이후 근관세포로의 분화를 유도하기 위해 근세포 분화배양액으로 세포배양액을 교환하여 4일간 배양하였다. 분화 유도 후 다양한 농도의 COME을 함유한 세포배양액으로 교환하여 세포를 배양하였고, 세포가 24시간 동안 condition한 세포배양액을 수거하여 세포배양액 내의 포도당 함량을 glucose assay kit(BioMax)을 사용하여 제조사의 제시 방법에 따라 측정하였다. COME을 함유한 세포배양액과 세포가 condition한 세포배양액 내의 포도당 함량을 각각 측정하여 두 배양액 내의 포도당 함량 차이를 포도당 소비량으로 산출하였다.

젖산 생성 측정

L6 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 24시간 세포를 배양하고 세포배양액을 근세포 분화배양액으로 교환하여 4일간 배양하였다. 분화 유도 후 다양한 농도의 COME을 함유한 세포배양액으로 교환하여 세포를 24시간 동안 배양하였고, 세포배양액 내의 포도당 함량을 glucose assay kit(BioMax)을 사용하여 제조사가 제시한 방법에 따라 측정하였다.

포도당 유입 측정

L6 세포를 3×10⁴ cells/well이 되도록 96-well plate에 분주하여 24시간 세포를 배양하고 세포배양액을 근세포 분화배양액으로 교환하여 4일간 배양하였다. 분화 유도 후 다양한 농도(0~600 μg/mL)의 COME을 함유한 세포배양액으로 교환하여 세포를 2시간 동안 배양한 후 glucose uptake colorimetric assay(Abcam)를 사용하여 제조사가 제시한 방법에 따라 포도당 유입량을 측정하였다.

Western blot에 의한 단백질 발현 측정

L6 세포를 1×10⁶ cells/dish가 되도록 100 mm 세포배양접시에 분주하여 24시간 세포를 배양하고 세포배양액을 근세포 분화배양액으로 교환하여 4일간 배양하였다. 분화 유도 후 다양한 농도의 COME을 함유한 세포배양액으로 교환하여 세포를 4시간 동안 배양한 후 세포를 수거하여 Kim 등(2022)의 방법으로 total cell lysate를 제조하였다. Total cell lysates의 단백질 함량은 BCA protein assay kit(Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였으며, Kim 등(2022)이 제시한 방법에 따라 western blot 분석을 수행하였다. Western blot 분석에 사용한 glucose transporter(GLUT) 4 항체는 Santa Cruz에서, Akt, phospho-Akt(Ser 473), AMP-activated protein kinase(AMPK)α, phospho-AMPKα(Thr 172), insulin receptor substrate-1 (IRS-1), phospho-IRS-1(Ser307) 및 β-actin 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하여 사용하였다. 단백질 밴드는 Luminata^TM Forte Western HRP Substrate(Millipore Corporation)를 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였고, 각 단백질의 발현 수준은 Image Quant^TM LAS 500 imaging system(GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 사용하여 정량 분석하였다.

통계 분석

모든 결과는 mean±SD로 나타내었다. 수집된 결과는 Statistical Analysis System(SAS) Window version 9.4(SAS Institute)를 이용하여 통계 분석하였다. 시험군 간의 유의성 검증은 Student’s t-test 또는 분산분석(analysis of variance, ANOVA)으로 분석하였고, 시험군 간의 다중 비교는 Duncan’s multiple range test로 분석하였다. P<0.05일 때 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

COME이 L6 세포의 세포 생존율에 미치는 영향

COME이 근원세포인 L6 세포에 세포독성을 야기하는지를 조사하기 위해 L6 세포에 다양한 농도(0~800 μg/mL)의 COME을 처리하여 세포를 72시간 배양한 후 세포 생존율을 측정하였다. COME을 100 μg/mL 농도로 처리한 경우 대조군(0 μg/mL)에 비해 유의적으로 세포 생존율이 증가하였다. COME을 50, 200, 400, 600 및 800 μg/mL 농도로 처리한 경우 세포 생존율은 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Fig. 1). 이는 0~800 μg/mL 농도 범위에서 COME은 L6 세포에 세포독성을 야기하지 않음을 제시하며, 이를 근거로 이후 실험에서는 COME 처리 농도를 0, 200, 400 및 600 μg/mL로 설정하여 수행하였다.

Fig 1. Effect of Cydonia oblonga Miller extract (COME) on the cell viability in L6 cells. L6 cells were plated at a density of 5×10⁴ cells/well in 48-well plates with DMEM supplemented with 10% FBS. After 24 h, cells were treated with various concentration of COME and incubated for 72 h. Cell viability was estimated by the MTT assay. Each bar represents the mean±SD. Mean without a common letter differs significantly at P<0.05.

COME이 포도당 이용 및 젖산 생성에 미치는 영향

COME이 근육세포의 포도당 이용에 미치는 영향을 조사하기 위해 근관세포로 분화를 유도한 L6 세포에 COME을 처리하여 배양한 후 배양액에 남아 있는 포도당 함량을 측정하여 세포의 포도당 소비량을 측정하였다.

포도당 소비량은 COME 및 양성 대조물질인 metformin(2 mM) 처리에 의해 유의적으로 증가하였다. COME을 처리하지 않은 대조군의 포도당 소비량은 0.21±0.06 mM이었으며, 600 μg/mL COME 처리군과 metformin 처리군의 포도당 소비량은 각각 0.62±0.21 mM, 0.76±0.17 mM이었다(Fig. 2A).

Fig 2. Effect of Cydonia oblonga Miller extract (COME) on glucose consumption and lactate production in L6 cells. L6 cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/well in 24-well plates with DMEM supplemented with 10% FBS. After 24 h, cells were incubated with DMEM supplemented with 2% FBS for 4 days to differentiate into myotubes. After differentiation induction, cells were treated with various concentration of COME and incubated for 24 h. The 24 h-conditioned medium was collected. (A) Glucose content in medium was measured using glucose assay kit. (B) Lactate content in medium was measured using lactate assay kit. Met, 2 mM metformin. Each bar represents the mean±SD. Mean without a common letter differs significantly at P<0.05.

근육세포에서 포도당이 해당 작용을 거쳐 분해될 때 젖산이 생성되므로 COME이 근육세포에서 포도당 대사에 미치는 영향을 조사하고자 젖산 생성에 미치는 영향을 조사하였다. Fig. 2B에 나타난 바와 같이 배양액 내의 젖산 함량은 대조군에 비교하여 COME 처리에 의해 유의적으로 증가하였으나 COME 처리 농도에 따라 유의적인 차이를 나타내지는 않았다. 600 μg/mL COME을 처리한 경우 대조군과 비교하여 젖산 함량이 12.5% 증가하였고, 2 mM metformin을 처리한 경우 대조군과 비교하여 73.0% 증가하였다.

COME이 포도당 유입에 미치는 영향

포도당 유사체로 세포 내로 흡수된 후 인산화되어 대사되지 않고 세포 내에 축적되는 2-deoxyglucose(2-DG)를 사용하여 COME의 포도당 유입 영향을 조사하였다. 2-DG를 처리하지 않은 시험군보다 2-DG를 처리한 시험군에서 포도당 유입이 현저히 증가하였고 이는 세포에 처리한 2-DG가 세포 내로 유입되었음을 나타낸다. 2-DG와 함께 COME을 처리한 경우 세포 내 포도당 유입이 유의적으로 증가하였다. 2-DG 처리하에서 400 및 600 μg/mL COME을 처리한 경우 COME을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포 내 포도당 유입이 각각 13.0%, 19.7% 증가하였다(Fig. 3).

Fig 3. Effect of Cydonia oblonga Miller extract (COME) on glucose uptake in L6 cells. L6 cells were plated at a density of 3×10⁴ cells/well in 96-well plates, treated with various concentration of COME, and incubated for 2 h as described in Fig. 2. Glucose uptake was measured using glucose uptake colorimetric assay kit. Met, 2 mM metformin. Each bar represents the mean±SD. ^***P<0.001 significantly different from that of 2-deoxyglucose (2DG)-untreated group. Mean without a common letter differs significantly at P<0.05.

COME이 GLUT4 발현 및 포도당 유입 조절 신호전달 단백질 발현에 미치는 영향

COME이 포도당 유입에 주요한 역할을 담당하는 포도당수송체인 GLUT4의 발현을 조사하기 위해 western blot을 실시하였다. Fig. 4에 나타난 바와 같이 COME과 metformin 처리는 GLUT4 발현을 유의적으로 증가시켰다. GLUT4 발현은 COME 처리 농도 의존적으로 증가하였으며, 600 μg/mL COME을 처리한 경우 대조군과 비교하여 GLUT4 발현이 112% 증가하였다.

Fig 4. Effect of Cydonia oblonga Miller extract (COME) on GLUT4 expression in L6 cells. L6 cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/dish in 100 mm dishes, treated with various concentration of COME, and incubated for 4 h as described in Fig. 2. Total cell lysates were prepared and analyzed by western blotting with the indicated antibodies. (A) Images of western blots representative of four independent experiments are shown. (B) Quantitative analysis of western blot results. The protein expression was normalized to that of β-actin and is represented relative to that of control (0 μg/mL). The control levels were set at 1. Met, 2 mM metformin. Each bar represents the mean±SD. Mean without a common letter differs significantly at P<0.05.

COME이 포도당 유입 조절 신호전달 경로에 미치는 영향을 조사하기 위해 phospho-IRS-1, IRS-1, phospho-Akt, Akt, phospho-AMPK 및 AMPK 발현을 조사하였다. COME은 IRS-1과 Akt 발현에는 유의한 영향을 미치지 않았다. 반면, phospho-IRS-1과 phosphop-Akt 발현이 증가하여, phospho-IRS-1/IRS-1 ratio 및 phospho-Akt/Akt ratio가 COME 처리에 의해 유의적으로 증가하였다(Fig. 5). 이는 COME이 IRS-1과 Akt의 활성을 증가시킴을 나타낸다. AMPK 발현은 COME 처리에 의해 유의적인 변화를 나타내지 않았으나 phospho-AMPK 발현은 유의적으로 증가하였고 이에 phospho-AMPK/AMPK ratio가 COME 처리에 의해 유의적으로 증가하였다(Fig. 6). 이는 COME이 AMPK 활성을 증가시켰음을 나타낸다.

Fig 5. Effect of Cydonia oblonga Miller extract (COME) on IRS-1 and Akt expression in L6 cells. L6 cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/dish in 100 mm dishes, treated with various concentration of COME, and incubated for 4 h as described in Fig. 2. Total cell lysates were prepared and analyzed by western blotting with the indicated antibodies. (A, C) Images of western blots representative of four independent experiments are shown. (B, D) Quantitative analysis of western blot results. The protein expression was normalized to that of β-actin and is represented relative to that of control (0 μg/mL). The control levels were set at 1. Met, 2 mM metformin. Each bar represents the mean±SD. Mean without a common letter differs significantly at P<0.05.

Fig 6. Effect of Cydonia oblonga Miller extract (COME) on AMPK expression in L6 cells. L6 cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/dish in 100 mm dishes, treated with various concentration of COME, and incubated for 4 h as described in Fig. 2. Total cell lysates were prepared and analyzed by western blotting with the indicated antibodies. (A) Images of western blots representative of four independent experiments are shown. (B) Quantitative analysis of western blot results. The protein expression was normalized to that of β-actin and is represented relative to that of control (0 μg/mL). The control levels were set at 1. Met, 2 mM metformin. Each bar represents the mean±SEM. Mean without a common letter differs significantly at P<0.05.

본 연구에서는 COME이 L6 근육세포에서 GLUT4 발현을 증가시키고 IRS-1/Akt 신호전달 경로와 AMPK 활성을 증가시켜 세포 내로 포도당의 유입을 증가하고 포도당 이용을 증가시킴을 나타내었으며, 이는 COME이 근육세포에서 당대사를 촉진하여 항당뇨 효과를 나타낼 수 있음을 제시하였다. 대표적인 항당뇨제인 metformin(2 mM)은 L6 세포에서 포도당 유입 및 포도당 이용을 증가시켰고, GLUT4 발현, IRS-1/Akt 활성 및 AMPK 활성을 증가시켰다. COME(600 μg/mL)은 metformin(2 mM)에 준하는 효능을 나타내었고 이는 COME이 강한 항당뇨 효능을 나타냄을 제시한다.

제2형 당뇨병에서 나타나는 고혈당 및 인슐린 저항성 개선을 위해 식후에 나타나는 고혈당 증상을 적절하게 제어하는 것이 중요하다(Yari 등, 2020). 식후 혈중에 포도당 농도가 증가하면 인슐린의 분비가 촉진되고, 인슐린은 근육, 지방 및 여러 조직으로 포도당의 유입을 촉진해 혈당을 조절한다. 골격근(근육)은 식후 고혈당 상태에서 인슐린에 반응해 약 80% 포도당을 유입하여 소비하고 있어 체내 포도당 항상성(glucose homeostasis) 유지에 중요한 역할을 담당하고 있다(Tripathy와 Chavez, 2010). 이에 골격근에서 포도당 유입과 이용 증대는 고혈당 개선을 위한 주요한 타깃 중의 하나이다. 본 연구에서 COME은 L6 세포의 포도당 소비량(Fig. 2A)과 해당과정의 산물인 젖산의 생성(Fig. 2B)을 증가시켰으며, 포도당 유입(Fig. 3)을 증가시켰다. 이는 COME이 근육세포의 포도당 유입 및 포도당 대사를 촉진함을 나타내며, 체내 포도당 항상성에 기여하여 고혈당 개선 가능성을 제시한다.

혈중 포도당이 각 말초조직에서 소비되기 위해서는 세포 내로 유입되어야 하며, 포도당의 유입은 포도당수송체(GLUT)에 의해 이루어진다. GLUT는 형질막(plasma membrane, PM)을 가로질러 촉진확산으로 포도당을 수송하는 막단백질로 다양한 아형이 존재한다(Bell 등, 1990). GLUT4는 주로 근육과 지방조직에서 발현하는 인슐린 민감형 포도당수송체이며(Leto와 Saltiel, 2012), 기저상태에서 GLUT4는 세포질 내에 GLUT4 storage vesicles(GSVs)로 존재한다. 인슐린 자극에 의해 GLUT4는 GSVs에서 PM으로 전위(translocation)하여 포도당을 세포 내로 수송한다(Klip, 2009). 세포 내로의 포도당 유입에 있어 GLUT4 translocation에 의한 포도당 수송은 속도 제한(rate-limiting) 단계로, GLUT4 translocation과 GLUT4 발현 감소는 인슐린 저항성을 유도하고 더 나아가 제2형 당뇨를 초래한다(Leto와 Saltiel, 2012). 이에 GLUT4는 세포 내 포도당 유입 증가를 통한 인슐린 저항성 개선 및 제2형 당뇨 치료의 주요한 타깃으로 간주한다. 본 연구에서 COME은 GLUT4 발현을 유의적으로 증가하였고(Fig. 4), 이는 COME에 의한 포도당 유입 증가가 GLUT4의 발현에 의한 것임을 나타낸다.

근육세포에서 포도당의 유입은 phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/Akt 신호전달 경로(Cantley, 2002)와 AMPK 신호전달 경로(Treebak 등, 2006)에 의해 조절된다. 인슐린이 PM에 존재하는 인슐린 수용체에 결합하면 그 하위 신호전달 단백질인 IRS-1, PI3K 및 Akt가 순차적으로 인산화되어 활성화된다(Chang 등, 2004). 활성화된 Akt는 Akt substrate of 160 kDa(AS160)의 인산화를 유도하고, 활성화된 AS160은 GLUT4 translocation을 유도하여 세포 내로의 포도당 유입을 촉진한다(Sakamoto와 Holman, 2008). 근육세포에서 phospho-IRS-1, phospho-PI3K, phospho-Akt 및 phospho-AS160 발현이 증가하면 GLUT4 translocation이 증가하여 포도당 유입이 증가한다(Oak 등, 2006). Zhao 등(2018)은 L6 세포에 Folium sennae 에탄올 추출물을 처리한 경우 phospho-Akt 발현이 증가하고 GLUT4 발현과 GLUT4 translocation이 증가하며, 이를 통해 포도당 유입이 증가함을 제시하였다. 본 연구에서 COME은 phospho-IRS-1과 phosphop-Akt 발현을 증가시켰고, phospho-IRS-1/IRS-1 ratio 및 phospho-Akt/Akt ratio가 COME에 의해 증가하였다(Fig. 5). 이는 L6 세포에서 COME이 PI3K/Akt 신호전달을 활성화하여 포도당 유입을 촉진함을 제시한다.

생체 내 에너지 조절 센서로 작용하는 AMPK는 근육세포에서 인슐린 비의존성 경로로 포도당 유입을 조절한다(Hardie, 2003). 포도당 고갈, 저산소증, 산화적스트레스 및 근육 수축 등에 의해 세포 내 에너지가 감소하여 AMP/ATP ratio가 증가하면 AMPK가 인산화되어 활성화된다. 활성화된 AMPK는 AS160을 인산화하며 이를 통해 포도당의 유입이 증가한다(Schultze 등, 2012). 인슐린 저항성 당뇨환자에게 사용되는 metformin은 AMPK를 활성화하여 인슐린 민감성을 개선하고 세포 내 포도당 유입을 증가하여 혈당을 조절한다(Shaw 등, 2005). L6 세포에서 metformin(2 mM)은 AMPK 활성을 유도하였고, COME도 AMPK 활성을 유도하였다(Fig. 6). 이는 COME이 metformin처럼 AMPK 활성을 유도하여 인슐린 민감성을 개선하고 세포 내 포도당 유입을 증가하여 혈당을 조절할 수 있는 가능성을 제시한다.

다양한 천연물 유래 물질들은 근육세포인 L6 세포에서 인슐린 의존성 PI3K/Akt 신호전달 경로 또는 인슐린 비의존성 AMPK 신호전달 경로를 활성화하여 포도당 유입을 증가시킴이 보고되었다(Park 등, 2021; Prasad 등, 2013; Tang 등, 2016; Zhao 등, 2018). Caulerpa okamurae 에탄올 추출물(Park 등, 2021)과 Calophyllum inophyllum 잎에서 유래한 calophyllic acid와 isocalophyllic acid 혼합물(Prasad 등, 2013)은 PI3K/Akt와 AMPK를 활성화하였다. 반면, 마르멜로 씨 에탄올 추출물(Tang 등, 2016)은 PI3K/Akt만을 활성화하였고, Taraxacum mongolium Hand.-Mazz 추출물(Zhao 등, 2018)은 AMPK를 활성화하여 포도당 유입을 유도하였다. COME은 PI3K/Akt와 AMPK를 모두 활성화했으며, 이는 COME이 인슐린 의존성 신호전달 경로와 인슐린 비의존성 신호전달 경로를 통해 포도당의 유입을 증진함을 나타낸다.

이상의 결과는 COME이 근육세포에서 포도당 유입을 증가함을 나타내며, 항당뇨 기능성 소재로의 활용 가능성을 제시한다. 향후 당뇨병을 예방하고 치료할 수 있는 기능성 소재로 COME을 사용하기 위해서는 COME 내 유효성분 탐색 연구와 적절한 동물모델에서 생체 내의 효능 연구가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구에서는 마르멜로 열매 추출물인 COME의 당뇨 예방 및 치료를 위한 기능성 소재로의 이용 가능성을 평가하기 위해 rat에서 유래한 근육세포인 L6 세포에서 COME이 포도당 이용, 포도당 유입 및 당대사 조절 신호전달 경로에 미치는 영향을 조사하였다. L6 세포에 세포독성을 나타내지 않는 농도(0~600 μg/mL)로 COME을 처리한 경우 포도당 소비가 증가하고 젖산의 생성이 증가하였으며 포도당 유입이 유의적으로 증가하였다. 또한 COME 처리에 의해 L6 세포에서 GLUT4 발현이 증가하였고 IRS-1과 Akt의 인산화가 증가하였으며 AMPK 인산화가 증가하였다. 이는 근육세포에서 COME이 인슐린 의존성 IRS-1/PI3K/Akt 신호전달 경로와 인슐린 비의존성 AMPK 신호전달 경로를 활성화하여 세포 내로의 포도당 유입을 증가시킴으로써 포도당 대사를 촉진함을 나타내며, 향후 항당뇨 기능성 소재로의 활용 가능성을 제시한다.

본 연구에 사용한 마르멜로 열매 추출물인 COME을 제공해 준 (주)비엔지에 감사드립니다.