모링가(Moringa oleifera, Moringaceae)는 인도, 남아시아, 아프리카 등지에서 널리 재배되는 식물로, 높이가 5~10 m에 이르는 나무이며, 세계적으로 38,000 ha 정도 상업적으로 재배 및 이용되고 있다(Kwon과 Youn, 2014). 모링가는 꽃, 뿌리, 씨, 잎, 열매 등에 비타민, 플라보노이드, 아미노산 등과 같은 phytochemical이 풍부하게 함유되어 있으며, 항염, 항산화, 항암 등과 같은 다양한 약리 작용을 갖고 있다(Abdull Razis 등, 2014). 그러나 국내에서는 모링가에 관한 연구가 미비한 실정이다. 국내에서는 2017년 6월 기준 순천, 장흥, 완도, 함평 등 8개 시･군에서 42 ha 정도 모링가를 재배하고 있다. 특히 순천은 재배 면적이 13개 농가, 1만 3천 평으로 전남 최대 모링가 재배 단지를 구성하고 있으며, 이차적으로 음료, 차, 화장품류 등 다양한 가공식품을 개발 및 유통하고 있다.

모링가 부위 중 잎과 씨앗은 가장 활발하게 연구가 이루어지고 있다. 특히 모링가 잎은 추출 방법에 따라 다양한 양상을 나타내었다. 산화적 스트레스는 대사 생성물을 통해 발생하는 유해한 활성산소종에 의해 유발될 수 있으며, 활성 산소는 세포막, DNA, 단백질 등을 손상시켜 노화, 질병 등의 원인이 된다(Jones, 2008). 항산화 효과의 경우 에탄올, 메탄올 등의 용매에 비해 물 추출물에서 플라보노이드 함량이 높게 나타났으며, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)과 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 자유라디칼 소거능 역시 높게 나타났다(Kwon과 Youn, 2014). 또한 아세톤 추출물과 물 추출물을 비교했을 때 아세톤 추출물에서 총 플라보노이드, 프로안토시아니딘 등의 함량이 높게 나타났으며, superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione의 활성이 증가한 것을 확인하였다(Moyo 등, 2012).

염증은 외부로부터의 자극이나 손상에 의해 발생하는 생체 반응으로, 염증이 만성화되면 조직 손상을 악화시키고 각종 질환을 유발할 수 있다(Park과 Lee, 2018). 염증 반응에서는 산화질소(nitric oxide, NO)와 프로스타글란딘(prostaglandin, PG) E2, 인터페론(interferon), 사이토카인(cytokine)과 같은 염증성 매개 인자들이 생산된다(Yahfoufi 등, 2018; Zhu 등, 2018). 이 중 NO는 항염증 작용을 하는 것으로 알려졌지만, NO의 과도한 생성은 오히려 염증을 유발할 수 있다. NO 생성을 억제함으로써 염증을 유발하는 세포들인 대식세포, 호중구, 림프구 등의 활성을 억제할 수 있으며, 염증 부위의 혈관 투과성을 감소시켜 조직 손상을 줄일 수 있다. 또한 염증성 사이토카인, 케모카인, PG 등의 생성을 억제하여 염증을 완화할 수 있다(Kroncke 등, 1998; Nathan, 1997; Zamora 등, 2000). 최근 NO 억제제가 염증을 억제하는 데 도움이 될 수 있다는 임상 연구들이 보고되어 있으며, 동물 모델 연구에서도 NO 억제제가 류마티스 관절염, 천식, 염증성 장 질환, 뇌졸중 등에서 염증을 완화하는 것으로 나타났다(Merenzon 등, 2023; Wong과 Lerner, 2015). 그러므로 NO 억제제의 개발은 염증성 질환의 치료에 새로운 치료 전략을 제공할 수 있다. 염증성 사이토카인은 염증 반응을 유발하는 사이토카인으로, 염증 세포의 활성을 증가시키고 염증 매개체의 생성을 촉진한다. 대표적인 염증성 사이토카인으로는 인터루킨(interleukin, IL)-1, IL-6, IL-8, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)-α 등이 있다(Banyer 등, 2000; Thornton과 Morgan, 2009; Trinchieri 등, 1993). 그중 TNF-α는 nuclear factor(NF)-κB와 mitogen-activated protein kinase(MAPK)를 활성화하여 IL-1, IL-6, IL-8 등의 발현을 증가시켜 염증 반응을 촉진한다(Wang 등, 2023; Webster와 Vucic, 2020). 1990년대 후반부터 TNF-α 억제제(infliximab, adalimumab, etanercept 등)가 개발되어 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선성 관절염, 습진 등의 다양한 염증성 질환 치료에 사용되고 있다(Balkwill, 2009; Jang 등, 2021). 그러므로 TNF-α 조절을 통해 염증을 효과적으로 제어함으로써 피부 질환 및 염증 관련 질환 개선을 기대할 수 있다. 모링가의 항염증 효과 연구의 경우, 잎의 메탄올 추출물을 발 부종을 유발한 렛트에 복강 주사하였을 때 진통 효과가 나타났으며(Adedapo 등, 2015), 모링가 잎을 극성 및 비극성 용매로 추출하여 관절염 렛트에게 처리했을 때 염증 억제를 통한 통증 감소 효과가 확인되었다(Martinez-Gonzalez 등, 2017). 또한 염증을 유발한 사람의 대식세포주에 에틸아세테이트 추출물을 처리한 결과 TNF-α, IL-6, IL-8 발현이 억제되었고(Kooltheat 등, 2014), 급성 폐 염증을 일으킨 마우스에게 투여했더니 염증 억제 반응을 확인할 수 있었다(McKnight 등, 2014).

이외에도 모링가 잎에 대한 항당뇨 효과도 보고되었는데, 물 추출물을 당뇨가 유도된 렛트에 투여했을 때 당화혈색소 수치가 유의적으로 감소하는 경향을 관찰할 수 있었으며(Gupta 등, 2013), 공복 혈당수치가 대조군에 비하여 유의적으로 낮아진 것을 볼 수 있었다(Jaiswal 등, 2009). 또한 새로운 항암제 개발 연구의 일환으로 모링가의 항암 효과에 대하여도 많이 연구되었는데, 사람 폐암 세포주에 모링가 물 추출물을 처리했을 때 세포 사멸 억제 인자인 NF-κB, AKT, p-IκB, p-ERK 등의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(Jung, 2014). 또한 동일 세포주에서 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)이 급격히 증가하였고, p53, caspase-3/7의 활성이 증가하였으며, Smac/DIABLO의 발현과 PARP-1 절단이 증가하였다(Tiloke 등, 2013). 췌장세포주에서도 잎의 물 추출물에 의한 증식 억제 효과가 나타났고(Berkovich 등, 2013), 잎의 에탄올 추출물을 유방암, 직장암 세포주에 처리했을 때 세포 생존과 세포의 콜로니 형성이 모두 감소하였다(Al-Asmari 등, 2015).

이렇듯 모링가가 여러 효능이 있다는 것이 밝혀졌으며, 특히 모링가 잎을 활용하여 여러 실험이 진행되고 있다. 본 연구에서는 다양한 생리활성을 가진 것으로 알려진 모링가 제품들(오일, 발효환, 분말, 차)의 항산화, 항노화, 미백, 항염 효과를 확인하여 식품 및 화장품 소재로서의 가능성을 알아보고자 한다. 모링가 제품의 항산화 효과를 알아보기 위해 총 페놀 함량을 측정하였으며, DPPH 라디칼 소거능 및 SOD 활성을 알아보았다. 또한 항노화, 미백 효과를 알아보기 위해 티로시나아제(tyrosinase) 및 엘라스타제(elastase) 저해 활성을 측정하였으며, 마지막으로 항염 효과를 확인하기 위해 마우스의 대식세포주(RAW macrophage cell)에 모링가 제품을 농도별로 처리하여 사이토카인 및 NO의 생산을 알아보았다.

실험재료

국내산 모링가 제품 네 가지는 순천만모링가협동조합에서 제공하였으며, 전라남도 순천 모링가 농장에서 무농약으로 재배한 모링가를 2022년 7월에 수확하여 세척 및 살균한 후 70°C에서 건조하였다.

모링가 오일(oil) 제품은 100 kg의 모링가 씨앗을 50°C에서 압착 착유기를 이용하여 30분간 착유하였고, 1 μm 필터를 이용하여 필터링하여 제조했다. 실험 샘플을 제조하기 위하여 제품의 씨앗 침전물과 오일을 함께 분쇄하여 혼합하였고, 0.2 μm 필터에 여과하여 사용하였다. 앰플 1개의 내용량인 15 g당 83.3 g의 모링가 씨앗이 사용되었으므로, 오일 샘플의 원액 농도를 5.6 g/mL로 설정하여 실험을 진행하였다.

모링가 발효환(fermented capsule) 제품은 모링가 분말 50%, 청국장 분말 30%, 알파화된 현미분말 20%를 혼합하여 발효기에 담아 40~45°C, 상대습도 80~100% 조건에서 36시간 고속발효하였다. 생성된 모링가 발효 조성물은 60°C에서 12시간 건조하였고, 환 조제기를 통해 직경 4~5 mm 단위로 성형하고 23°C, 습도 35% 이하에서 저온 숙성 공정하여 환을 제조했다. 실험 샘플 제조를 위하여 발효환 제품을 분쇄기로 잘게 분쇄한 후, 2 g에 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)을 넣어 총 20 mL로 만들어 샘플 농도를 100 mg/mL로 설정하였다. 이후 20분간 sonication 하고 0.2 μm 필터에 여과하여 사용하였다.

모링가 분말(powder) 제품은 모링가 잎을 1 cm 이하 크기로 세절하고 세척한 후, 증기로 모링가 생잎을 쪄내어 냉풍 건조하였다. 증제된 모링가 잎을 볶아서 익힌 후 23°C, 습도 35% 이하에서 강제 배풍하여 저온 건조한 후 숙성한 후 분쇄하여 분말을 제조하였다. 실험 샘플 제조를 위해 모링가 분말 제품 2 g에 PBS(pH 7.4)를 넣어 총 20 mL로 만들어 샘플 농도를 100 mg/mL로 설정하였다. 이후 20분간 sonication 하고 0.2 μm 필터에 여과하여 사용하였다.

모링가 차(tea) 제품은 잎을 100°C의 증기로 30~40초간 증열하였으며, 엽타기를 이용하여 100°C에서 10분간 찻잎의 표면 수분을 제거하였다. 다음에는 조유기를 이용하여 5.5 kg/5 cm 압력을 가하여 비비면서 건조하여 찻잎의 내부 수분까지 증산시켰다. 이후 재건기에 대해 초기 성형 작업을 용이하게 하기 위해 1차 형상을 만드는 증류 공정을 2회에 걸쳐 진행하였다. 1회차는 32~34°C, 20분간, 2회차는 36~38°C, 20분간 증류기를 이용하여 진행하였다. 재건 공정은 재건기를 이용하여 1회차는 32~34°C, 20분간, 2회차는 36~38°C, 20분간 진행하였고, 건조 공정은 건조기를 이용하여 1회차는 80°C, 30분간, 2회차는 75°C, 30분간 진행하여 모링가 차를 제조하였다. 실험 샘플 제조를 위해 티백 내부의 말린 잎을 측량한 후 5배 분량의 PBS(pH 7.4)를 가하고, 100°C에서 5분간 가열 추출하여 샘플 농도를 200 mg/mL로 설정하였다. 실온에 방치하여 냉각한 후 0.2 μm 필터에 여과하여 사용하였다.

세포 배양 및 세포 생존율 측정

쥐 대식세포인 RAW264.7은 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포에는 10% fetal bovine serum(Gibco BRL), 1% penicillin/streptomycin(GibcoBRL)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, GibcoBRL) 배지를 사용하였으며, CO₂ incubator(Sanyo, 5% CO₂, 95% air, 37°C)에서 배양하였다. 세포 생존율을 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolim bromide(MTT) assay를 사용하였다. 96-well plate(Nunc, Life Technologies)에 1×10⁴ cells/well씩 seeding 한 후 시료를 다양한 농도로 200 μL씩 분주하여 48시간 배양하였다. 이후 well에 MTT solution(3 mg/mL, Sigma-Aldrich)을 50 μL씩 넣고 incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 상등액을 제거한 뒤 dimethylsulfoxide를 150 μL씩 넣고 분광광도계(Sunrise, Tecan)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 페놀 함량 측정

총 페놀 함량을 측정하는 가장 일반적인 방법은 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent를 사용하는 방법이다. 이 방법은 페놀과 Folin-Ciocalteu’s reagent가 반응하여 파란색 혼합물을 생성하는 원리를 이용한다(Blainski 등, 2013). 시료를 농도별로 희석한 후 Folin-Ciocalteau’s phenol reagent(Sigma-Aldrich) 1 mL를 넣고 5분간 혼합한다. Na₂CO₃ 1 mL를 넣은 후 혼합하여 실온에서 1시간 방치 후 분광광도계(Sunrise)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정한다. 양성대조군인 퀘르세틴(quercetin, Sigma-Aldrich)은 농도별로 증류수에 용해하여 700 nm에서 검량곡선을 작성하고 총 페놀 함량을 산출하였다.

DPPH 라디칼 저해 활성(전자공여능) 측정

DPPH 라디칼은 안정한 자유라디칼로, 시료와 반응하여 흡광도가 517 nm에서 269 nm로 감소한다. 따라서 시료의 흡광도 감소량이 많을수록 DPPH 라디칼 저해 활성이 높다고 할 수 있다(Munteanu와 Apetrei, 2021; Pham-Huy 등, 2008). 각 시료를 일정 농도가 되도록 메탄올에 넣어 200 μL로 맞추고, 메탄올에 녹인 0.1 mM DPPH solution(Sigma-Aldrich)을 200 μL씩 가한 후 교반하고 실온에서 30분 동안 방치한 다음 분광광도계(Sunrise)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산(Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

SOD 유사 활성도 측정

SOD는 superoxide anion을 수소 이온(H⁺)과 과산화수소(H₂O₂)로 분해한다. SOD 유사 활성도는 SOD의 활성을 간접적으로 측정하는 방법으로, SOD 효소가 superoxide anion을 제거하는 과정에서 생성되는 과산화수소의 양을 측정하는 방법이다(Korycka-Dahl 등, 1979; McCord와 Fridovich, 1969). SOD 활성은 pyrogallol의 자가 산화를 저해하는 정도를 측정하였다. 1 mM diethylenetriamine pentaacetic acid가 포함된 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.2)에 0.2 mM pyrogallol을 넣고 분광광도계(Sunrise)를 이용하여 420 nm에서 3분 동안 흡광도 변화를 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산(Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

티로시나아제 저해 활성 측정

시료 100 μL에 50 mM Tris-HCl buffer(pH 7.5), 1 mM L-DOPA(Sigma-Aldrich) 50 μL를 가한 후 37°C에서 30분간 반응시키고, 분광광도계(Sunrise)를 이용하여 475 nm에서 티로시나아제에 의해 DOPA로부터 형성되는 DOPA chrome의 양을 측정하여 상대적 티로시나아제 활성으로 나타냈다. 양성대조군으로는 아스코르브산(Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

엘라스타제 저해 활성 측정

시료 100 μL에 50 mM Tris-HCl buffer(pH 7.5)에 녹인 porcine pancreas elastase(2.5 U/mL, Sigma-Aldrich) 용액 100 μL를 가한 후 기질로 50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(0.5 mg/mL)를 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. 엘라스타제 저해 활성은 분광광도계(Sunrise)를 이용하여 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타냈다. 양성대조군으로는 우르솔산(ursolic acid, Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

NO 생성 측정

모링가 제품군의 항염증 효과를 확인하기 위해 100 ng/mL lipopolysaccharide(LPS)로 자극한 RAW264.7 세포에 모링가 제품군 샘플을 처리하고 NO의 생산량을 알아보았다. NO 생산 정도는 Griess reagent system을 이용하여 배양된 배지에서 nitrite 농도를 측정함으로써 알 수 있다. 시료를 Griess reagent[0.1% N-(1-naphthyl)ethylenediamine, 1% sulfanilamide, 5% phosphoric acid]와 혼합한 후 10분간 상온에 방치하였다. 이후 570 nm에서 분광광도계(Sunrise)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

사이토카인 분비 측정

RAW264.7 마우스 대식세포에 LPS 100 ng/mL를 가하고 모링가 제품군 샘플을 농도별로 처리하여 사이토카인 분비량을 측정하였다. 사이토카인 분비 변화를 측정하기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 세트(TNF-α, IL-6)는 BD Biosciences에서 구입하였다. Capture antibody를 coating buffer(0.1 M sodium carbonate, pH 9.5)에 희석하여 96-well plate에 분주한 후 4°C에서 24시간 두었다. Plate를 PBS/Tween-20으로 3회 세척한 후 1% bovine serum albumin으로 blocking 한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였다. PBS/Tween-20으로 3회 세척 후 standard와 샘플인 세포 배양액을 분주하고 2시간 동안 상온에서 방치하였다. 다시 PBS/Tween-20으로 5회 세척하고 detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase를 mix 하여 분주한 후 1시간 동안 상온에 방치하였다. 마지막으로 PBS/Tween-20으로 5회 세척 후 TMB substrate reagent(BD Biosciences)를 분주한 후 상온에서 30분 방치하였다. 이후 stop solution(1 M phosphoric acid)으로 반응을 정지시킨 후 분광광도계(Sunrise)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리

결과 통계 처리는 Minitab Express 1.5.2를 이용하였다. 유의차 검증은 Dunnet’s test에 따라 분석하였으며, P<0.05 수준에서 유의성 여부를 검증하였다.

총 페놀 함량 측정

총 페놀 함량 측정 결과, 모링가 차가 다른 세 제품군에 비해 총 페놀 함량이 가장 높았으며, 발효환, 분말이 그 뒤를 이었다(Fig. 1A). 모링가 오일에서는 페놀 함량이 거의 측정되지 않았다. 제품군별로 총 페놀 함량에 차이가 나타나는 이유는 제품별로 사용된 가공 방법 때문으로 추정된다. 제품군 중 차 제품이 가장 높은 총 페놀 함량을 보였는데, 실제로 추출물 중 물 추출물이 다른 용매에 비해 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량이 가장 높았다고 보고되었다(Kwon과 Youn, 2014). 또한 모링가 씨앗을 사용하여 오일 가공 시 지방산, 비타민, 미네랄 등 비페놀성 성분이 주를 이룰 것으로 생각되며, Vyas 등(2015)도 모링가 꽃, 잎, 뿌리, 줄기 등과 비교해 볼 때 씨앗에서 페놀 함량이 가장 낮았다고 보고하였다.

Fig 1. (A) Total phenolic contents, (B) DPPH radical scavenging activities, and (C) superoxide dismutase (SOD)-like activities of Moringa oleifera. The results are represented as the mean±standard deviation. The P-value indicates significant differences between the control and M. oleifera-treated group (^***P<0.001, ^**P<0.01, ^*P<0.05).

DPPH 라디칼 저해 활성 측정을 통한 항산화능 검증

항산화 작용이란 활성 산소를 제거하여 세포 손상을 줄이는 것으로(Lu 등, 2021), 항산화 활성을 측정하기 위해 자주 사용되는 방법으로는 DPPH 자유라디칼 산화 활성 평가법이 있다. DPPH는 안정한 라디칼로서 활성 산소와 반응하여 색이 변하므로, DPPH의 색 변화를 측정하여 항산화 활성을 평가할 수 있다(Alam 등, 2013; Goncalves 등, 2020; Gulcin, 2020). DPPH 라디칼 저해 활성 측정법은 천연물의 항산화능을 평가하는 가장 대표적인 방법이며, 식품, 화장품, 의약품 등의 분야에서 활용된다. 식품 분야에서는 천연물을 식품 첨가제로 사용하여 식품의 산화 안정성 향상을 연구하고 있으며(Kil 등, 2009), 화장품 분야에서는 천연물을 화장품 원료로 사용하여 피부 노화 예방과 피부 보호 기능 강화를 연구하고 있다(Kang 등, 2018; Lee 등, 2023). 본 실험에서는 모링가 제품군 4가지의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였으며, 양성 대조군으로는 아스코르브산을 사용하였다. 그 결과, 모링가 차가 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25 mg/mL에서 각각 19.62%, 28.60%, 41.47%, 58.84%, 68.84%의 소거능을 보여 제품군 중 가장 높은 라디칼 소거능을 나타내었고, 모링가 발효환, 분말, 오일 모두 우수한 활성을 보였다(Fig. 1B). 특히 모링가 차의 총 페놀 함량이 가장 많기 때문에 DPPH 라디칼 저해 활성 역시 이와 비례하여 높게 나온 것으로 보인다.

SOD 유사 활성도 측정을 통한 항산화능 검증

SOD는 활성 산소 중 하나인 superoxide를 중화시켜 산화적 손상을 예방하는 역할을 한다. SOD는 세포 내에서 생성되며, 식물, 동물, 미생물 등 모든 생물에 존재한다(Eleutherio 등, 2021; Mruk 등, 2002). 따라서 SOD의 활성은 항산화 활성을 나타내는 중요한 지표로 사용된다(Islam 등, 2022). 본 실험에서는 모링가 제품군이 세포 내의 예방적 항산화제인 SOD의 활성에 미치는 영향을 확인하였고 양성대조군으로 아스코르브산을 사용하였다. 그 결과, 제품군 중 모링가 발효환이 6.25 mg/mL에서 15.42%의 가장 높은 SOD 유사 활성을 보였으며, 12.5와 25 mg/mL에서도 각각 13.44%, 12.19%의 유의한 SOD 유사 활성을 보였다(Fig. 1C). 그러나 모링가 오일, 분말, 차 제품군에서는 유의한 SOD 유사 활성이 나타나지 않았다. 모든 모링가 제품군이 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈음에도 불구하고, 모링가 발효환에서만 SOD 유사 활성이 나타난 이유는 각 측정 방법의 특징 때문으로 보인다. 즉, DPPH 라디칼 저해 활성 측정법은 항산화 물질과 배양한 후 DPPH 용액의 흡광도 감소를 측정하는 것이나 SOD 유사 활성 측정법은 과산화물 라디칼에 의한 nitroblue tetrazolium 환원 억제를 측정하는 것이기 때문이다(Chaves 등, 2020).

그러므로 추후 thiobarbituric acid reactive substances 생성 억제 활성, CAT 활성, ferric reducing antioxidant power assay 등 추가 항산화능 실험을 통하여 모링가 제품들의 항산화능을 측정할 필요가 있다.

티로시나아제 저해 활성 측정

티로시나아제는 멜라닌 색소를 생성하는 티로신(tyrosine)을 산화시키는 효소이다. 티로시나아제는 티로신을 도파(DOPA)로 전환시키고, 도파는 다시 도파퀴논(DOPA quinone)으로 전환된다. 이 도파퀴논은 멜라닌의 전구체로, 티로시나아제 활성을 억제하면 멜라닌 생성이 줄어들게 되고, 이는 기미, 주근깨, 색소 침착 등의 피부 색소 질환을 개선하는 데 도움을 줄 수 있다(Kumari 등, 2018; Lee 등, 2016; Li 등, 2023; Zhao 등, 2022). 대표적인 티로시나아제 억제제로는 하이드로퀴논, 코직산, 알부틴(arbutin) 등이 있으나 피부 자극, 가려움증, 홍조, 건조함, 홍반, 색소침착, 피부염 등의 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 주의해서 사용해야 한다(Ashooriha 등, 2022; Briganti 등, 2003; Desmedt 등, 2016). 최근에는 티로시나아제의 활성을 억제할 수 있는 천연 성분에 관한 관심이 고조되고 있는데, 대표적인 천연물로는 녹차, 감초, 솔잎 추출물 등이 있다(Goelzer Neto 등, 2022; Hassan 등, 2023).

모링가 제품군이 티로시나아제 활성도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 샘플을 농도별로 처리한 후 티로시나아제 활성을 측정하였으며 양성대조군으로 아스코르브산을 사용하였다. 그 결과 모링가 차 25 mg/mL에서 15.31%의 가장 높은 티로시나아제 저해 활성을 보였으며, 모링가 발효환 및 분말 25 mg/mL에서 각각 9.17%, 13.97%의 유의한 티로시나아제 저해 활성을 보였다(Fig. 2A). 티로시나아제는 피부 색소를 결정하는 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 효소로, 티로시나아제를 억제하면 멜라닌 생성이 감소하여 피부 미백에 효과적이다. 대표적인 미백 물질로 알부틴, 비타민 C, 니아신아미드(niacinamide) 등이 있으며, 천연물에 의한 티로시나아제 억제 및 미백에 관한 많은 연구도 진행되고 있다(Kim 등, 2018; Pillaiyar 등, 2017). 결과적으로 모링가 오일을 제외하고 모든 제품군에서 티로시나아제 활성이 저해되었는데, 이러한 활성 억제는 미백 화장품 및 미백 관련 제품의 효능을 평가하는 중요한 지표로 사용되므로, 모링가는 피부 미백에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다고 사료된다.

Fig 2. (A) Tyrosinase inhibition and (B) elastase inhibition activities Moringa oleifera. The results are represented as the mean±standard deviation. The P-value indicates significant differences between the control and M. oleifera-treated group (^***P<0.001, ^**P<0.01, ^*P<0.05).

엘라스타제 저해 활성 측정

엘라스타제는 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소로서, 콜라겐은 피부의 탄력을 유지하고 엘라스틴은 피부의 유연성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 따라서 엘라스타제의 활성이 증가하면 피부의 탄력과 유연성이 감소하게 되고, 이는 주름과 피부 처짐 등의 노화 현상을 유발할 수 있다. 그러므로 엘라스타제 활성이 억제되면 노화 현상을 예방하거나 개선하는 데 효과적일 수 있다(Atkinson, 1998; Newport 등, 1987; Robert, 2001; Sandberg 등, 1981). 잘 알려진 엘라스타제 억제제로는 레티놀(retinol), 비타민 C, E, 플라보노이드(flavonoid), 피루브산(pyruvic acid) 등이 있으며, 현재 연구되고 있는 천연 성분으로는 산거울, 편백나무, 녹차 추출물 등이 있다(Costa 등, 2022; Dang, 2021; Park 등, 2010).

모링가 제품군의 엘라스타제 저해 활성을 조사한 결과 전반적으로 농도가 증가함에 따라 저해 활성이 증가한 것을 볼 수 있었다. 특히 모링가 발효환, 분말, 차 25 mg/mL에서 엘라스타제 저해 활성이 각각 9.46%, 17.12%, 28.19%로 유의하게 나타났다(Fig. 2B). 그러나 티로시나아제 저해 활성 결과와 마찬가지로 모링가 오일에서는 엘라스타제 저해 활성이 나타나지 않았다. 엘라스틴은 피부의 탄력을 제공하며, 젊고 탄력 있는 피부의 모습을 유지하는 데 중요하다. 노화는 주로 피부의 주름, 탄력 상실, 굳어짐 등과 관련이 있으며, 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스타제를 저해하면 노화의 진행을 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 또한 엘라스타제가 억제되면 피부의 콜라겐 생성이 촉진되고 피부의 수분을 유지하는 효과도 있다(Chaikhong 등, 2022; Lee 등, 2021; Varani 등, 2006). 그러므로 모링가 제품군 중 엘라스타제의 활성을 저해할 수 있는 제품군들은 피부의 탄력을 개선하고 주름을 감소시킬 수 있으리라 생각된다.

세포 독성 측정

RAW264.7에 다양한 농도의 모링가 제품군 샘플을 처리한 후 24시간 및 48시간 동안 배양하여 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 모링가 제품군을 24시간 처리했을 때 오일, 발효환, 분말 그리고 차 5 mg/mL에서 70% 이상의 세포가 생존하였다(Fig. 3A). 이후 세포를 이용하여 24시간 동안 NO 생산량을 측정하는 실험에는 농도의 경우 5 mg/mL 이하를 사용하였다. 또한 모링가 제품군을 48시간 처리했을 때 오일, 발효환, 분말 그리고 차 625 μg/mL에서 70% 이상의 세포가 생존하였다(Fig. 3B). 이후 48시간 동안 분비되는 사이토카인 양을 측정하는 ELISA 실험에는 625 μg/mL 이하의 농도를 사용하였다.

Fig 3. Cytotoxic effects of Moringa oleifera for (A) 24 h and (B) 48 h. Cells were exposed to various concentrations of M. oleifera and cell viability was assessed using the MTT assay. Untreated control cell viability was set at 100%. Results represent the means±standard deviation of triplicate experiments.

NO 생성량 측정

NO는 염증을 포함한 많은 생리학적 과정에 중요한 역할을 하는 분자이다(Tripathi, 2007). NO 합성 효소(nitric oxide synthase, NOS)는 L-아르기닌에서 NO를 생성시키는 효소로, 포유류에는 세 가지 isoform이 존재한다. 내피세포 NOS(endothelial NOS)는 혈관 내피세포에서 발현되어 혈관 확장, 혈소판 응집 억제, 신경 전달 조절 등의 역할을 하며, 신경세포 NOS(neuronal NOS)는 주로 뉴런 내에서 발견되고 중추 신경계에서 중요한 역할을 한다. 이 두 가지는 정상적인 생리 기능에 필수적인 반면 유도성 NOS(inducible NOS, iNOS)는 염증 반응에 중요한 역할을 한다. 특히 iNOS는 세균 감염이나 손상과 같은 염증 자극에 의해 발현이 증가하며, 높은 수준의 NO를 생성하여 염증을 촉진한다(Costa 등, 2016; Forstermann과 Sessa, 2012; Mattila와 Thomas, 2014; Shu 등, 2015). 그러므로 NO 억제제는 iNOS에 작용하여 NO 생성을 억제할 수 있으며, 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 패혈증 등 다양한 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 최근 천연물을 이용한 NO 억제와 항염증 연구가 많이 진행되고 있다. 일례로, 콩류에서 발견되는 플라보노이드인 제니스틴(genistein)은 iNOS, 염증성 사이토카인, ROS, NF-κB 등을 억제해서 강력한 항염증 작용을 나타낸다고 보고되어 있다(Goh 등, 2022). 또한 알파-리놀렌산(α-linolenic acid)은 NF-κB와 MAPK 경로를 통해 NO 생성 및 iNOS 유전자 발현 억제를 할 수 있다고 보고되어 있으며(Ren과 Chung, 2007), Brucea javanica에서 분리한 brusatol도 NO 억제를 통한 항염증 작용이 연구되고 있다(Tang 등, 2014). 모링가 제품군의 항염증 효과를 확인하기 위해 100 ng/mL LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에 모링가 제품군 샘플을 처리하고 NO의 생산량을 알아보았다. 그 결과 모링가 제품군 중 분말 2.5 mg/mL 처리군에서 NO 생산량이 23.14% 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4). 모링가 제품군이 NO 생성 억제 효과를 입증한 만큼, 추후 iNOS, NF-κB, MAPK 등의 추가 기전 실험을 통하여 염증성 질환 개선에 관한 후속 연구가 필요하다.

Fig 4. Effect of Moringa oleifera on nitric oxide (NO) production in LPS-induced RAW 264.7 murine macrophages. Cells were treated with 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) with or without various concentrations of M. oleifera. The results are represented as the mean±standard deviation. The P-value indicates significant differences between the control and M. oleifera-treated group (^***P<0.001, ^**P<0.01, ^*P<0.05).

염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6) 분비량 측정

염증성 사이토카인(IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α 등)은 NO와 함께 염증 과정에서 중요한 역할을 하는 신호 전달 분자이다. 염증성 사이토카인을 억제하면 NO 생산을 유도하는 iNOS의 발현을 감소시켜 염증을 억제할 수 있다. 또한 iNOS의 억제는 TNF-α, caspase-1, Fas 리간드(Fas ligand), toll-like receptor-3 mRNA 발현 감소를 유도하여 NO 수준의 염증, 세포 사멸 및 면역 회피 기전에 기여한다(Kankuri 등, 2003; Kobayashi, 2010; Soufli 등, 2016; Zamora 등, 2000). 특히 TNF-α의 경우 여러 요인에 의해 TNF-α 신호 전달이 계속되면 염증이 지속적으로 나타나거나 세포 자살을 일으킬 수 있다(Guttman-Yassky 등, 2011; Kayserova 등, 2012). 본 실험에서는 RAW264.7 마우스 대식세포에 LPS 100 ng/mL를 가하고 모링가 제품군 샘플을 농도별로 처리하여 TNF-α 분비를 측정하였다. 그 결과, 모링가 발효환 78 μg/mL에서 대조군에 비해 15.67%, 분말 78 μg/mL에서 28.07%, 차 78 μg/mL에서 28.36%씩 TNF-α 분비량을 감소시켰다(Fig. 5A).

Fig 5. Effect of Moringa oleifera on the secretion of (A) TNF-α and (B) IL-6 in LPS-induced RAW264.7 murine macrophages. Cells were treated with 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) with or without various concentrations of M. oleifera. The results are represented as the mean±standard deviation. The P-value indicates significant differences between the control and M. oleifera-treated group (^***P<0.001, ^**P<0.01, ^*P<0.05).

IL-6 역시 염증 반응에 중요한 역할을 하는 사이토카인으로, 다양한 세포에서 생성되며 염증 반응을 유도하고 유지하는 데 관여한다. 특히 IL-6는 염증 반응 초기 단계에 관여하며, 대식세포, T 세포, B 세포 등을 활성화시켜 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α, interferon-gamma 등), 면역 글로불린, 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor)의 생산을 증가시키고, 체온 상승, 식욕 부진, 피로감 등의 전신적인 염증 증상도 유발한다(Tanaka 등, 2014; Wolf 등, 2014; Yao 등, 2014). 본 실험에서는 RAW264.7 마우스 대식세포에 LPS 100 ng/mL를 가하고 모링가 제품군 샘플을 농도별로 처리하여 IL-6 분비를 측정하였는데, 모든 모링가 제품군 샘플에서 IL-6의 감소가 유의성 있게 나타나지 않았다(Fig. 5B). 모링가 발효환, 분말, 차 샘플이 TNF-α 분비를 억제했음에도 불구하고 IL-6 분비에 영향을 미치지 않은 이유는 각 사이토카인의 조절 기전에서 찾을 수 있다. TNF-α는 주로 NF-κB라는 전사 인자에 의해 조절되는데, NF-κB는 염증을 포함한 다양한 자극에 의해 활성화된다(Cai와 Lin, 2022). 반면에 IL-6는 NF-κB, STAT3, JAK2 등 다양한 요인에 의해 조절된다(Schmidt-Arras와 Rose-John, 2021; Tanabe 등, 2010). 즉, NO의 생성이 억제되면 NF-κB의 활성화가 억제되기 때문에 TNF-α의 생성 역시 억제가 된다. 그러나 IL-6는 NF-κB 이외에도 다른 요인에 의해 조절되기 때문에 NO의 생성이 억제된다고 반드시 IL-6의 생성이 억제되는 것은 아니다. 이와 관련하여 모링가 제품군이 기타 염증성 사이토카인 및 NF-κB, STAT3, JAK2 발현 등에 미치는 영향을 더 연구하여 염증과 관련된 구체적인 기전 연구가 필요하다.

모링가 제품군 네 가지(오일, 발효환, 분말, 차)의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 모든 제품군에서 농도 의존적으로 높은 항산화능이 나타났으며, SOD 유사 활성을 측정한 결과 모링가 발효환 처리군에서 활성도가 증가하였다. 미백 효과를 알아보기 위하여 티로시나아제 억제 활성을 알아본 결과, 오일을 제외한 모든 제품 처리군에서 억제 활성이 나타났다. 또한 항노화 효과를 알아보았는데, 이 역시 오일을 제외한 모든 모링가 제품 처리군에서 우수한 엘라스타제 저해 효과를 나타냈다. 마지막으로 모링가 제품군 중 발효환, 분말, 차가 NO 생성 및 TNF-α 분비를 억제하는 것을 보여주어 항염증 효과를 입증하였다.

본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원의 스마트특성화 기반구축사업으로 수행된 연구결과입니다(P0017660).