대장암은 직장의 상피세포에서 발생하는 흔한 악성 종양이다(Jahanafrooz 등, 2020). 이는 전 세계적으로 가장 흔한 암 중 하나이며, 많은 지역에서 흔히 발생한다(Ahmed, 2020). 대장암의 발병기전은 유전적 요인, 환경, 생활습관 등 다양한 요인이 관련되어 있으며, 특히 고지방식이, 당뇨, 흡연, 음주 등 식이에 관련된 해로운 습관은 대장암의 위험 증가와 관련이 있다(Pietrzyk, 2017). 대장암 치료에 있어서 최근 종양세포의 성장 신호전달 경로를 방해하는 것을 목표로 최근 몇 년간 중요한 치료 전략이 되었다(Shanmugam 등, 2011). 비용이 많이 들고 부작용이 발생하기 쉬운 약물에 비해 식품 기반 표적치료제는 식습관을 조절하고 식품 내 생리활성 화합물을 활용하여 질병을 예방하고 관리하는 것으로 사용되고 있다(Saiwal 등, 2019).

간장은 오랜 역사와 전통을 가진 한국의 대표적인 발효식품으로, 단순히 맛을 더하는 조미료의 역할을 넘어 건강에 유익한 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있다(Jang 등, 2021). 간장은 콩을 주재료로 하여 미생물의 발효 과정을 거쳐 만들어지며, 이 과정에서 다양한 유익균과 발효 산물이 생성된다(Jung 등, 2022). 이 과정은 주로 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus) 등 유익한 박테리아가 참여하며, 이들 미생물은 콩 단백질을 분해하여 아미노산과 다양한 생리활성 물질을 생성한다(Sassi 등, 2021). 간장은 원료의 종류, 숙성 기간, 재래식 혹은 개량식 등의 제조 방법에 따라 항암효과에 차이가 있으므로, 최근 이러한 제조 과정에 따라 간장의 항암 및 항산화 효과를 극대화하고자 연구가 진행되어 왔다(Jang 등, 2021). 특히 간장은 사용하는 소금의 종류에 따라 그의 기능성이 변화하는 것으로 확인되었는데, 죽염으로 제조된 간장은 산화스트레스에 대한 신경 보호 및 항산화 활성이 증가하였다(Jeong 등, 2016; Seo 등, 2014).

Isoflavone 및 anthocyanin이 다량 함유된 서목태(Rhynchosianulubilis)는 쥐눈이콩 혹은 약콩이라고도 불리운다. 서목태는 해독성이 탁월하고 신체 기능을 강화하는 약재로 신약본초에 보고되어 있으며, 서목태가 갖는 cyanidin-3-glucoside 성분은 활성산소를 제거하여 신체의 노화를 예방하는 것으로 알려져 있다(Bae와 Ha, 2015; Kim과 Kim, 2018).

오리에게 유황을 먹여 황화수소, 황산화물 및 methyl mercaptan과 같은 휘발성 황 화합물들과 같은 독성물질을 제거하는 해독물질이 오리 내에 생산되어 오리의 간, 쓸개 등에 축적이 되고, 이로 인해 해독력이 3~4배로 증가하게 된다(Jeon, 2006). 이런 유황오리는 단순히 해독 능력뿐 아니라 각종 암세포에 대한 성장 억제 효과도 나타내며, 마우스의 대장염에 대한 항염증 효과가 있음이 확인되었다(Choi와 Kim, 2002; Kim 등, 2013). 또한 서목태 간장에 유황오리를 혼합하여 만든 간장이 항염증 및 면역 활성 효능과 항산화 효과를 가지고 있음이 보고되었다(Jin 등, 2011; Seo 등, 2014).

본 연구에서는 식품으로 가장 많은 영향을 미치는 대장암에서의 항암효과를 확인하고자(Celiberto 등, 2023) HT-29 인체 대장암세포에서의 서목태, 유황오리진액 및 죽염 등이 혼합된 복해정 간장(Bokhaejeong Ganjang, BG)의 항암효과를 연구하고자 하였다.

시료 제조

본 연구는 (주)인산가에서 제조한 서목태 간장(Seomoktae Ganjang, SG)과 복해정 간장(BG)을 제공받았으며, 시중에서 판매 중인 간장(Commercial Ganjang, CG)을 실험에 사용했다. 서목태 간장은 서목태를 가마솥에서 6시간 동안 삶은 뒤 일정한 크기의 육면체 모양의 서목태 메주를 제조한 후, 이를 볏짚을 깐 건조실에서 40~45일간 건조했다. 메주 성형 후 물로 깨끗이 세척한 후 장독에 넣고 9회 죽염을 부어 60일간 발효를 진행한 다음, 서목태 간장과 서목태 메주를 분리하여 사용하였다. 복해정 간장은 서목태 메주 29.4%, 유황오리 6.3%, 정제수 27%, 자죽염 29.4%, 계피 0.7%, 마늘 2.5%, 왕느릅나무껍질 4%, 생강 0.7%를 혼합하여 제조하였다. 전통적인 방법으로 서목태 메주를 띄운 후, 9회 죽염을 사용하여 유황오리 여액으로 염수를 만들었다. 항아리에 염수와 메주, 유근피 등을 담고 숙성시키며, 6개월 이상 숙성되면 메주를 분리하고 여과하여, 여과액을 항아리에 보관 및 숙성하여 사용했다. 천일염이 첨가된 시판 간장(S Co.)은 농협마트에서 구입하여 사용하였다. 시판 간장의 경우 메주 발효, 저온발효, 유산균 발효, 효모 발효 및 숙성 발효로 5단계에 걸쳐 5개월 이상 발효된 간장이며, 총질소 함량이 1.5% 이상인 간장을 사용했다.

간장 추출물의 제조

본 실험에 사용하고자 제조된 간장 시료를, 동결건조기(FDS-7012, Operon Co.)를 사용하여 동결 건조하여 가루 형태로 제조한 후, 이를 시료 20배(w/v)의 메탄올을 첨가하고 12시간 교반을 3회 반복한 다음 여과하여 회전식진공농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co.)로 농축하여 추출물을 얻었다. 이 추출물은 dimethly sulfoxide(Sigma-Aldrich)에 희석하여 항산화 및 암세포 실험에 사용하였다.

이화학적 평가(pH value, acidity, salinity)

간장 시료의 pH는 10배 희석한 후 희석액을 pH meter(M220, Corning Co.)를 이용하여 측정하였다. 산도는 시료를 20배 희석한 후 pH를 8.4로 조절하고자 0.1 N NaOH를 소비하여 소비된 0.1 N NaOH의 양을 측정하였다. 염도는 간장 300 μL를 염도 측정기(PALES2, ATAGO Co.)에 넣고 측정된 값을 얻었다(Lee 등, 2022).

Acidity (%)＝(mL of 0.1 N NaOH×normality of NaOH×0.09/ weight of sample)×100

총 플라보노이드 함량 평가

1 mL의 diethylene glycol을 시료 100 μL에 첨가하고 실온에서 5분 동안 방치해 두었다. 그 후 100 μL의 1 N NaOH를 첨가하고 혼합물을 37°C에서 60분 동안 반응시켰다. 그리고 Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter(Perkin-Elmer)를 사용하여 420 nm에서 ELISA reader(model 680, Bio-Rad)로 흡광도를 측정하였다. 플라보노이드 함량은 퀘르세틴(Sigma-Aldrich)을 기준으로 하여 표준 보정 곡선을 얻어 표준 곡선(0~1,280 μg/mL)을 이용하여 계산하였다.

총 페놀 함량 평가

75 μL Folin-Ciocalteu 시약(Sigma-Aldrich)을 250 mg/mL 각 시료의 메탄올 추출물 25 μL와 혼합하여 실온에서 5분간 반응시켰다. 그 후 200 μL의 7.5% Na₂CO₃ 용액과 700 μL의 증류수를 첨가하고 빛을 차단하여 실온에서 40분간 반응시켰다. 이후 765 nm에서 ELISA reader(model 680, Bio-Rad)로 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 기준으로 표준 곡선을 그리고(0.03125~1.0 mg/mL) 표준 곡선을 사용하여 간장의 총 페놀 함량을 계산하였다(Lee 등, 2024).

DPPH 소거능 평가

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhyrazyl) 자유라디칼 소거 효과를 측정하고자, 시료 100 μL와 150 μm DPPH(Sigma Co.) 용액 100 μL 를 96-well plate에 혼합하여 30분간 실온에 빛이 차단된 상태를 반응시킨 후 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.

SD: sample+DPPH, SM: sample+methanol

MD: methanol+DPPH

MM: methanol+methanol (흡광도 값)

암세포 배양

인체 결장암종 세포주인 HT-29 세포는 한국세포주은행에서 구입했다. 세포배양은 5% CO₂ 인큐베이터(BB150, Thermo Scientific)에서 37°C 조건에서 배양했으며, 사용된 배지는 RPMI1640(Welgene Inc.)에 10% fetal bovine serum(Welgene Inc.)과 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL)을 혼합하여 사용했다. 또한 계대 배양을 진행하고자 세포를 75T cell culture flask(Falcon)에서 배양한 후, 0.05% trypsin-0.02% EDTA(Gibco BRL)를 2 mL 이용하여 부착된 세포를 탈착 및 원심분리로 집적시켰다. 이후 집적된 세포와 배지를, 피펫을 이용하여 잘 혼합한 후 새로운 75T cell culture flask에 10 mL씩 넣어 계대 배양을 진행하면서 실험에 사용했다(Lee 등, 2023).

MTT assay를 통한 암세포 성장 억제율 측정

배양된 암세포는 96-well plate에 well당 5×10⁴ cells/mL가 되도록 만들어 well당 100 μL씩 분주하고 일정 농도로 제조한 시료를 첨가하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후 배지를 제거한 후 phosphate-buffered saline을 이용하여 5 mg/mL의 농도로 제조한 MTT 용액을 첨가하여 동일한 배양 조건에서 4시간 동안 더 배양한 후 생성된 formazan 결정을 dimethly sulfoxide에 30분간 처리한 후 ELISA reader(model 680, Bio-Rad)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

RT-qPCR을 이용한 암세포 내 세포사멸 관련 유전자 mRNA 발현 측정

HT-29 인체 대장암 세포주의 배양된 세포는 세포 계수기(Luna cell counter; Logos Biosystems)를 사용하여 계수했고, 각 well당 1.0×10⁵ cells/mL의 세포를 6-well plate에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 HT-29 대장암세포는 CG 4 mg/mL, SG 4 mg/mL, 그리고 BG 4 mg/mL가 포함된 배지를 추가하여 48시간 동안 처리하였다. 처리 후 배지를 제거한 다음 세포로부터 Trizol(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 분리했고, 이를 0.1% diethyl pyrocarbonate water(Bioneer Co.)에 용해했다. 총 용해된 RNA는 Nano Drop ND-1000(NanoDrop Technologies Inc.)을 사용하여 정량화했고, 정량화된 RNA를 Superscript Ⅱ 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 Bio Rad CFX96(Bio-Rad)을 사용하여 Thermalcycler로 유전자 발현을 분석하였다(Lee 등, 2023). 사용된 Primer 서열은 Table 1에 나타난 바와 같다.

Table 1 . Primer sequences of RT-qPCR assay.

Gene name.	Primer sequence.
p53.	F: 5′-ATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3′. R: 5′-TGCAGGGGCCGCCGGTGTAG-3′.
p21.	F: 5′-ATGTCAGAACCGGCTGGGG-3′. R: 5′-GCCGGGGCCCCGTGGGA-3′.
BIM.	F: 5′-AGATCCCCGCTTTTCATCTT-3′. R: 5′-TCTTGGGCGATCCATATCTC-3′.
BCL-2.	F: 5′-AAGATTGATGGGATCGTTGC-3′. R: 5′-GCGGAACACTTGATTCTGGT-3′.
Caspase 9.	F: 5′-CTAGTTTGCCCACACCCAGT-3′. R: 5′-CTGCTCAAAGATGTCGTCCA-3′.
Caspase 3.	F: 5′-TTTTTCAGAGGGGATCGTTG-3′. R: 5′-CGGCCTCCACTGGTATTTTA-3′.
GAPDH.	F: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′. R: 5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′.

통계처리

이화학적 평가(pH value, acidity, salinity)는 SPSS v18 statistical software package(SPSS Inc.)를 통해 one-way ANOVA를 Duncan’s multiple range test로 진행하여 P<0.05 이하일 때 유의성이 있다고 간주했다. 이외의 데이터는 Graph PadPrism 9.4.1(GraphPad)을 이용하여 분석하였으며, 실험의 데이터는 평균±표준편차(standard deviation)로 표시하였다. Two-way ANOVA 및 one-way ANOVA를 이용하여 각 그룹 간의 유의성을 확인하였다(P<0.05, P<0.01, P<0.001, P<0.0001).

간장의 발효 특성

pH, 산도 및 염도 분석: Table 2에서 보는 바와 같이 CG군에서의 pH는 4.86±0.02, SG군 및 BG군 에서는 각각 6.53±0.02, 5.83±0.01로 CG군보다 높은 pH를 나타내었다. pH의 경우 발효 기간이 오래될수록 낮아지는데, 이러한 결과는 60일간 발효를 진행한 SG군보다 6개월간 발효를 진행한 BG군의 pH가 낮은 경우를 통해 확인할 수 있었다. 또한, 전통 발효를 통해 제조되는 SG군 및 BG군과 다르게 시판 간장인 CG군의 경우, 대량 생산 및 유통을 위해 유산균 및 효모 발효를 통해 단기간에 걸쳐 빠르게 발효시키는 공정을 가지게 되는데, 이는 미생물의

Table 2 . Physicochemical characteristics analysis (pH values, acidity, and salinity) of Ganjang.

	pH value.	Acidity (%).	Salinity (%).
CG. SG. BG.	4.86±0.02c. 6.53±0.02a. 5.83±0.01b.	2.67±0.03a. 2.02±0.05b. 1.99±0.01b.	13.9±0.01b. 25.8±0.01a. 25.7±0.02a.

CG: Commercial Ganjang, SG: Seomoktae Ganjang, BG: Bokhae-.

jeong Ganjang..

Means with the different letters (a-c) in a column are signifi-cantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range tests..

대사활동으로 인해 유기산이 축적되고, 이로 인해 수소 이온 농도가 증가하여 pH가 낮아지기 때문이다(Sionek 등, 2023). 이는 BG군의 더 긴 발효 기간, 유산균 및 효모를 이용하여 숙성 발효한 CG군이 SG군보다 낮은 pH를 보이는 것은 긴 발효 기간에 유산균 및 효모에 의한 유기산 축적이 더 많이 이루어졌기 때문이며, 이로 인해 pH가 감소한 것으로 보인다.

이 외에 염도의 농도에 따라 pH가 변화하는데, 염도가 13.9±0.01%를 보여준 CG군이 25.8±0.01%, 25.7±0.02%로 나타난 SG군 및 BG군보다 pH가 낮은 경향을 보였다. 이는 소금 함량이 높아 발효 기간에 따른 pH의 감소가 적은 것으로 보인다(Park 등, 2015). SG군 및 BG군에서의 염도가 CG군보다 높은 결과를 보였는데, 이는 한국 전통 간장 제조 방식으로 제조하기에 다른 한국 전통 간장 18종의 염분 함량인 27.5±3.6%와 유사한 경향을 보였다(Park 등, 2016). 전통 발효 방식에서는 발효 동안 높은 소금의 농도가 미생물 활동을 조절하여 유기산의 축적을 억제할 수 있으므로, 염도가 높은 SG군과 BG군의 pH 감소가 CG군보다 덜 나타났을 가능성도 고려할 수 있다.

산도의 경우 CG군에서 2.67±0.03%, SG군에서 2.02±0.05%, BG군에서 1.99±0.01%로 나타나 CG, SG, BG군으로 산도가 낮아지는 경향을 보였다. 이는 평균적으로 120일가량 발효하는 간장의 특성상 짧은 발효 기간을 가지기에 2%가량의 산도를 나타낼 수 있으며, SG군 및 BG군에서는 높은 염도 함량을 보였으므로 이는 미생물의 활동 억제 및 산도 생성을 유의적으로 억제한 것으로 보인다(Devanthi와 Gkatzionis, 2019). 이러한 결과는 한국 전통 발효 과정인 자연 발효를 통해 만든 SG군 및 BG군이 시판되는 CG군보다 높은 염도에 따른 높은 pH와 낮은 산도를 유지할 수 있음을 보여주며, 이러한 특성은 발효 기간에 따른 간장의 적절한 품질을 결정하는 중요한 요소라고 생각된다.

총 플라보노이드, 페놀 함량 및 DPPH 소거 효과 측정

간장의 총 플라보노이드 함량 및 페놀 함량 측정 결과는 Fig. 1A, B와 같다. 농도 의존적으로 모든 그룹에서 플라보노이드 함량이 증가하는 경향을 보였으며, 서목태로 제조된 SG군과 BG군이 CG군보다 유의적으로 증가하였고 특히 BG군에서 가장 높은 함량을 보였다(P<0.0001). 이는 서목태와 같은 검정콩의 경우 안토시아닌이라는 플라보노이드 화합물을 다량 함유하고 있으며, 이외에도 유황오리진액, 계피, 마늘, 왕느릅나무껍질 등 다양한 재료에 따른 플라보노이드를 함유하고 있어 이러한 화합물들은 항산화, 항염, 항암효과를 지니고 있으므로 건강에 유리한 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2016; Lee 등, 2020). 또한 BG군에 혼합된 유황오리진액의 경우 다양한 아미노산 성분들을 포함하고 있으며, 유황 공급 돼지고기 소시지의 경우 일반 돼지고기 소시지보다 높은 플라보노이드 함량을 가지고 있음이 보고되었다(Kim 등, 2013; Song 등, 2014). 이러한 결과는 서목태와 유황오리진액을 혼합하여 제조된 복해정 간장이 다른 간장보다 높은 플라보노이드 함량을 가지고 있음을 보여준다.

Fig 1. Total flavonoid, total phenol, and DPPH free radical scavenging contents of Ganjang samples. CG: Commercial Ganjang, SG: Seomoktae Ganjang, BG: Bokhaejeong Ganjang. Significantly different at ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001, ^****P<0.0001 by two-way ANOVA.

간장의 DPPH 소거 효과의 경우 Fig. 1C에서 보는 바와 같이, 농도가 증가함에 따라 DPPH 소거 활성능은 증가했으며, 모든 농도에서 BG군이 CG 및 SG군보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 특히 8 mg/mL 농도에서 BG는 CG보다 2.42배, SG보다 1.77배로 큰 차이를 보였으며, 이는 BG군에 혼합된 유황오리진액에 포함된 황에 의한 항산화 효능 증가 및 서목태가 갖는 높은 플라보노이드와 페놀 함량에 의한 것으로 보인다(Cheng 등, 2013; Ha 등, 2013). 또한, BG에 사용된 죽염은 정제염, 천일염보다 높은 활성산소 소거능을 가지고 있으며, 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가한다(Zhao 등, 2012). 따라서 이런 파이토케미컬들을 잘 혼합하며 만든 복해정 간장에서 더욱 높은 항산화 효과를 갖는 것으로 생각된다.

HT-29 인체 대장암 세포에서 in vitro 항암효과

MTT assay: 간장 추출물의 농도별 HT-29 대장암세포 성장 억제율에 관한 결과는 Fig. 2와 같다. 1 mg/mL 및 2 mg/mL를 제외하고 농도가 높아질수록 BG군이 CG와 SG군보다 유의적으로 높은 HT-29 대장암세포 사멸률을 보였다(P<0.05). 이는 총 플라보노이드 함량 및 DPPH 자유 라디칼 소거능처럼 BG군이 유의적으로 증가하는 경향과 유사하였다. BG군의 높은 항암효과는 서목태에 함유된 페놀화합물 외에도 긴 발효 기간과 유황오리진액 및 유근피 등의 재료에 의한 시너지 효과에 의해 증대되었을 가능성이 크다(Kim 등, 2013; Lim, 2007). 유황오리진액은 항염증 및 항암효과가 보고된 바 있으며, 이는 서목태의 페놀화합물과 혼합되어 암세포의 성장을 더욱 효과적으로 억제하는 것으로 보인다(Chen 등, 2021; Kim 등, 2013). 또한 BG군은 SG군보다 긴 발효 과정을 통해 유기산, 페놀, 플라보노이드와 같은 생리활성 성분이 더 많이 생성되어 암세포 사멸 효과를 증진시켰을 가능성이 있는 것으로 사료된다(Sionek 등, 2023). 다만, 본 연구에서 간장 추출물 제조 시 동결건조 파우더의 수율을 정확히 확인하지 못한 점은 제한점으로 남는다. 추출물의 수율은 실험 결과에 중요한 요소이므로 이후 실험에서는 수율을 명확히 측정하여 더욱 정확한 데이터를 제공할 수 있도록 할 필요가 있다. 이는 향후 연구에서 개선되어야 할 부분이며, 더욱 정확한 실험 설계를 하고자 한다.

Fig 2. Inhibition rate of HT-29 colon cancer cells according to the Ganjang samples. CG: Commercial Ganjang, SG: Seomok-tae Ganjang, BG: Bokhaejeong Ganjang. Significantly different at ^*P<0.05, ^***P<0.001, ^****P<0.0001 by two-way ANOVA.

RT-qPCR을 이용한 p53, p21의 mRNA 발현: 세포주기 정지와 관련된 유전인자인 p53과 p21의 mRNA 발현을 측정하였다(Fig. 3). p53에서 SG군은 아무것도 처리되지 않은 CON군보다 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며(P<0.05), BG군도 유의적으로 더 증가하였다(P<0.01). p53은 종양 억제 유전자로 세포주기 조절 및 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 역할을 하며, p21은 p53에 의해 유도되는 사이클린 의존성 키나아제 억제제로 세포주기 정지를 통해 세포의 손상 복구 시간을 제공한다(Vousden과 Lane, 2007). 이는 서목태 등이 갖는 페놀 및 플라보노이드와 같은 항산화 물질이 세포 내 산화스트레스를 줄이고 암세포의 성장을 억제하고자 서목태의 항암 성분이 p53 경로를 활성화하여 p21의 발현을 유도한 것으로 보인다(Neupane과 Lamichhane, 2020).

Fig 3. Effects of Ganjang samples on mRNA expression levels of p21 and p53 in HT-29 cancer cells. CG: Commercial Gan-jang 4 mg/mL, SG: Seomoktae Ganjang 4 mg/mL, BG: Bokhae-jeong Ganjang 4 mg/mL. Fold ratio: Gene expression/ GAPDH ×control numerical value (control fold ratio＝1). Significantly different at ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^****P<0.0001 by one-way ANOVA.

RT-qPCR을 이용한 Bim, Bcl-2, caspase 9 및 caspase 3의 mRNA 발현: Apoptosis와 관련된 유전인자인 Bim, Bcl-2, caspase 9 및 caspase 3의 mRNA 발현을 측정한 결과(Fig. 4), 모든 추출물이 CON군보다 유의적으로 증가 및 감소하는 경향을 보였는데, pro-apoptosis 인자인 Bim에서 모든 간장 추출물이 유의적으로 CON군보다 증가했으며, 그중 BG군이 2.67배로 증가하여 수치상 가장 높은 경향을 보였다(P<0.0001). 소금이 많은 간장의 항암효과가 높은 것은 발효식품이 갖는 한국의 역설(Korean Paradox)로 이는 발효함에 따라 소금이 갖는 유해성은 억제되고 소금의 종류에 따라 죽염 등은 천일염보다 더 높은 항암효과를 보이기에, 이처럼 간장 추출물들에서 유의적인 경향을 보였다(Park 등, 2023). Anti-apoptosis 인자인 Bcl-2의 발현의 경우 CON군보다 SG군에서는 0.23배, BG군에서는 0.25배로 유의적으로 감소하였다(P<0.0001). Caspase 9 및 caspase 3에서는 BG군이 CON군보다 각각 1.35배, 1.70배가량 증가하며 다른 간장 추출물보다 유의적으로 높은 모습을 보였다(P<0.0001). Bim은 Bcl-2 family의 pro-apoptosis 단백질로 apoptosis의 시작을 담당한다. 간장 추출물, 특히 BG군에서 2.67배로 증가한 것은 apoptosis 신호를 활성화하는 역할을 보여준다. 이는 서목태 간장에 유황오리진액의 조합이 apoptosis를 촉진하는 데 효과적이라는 것을 시사한다(Kashiwagi 등, 2007). Bcl-2는 apoptosis를 억제하는 역할을 하며, 미토콘드리아에서 cytochrome c의 방출을 막는 역할을 한다(Strasser 등, 2000). SG군과 BG군에서 Bcl-2의 발현이 유의미하게 감소한 것은 세포 생존 유전자의 발현을 억제하여 apoptosis를 촉진함을 보여준다. Caspase 9은 미토콘드리아 경로에서 apoptosis를 유도하는 시작 효소이며, caspase 3는 apoptosis의 주요 효소로 다양한 세포기질을 분해하여 세포의 사멸을 실행한다(Lei 등, 2022; Wang 등, 2020). BG군에서 caspase 9 및 caspase 3의 발현이 1.35배, 1.70배가량 증가한 것은 서목태 간장과 유황오리진액을 혼합하면 HT-29 대장암세포에서 apoptosis를 유도하는 데 잠재적 시너지 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는 서목태에 함유된 높은 페놀 및 플라보노이드 함량과 유황오리진액 등이 갖는 항산화 및 죽염과 전통 방식의 발효 과정을 통한 항암효과 증가에 의해 HT-29 대장암세포의 성장을 유의적으로 억제한 것으로 생각된다(Bae와 Ha, 2015; Choi와 Kim, 2002).

Fig 4. Effects of Ganjang samples on mRNA expression levels of Bim, Bcl-2, caspase 9, and caspase 3 in HT-29 cancer cells. CG: Commercial Ganjang 4 mg/mL, SG: Seomoktae Ganjang 4 mg/mL, BG: Bokhaejeong Ganjang 4 mg/mL. Fold ratio: Gene expression/ GAPDH×control numerical value (control fold ratio＝1). Significantly different at ^***P<0.001, ^****P<0.0001 by one-way ANOVA.

본 연구는 복해정 간장(BG)이 HT-29 대장암 세포에서 항암효과에 미치는 영향을 분석하였다. 연구 결과, BG군은 시판 간장(CG) 및 서목태 간장(SG)에 비해 높은 pH와 염도, 낮은 산도를 보였으며, 높은 총 플라보노이드 및 페놀 함량을 나타내었다. 특히 BG군은 다른 샘플들보다 높은 DPPH 소거 활성 능력을 보였는데, 이는 유황오리진액에 포함된 황 성분과 서목태의 높은 플라보노이드 함량이 시너지 효과를 발휘한 결과로 생각된다. MTT assay 결과, BG군은 CG군 및 SG군보다 높은 대장암 세포사멸률을 보였으며, 이는 서목태와 유황오리진액 등이 갖는 항염증 효과 및 항암효과가 결합한 결과로 사료된다. 유전자 발현 분석에서는 p53과 p21의 mRNA 발현이 증가하여 세포주기 정지와 세포사멸을 유도하였고, pro-apoptosis 유전자인 Bim의 발현이 증가하고 anti-apoptosis 유전자인 Bcl-2의 발현이 감소하였으며, caspase 9 및 caspase 3의 발현이 증가하여 apoptosis를 촉진하였다. 결론적으로 서목태 및 유황오리진액 혼합간장은 높은 항산화 및 항암효과를 나타내며, 대장암 세포에서 apoptosis를 유도하는 데 효과적임을 시사한다. 이는 서목태의 높은 플라보노이드 및 페놀 함량과 유황오리진액의 항산화 성분이 결합한 결과로, 추가적인 연구를 통해 그 기전과 효과를 명확히 할 필요가 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 (주)인산가의 지원을 받아 수행하였으며 이에 감사를 드립니다.