자작나무(birch), 유칼립투스(eucalyptus), 플라타너스(plane tree), 대추나무(jujube) 등과 같은 다양한 식물의 껍질이나 열매에서 발견되는 betulinic acid는 lupine-type triterpenoid 계열에 속하는 천연물의 일종으로 항산화, 항염증, 항당뇨, 항종양, 혈관신생 억제 및 항바이러스 등과 같은 약리학적 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Aswathy 등, 2022; Banerjee 등, 2024; De Silva 등, 2023; Lou 등, 2021). 특히 항산화 활성과 직접 연관된 연구의 예로, betulinic acid는 에탄올로 유도된 생쥐의 간세포 손상을 억제하였으며(Szuster-Ciesielska와 Kandefer-Szerszeń, 2005), 이는 간에서 glutathione(GSH), superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GSH-Px)와 catalase(CAT) 활성의 증가와 malondialdehyde(MDA) 함량과 미세소포성 지방간(microvesicular steatosis)의 감소에 의한 것이었다(Yi 등, 2014). 이와 유사하게 betulinic acid는 간독성이 매우 높은 발암물질로 알려진 N-nitrosodimethylamine(NDMA)이 처리된 생쥐의 간과 신장에서 억제된 SOD, CAT, GSH-Px와 glutathione-S-transferase의 활성과 GSH 함량의 개선과 함께 혈청 내 interleukin-6(IL-6)와 tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 같은 염증성 cytokine의 수치를 낮추었다. Betulinic acid는 또한 NDMA에 의한 변화된 약물 대사 효소들(drug-metabolizing enzymes)의 활성을 회복시켜 간의 섬유증(fibroplasia)과 신장에서 피질 변성(cortical degeneration)을 감소시켰다(Adeleke와 Adaramoye, 2021). 이들과 유사한 결과들은 NDMA가 처리된 Sprague Dawley 쥐(Kaur와 Arora, 2013)와 dextran sulfate sodium으로 유도된 대장염과 마우스의 내장 통증 모델(Kalra 등, 2018) 및 carrageenan에 의한 흉막염 모델(Ekuadzi 등, 2018)에서도 보고된 바 있다. 또한 betulinic acid는 간 손상 시 활성화되고 간 섬유증에서 콜라겐이 풍부한 세포외 기질을 생성하는 것으로 알려진 간 성상세포(hepatic stellate cells)의 활성은 억제하였고, betulinic acid에 의한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성 억제는 nuclear factor-kappa B(NF-κB)의 신호 전달을 감소시켜 염증 반응을 차단하였다(Szuster-Ciesielska 등, 2011). 이와 유사한 betulinic acid의 항산화 활성은 생쥐의 뇌 손상 유도 모델에서도 보고된 바 있는데, Huang 등(2022)은 betulinic acid가 면역 체계와 인지 기능에 해로운 영향을 미치는 mycotoxin에 의해 억제된 SOD, CAT, GSH-Px 활성을 증가시키고 GSH 수준의 보존과 ROS 및 MDA 생성은 감소시켰다. 그리고 betulinic acid는 염증성 cytokine의 발현은 감소시켰지만, IL-10과 같은 항염증성 cytokine의 발현은 증가시키면서 세포사멸(apoptosis)을 억제하여 뇌 손상에 대해 예방 및 보호 역할을 할 수 있음을 보고한 바 있다(Huang 등, 2022). 나아가 폐 및 신장 손상 모델에서 betulinic acid의 강력한 항산화 활성은 ROS 제거를 위한 항산화 유전자의 활성을 조절하는 대표적인 전사인자인 nuclear factor erythroid-2-related factor 2의 활성과 연관성이 있었다(Huang 등, 2024; Kaur 등, 2024; Wu 등, 2023).

한편 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 이용한 Sudharshan 등(2022)의 연구에 의하면, betulinic acid는 과산화수소(H₂O₂)에 의한 ROS의 생성과 세포사멸을 억제하여 세포 노화를 지연시키고 수명을 연장하였다. 아울러 Musayeva 등(2021)은 betulinic acid가 마우스 망막에서 혈관 내피 기능의 개선과 ROS 수치를 감소시켜 허혈/재관류 손상으로부터 보호할 수 있음을 보고한 바 있다. 나아가 betulinic acid는 척수 손상 모델에서 ROS 생성 저해를 통하여 염증성 세포사멸(pyroptosis)과 미토콘드리아의 선택적 분해(mitophagy)를 감소시키고 불필요하거나 기능하지 않는 세포 구성 성분을 분해하는 자가포식(autophagy)을 촉진시켜 척수의 기능적 회복을 유도하였다(Wu 등, 2021). 이와 같이 betulinic acid의 항산화 활성의 중심에는 ROS 생성 억제가 핵심적인 역할을 하지만, 다양한 암세포에서 betulinic acid의 항암 활성은 미토콘드리아 손상에 따른 ROS 의존적인 경우가 대부분이다(Chen 등, 2024; Park 등, 2021; Zhang 등, 2024). 특히 Chen 등(2024)은 인체 자궁경부암세포에서 betulinic acid는 세포 내 칼슘(Ca²⁺)의 수준을 증가시키고 ROS 의존적 소포체(endoplasmic reticulum stress, ER) 스트레스와 세포 보호적 자가포식을 통하여 세포사멸을 개시하였음을 보고하였다. 반면, Zhang 등(2024)은 인체 방광암세포에서 betulinic acid가 자가포식 의존적 세포사멸을 유도하였음을 제안하여 암세포의 유형에 따라 betulinic acid의 항암 활성 기전이 서로 다름을 알 수 있다.

각질세포(keratinocytes)는 다양한 물리적, 화학적, 생물학적 자극에 대한 보호 역할을 하는 피부의 가장 바깥쪽 층인 표피의 주요 구성 세포다. 각질세포는 ROS 생성을 유도하는 자외선과 같은 외부 자극에 직접 노출되어 있으며 산화 스트레스에 의한 염증, DNA 손상, 미토콘드리아 기능 장애, 세포사멸 유도 등에 취약하다(Merin 등, 2022; Nakai와 Tsuruta, 2021). 산화 스트레스로부터 각질세포를 보호하기 위하여 다양한 천연물이 이용되고 있지만(Hooda 등, 2023), betulinic acid가 산화 스트레스로부터 각질세포를 보호할 가능성에 관한 연구는 아직 이루어진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 HaCaT 인체 각질세포에서 H₂O₂에 의하여 묘사된 산화 스트레스에 의한 세포 손상에 미치는 betulinic acid의 보호 기전을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 HaCaT 세포에서 betulinic acid는 H₂O₂에 의한 자가포식과 세포사멸을 억제하였으며, 이는 미토콘드리아 손상에 따른 ROS의 생성과 Ca²⁺ 매개 ER 스트레스의 차단과 연관성이 있었다.

세포배양

본 연구에 사용한 HaCaT 인체 각질세포(CRL-1458^TM)는 American Type Culture Collection에서 구입하였으며, 10% fetal bovine serum과 1% antibiotic-antimycotic solution이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s 배지를 이용하여 37°C 조건에서 5% CO₂ 배양기를 이용하여 배양하였다. 세포배양에 필요한 모든 재료는 WELGENE Inc.에서 구입하였다. Betulinic acid(3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)와 H₂O₂는 Cayman Chemical Co. 및 Sigma-Aldrich Chemical Co.에서 각각 구입하였으며 dimethyl sulfoxide(Thermo Fisher Scientific)와 증류수에 용해하여 각각 100 mM의 원액(stock solution)을 제조하였다. 원액은 적정 농도로 배지에 희석하여 세포에 처리하였다.

세포 생존율 및 세포독성 분석

Betulinic acid 및 H₂O₂ 단독 처리 또는 H₂O₂의 세포독성에 미치는 betulinic acid의 영향을 조사하기 위하여, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 및 lactate dehydrogenase(LDH) 분석을 수행하였다. 이를 위하여 다양한 농도의 betulinic acid와 H₂O₂가 희석된 배지에서 HaCaT 세포를 24시간 배양하거나 5 μg/mL의 betulinic acid가 1시간 처리된 세포에 1 mM의 H₂O₂를 처리하여 24시간 배양하였다. 처리가 끝난 세포를 모아 MTT assay kit(Abcam Limited) 및 LDH cytotoxicity assay kit(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase) 활성 및 배양 배지로 방출되는 LDH의 양을 microplate reader(Beckman Coulter Inc.)로 정량화하여 세포 생존율 및 세포독성을 측정하였다.

자가포식 유도의 분석

상기와 동일한 조건에서 배양된 세포들에서 자가포식 유도의 정도를 비교하기 위하여 먼저 위상차 현미경(Carl Zeiss) 하에서 세포의 형태적 변화를 관찰하였으며, Cyto ID^® autophagy detection kit(Enzo Life Sciences Inc.)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포를 염색하였다. 염색 후 핵을 4′,6′-diamidino-2-phenylindole(Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 염색하여 형광 현미경 하에서 관찰하거나 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 자가포식 유도 정도를 정량적으로 분석하였다.

단백질 분리 및 immunoblotting

Betulinic acid가 있거나 없는 조건에서 H₂O₂가 24시간 처리된 세포를 PBS로 세척 후 세포의 총 세포 단백질은 RIPA 용액(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 분리하였고, 미토콘드리아 및 세포질 분획을 분리하기 위해서는 Mitochondrial/Cytoplasmic fractionation kit(Active Motif Inc.)을 사용하였다. Immunoblotting을 위해 처리군별 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용한 electrophoresis로 분리하여 polyvinylidene difluoride membrane(Thermo Fisher Scientific)으로 전이시킨 후 Santa Cruz Biotechnology Inc., Abcam Inc. 및 Cell Signaling Technology에서 구입한 검출 단백질 대상 1차 항체와 반응시켰다. 이어서 horseradish peroxidase conjugated 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.)와 반응시키고, enhanced chemiluminescence solution(Thermo Fisher Scientific)을 처리 후 Fusion FX Imaging system(Vilber Lourmat)을 이용하여 해당 단백질의 발현 정도를 시각화하였다.

ROS 생성의 분석

HaCaT 세포에서 H₂O₂에 의한 ROS의 생성에 미치는 betulinic acid의 영향을 조사하기 위하여 세포를 betulinic acid 및 H₂O₂를 단독으로 24시간 처리하거나, betulinic acid가 함유되었거나 없는 조건에서 H₂O₂를 1시간 처리하였다. 이어서 phosphate-buffered saline(PBS)으로 세포를 세척하고 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA, Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 20분 동안 염색한 후 ROS 생성을 유세포 분석기를 사용하여 분석하거나 형광 현미경(Carl Zeiss) 하에서 형광 강도를 관찰하였다. 아울러 ROS 생성 억제제인 N-acetyl-L-cysteine(NAC, Sigma-Aldrich Chemical Co.)은 양성 대조군으로 사용하였다.

Mitochondrial membrane potential(MMP) 측정

미토콘드리아 기능 손상 여부를 조사하기 위하여 betulinic acid 또는 H₂O₂를 단독 24시간 처리하거나, betulinic acid를 1시간 처리 후 H₂O₂를 24시간 동안 처리하였다. MMP의 변화를 측정하기 위하여 세포를 모아 PBS로 세포를 세척 후 cationic carbocyanine dye인 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine iodide(JC-1, Thermo Fisher Scientific) 염색을 수행하였다. 제조사의 지침에 따라 유세포 분석을 통해 JC-1 monomer를 나타내는 세포의 집단을 MMP가 소실된 빈도로 간주하였다. 아울러 MMP 의존적으로 미토콘드리아 기질에 염색되는 MitoTracker Red^®(Cell Signaling Technology)로 염색 후 형광 현미경 하에서 염색 강도를 비교하였다.

세포사멸 유도의 분석

H₂O₂에 의해 유도된 HaCaT 세포의 세포사멸 유도에 미치는 betulinic acid의 영향을 조사하기 위하여 betulinic acid를 단독 24시간 처리하거나 betulinic acid를 1시간 처리 후 H₂O₂를 24시간 동안 처리하였다. 처리가 끝난 세포를 PBS로 세척 후 4% paraformaldehyde 용액(Sigma-Aldrich Chemical Co.)으로 고정하였다. 이어서 세포를 annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)/propidium iodide(PI)(BD Biosciences)로 염색 후 유세포 분석기로 annexin V-양성 세포의 빈도를 세포사멸이 유도된 세포 집단으로 정량화하였다.

Caspase-3 활성 측정

다양한 조건에서 배양된 세포의 caspase-3 활성 차이를 조사하기 위하여 Abcam Inc.에서 구입한 Caspase-3 assay kit을 사용하였다. 이를 위하여 제조업체의 분석 방법에 따라 세포를 용해시켜 추출한 세포 단백질을 반응 완충액에서 기질과 반응시켰다. Caspase-3의 활성은 microplate reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군 대비 상댓값으로 제시하였다.

CER 스트레스 및 Ca²⁺ 수준 변화의 측정

Betulinic acid 또는 H₂O₂를 단독으로 24시간 처리하거나 betulinic acid를 1시간 처리 후 H₂O₂가 24시간 동안 처리된 세포에서 H₂O₂에 의한 ER 스트레스 유도에 미치는 betulinic acid의 영향을 조사하기 위하여 ER-Tracker^TM reagent(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 이를 위하여 처리가 끝난 세포를 모아 ER-Tracker^TM 시약과 반응시킨 후 형광 현미경 하에서 형광 강도를 비교하였다. 또한 세포 내 Ca²⁺ 수준의 변화는 calcium-sensitive indicator인 Fluo-4 AM(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 제조업체가 제시한 방법에 준하여 유세포 분석기로 분석하였다.

통계 분석

모든 실험은 유의성을 평가하기 위해 최소 3회 독립적으로 반복되었다. 실험 결과는 GraphPad Prism Statistical Software(GraphPad Software Inc.)를 사용하여 분석하였으며 평균±표준 편차(standard deviation)로 나타내었다. One-way analysis of variance과 Tukey’s post-test를 사용하여 실험 그룹 사이의 차이를 조사하였고, P값이 0.05 미만의 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

HaCaT 세포에서 H₂O₂에 의한 세포독성에 미치는 betulinic acid의 영향

HaCaT 세포의 배양 조건에서 산화적 환경을 묘사하기 위하여 H₂O₂를 사용하였으며, 산화 스트레스 유발 적정 H₂O₂ 처리 농도를 선정하기 위하여 다양한 농도의 H₂O₂가 처리된 배지에서 HaCaT 세포를 24시간 동안 배양하였다. Fig. 1A의 MTT 분석 결과와 같이 H₂O₂의 처리 농도 의존적으로 HaCaT 세포의 세포 생존율이 점차 감소하였다. 그리고 H₂O₂에 의한 산화 스트레스에 미치는 betulinic acid의 영향을 조사하기 위하여 다양한 농도의 betulinic acid가 함유된 배지에서 HaCaT 세포를 24시간 동안 배양한 후 MTT 분석을 수행하였다. 10 μg/mL의 betulinic acid가 처리된 세포에서는 대조군 대비 약 82%의 세포 생존율을 나타내었으나, 5 μg/mL 이하의 betulinic acid 처리군에서는 유의적인 세포 생존율 억제가 관찰되지 않았다(Fig. 1B). 따라서 산화 스트레스를 유발하기 위한 H₂O₂의 처리 농도는 대조군 대비 약 63%의 생존율을 나타낸 1 mM로, 산화 스트레스에 대한 betulinic acid의 억제 효과를 조사하기 위해서는 세포독성이 나타나지 않은 5 μg/mL로 선정하였다.

Fig 1. Inhibitory effect of betulinic acid (BA) on H₂O₂-induced cytotoxicity in HaCaT kera-tinocytes. Cells were treated with the indi-cated concentrations of H₂O₂ (A) or BA (B) for 24 h, or treated with 5 μg/mL BA or 1 mM N-acetyl-L-cystein (NAC) for 1 h and then exposed to 1 mM H₂O₂ for 24 h (C, D). Cell viability was analyzed by MTT assay (A-C) or the relative amount of lactate dehydrogenase (LDH) released into the culture medium was determined (D). The data were represented as mean±SD of three independent experiments (^*P<0.05, ^**P<0.01 and ^***P<0.001 vs. control group; ^###P<0.001 vs. H₂O₂-treated group).

H₂O₂에 의한 세포독성에 미치는 betulinic acid의 영향을 조사하기 위하여 5 μg/mL의 betulinic acid가 1시간 처리된 세포에 1 mM의 H₂O₂를 처리하여 24시간 배양한 후 MTT 분석을 실사하였다. Fig. 1C에 제시한 결과에 의하면 5 μg/mL의 betulinic acid가 전처리된 세포에서는 1 mM의 H₂O₂ 단독 처리된 세포에 비하여 세포 생존율이 약 20% 정도 증가(81.18%)하여 H₂O₂에 의한 세포 생존율 저하를 유의적으로 차단하였으며, 이는 betulinic acid가 산화적 손상에 대한 억제 효능을 가질 수 있음을 의미한다. 또한 양성 대조군으로 사용한 NAC 전처리군에서도 H₂O₂에 의한 세포 생존율의 저하가 유의적으로 회복(92.06%)되었다. 이러한 H₂O₂ 유도 산화 스트레스에 대한 betulinic acid의 억제 효능을 재평가하기 위하여 LDH 분석을 추가로 수행하였으며, H₂O₂에 의한 LDH의 세포 외 유리를 betulinic acid가 유의적으로 차단하여 산화 스트레스에 대한 betulinic acid의 방어 효과를 다시 확인하였다(Fig. 1D). 이상의 결과는 betulinic acid가 H₂O₂에 의해 유도된 산화 스트레스 조건에서 HaCaT 세포를 보호할 수 있음을 의미한다.

H₂O₂에 의한 자가포식 유도에 미치는 betulinic acid의 영향

산화 스트레스로 인한 세포 손상은 종종 자가포식과 함께 발생하며(Kaminskyy와 Zhivotovsky, 2014), 각질세포에서도 자가포식은 산화 스트레스 유도 물질로 인한 DNA 손상 및 세포사멸 유도와 연관되어 있어(Fidrus 등, 2021; Park 등, 2022; Piao 등, 2021; Xiong 등, 2024) ROS가 자가포식의 강력하고 효과적인 유도자임을 시사한다. 자가포식은 원치 않는 단백질 응집물 및 손상된 세포소기관과 같은 세포질 성분을 재활용하기 위한 고도로 보존된 자가 소화 과정(self-digestion process)으로, 이들은 자가포식체(autophagosome)라는 새로 생성된 이중 막 구조에 격리되며, 자가포식체는 리소좀과 순차적으로 융합하고 리소좀 분해 경로(lysosomal catabolic pathway)를 통해 이들을 제거한다(Sánchez-Martín과 Komatsu, 2020; Trelford와 Di Guglielmo, 2021). H₂O₂가 함유된 배지에서 배양된 HaCaT 세포의 형태적 변화를 Fig. 2A에 제시하였다. 선행 연구에서처럼 전형적인 자가포식이 유도된 세포에서 관찰되는 공포 형성(autophagic vacuoles)이 H₂O₂가 처리된 세포에서 증가하였지만(Park 등, 2022; Xiong 등, 2024), betulinic acid가 전처리된 세포에서는 이러한 공포 형성이 감소하였기 때문에 betulinic acid가 H₂O₂ 유도 자가포식을 억제할 수 있는지를 조사하였다. Cyto-ID 염색을 사용한 유세포 분석 결과, H₂O₂가 처리된 세포에서 자가포식 유도가 증가하였고 betulinic acid가 존재하는 조건에서는 유의적으로 감소하였으며(Fig. 2B, C), Cyto-ID 염색에 따른 형광 현미경을 이용한 관찰에서도 동일한 결과가 관찰되었다(Fig. 2D). 자가포식의 유도에 관여하는 바이오마커 중에서 microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3)은 자가포식체 형성 과정에 핵심적인 역할을 하며, autophagy-related gene 5(ATG5)는 자가포식에 요구되는 단백질 및 세포소기관에 대한 리소좀 분해 경로에 관여하는 인자 중 하나이다(Trelford와 Di Guglielmo, 2021; Ye 등, 2018). 따라서 이들의 발현 변화를 분석한 결과, H₂O₂가 처리된 HaCaT 세포에서 LC3-I 뿐만 아니라 LC3-I의 변환형인 LC3-II와 ATG5 단백질의 축적이 증가하였지만, betulinic acid가 전처리된 세포에서는 두 가지 자가포식 조절인자의 발현은 모두 감소하였다(Fig. 2E). 이는 betulinic acid가 H₂O₂에 의한 산화적 손상으로부터 HaCaT 세포를 보호하는 데 자가포식의 억제가 최소한 관여하였음을 시사한다.

Fig 2. Protective effect of betulinic acid on H₂O₂-induced autophagy in HaCaT keratinocytes. Cells were treated with 5 μg/mL betulinic acid (BA) for 1 h, and then stimulated with 1 mM H₂O₂ for 24 h. (A) Representative images of cell morphologies observed under an inverted microscope were presented. (B and C) Cells were stained with Cyto-ID and analyzed by flow cytometry (B), and the frequency of cells in which autophagy was induced was presented (C, ^***P<0.001 vs. control group; ^###P<0.001 vs. H₂O₂-treated group). (D) Cells were labeled for Cyto-ID (green) and DAPI (blue), and representative immunofluorescence images were presented. (E) The protein expression of LC3 and ATG5 was determined by immunoblotting using total protein. β-actin was used as an internal standard.

H₂O₂에 의한 ROS 생성에 미치는 betulinic acid의 영향

알려진 바와 같이 산화 스트레스는 핵산과 같은 세포 내 거대분자에 대한 손상을 유도하고 미토콘드리아 기능 소실에 따른 세포사멸 유도에 기여한다(Brillo 등, 2021; Jiang 등, 2020). Betulinic acid의 항산화 활성이 HaCaT 세포에서 H₂O₂에 의한 세포독성과 자가포식 차단과 직접적인 연관성이 있는지를 확인하기 위하여 H₂O₂에 의한 ROS의 생성에 미치는 betulinic acid의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 betulinic acid가 있거나 없는 배지에서 HaCaT 세포를 1시간 배양 후 H₂O₂가 1시간 동안 처리된 세포를 ROS에 대한 세포 투과성 지표인 DCF-DA로 염색하였다. DCF-DA 염색 후 유세포 분석 결과, 세포 내 ROS 생성 수준이 H₂O₂에 노출된 HaCaT 세포에서 현저히 증가하였으며(Fig. 3A, B), 이와 일치하게 H₂O₂가 처리된 세포에서 DCF 형광 강도는 대조군 세포에 비해 매우 강하게 발현되었다(Fig. 3C). 그러나 NAC 전처리와 유사하게 betulinic acid는 H₂O₂ 유도 ROS 생성을 현저히 감소시켜 HaCaT 세포에서 betulinic acid의 H₂O₂에 대한 세포독성 억제 효과는 항산화 활성과 연관이 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 다양한 산화 스트레스 유도 세포 손상 모델에서 betulinic acid가 강력한 ROS 생성 차단 효능을 지니고 있다는 선행 연구 결과들과 일치한다(Huang 등, 2022; Sudharshan 등, 2022; Wu 등, 2023; Yang 등, 2023).

Fig 3. Alleviating effect of betulinic acid (BA) on H₂O₂-induced ROS generation in HaCaT keratinocytes. Cells were cultured in medium containing 5 μg/mL BA or 1 mM N-acetyl-L-cystein (NAC) for 1 h and then treated with 1 mM H₂O₂ for 1 h. After DCF-DA staining, intracellular ROS levels were calculated using a flow cytometer (A and B, ^***P<0.001 vs. control group; ^###P<0.001 vs. H₂O₂-treated group) or observed under a fluorescence microscope (C).

H₂O₂에 의한 세포사멸 및 미토콘드리아 손상에 미치는 betulinic acid의 영향

선행 연구들에 의하면 HaCaT 세포에서 H₂O₂로 유도된 세포사멸은 미토콘드리아 매개 내재적 세포사멸 경로(mitochondria-mediated intrinsic apoptosis pathway)를 개시하는 cytochrome c와 같은 세포사멸 유발 인자(apoptogenic factors)의 세포질 유리와 밀접한 상관관계가 있었다(Park 등, 2020, 2022; Shim 등, 2008). 미토콘드리아의 기능적 손상에 따른 MMP 소실로 인하여 미토콘드리아에서 세포질로 방출된 cytochrome c는 caspase-9의 활성화를 통해 caspase-3 및 caspase-7과 같은 효과기 caspase를 활성화하여 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)를 포함한 기질 단백질의 분해를 유도하여 세포사멸을 종결시킨다(Dadsena 등, 2021; Srivastava와 Saxena, 2023). 따라서 H₂O₂에 의한 세포독성에 대한 betulinic acid의 억제 작용이 미토콘드리아 기능 손상의 억제와 세포사멸의 차단에 의한 것인지를 조사하였다. 이를 위하여 1시간 동안 betulinic acid가 있거나 없는 배지에서 HaCaT 세포를 배양한 후 24시간 H₂O₂가 처리된 세포를 JC-1으로 염색 후 MMP의 변화를 조사하였다. Fig. 4A 및 4B의 결과에서 알 수 있듯이 H₂O₂가 단독 처리된 HaCaT 세포에서 MMP의 소실을 의미하는 JC-1 monomers의 빈도가 현저히 증가했지만, betulinic acid가 전처리된 세포에서는 유의적으로 차단되었다. 그리고 MMP에 따라 미토콘드리아 기질에 통합되는 Mito Tracker Red의 형광 강도가 H₂O₂ 처리에 의해 억제된 반면, betulinic acid의 전 처리군에서는 대조군 수준으로 유지되어(Fig. 4C) MMP의 소실이 betulinic acid에 의하여 억제되었음을 재확인하였다. 또한 H₂O₂가 처리된 세포에서 cytochrome c의 발현이 세포질 분획에서 증가하였고 미토콘드리아 분획에서는 저하되었지만, betulinic acid가 존재하는 조건에서 이들의 발현은 역전되었으며(Fig. 4D), 이는 betulinic acid가 H₂O₂로 인한 미토콘드리아 손상을 차단함에 따른 결과일 것이다.

Fig 4. Attenuation of H₂O₂-induced mitochondrial impairment and apoptosis by betulinic acid (BA) in HaCaT keratinocytes. Cells were cultured in medium with or without 5 μg/mL BA for 1 h and then treated with to 1 mM H₂O₂ for 24 h. (A and B) After JC-1 staining, MMP of cells in each treatment group was examined using flow cytometry. (A) Representative profiles of flow cytometry analysis were presented. (B) The percentage of cells expressing JC-1 monomers was presented as a population of cells in which MMP was lost (^***P<0.001 vs. control group; ^###P<0.001 vs. H₂O₂-treated group). (C) Representative images obtained under a fluorescence microscope after staining with MitoTracker Red were presented. (D) After separating cytosolic and mitochondrial fractions, the expression of cytochrome c in each fraction was examined by immunoblotting. β-actin and cytochrome c oxidase subunit IV (COX IV) were used as the reference genes for cytosolic and mitochondrial fractions. (E and F) Cells were stained with annexin V-FITC/PI, and analyzed by flow cytometry (E), and the frequencies of apoptotic cells were presented (F, ^***P<0.001 vs. control group; ^###P<0.001 vs. H₂O₂-treated group). (G and H) After extracting total proteins from cells, changes in expression of apoptosis-regulating proteins (G) and activity of caspase-3 (H) were examined using immunoblotting and a commercially available caspase-3 activity assay kit (^***P<0.001 vs. control group; ^###P<0.001 vs. H₂O₂-treated group).

이어서 annexin V-FITC/PI 염색에 의한 유세포 분석을 통하여 H₂O₂에 의한 세포사멸 유도에 미치는 정도를 betulinic acid의 영향을 조사하였다. Fig. 4E 및 4F에 나타낸 바와 같이 H₂O₂가 단독 처리된 HaCaT 세포에서 세포사멸의 유도가 현저히 증가했지만, betulinic acid가 전처리한 세포에서는 유의적으로 차단되었다. 다양한 세포사멸 조절인자 중 세포사멸 억제제인 Bcl-2와 Bax와 같은 길항제 단백질로 구성된 Bcl-2 family 단백질은 미토콘드리아 막 투과성 조절을 통해 세포사멸 유발 인자의 방출 여부를 조절하여 내재적 세포사멸 경로 개시 여부의 결정에 핵심적인 역할을 한다(Dadsena 등, 2021; Wolf 등, 2022). 본 연구 결과에 의하면 대조군에 비해 H₂O₂를 처리한 세포에서는 미토콘드리아 투과성 전이 기공(mitochondrial permeability transition pore)의 형성을 억제하여 MMP의 보존에 관여하는 Bcl-2의 발현은 감소하였지만, 그 반대 역할을 하는 Bax 단백질 발현은 증가하였다. 또한 대표적인 세포사멸 표지 단백질인 PARP의 단편화와 caspase-3의 활성이 H₂O₂ 처리로 현저하게 증가하였다(Fig. 4G, H). 그러나 H₂O₂에 의한 Bax/Bcl-2 발현 비율의 증가, PARP의 단편화 및 caspase-3의 활성화가 betulinic acid의 존재 하에서 유의적으로 차단되었다. 이러한 결과는 betulinic acid가 ROS의 소거제로서 H₂O₂에 의한 미토콘드리아 손상을 차단하여 HaCaT 세포를 세포사멸로부터 보호하였기 때문에 나타난 현상이다.

H₂O₂에 의한 ER 스트레스 유도 및 Ca²⁺ 수준 변화에 미치는 betulinic acid의 영향

ER은 세포 내 Ca²⁺ 항상성을 제어하는 데 중요한 역할을 하며, 세포 내 Ca²⁺ 과부하는 세포독성을 유발하고 결과적으로 세포사멸 유도 신호로 작용하는 것으로 알려져 있다(Liu 등, 2022). 이는 세포소기관의 단백질 접힘 용량과 세포소기관에 가해지는 기능적 요구 사이의 불균형으로 정의되는 ER 스트레스로 인해 ER에서 세포질로 Ca²⁺가 방출되면 미토콘드리아 Ca²⁺ 부하가 발생하고, 미토콘드리아 Ca²⁺ 과부하는 MMP의 소실을 유도하기 때문이다(Cnop 등, 2017; Mao 등, 2022). 따라서 H₂O₂가 처리된 HaCaT 세포에서도 이러한 현상이 나타나는지와 betulinic acid가 이를 억제할 수 있는지를 조사하기 위하여, 먼저 다양한 조건에서 배양된 세포들을 대상으로 정상적인 기능을 가진 ER에 선택적으로 염색되는 세포 투과성 염료인 ER-Tracker 시약으로 염색 후 형광 현미경 하에서 염색 강도를 비교하였다. Fig. 5A의 결과에서 알 수 있듯이 정상 배지에서 배양된 세포에서 ER-Tracker의 형광 강도가 세포질 전체에 걸쳐 강하게 발현되었지만, H₂O₂가 처리된 세포에서는 현저하게 낮게 발현되어 ER 스트레스가 유도되었음을 알 수 있었다. H₂O₂ 처리에 의한 ER 스트레스 유도가 세포 내 Ca²⁺ 수준의 증가와 관련이 있는지를 조사하기 위해 Fluo-4 AM 염색에 따른 유세포 분석을 수행한 결과, H₂O₂가 처리된 세포에서 세포 내 Ca²⁺ 수준이 매우 증가하였음을 확인하였다(Fig. 5B, C). 또한 ER 스트레스 유도에 핵심적인 역할을 하는 protein kinase RNA-like ER kinase(PERK)와 eukaryotic translation initiation factor 2(eIF2)의 인산화[phosphor(p)-PERK 및 p-eIF2]와 C/EBP homologous protein(CHOP)의 발현(Cnop 등, 2017; Rozpedek 등, 2016)이 H₂O₂ 처리에 의하여 증가하였다(Fig. 5D). 이는 H₂O₂ 처리에 의한 HaCaT 세포의 세포사멸 유도 과정에 ER 스트레스가 관여한다는 선행 결과와 일치된다(Min 등, 2008).

Fig 5. Inhibition of H₂O₂-induced endoplasmic reticulum (ER) stress and cytosolic Ca²⁺ accumulation by betulinic acid in HaCaT keratinocytes. Cells were cultured in medium with or without 5 μg/mL betulinic acid for 1 h and then treated with 1 mM H₂O₂ for 24 h. (A) Representative images obtained under a fluorescence microscope after staining with ER-Tracker red were presented. (B and C) After collecting the cells, they were reacted with Fluo-4 AM and the cytoplasmic Ca²⁺ levels of each treatment group were analyzed using a flow cytometer to present the frequency of Fluo-4 AM positive cells (^***P<0.001 vs. control group; ^###P<0.001 vs. H₂O₂-treated group). (D) The express-ion of ER stress-regulated proteins was investigated by immunoblotting using total proteins extracted from cells.

그러나 H₂O₂에 의한 모든 변화는 betulinic acid 전처리에 의해 차단되었으며, betulinic acid의 항산화 활성이 산화 스트레스 조건에서 HaCaT 세포 ER의 항상성 유지에 기여하였음을 시사한다. 최근 Spina 등(2022)은 근육세포에서 산화 스트레스에 의해 ER에서 방출된 Ca²⁺이 미토콘드리아로 이동하여 미토콘드리아 과산화물(superoxide) 형성을 촉진하여 세포사멸을 유도하였음을 보고한 바 있다. 또한 Karthikeyan 등(2017)도 마우스 망막 색소 상피 세포에서 H₂O₂에 의한 ER 스트레스로 인한 세포 내 Ca²⁺ 증가가 미토콘드리아로 유입되어 ROS 생성 증가에 관여함으로써 Ca²⁺ 항상성의 붕괴가 세포사멸 유도에 직접 개입한다고 제안한 바 있다. 이러한 결과는 ER의 Ca²⁺유출로 인한 미토콘드리아 Ca²⁺ 증가가 과산화물 음이온(superoxide anion)을 포함한 ROS 생성을 통해 미토콘드리아 기능 장애의 잠재적 원인으로 작용하는 것을 의미한다.

본 연구에서는 betulinic acid가 HaCaT 인체 각질세포에서 H₂O₂에 의한 산화 스트레스에 의한 세포독성을 차단할 수 있음을 제시하였다. 비록 betulinic acid가 미토콘드리아 손상과 연관된 ROS의 생성을 차단하였지만, ROS 생성 억제에 관여하는 핵심 유전자들의 작용에 관한 역할은 추가로 규명되어야 할 것이다. 그리고 H₂O₂에 의한 HaCaT 세포의 자가포식 억제가 ER 스트레스 감소와 연관되었다는 증거도 여전히 부족하다. 특히 ER에서 방출된 Ca²⁺이 세포질과 미토콘드리아 Ca²⁺ 증가로 직접 연계되었는지, 이 과정을 차단하는 betulinic acid의 역할에 대한 구체적인 기전은 아직 확인되지 않았다. 그러나 HaCaT 세포에서 betulinic acid의 항산화 활성은 ER과 미토콘드리아 사이의 Ca²⁺ 플럭스(Ca²⁺ flux)에 영향을 미쳐 궁극적으로 미토콘드리아 매개 세포사멸 경로를 억제할 수 있음은 확실한 것으로 추정된다(Fig. 6). 따라서 본 연구의 결과는 ER 스트레스와 자가포식 사이의 긴밀한 연계와 관련된 분자 패턴 변화에 영향을 미치는 betulinic acid의 효능에 대한 추가 연구를 위한 기초 자료로 활용될 것이다.

Fig 6. Schematic representation of the protective mechanism of betulinic acid against H₂O₂-induced oxidative damage in HaCaT human keratinocytes.

산화 스트레스는 피부를 포함한 다양한 장기에서 만성 질환의 발병과 진행에 큰 영향을 미친다. Triterpene 계열에 속하는 천연물인 betulinic acid는 항산화 활성을 포함하여 광범위한 약리학적 잠재력을 가지고 있지만 각질세포에서 산화적 자극에 의한 세포 손상을 보호할 수 있는 분자적 기전 연구는 거의 이루어지지 않았다. 따라서 이 연구에서는 betulinic acid가 HaCaT 인체 각질세포에서 H₂O₂로 묘사된 산화 스트레스에 의해 유도된 세포 손상으로부터 보호할 수 있는지 평가하는 것을 목표로 하였다. 본 연구의 결과에 의하면 betulinic acid는 H₂O₂가 처리된 세포에서 ROS의 생성을 차단하면서 세포독성을 억제할 수 있음을 보여주었다. Betulinic acid는 또한 H₂O₂에 의한 자가포식을 억제하였으며, 이는 자가포식 핵심 바이오 마크들의 발현 억제와 관련이 있었다. 아울러 betulinic acid는 H₂O₂에 의한 미토콘드리아에서 세포질로의 cytochrome c 유리와 MMP 소실을 감소시켜 미토콘드리아 항상성을 유지시켰다. 그리고 betulinic acid는 H₂O₂로 유도된 Bax/Bcl-2 발현 비율의 증가, caspase-3의 활성 및 PARP의 절단을 억제하여 세포사멸 유도를 감소시켰다. 나아가 betulinic acid는 ER 스트레스 조절 단백질과 세포질 Ca²⁺ 과부하를 억제하여 H₂O₂ 처리에 의한 ER 스트레스를 억제하였다. 이러한 결과는 betulinic acid가 산화 스트레스를 최소화하여 미토콘드리아 손상과 Ca²⁺ 매개 ER 스트레스를 차단함으로써 HaCaT 각질세포를 H₂O₂로 유도된 세포 손상으로부터 보호하였음을 의미한다.

이 연구는 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원(No. 2021R1A2C2009549)을 받아 수행되었습니다.