최근 경제 발전과 함께 건강에 대한 패러다임이 질병의 치료에서 예방과 건강 유지로 변화되고 있다. 특히 코로나19 이후 국민들이 건강에 관한 관심이 높아지면서 건강기능식품 시장 또한 5조 454억 원으로 최근 5년간 20% 상승하였다. 이렇게 소비자의 니즈 증가와 시장 확대로 다양한 기능성 소재가 개발되면서 기능성분에 관한 연구 등이 꾸준히 증가하고 있으며, caffeic acid, ferulic acid, p-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid, vanillic acid, salicylic acid와 gallic acid 등이 포함된 phenolic acids는 tannins, coumarins, benzoquinones, naphthoquinones의 전구체(precursor)로 다양한 기능성분 개발 및 작용 기전 입증 등에 관한 연구가 수행되었다(Giftson 등, 2010; Liao 등, 2012).

우리나라뿐 아니라 세계적으로도 가장 오래된 음료인 차는 약용 또는 식용 목적으로 사용되어 오고 특히 차나무(Camellia sinensis L.)의 찻잎을 사용하여 제조되는 차는 약 5000년 전 중국에서 처음으로 차를 마시기 시작하였고 우리나라 역시 불교문화를 중심으로 신라시대 때부터 이용되고 있는 기호식품으로 다양한 생리활성 기능이 있다고 알려져 중국, 일본, 우리나라 등 아시아를 중심으로 많은 나라에서 널리 음용되고 있다(Jeon과 Park, 1999; Park 등, 2002).

제조 방법에 따라 차의 종류는 발효하지 않은 차(green tea), 반발효차(oolong tea), 발효차(black tea), 그리고 후발효차(dark tea)로 구분된다(Jiang 등, 2011). 후발효차인 보이차(Pu-erh tea)는 차나무의 찻잎을 사용하여 Bacillus, Aspergillus spp. 등 미생물에 의한 발효 과정에 의해 페놀류 성분의 비율과 함량 차이가 크고 이로 인해 향과 맛, 색이 변화되고 동시에 항염증, 항암, 항알레르기 등 다양한 기능성(Choi, 2016; Jung, 2013; Lv 등, 2013)이 발현된다고 알려져 있다. 보이차의 떫은맛을 내며 항산화 물질 등으로 알려진 tannin류의 gallic acid는 항산화, 항염증, 항돌연변이, 항알레르기 등 생리활성이 있다고 알려져 있다. 차류의 쓴맛 원인인 카페인은 120~178°C에서 승화되는 백색 침상의 가벼운 결정으로 뜨거운 물에 잘 녹는다고 알려져 있고 다양한 약리 작용으로 주의력 및 집중력 향상, 피로감 해소, 심혈관계 등 생리활성 관련 연구(Kim 등, 2021)가 많이 보고되고 있다(Jeon 등, 2008).

찻잎에는 건조 중량의 10~30%의 폴리페놀(카테킨, 플라보놀, 플라바논, 페놀산, 글리코사이드와 식물 색소의 아글리콘)(Pan 등, 2003)이 함유되어 있어 물로 추출한 차 추출물은 강력한 산화 방지제로 카테킨, (-)-에피카테킨, (-)-에피갈로카테킨, (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 및 (-)-에피카테킨 갈레이트(Salah 등, 1995)와 gallic acid를 함유하고 있다.

최근 Chung(2020)의 논문에서 보이차 생차로부터 항산화 효능이 있는 kaempferol, kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside, quercetin을 분리하여 대장암 세포주의 증식억제 효과 등을 규명하였으며 기능성 성분의 구조 동정을 통해 항산화 플라보노이드류 이외에 새로이 5종의 phenolic acid류(caffeic acid, gallic acid 등) 분리 후 효능을 평가하였다.

페놀산은 벤젠고리에 부착되거나 연결된 카르복실기 그룹이 있고 이 부착기의 형태에 따라 벤조산 유도체인 hydroxybenzoic acid와 계피산 유도체인 hydroxycinnamic acid로 분류된다(Lafay와 Gil-Izquierdo, 2008; Robbins, 2003). Hydroxybenzoic acids에는 gallic acid, 4-hydroxybenzoic acid, benzoic acid, salicylic acid, vanillic acid, syringic acid, protocatechuic acid, gentisic acid 등이 있으며, hydroxycinnamic acids는 caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, trans-cinnamic acid, 그리고 hydrocaffeic acid 등이 있다(Kang 등, 1996). 본 연구에서 분석하고자 하는 caffein과 gallic acid 또한 유사 구조로 관련된 분석 연구가 다수 수행되었다.

이렇게 다양한 기능성에 관한 연구를 통해 보이차 추출물은 건강기능식품 기능성 원료로 2009년, 2014년에 혈중 콜레스테롤 개선 및 체지방 감소에 도움을 줄 수 있으므로 ｢건강기능식품에 관한 법률｣ 제15조(원료 등의 인정)에 관한 규정에 따라 ｢건강기능식품 기능성 원료 및 기준･규격 인정에 관한 규정｣에서 정하고 있는 기준에 따라 인정된 고시되지 아니한 원료이다.

이에 본 연구에서는 최근 5년간 기능성 원료 중 품목 제조 보고 실적과 유통 판매되는 제품이 많은 원료로 향후 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣에 따라 고시형 원료로 전환 가능성이 높은 보이차 추출물이 함유된 건강기능식품을 선정하고 인정된 보이차 추출물이 함유된 건강기능식품의 성분 분석 시 국내 공인된 시험법이 없는 실정이어서 기준･규격으로 설정된 카페인(80,000 mg/kg 이하)과 기능(지표)성분인 gallic acid(35 mg/g)에 함량 분석법을 마련하고자 하였다. 이와 유사한 분석법으로는 식품의약품안전처의 건강기능식품 공전 시험법 중 녹차 추출물이 함유된 건강기능식품 규격 관리를 위해 마련된 ‘카테킨 및 카페인 동시분석법’이 녹차의 기능성분인 카테킨과 섭취량이 제한되는 카페인 성분의 규격 관리를 위한 동시분석법을 예시로 소개할 수 있다.

지속적으로 판매가 증가하고 있는 기능성 원료 보이차 추출물이 함유된 건강기능식품의 갈릭산과 카페인 성분 또한 동시분석법 마련을 통해 품질 및 규격 관리와 동시 분석으로 분석의 편의성을 높이고 유통 중 제품의 품질 관리의 효율성 향상과 최적의 분석법 확립을 목적으로 수행되었다.

재료 및 시약

표준물질 갈릭산과 카페인, 이동상 용매로 사용된 개미산과 아세토니트릴(HPLC급)은 Sigma 사로부터 구입하여 사용하였다. 시료 전처리와 이동상에 사용되는 물은 3차 증류수(distilled water)로 18.0 MΩ 이상인 것을 사용하였다.

본 실험에 사용한 재료는 시제품의 적용성 검토를 위해 개별인정 기능성 원료 제2009-17호와 제2014-7호로 품목제조 신고된 완제품을 2021년 6월 기준 기능성 원료 보이차 추출물로 국내 온라인에서 유통 및 판매되고 있는 9개 제품을 구입하여 사용하였다.

시험법의 완제품 적용성 검토를 위해 추가적인 당질, 지방질, 단백질을 부원료로 시제품을 제조하여 사용하였다. 본 연구에 사용된 시제품은 보이차 추출물 원료 특성을 고려하여 부형제로 당질과 단백질을 활용하였으며, 제조 가능한 제형은 경질캡슐과 정제형으로 각각 당질과 단백질을 부원료로 정, 경질캡슐로 제조한 총 4건의 시제품을 시험 재료로 사용하였다.

표준용액 조제

갈릭산 표준품과 카페인 표준품 각각 50 mg을 정밀하게 취하여 증류수로 완전히 녹인 후 50 mL 갈색 부피플라스크에 정용한 용액을 표준원액으로 한다. 이 용액에 증류수를 가하여 적정농도(10, 20, 30, 40, 50, 60 μg/mL)로 희석하여 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 액을 표준용액으로 하였다.

시험용액 조제

갈릭산으로 1.8~8.8 mg 함유되도록 시료량을 계산하여 저울을 이용해 정밀하게 취하고 증류수를 적정량 첨가하여 시료를 녹인다. 10분 초음파 추출 후 50 mL 갈색 부피플라스크에 정용한 액을 시험용액으로 한다. 이 용액을 9,981.504×g(12,000 rpm)에서 5분간 원심분리한다. 증류수를 이용해 적절한 농도로 희석하고 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 액을 시험용액으로 하였다.

기기 분석 조건

갈릭산과 카페인의 동식분석을 위해 HPLC는 photo diode array(PDA)가 장착된 Nanospace SI-2(Shiseido Co.)를 사용하였다. 칼럼은 Capcell Pak UG120 C18(Shiseido, 4.6×150 mm, 5 μm)을 사용하였으며, 이동상은 0.1% 개미산 함유 수용액과 0.1% 개미산 함유 아세토니트릴을 사용하여 1.0 mL/min 유속으로 280 nm에서 측정하였다(Table 1).

Table 1

HPLC analytical conditions for gallic acid.

	Conditions
Instrument	Nanospace SI-2 (Shiseido Co.)
Column	Capcell Pak UG120 C18 (Shiseido, 4.6×150 mm, 5 μm)
Column temp.	30°C
Mobile phase	A: 0.1% formic acid in water
	B: 0.1% formic acid in acetonitrile
	Time (min)	A (%)	B (%)
	0	97	3
	3	97	3
	23	75	25
	24	0	100
	34	0	100
	35	97	3
	40	97	3
Flow rate	1.0 mL/min
Detector	Photo diode array
Wavelength	280 nm
Injection vol.	5 μL
Running time	40 min

시험법 밸리데이션

갈릭산과 카페인이 선택적으로 정확하게 측정되는지, 즉 특이성을 확인하기 위해 표준용액과 시험용액에서 나타나는 물질의 분리도, 머무름시간과 스펙트럼 일치 여부를 확인하였다.

직선성은 분석대상물질의 농도에 대해 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력으로 시료에서 성분이 검출되는 농도 범위를 중간값으로 설정하여 총 6개의 농도 10, 20, 30, 40, 50, 60 μg/mL를 검토하였고 표준용액만을 이용하여 산출했으며, 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위해 각 농도에 대해서 3 반복 실험을 수행한 후 성분의 peak 면적과 각 조제 농도 간의 검량선을 작성하여 기울기, y절편(y-intercept) 및 상관계수(correlation coefficient, R²)를 통해 직선성을 확인하였다.

검출한계와 정량한계의 경우 표준용액을 3회 분석한 검량선의 기울기와 y절편값을 이용하여, 검량선 y절편값의 표준편차에 3.3배를 곱한 값을 기울기 평균값으로 나눈 것을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값으로 나눈 것을 정량한계로 설정하였다.

정확도는 갈릭산과 카페인을 함유하지 않은 공시료에 대하여 각각 다른 농도를 Spiking/Recovery 방법으로 회수되는 백분율을 통해 매트릭스 영향을 검토하였다. 표준물질 첨가법에 따라 공시료에 대하여 일정량의 시료를 채취하고, 표준용액을 각각 첨가하였을 때 갈릭산 최종농도의 합이 15, 30, 45 μg/mL가 되도록 설정하여 진행하였다. 시료에 존재하는 참값과 가까운 농도를 시료에 추가하여 회수율을 측정하였다.

정밀도를 확인하기 위하여 반복성(repeatability)과 재현성(reproducibility)을 측정하였다. 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성)를 확인하기 위해 1개의 표본 시료를 선정했으며, 시료 125, 250, 500 mg을 취해 5회 반복 측정하였다. 마지막으로 실험실 간 재현성을 확인하기 위해 3개 실험실에서 표본 시료를 5회 반복 측정하였다.

본 연구의 기능성 원료 보이차 추출물 원료 2건(제2009-17호, 제2014-7호)에서 제시하고 있는 시험법은 추출용매를 증류수 HPLC-UVD를 사용한 시험법으로, 검토 결과 시료량, 시험용액의 부피, 초음파 추출 시간 등 전처리 과정에 대한 방법이 정확하지 않아 최적의 분석 조건을 확립하고자 유사 연구 자료 분석을 통해 각각의 전처리 단계별 상세 조건을 설정하였다.

추출 조건(용매, 초음파 추출 시간, 시료량)

갈릭산은 탄닌을 구성하는 주요 페놀성 물질로 탄나아제로 불리는 ‘ester’ 결합과 ‘depside’ 결합에 작용하는 분해 효소에 의해 차류의 epigallocatechin gallate(EGCG)를 epicatechin(EC)과 epigallocatechin(EGC)으로 전환하고 갈릭산으로 유리되어 생성된다(Hong과 Jung, 2012). 갈릭산은 하이드록시기가 3, 4, 5번 위치에 있는 트리하이드록시 벤조산으로 단일 구조로 자연에 존재하기보다는 ellagic acid의 결합된 형태로 주로 존재하고 있다. 카페인 구조 또한 퓨린의 구조로 피리미딘과 이미다졸로 구성된 헤테로고리 방향족 화합물로 2개의 카르보닐기와 4개의 3차 아민으로 구성된다. 탄소 원자와 질소 원자에 결합된 카르보닐기와 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 불포화 탄화수소인 알켄으로 구성된 작용기인 아미드기가 포함되어 알켄, 아미드, 아민의 작용기를 가지고 있다. 두 성분 모두 극성 즉 수용성 성분으로 쉽게 물과 같은 극성이 높은 용매에 용해도가 높아 앞서 소개한 연구들에서도 물과 메탄올로 추출한 것을 확인할 수 있다(Fig. 1).

Fig 1. Structure of gallic acid and caffeine.

일반적으로 식물에서 페놀계 성분 추출에 사용되는 용매로는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 헥산, 물이 사용되고 물만을 이용한 경우 회수율이 떨어질 수 있어서 주로 에탄올, 메탄올 혼합액을 사용하고 있다. 최근 갈릭산의 최적 추출 조건 연구(Hayat 등, 2023)에서 수용성 에탄올의 농도를 달리한 결과 수율이 높은 조건은 물만으로 추출한 것보다 20% 에탄올이 가장 좋았으며 40%, 60%로 농도를 높일수록 수율이 저하되는 것을 확인하였다.

다양한 연구 자료와 갈릭산과 카페인의 구조적인 특성을 반영해서 본 연구에서는 가장 많이 이용된 추출용매인 물을 선택하고 추출 수율을 높이기 위하여 초음파 처리를 통해 추출 수율을 높이고자 하였다. 최근 식물 추출 방법에 관한 연구(Tabaraki와 Nateghi, 2011)에서는 다양한 추출 방법을 소개하면서 기존 용매 추출의 단점은 추출 시간이 길고 용매 소모량이 많은 점을 문제로 제기하고 특히 초임계 유체 추출의 단점으로 장비 비용이 더 비싸고 시료에 물이 존재하여 시스템이 에러가 발생할 수 있다고 설명하고 있다.

최근 분석 분야에서도 환경 개선에 관심을 보이면서 “녹색 화학” 개념이 발전하면서 환경친화적인 기술이 점점 더 매력적으로 떠오르고 있어 에탄올, 메탄올 용매보다는 물 추출 시 물리적인 처리를 통해 수율을 향상시킬 방법도 소개되고 있다(Chemat 등, 2008). 또한 초음파 조사(20~100 kHz)에서 생리활성 화합물을 추출하는 것은 더 짧은 시간에 높은 재현성을 제공하고 조작을 단순화하며, 용매 소비 및 온도를 줄이고 에너지 입력을 낮출 수 있는 다가오는 추출 기술 중 하나로 소개하고 있다. 이러한 다양한 연구 보고 등을 반영하여 본 연구에서도 더욱 정확한 초음파 추출 조건을 제시하고자 하였다. 이에 추출 시간을 5분, 10분, 20분, 30분, 60분으로 회수율을 확인한 결과 추출 시간 10분에서 갈릭산의 표시량 대비 함량 비율이 가장 높았으며 낮은 상대표준편차가 나타났다. 카페인 분석함량 또한 추출 시간 10분에서 가장 높게 분석되어 초음파 추출 시간으로 10분을 설정하였다(Table 2).

Table 2

Comparison of analysis results by pre-treatment conditions (ultrasonic extract time).

Ultrasonic extract time (min)	Gallic acid content (mg/g)	Content ratio to labeled amount (%) [80∼120%]	Caffeine content (mg/kg) [80,000 mg/kg or less]
5	22.0±0.9	94	37,696±0.8
10	24.7±0.9	106	42,331±0.9
20	23.7±1.4	102	40,642±1.3
30	23.5±2.4	101	40,229±2.1
60	24.3±1.3	104	41,620±1.2

또한 Hayat 등(2023)의 연구에서 용매 대 시료 비율이 증가함에 따라 용매의 추출률을 높이는 결과를 제시하면서 용매 대 시료의 비율을 설정하는 것이 필요 이상의 용매 사용량을 줄일 수 있고 비효율적 용매 추출 조건을 개선할 수 있을 것으로 제안하고 있다. 이러한 연구 자료를 통해 본 연구에서도 용매 대 시료의 비율 최적 조건 설정을 위해 일정 용매에 취하는 시료량 설정을 위해 시험용액 부피 50 mL를 기준으로 시료량 설정을 위해 시료량 0.5 g을 기준으로 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 g으로 하여 시료량 설정을 검토하였다. 건강기능식품의 경우 기능성 원료뿐만 아니라 다양한 원료가 복합된 제품으로도 제조되기 때문에 시료량의 설정 시 지표성분을 기준으로 설정하는 것이 적절하여 검체 중 갈릭산 함량을 최소로 갖는 검체 1과 갈릭산을 최대로 갖는 검체 2를 기준으로 용매 대 시료의 비율 설정 시험을 진행하였고 결과적으로 갈릭산과 카페인 모두 시료 채취량이 증가할수록 분석함량이 감소하는 경향을 보였다. 분석 결과 모두 갈릭산 함량 기준(80~120%) 이내였으며 그중 상대표준편차가 가장 낮은 시료량 0.25 g(갈릭산으로 1.8~8.8 mg)을 시료 채취량으로 설정하였다(Table 3, 4).

Table 3

Comparison of analysis results (low content of gallic acid) by pre-treatment conditions (sample amount).

Sample amount (g)	Gallic acid (mg)	Sample 1
		Gallic acid contents (mg/g)	Content ratio to labeled amount (%) [80∼120%]	Caffeine contents (mg/kg) [80,000 mg/kg or less]
0.125	0.9	7.8±2.5	112.1	28,381±2.1
0.25	1.8	7.7±0.4	110.7	28,330±0.8
0.5	3.5	7.7±1.6	110.3	27,972±1.0
1.0	7.0	7.6±0.8	108.0	27,048±1.6
2.0	14.0	7.3±0.9	104.0	25,480±0.3

Table 4

Comparison of analysis results (high content of gallic acid) by pre-treatment conditions (sample amount).

Sample amount (g)	Gallic acid (mg)	Sample 2
		Gallic acid contents (mg/g)	Content ratio to labeled amount (%) [80∼120%]	Caffeine contents (mg/kg) [80,000 mg/kg or less]
0.125	4.4	37.8±1.0	108.0	64,109±0.9
0.25	8.8	38.4±0.5	109.8	64,544±0.5
0.5	17.5	37.2±1.3	106.3	61,848±1.1
1.0	35.0	36.3±1.4	103.6	59,532±1.5
2.0	70.0	35.2±0.9	100.5	55,858±1.1

기기 분석 조건

갈릭산의 시험법은 HPLC를 통해 분석한 논문들이 다수 보고되고 있다. Luaibi 등(2019)은 녹차와 홍차를 80% 메탄올로 용해한 후 액체크로마토그래피/자외선 흡광광도검출기를 통해 아세토니트릴을 이동상으로 하여 분석하였다. Ma 등(2017)은 보이차를 증류수로 용해한 후 액체크로마토그래피/자외선 흡광광도검출기로 0.05 M 인산과 아세토니트릴 혼합액을 이동상으로 하여 분석하였다. Zhao 등(2017)은 보이차를 증류수로 용해한 후 액체크로마토그래피/자외선흡광광도검출기로 0.1% 인산 수용액과 메탄올을 이동상으로 분석하였고, Huang 등(2016)은 발효차를 증류수로 용해한 후

액체크로마토그래피/자외선흡광광도검출기로 0.1% 초산 수용액과 아세토니트릴을 이동상으로 분석하였다. Zhu 등(2015)은 발효차를 증류수로 용해한 후 액체크로마토그래피/자외선흡광광도검출기를 통해 0.17% 초산 수용액과 아세토니트릴을 이동상으로 분석하였고(Table 5),

Table 5

Analytical method study comparison.

Reference	Sample	Extraction solvent	Analysis conditions
Luaibi et al. (2019)	Black & green tea	80% methanol	Instrument: LC-UVD
			Wavelength: 282 nm
			Mobile phase: 80% acetonitrile
Ma et al. (2017)	Fermentation of Pu-erh tea	Distilled water	Instrument: LC-UVD
			Wave length: 280 nm
			Mobile phase
			A) 0.05 M phosphoric acid:acetonitrile (95:5, v/v)
			B) 0.05 M phosphoric acid:acetonitrile (20:80, v/v)
Zhao et al. (2017)	Fermentation of Pu-erh tea	Distilled water	Instrument: LC-UVD
			Wave length: 280 nm
			Mobile phase
			A) 0.1% acetic acid in water
			B) Methanol
Huang et al. (2016)	Fermentation tea	Distilled water	Instrument: LC-UVD
			Wave length: 278 nm
			Mobile phase
			A) 0.1% acetic acid in water
			B) Acetonitrile
Zhu et al. (2015)	Fermentation tea	75% methanol	Instrument: LC-UVD
			Wave length: 280 nm
			Mobile phase
			A) 0.17% acetic acid in water
			B) Acetonitrile

다양한 차류에서 고성능 액체크로마토그래피와 모세관 전기영동을 사용하여 갈릭산과 카페인을 결정하는 광범위한 연구 또한 보고되었다(Zuo 등, 2002). 추가로 건강기능식품시험법 2-5-2의 카페인 시험법 또한 고성능 액체크로마토그래피를 사용하고 있어 본 연구에서도 보이차 추출물의 갈릭산과 카페인 동시분석법 마련을 위한 분석 기기는 HPLC로 설정하고 두 물질의 분석 파장 역시 기존 연구 논문에서 278~282 nm 파장대를 사용하는 것을 참고하여 280 nm로 설정하였다.

시료 상태와 혼합 물질 등 다양한 매트릭스에 의해 정확한 갈릭산과 카페인 분리 및 검출 조건 설정에 제한이 있어, 기기분석 조건 설정 중 이동상 조건 설정을 우선하였다. 가장 기본이 되는 건강기능식품 공전 카페인 분석법 조건은 0.1% 초산 함유 수용액과 아세토니트릴 용액을 이용한다. Wangkarn 등(2021)의 연구에서는 상온에서 특이성, 분해능 및 분석시간 조절을 위해 인산 또는 아세트산과 혼합된 메탄올 또는 아세토니트릴을 이동상으로 제안하고 있다. 이를 통해 갈릭산과 카페인의 정확한 정량과 완벽한 분리를 위해 이동상에 산이 존재하는 것이 필수라고 결론지었다.

다양한 연구에서 제시하고 있는 조건을 검토하여 피크 분리도가 높은 이동상 조건을 설정하고 시험을 진행한 결과 갈릭산 표준품은 피크가 문제없이 분리되어 분석되나, 다른 기능성 원료 혹은 부원료가 복합되어 제조된 검체의 경우 갈릭산 피크가 갈라지는 문제점이 발견되어 이동상의 유속과 비율 등 조건 변경으로 쉽게 해결되지 않았다(Fig. 2).

Fig 2. HPLC chromatograms of gallic acid and caffeine in (A) standard and (B) sample.

이를 해결하기 위해 Rashid(1985) 연구에서 제시하고 있는 자연 발생 방향족 카르복실 화합물이 물에 용해되었을 때 열 안정성과 관련된 연구를 통해 수용액 상태의 갈릭산은 열에 민감하여 탈카르복실화로 분해가 이루어지고 이로 인해 안정성이 저하될 수 있다는 의견을 반영하여 분석 시 컬럼의 온도 조건을 40°C에서 30°C로 낮추어 조금 더 안정화된 상태에서 시험을 진행한 결과 피크의 갈라짐이 개선되었다. 이는 수용액 상태의 갈릭산의 피크 분리가 열에 의한 불안정한 구조 변화에 의한 것으로 보이며 이를 반영해 낮은 온도 조건에서 분석하는 것이 갈릭산 구조의 안정성을 유지하여 분석 시 정확도를 높일 수 있는 것으로 사료되었다.

시험법 밸리데이션

확립한 전처리법 및 분석 방법에 대한 신뢰성을 확인하고자 ‘시험법 밸리데이션 가이드라인’(MFDS, 2015)을 바탕으로 특이성, 직선성, 검출한계(limit of detection; LOD), 정량한계(limit of quantification; LOQ), 정확성 및 정밀성을 검증하였다.

특이성을 확인하기 위해 표준용액과 시험용액에서 머무름시간 및 분리도를 확인하였다. Fig. 3은 갈릭산과 카페인 각각 표준품과 표준물질을 첨가한 시료를 분석한 크로마토그램이며 동일한 위치에서 단일 피크가 형성되는지 확인하였다. 그 결과 표준용액과 시료에서 지표(기능)성분인 갈릭산 머무름시간 4.9분, 카페인 머무름시간 13.4분으로 일치함을 확인할 수 있었다. 또한 분리된 피크의 정점에서 PDA 스펙트럼은 표준물질과 시료의 패턴이 일치함을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig 3. HPLC chromatograms and spectrums of gallic acid and caffeine in (A) standard chromatograms and spectrum, and (B) sample chromatograms and spectrum.

시료에서 갈릭산이 검출되는 농도 범위를 중간값으로 설정하여 총 6개의 농도 10, 20, 30, 40, 50, 60 μg/mL에 대한 직선성을 검토하였다. 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위해 각 농도에 대해 3 반복 실험을 수행하였다. 실험 결과 검량선 상관계수(R²) 0.999 이상의 높은 직선성을 보였다(Fig. 4). 표준용액을 3회 분석한 검량선을 이용하여 y절편의 표준편차 3.3배로 곱한 값을 기울기의 평균값으로 나눈 값을 검출한계로, 10배 곱한 값에 기울기의 평균값으로 나눈 값을 정량한계로 설정하였다. 그 결과 갈릭산과 카페인의 검출한계는 1.20, 1.05 μg/mL이며, 정량한계는 3.63, 3.18 μg/mL로 나타났다.

Fig 4. Calibration curves of gallic acid (A) and caffeine (B).

갈릭산과 카페인을 함유하지 않은 공시료에 대하여 각각 다른 농도를 Spiking/Recovery 방법으로 회수되는 백분율을 통해 매트릭스 영향을 검토하였다. 표준물질 첨가법에 따라 공시료에 대하여 일정량의 시료를 채취하고 표준용액을 각각 첨가했을 때 갈릭산 최종농도의 합이 15, 30, 45 μg/mL가 되도록 하였다. 그 결과 각각의 농도에서 회수율은 94.5~99.0%로 나타났으며, 상대표준편차는 1.1~1.7%임

을 확인하였다(Table 6). 카페인의 회수율은 100.9~105.9%로 나타났으며, 상대표준편차는 1.1~1.9%로 나타났다(Table 6).

Table 6

Accuracy of analytical method for gallic acid and caffeine (n=5).

Treatment	Gallic acid			Caffeine
	Spiked conc. (μg/mL)			Spiked conc. (μg/mL)
	15	30	45	15	30	45
1	14.0	29.1	44.3	14.9	31.2	47.2
2	14.3	29.7	43.7	15.4	31.8	46.7
3	13.9	29.8	43.7	14.8	31.9	46.6
4	14.5	30.1	43.9	15.5	32.2	46.9
5	14.1	29.7	44.8	15.0	31.8	47.9
Measured mean (μg/mL)	14.2	29.7	44.1	15.1	31.8	47.1
%RSD	1.7	1.2	1.1	1.9	1.2	1.1
Recovery mean (%)	94.5	99.0	97.9	100.9	105.9	104.6

시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성)를 확인하기 위해 1개의 표본 시료를 선정했으며, 각각 시료량으로 125, 250, 500 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 그 결과 갈릭산 함량은 각각 22.7, 24.0, 23.4 mg/g으로 나타났으며, 상대표준편차는 각각 1.8, 1.9, 1.4%임을 확인하였다(Table 7). 카페인 함량은 각각 38,976, 40,843, 39,388 mg/kg으로 나타났으며, 상대표준편차는 각각 1.5, 2.1, 1.5%로 나타났다(Table 7). 실험실 간 정밀도(재현성)를 확인하기 위해 1개의 표본 시료를 선정하여 세 실험실에서 각각 5회 반복 측정했다. 재현성의 상대표준편차를 확인한 결과 갈릭산은 5.0%, 카페인은 0.6%로 나타났다(Table 8).

Table 7

Repeatability of analytical method for gallic acid and caffeine (n=5).

Treatment	Gallic acid (mg/g)			Caffeine (mg/kg)
	Sample contents (mg)			Sample contents (mg)
	125	250	500	125	250	500
1	22.8	24.5	23.2	38,785	41,941	38,939
2	22.3	23.9	23.8	39,563	40,428	39,894
3	22.8	23.4	23.6	39,437	39,789	39,620
4	22.5	24.0	23.0	38,145	40,614	38,624
5	23.3	24.5	23.7	38,949	41,440	39,865
Measured mean	22.7	24.0	23.4	38,976	40,843	39,388
SD	0.4	0.4	0.3	567	851	575
%RSD	1.8	1.9	1.4	1.5	2.1	1.5

Table 8

Reproducibility of analytical method for gallic acid and caffeine (n=5).

Treatment	Gallic acid (mg/g)			Caffeine (mg/kg)
	Laboratory			Laboratory
	A	B	C	A	B	C
1	24.5	25.0	27.0	41,941	41,149	41,120
2	23.9	24.1	26.1	40,428	39,715	39,825
3	23.4	24.9	26.7	39,789	40,962	40,735
4	24.0	24.8	25.8	40,614	40,819	39,280
5	24.5	24.9	27.0	41,440	41,030	41,086
Measured mean	25.1			40,662
SD	1.3			225.4
%RSD	5.0			0.6

건강기능식품의 적용성 검토

확립된 시험법을 이용하여 유통 판매되고 있는 건강기능식품을 수거하고 제품별 지표(기능)성분 함유량에 대해 적용성을 검토하였다. 그 결과 건강기능식품 기능성 원료 보이차 추출물의 기준･규격이 갈릭산 함량은 표시량의 80~120% 범위, 카페인 함량은 80,000 mg/kg 이하로 설정되었다. 총 9건 유통 제품의 갈릭산 및 카페인을 3 반복하여 분석한 결과 갈릭산은 표시함량 대비 99.3~111.7%로 적합하였고, 카페인은 모두 80,000 mg/kg 이하로 검출되었다(Table 9).

Table 9

Results of application of health functional foods in circulation about analytical method.

No.	Function raw materials	Formulation	Sample labeled contents of gallic acid (mg/g)	Gallic acid contents (mg/g) [Content ratio to labeled amount (%)]	Caffein contents (mg/kg)
1	Pu-erh tea extract	Powder	35.0	34.9(99.7)	58,701
2	Pu-erh tea extract	Powder	35.0	35.4(101.2)	59,681
3	Pu-erh tea extract	Powder	23.3	26.1(111.7)	42,323
4	Pu-erh tea extract	Powder	7.0	7.0(99.3)	26,045
5	Pu-erh tea extract	Powder	32.4	34.2(105.6)	61,145
6	Pu-erh tea extract	Tablet	23.3	23.4(100.3)	47,188
7	Pu-erh tea extract	Tablet	25.0	25.9(103.6)	40,822
8	Pu-erh tea extract, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, pantothenic acid	Tablet	21.9	22.8(104.2)	37,986
9	Pu-erh tea extract, oil containing octacosanol, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, pantothenic acid	Tablet	21.9	22.5(102.9)	38,226

추가로 향후 다양한 유형의 건강기능식품이 제조 판매될 수 있는 점을 감안하여 당질, 지방질, 단백질을 부원료로 시제품을 제조하여 갈릭산과 카페인 동시분석법의 적용성 검토를 수행하였다. 원료 특성상 시제품 제조가 가능한 제형은 단백질이 정, 경질 캡슐 2종류였으며 당질은 정, 경질 캡슐 2종류로 각각 정제의 갈릭산 함량은 8.8 mg/g이었으며 경질 캡슐은 17.5 mg/g이었고 모두 카페인 함량은 80,000 mg/kg 이하로 제조되었다. 총 4건 검체의 갈릭산 및 카페인 함량을 3 반복하여 분석한 결과 갈릭산은 표시함량 대비 99.9~105.2%로 적합하였고, 카페인은 모두 80,000 mg/kg 이하로 검출되었다(Table 10).

Table 10

Results of application of health functional foods in prototype about analytical method.

No.	Auxiliary material	Formulation	Gallic acid		Caffeine
			Analytical contents (mg/g)±%RSD	Recovery rate (%)	Analytical contents (mg/kg)±%RSD
1	Protein	Tablet	8.7±0.2	99.9	16,736±0.5
2		Hard capsule	17.9±0.8	102.1	33,484±0.7
3	Sugar	Tablet	8.9±0.9	102.2	16,970±1.0
4		Hard capsule	18.4±0.6	105.2	34,499±0.5

보이차 추출물은 ‘혈중 콜레스테롤 개선 및 체지방 감소에 도움을 줄 수 있음’으로 2009년과 2014년에 기능성 원료로 인정받았으며, 지표성분은 갈릭산이고 카페인이 함유되어 있다. ｢건강기능식품 기능성 원료 및 기준･규격 인정에 관한 규정｣에 따라 인정된 기능성 원료는 인정받은 일로부터 6년이 경과하고, 품목제조신고 50건(생산실적이 있는 경우에 한함) 이상인 경우 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣에 추가로 등재할 수 있다. 이에 따라 보이차 추출물이 추가 등재될 경우를 대비하여 갈릭산 지표성분 시험법을 설정하고, 카페인이 동시 분석되도록 최적화하는 연구를 진행하였다. 갈릭산과 카페인을 증류수로 추출하여 개미산 용액과 개미산 함유 아세토니트릴로 액체크로마토그래피를 통해 280 nm에서 분석하였다. 시험법 밸리데이션 결과, 직선성 정량범위 내 상관계수(R²) 0.999 이상의 유의수준을 보였으며, 갈릭산과 카페인 검출한계는 1.20과 1.50 μg/mL이고 정량한계는 3.63과 3.18 μg/mL로 나타났다. 정확도는 갈릭산과 카페인 회수율 94.5~105.9%로 확인되었다. 반복성은 갈릭산 함량 24.0 mg/g, 표준편차 1.4~1.9%, 카페인 함량 40,843 mg/kg, 표준편차 1.5~2.1%로 확인되었으며 실험실 간 재현성은 상대표준편차 5.0%로 나타났다. 분석 결과는 AOAC 밸리데이션 가이드라인을 통해 적합함을 확인하였으며, 갈릭산 및 카페인 시험법을 최종적으로 확립하였다. 시중 유통되는 갈릭산 추출물 완제품과 지방, 단백질, 탄수화물 등 다양한 매질로 조제된 시제품을 통해 적용성 검토 결과, 갈릭산과 카페인 동시 정량이 가능한 시험법임을 확인하였다.

본 연구는 2021년도 식품의약품안전처 연구개발사업의 연구비지원(21161미래식044)에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.