비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease)은 알코올 섭취 없이 간세포 내 5% 이상의 지질이 침착되는 것을 특징으로 만성 간 질환 중 가장 흔하게 나타나는 질환이다. 이 질환은 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병, 고지혈증 등 대사증후군과 밀접한 관련을 갖는다. 전 세계적으로 과도한 음식물 섭취, 운동 부족 등으로 비만 인구가 증가함과 동시에 비알코올성 지방간 질환의 발생도 증가하고 있으며, 국내에서도 서구화된 식습관으로 인해 꾸준히 증가하는 추세이다(Bellentani, 2017). 간 내 단순히 지방이 침착되는 지방증 상태부터 염증과 풍선변성의 세포손상을 동반하는 비알코올성 지방간염, 더 악화하면 간경변까지 진행되는 비알코올성 지방간 질환은 이 광범위한 병변을 포함한다(Musso 등, 2016; Peng 등, 2018). 질병의 원인으로는 주로 과잉 영양 섭취로 인한 체내 유리지방산이 급격히 증가하여 간 내 중성지방의 생합성이 증가하게 되어 발병한다. 체내 유리지방산의 축적은 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 생성을 유도하며, 이는 비알코올성 지방간 질환의 개시와 진행에 원인으로 작용한다(Chen 등, 2020). 또한, ROS의 축적은 체내 산화스트레스를 유발하여 미토콘드리아 기능장애, 간세포 손상, 지질 항상성 불균형을 초래하여 비알코올성 지방간 질환의 진행을 촉진한다(Zhang 등, 2016). 따라서 산화스트레스를 억제하는 것이 비알코올성 지방간 질환의 치료 표적 중 하나로 제시되며, 다양한 추출물들이 산화스트레스를 억제하여 비알코올성 지방간 치료에 효과가 있다고 보고되어 있다(Musolino 등, 2020; Sangineto 등, 2021; Yang과 Jo, 2018).

간의 중성지방은 지방산으로 분해되어 carnitine palmitoyltransferase 1(CPT-1)을 통해 지방산 산화를 위해 미토콘드리아로 들어간다. 이때 CPT-1은 β-oxidation의 속도를 조절하며, 이러한 과정은 간의 중성지방 수준을 줄여 지방증을 개선한다(Ma 등, 2022). Sterol regulatory element binding protein 1(SREBP-1c)은 지방산 및 중성지방 합성에 관여하는 유전자를 활성화하여 de novo lipogenesis를 우선적으로 조절한다(Li 등, 2011). Adenosine monophosphate-activated protein kinase(AMPK)는 간에서 에너지 저장, 지방산 합성 및 분해, 콜레스테롤 배출을 조절하며, AMPK 활성화는 SREBP-1c 의존성 de novo lipogenesis를 억제하고 CPT-1을 향상시켜 β-oxidation을 촉진하여 지질축적을 억제한다(Mihaylova와 Shaw, 2011). AMPK 조절을 통한 비알코올성 지방간 질환 개선 효과의 연구는 꾸준히 이어지고 있다(Gnoni 등, 2022; Lee 등, 2020).

꿀풀과에 속하는 다년생 초본식물 종으로 Phlomis umbrosa Turcz.의 뿌리는 우리나라에서는 한속단으로 잘 알려져 있다. 이전 연구에 따르면 한속단은 phenolics, iridoids, flavonoids 및 phenylethanoids와 같은 생리활성 화합물을 함유하며(Zhang과 Wang, 2009), 항통각, 항염(Shang 등, 2011), 항알레르기(Shin 등, 2008) 등의 활성이 보고되어 있으나 비알코올성 지방간 질환에 대한 효과는 보고된 바가 없어 이에 관한 연구가 필요한 것으로 사료된다.

본 연구에서는 한속단(P. umbrosa)을 대상으로 비알코올성 지방간 세포모델에서 지질대사 및 항산화 활성에 대한 효과를 조사하였다.

한속단 열수 추출물 제조

실험에 사용한 한속단 뿌리는 경상북도 영주에서 재배된 2020년산을 수확하여 세척, 건조 후 잘게 분쇄하였다. 용매로 20배의 증류수를 가하여 100°C에서 3시간의 환류 추출 후 1시간 동안 냉각하였다. 추출물은 여과지(No 2. Whatman)로 여과한 후 감압농축(EYELA rotary evaporator, Rikakikai Co.)하였고 7일간 동결건조하였다. 이러한 과정을 통해 얻은 한속단 열수 추출물(PUW)은 사용 전까지 -20°C에서 보관하였다.

총 페놀 화합물 함량 측정

PUW의 총 페놀 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu 방법에 따라 실시하였다(Lee 등, 2003). PUW는 1,000 μg/mL가 되도록 증류수에 용해한 시료액을 준비하였다. 시료액 1 mL와 증류수 9 mL를 혼합한 후 Folin-Ciocalteu reagent 1 mL, 7% Na₂CO₃ 10 mL, 증류수 4 mL를 순서대로 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 이후 microplate reader(Biotek Instruments Winooski)를 통해 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. PUW의 총 페놀 함량은 표준시료인 갈산(gallic acid)의 표준곡선에 따라 계산하였으며, 추출물 100 g당 GAE 당량의 mg으로 표시하였다.

플라보노이드 함량 측정

PUW의 플라보노이드 함량은 Zhishen 법을 사용하여 측정하였다(Le 등, 2019). 위의 시료액 1 mL와 증류수 4 mL를 혼합한 후 5% NaNO₂ 0.3 mL, 10% AlCl₃ 0.3 mL, 1 M NaOH 2 mL를 순서대로 분주하였다. 곧바로 증류수 2.4 mL를 첨가한 후 510 nm에서 absorbance를 측정하였다. PUW의 플라보노이드 함량은 표준시료인 카테킨산(catechin acid)의 표준곡선에 따라 계산하였으며, 추출물 100 g당 CE의 mg으로 표시하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성 측정

ABTS stock은 2.45 mM potassium persulfate와 7 mM ABTS를 혼합하여 라디칼을 형성할 수 있도록 차광한 상태로 24시간 동안 반응시켰다. ABTS 측정 용액이 734 nm에서 흡광도가 0.8~1.2가 나오도록 PBS로 희석하였다. 시료액 10 μL와 ABTS 측정용액 390 μL를 넣고 microplate reader를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. PUW의 최종농도는 50 μg/mL이었다. ABTS 라디칼 소거 활성은 다음 식을 통하여 계산되었다.

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 측정용액은 515 nm에서 흡광도가 0.8~1.2가 되도록 조정하였다. 위의 시료액 20 μL와 DPPH 측정용액 380 μL를 혼합한 후 30분간 암실에서 반응시켰다. 이후 microplate reader를 통해 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. PUW의 최종농도는 100 μg/mL였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 다음 식을 통하여 계산되었다.

세포배양 및 지질 축적 유도

인간 간암 세포주인 HepG2 세포는 American Type Culture Collection으로부터 구매하였다. 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin이 포함된 minimum essential medium(MEM)을 사용하여 5% CO₂, 37°C의 일정한 조건에서 배양하였다. 세포 내 지질 축적을 유도하기 위하여 sodium oleate와 palmitate는 2:1의 비율로 1% penicillin/streptomycin, 1% bovine serum albumin을 포함한 MEM으로 용해하여 1 mM free fatty acid(FFA) mixture를 만들었다. HepG2 세포를 24-well culture plate에 2.5×10⁵ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, PUW와 silymarin(SILY)으로 각각 24시간 전처리하였다. 이후 FFA는 PUW 또는 SILY와 함께 또는 단독으로 4~6시간 처리하였다.

세포 생존율 측정

PUW에 대한 세포독성을 확인하기 위해 XTT assay를 수행하였다. XTT 측정 용액은 1,000 μg/mL XTT 용액과 800:1의 100 μM N-methylphenazinium methyl sulfate를 혼합하여 제조하였다. PUW는 용해도를 높이기 위해 dimethyl sulfoxide로 용해하였고, PUW 처리 시 dimethyl sulfoxide의 최종농도는 세포에 영향을 끼치지 않는 0.5% 이하로 조절되었다. HepG2 세포를 24-well culture plate에 2.5×10⁵ cells/well로 배양한 후 PUW를 농도별로 24시간 동안 처리하였다. 배지 제거 후 XTT 측정용액은 세포와 함께 5% CO₂, 37°C 조건에서 2시간 동안 배양되었다. 이후 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 내 중성지방 함량 측정

HepG2 세포를 24-well culture plate에 2.5×10⁵ cells/well로 24시간 배양하였다. PUW 전처리 과정을 거친 후 1 mM FFA로 지질축적을 유도하였다. 세포 내 중성지방 함량은 adipoRed assay kit(Lonza)을 이용하여 측정하였는데, fluorescence를 microplate reader를 사용하여 excitation 485 nm, emission 530 nm에서 측정하였다.

실시간 유전자 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR) 분석

HepG2 세포에서 easy-BLUE^TM total RNA extraction kit(iNtRON Biotechnology)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Nano-drop spectrophotometer(Seolin Tech)를 이용하여 정량하였다. Purity 1.9~2.1의 RNA는 iScript cDNA sythesis kit(Bio-Rad)을 사용하여 cDNA로 합성한 후 iQ SYBR Green supermix를 각각의 primer와 혼합하여 CFX96 Touch real-time PCR detection system(Bio-Rad)을 통해 분석하였다. ACTIN을 기준값으로 사용하였고 각각의 primer sequence는 다음과 같다.

hAMPK: Forward 5′-GGCACCCTCCCATTTGATG-3′/Reverse 5′-ACACCCCCTCGGATCTTCTT-3′

hSREBP-1c: Forward 5′-TGGCTTGGTGATGCTATGTTG-3′/Reverse 5′-CGGAACCATCTTGGCAACA-3′

hCPT-1: Forward 5′-TGTTGGGTATGCTGTTCATG-3′/Reverse 5′-GCGGCCTGGGTAGGAAGA-3′

항산화 효소 활성 측정

HepG2 세포를 항산화 효소 활성 분석을 위해 lysis 하였다. PUW와 1 mM FFA로 처리한 HepG2 세포는 1×RIPA buffer, Halt^TM protease & phosphatase inhibitor cocktail(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 20분 동안 추출하였다. 이후 10,000×g, 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 단백질은 Bradford(1976) 정량법을 통해 정량하였다. Superoxide dismutase(SOD)는 Sun 등(1988)의 방법으로 단백질 추출물 10 μL, 3 mM xanthine 140 μL, 0.2 mM WST-1 20 μL, xanthine oxidase 20 μL를 각각 순서대로 분주하여 microplate reader로 450 nm에서 15분간 kinetic 방법으로 측정한 후 absorbance는 inhibitory를 계산하여 단백질 정량 값으로 나누어 U/mg protein으로 나타내었다. Catalase(CAT)는 Aebi(1984)의 방법으로 추출한 단백질 10 μL에 20 mM H₂O₂ 290 μL를 첨가하고 kinetic 방법을 통해 3분 동안 microplate reader로 absorbance를 측정한 후 U/mg protein을 나타내기 위해 CAT 활성(Unit/mL)을 단백질 정량값으로 나누었다. 또한 glutathione reductase(GR)는 Carlberg와 Mannervik(1985)의 방법을 사용하여 단백질 추출물 20 μL에 assay buffer 20 μL, 2 mM oxidized glutathine 100 μL, 3 mM 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) 50 μL를 순서대로 분주하고, 2.5 mM nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen으로 반응을 개시하여 microplate reader로 10초마다 11회 kinetic 방법을 통해 412 nm에서 absorbance를 측정한 후 GR 활성은 단백질 정량 값으로 나누어 U/mg protein으로 표시하였다.

통계분석

모든 실험 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다. IBM SPSS Statistics 26 software(version 26, SPSS Inc.)를 사용하여 one-way analysis of variance와 Duncan’s multiple range test(P<0.05)에 의해 실험 그룹 간의 유의적인 차이를 표시하였다.

PUW의 페놀성 화합물 함량 및 라디칼 소거 활성

식물계에 널리 존재하는 총 페놀 화합물 및 플라보노이드는 우리 몸에 있는 활성산소를 제거하는 항산화 특성을 갖는다. PUW 소재에 대한 총 페놀 화합물 함량을 측정하였을 때, 667.9±5.1 GAE mg/100 g, 플라보노이드 함량은 431.7±14.4 CE mg/100 g으로 나타났다(Table 1).

Table 1

Levels of polyphenol and flavonoid in Phlomis umbrosa Turcz. water (PUW) extract, and their antioxidant activities.

	TPC1) (GAE mg/100 g)	FC2) (CE mg/100 g)	ABTS3) (%)	DPPH4) (%)
PUW	667.9±5.1	431.7±14.4	63.6±1.6	26.4±1.6

¹⁾TPC: total phenolic content. ²⁾FC: flavonoid content..

³⁾ABTS: ABTS radical scavenging activity. The final concentration of PUW was 50 μg/mL..

⁴⁾DPPH: DPPH radical scavenging activity. The final concentration of PUW was 100 μg/mL..

All values are mean±SD..

한속단 잎의 아세톤 용매 추출물의 총 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량은 각각 4,000±30 mg GAE/100 g, 1,200±16 mg/100 g이었다(Zhang과 Wang, 2009). 부위와 용매에 차이가 있으나, 한속단의 페놀성 화합물 및 플라보노이드는 유기용매 추출물에 더 많이 함유되었음을 추론할 수 있다. 자유라디칼은 짝을 이루지 않은 전자를 가지고 있어 매우 불안정하고 반응성이 높은 분자종이다. 자유라디칼과 항산화 활성 사이의 불균형이 있을 때 산화스트레스가 발생하는데, 이는 체내 대사과정에서 노화, 동맥경화, 암 등의 원인과 관계를 갖는다(Cheeseman과 Slater, 1993). DPPH 소거 활성은 자유라디칼인 DPPH가 항산화 물질에 의해 제거되어 변화되는 색 농도에 따라 활성을 측정한다(Molyneux, 2004). ABTS는 비교적 안정한 자유라디칼로써 DPPH와 함께 소재의 항산화 활성을 측정하는 데 널리 이용된다. PUW의 라디칼 소거 활성 측정 결과는 Table 1에 나타냈다. ABTS 라디칼 소거 활성은 63.6±1.6%였으며, DPPH 라디칼 소거 활성은 26.4±1.6%였다. ABTS는 양이온, DPPH는 음이온 라디칼을 생성하는 특성이 다르기 때문에 기질과 반응물질의 결합 정도가 달라 측정 결과에 차이가 나타날 수 있다(Kwak과 Choi, 2015).

PUW의 세포독성

PUW의 안전한 농도 한계 확인을 위해 세포독성 실험을 실시하였다(Fig. 1). PUW를 대상으로 1,000 μg/mL 이하의 다양한 농도로 HegG2 세포에 배양한 결과, 1,000 μg/mL까지는 시료 무처리군인 CON군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 따라서 PUW가 1,000 μg/mL까지는 HepG2 세포에서 세포독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 한속단의 열수 추출물을 대상으로 HepG2 세포에서 세포독성의 결과를 보고한 사례는 없으나, 세포종이 다른 MCF-7 세포에서는 250 μg/mL의 농도(Bae 등, 2011), mast cell에서는 1,000 μg/mL의 농도(Shin 등, 2008)에서 세포독성이 없다고 보고된 바 있다.

Fig 1. Effect of Phlomis umbrosa Turcz. water extract (PUW) on cell viability in HepG2 cells. Data are presented as the mean±SD. NS indicates no significant difference as determined by the Duncan’s multiple range test (P<0.05).

PUW가 중성지방 생성에 미치는 영향

PUW가 간세포 내 지질 축적에 미치는 영향을 평가하기 위해 중성지방만을 특이적으로 염색하는 AdipoRed assay를 수행하였다(Fig. 2). PUW의 효과 정도를 평가하기 위해서 SILY를 PUW와 동일한 조건에서 양성대조군으로 사용하였다. PUW 세포독성평가를 기반으로 하여 안전한 범위인 750 및 1,000 μg/mL로 전처리된 세포에 1 mM FFA를 단독 또는 PUW와 함께 배양하였다. HepG2 세포 내 중성지방 수준은 FFA 단독처리군에서 CON군 대비 약 137% 증가하였으며, PUW 750 및 1,000 μg/mL 처리군에서 FFA군 대비 세포 내 중성지방 수준이 각각 약 11 및 13% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 PUW는 중성지방 생성 억제 효과가 있음을 알 수 있다. Musso 등(2016)에 의하면 과생성된 FFA는 간세포에 지방축적을 촉진함으로써 비알코올성 지방간 질환에 노출되기 용이하다고 보고하였다. 따라서 PUW의 섭취가 비알코올성 지방간 질환을 억제하는 역할을 할 것으로 기대된다.

Fig 2. Effect of Phlomis umbrosa Turcz. water extract (PUW) on lipid accumulation in HepG2 cells. Data are presented as the mean±SD. Significant differences are indicated by different letters (a-d), as determined by Duncan’s multiple range test (P<0.05). FFA: free fatty acid, SILY: sylimarin.

PUW가 지질대사 관련 mRNA 발현에 미치는 영향

PUW의 간세포 내 지질축적에 대한 억제 효과를 확인한 후, 지질대사와 관련된 인자들의 mRNA 발현 수준의 측정을 통해 PUW의 지질축적 억제 기전을 분석하였다. AMPK의 활성화가 지질축적을 억제한다는 여러 연구 결과가 보고되어 있다(Chen 등, 2018; Jung 등, 2022). PUW가 AMPK의 mRNA 발현에 영향을 미치는지를 확인하기 위해 PUW를 1 mM FFA와 함께 배양한 후 real-time PCR을 실행하였다. Fig. 3에 나타난 바와 같이 FFA 단독 처리군에서 AMPK의 mRNA 발현 수준이 감소하였으나, PUW 처리에 의해 유의성 있게 증가하였다. PUW 처리군의 발현도는 FFA를 처리하지 않은 세포군과 유사하였으며, 간 지방축적 억제 효과가 확인된 SILY 처리군과도 유사하였다. AMPK의 활성화는 지방합성 전사인자인 SREBP-1c의 분열을 억제함으로써 acetyl-CoA carboxylase, fatty acid synthase 및 stearoyl-CoA desaturase 1과 같은 지방합성 유전자들의 활성을 억제시켜 궁극적으로 지방축적이 억제된다(Li 등, 2020; Liang 등, 2022). 또한 AMPK의 활성화는 지방산의 산화를 촉진하는 역할을 하는 CPT-1의 활성을 촉진하여 지방축적을 억제한다(Tahri-Joutey 등, 2021). 본 연구 결과에서도 SREBP-1c의 발현은 FFA군에서 CON군과 비교하여 유의적으로 증가하였으며, AMPK에 의해 활성화되는 β-oxidation 인자인 CPT-1의 발현은 FFA군에서 mRNA 발현이 유의미하게 감소하였다(Fig. 3).

Fig 3. Effect of Phlomis umbrosa Turcz. water extract (PUW) on mRNA expression levels in HepG2 cells. Data are presented as the mean±SD. mRNA expression level is relative of CON. Significant differences are indicated by different letters (a-e), as determined by Duncan’s multiple range test (P<0.05). FFA: free fatty acid, SILY: sylimarin, AMPK: AMP-activated protein kinase, SREBP-1c: sterol regulatory element binding protein-1c, CPT-1: carnitine palmitoyltransferase-1.

이와 같은 결과를 통하여 1 mM FFA만 처리하였을 경우에는 지질 축적이 증가함을 확인할 수 있었다. FFA에 PUW를 함께 처리하였을 때 SREBP-1c는 농도 의존적으로 감소하였으며, CPT-1의 발현은 농도 의존적으로 증가하였다. 특히 CPT-1은 PUW 1,000 μg/mL 농도에서 SILY와 유사한 발현도를 보였다. 이와 같은 결과를 토대로 FFA 처리에 의해 하향 조절되었던 AMPK의 mRNA 발현을 PUW가 활성화함으로써, lipogenesis는 억제되고 β-oxidation은 활성화되어 결과적으로 간에서의 지방축적을 억제시킨다는 기전적 결론에 도달할 수 있다.

PUW가 항산화 효소 활성에 미치는 영향

항산화 효소의 활성화는 과생산된 ROS 수준을 억제하여 산화스트레스를 완화한다(Mylona와 Polidoros, 2010; Ore와 Akinloye, 2019). 인체 내 활성산소를 제거하는 대표적인 항산화 효소 중 하나인 SOD는 세포에 유해한 superoxide를 과산화수소로 전환하는 반응을 촉매한다(Jeong, 2017). 이 과산화수소는 항산화 효소들에 의해 무독한 물로 전환이 되는데, 이때 CAT와 GR이 작용한다. 본 연구에서는 FFA로 유도된 HepG2 세포에서 PUW 처리에 따른 항산화 효소 활성의 변화를 측정하였다. Fig. 4에 나타난 바와 같이 FFA 단독처리군에서는 항산화 효소들인 SOD, CAT 및 GR의 활성이 CON군과 비교하여 급격히 감소하였다. Lee 등(2015)에 의하면 산화스트레스는 간에서의 지방축적을 촉진한다고 보고한 바가 있다. 반면에 PUW를 FFA와 함께 처리하였을 때는 이들 항산화 효소의 활성이 유의적으로 증가하여 CON군 및 양성대조군의 활성과 유사하게 나타남을 확인하였다. 특히 CAT와 GR의 활성은 PUW의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 상승하였다. 이와 같은 결과들은 지방의 과생성으로 항산화 효소들의 활성이 제한됨으로써 인체 내에 산화스트레스 환경이 조성되나, PUW는 FFA로 인해 감소한 항산화 효소 활성을 향상시켜 산화스트레스 완화 효과가 있음을 시사한다.

Fig 4. Effect of Phlomis umbrosa Turcz. water extract (PUW) on antioxidant enzymes in HepG2 cells. Data are presented as the mean±SD. Significant differences are indicated by different letters (a-d), as determined by Duncan’s multiple range test (P<0.05). FFA: free fatty acid, SILY: sylimarin, SOD: superoxide dismutase, CAT: catalase, GR: glutathione reductase.

본 연구에서는 FFA 처리를 통해 PUW의 비알코올성 지방간 보호 효과를 세포모델에서 평가하였다. PUW는 간세포에서 FFA 처리 시 증가한 세포 내 중성지방을 감소시켰다. 또한 PUW가 FFA 처리로 인해 감소하였던 AMPK mRNA 발현 수준을 회복시킴으로써 lipogenesis 인자인 SREBP-1c 발현이 억제되고 β-oxidation 인자인 CPT-1의 발현이 억제되어 간에서의 지방축적을 억제함을 확인하였다. 동시에 FFA 처리로 인해 감소하였던 항산화 활성이 PUW의 처리에 의해 활성이 유의적으로 증가하였다. 이와 같은 결과에 의해 PUW는 AMPK를 활성화함으로써 지방 생성을 억제하고 지방산화를 촉진함과 함께 산화스트레스를 억제함으로써 체내 비알코올성 지방간의 억제 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

이 논문은 2020년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(NRF-2020R1l1A3A04036943).