땅콩(Arachis hypogaea L.)은 콩과(Fabaceae) 작물에 속하는 1년생 식물로 남아메리카가 원산지로 알려져 있으며 열대 및 아열대 지역에 걸쳐 세계적으로 재배되는 작물이다. 2022년 농림축산식품 주요통계 자료에 따르면 우리나라 땅콩 재배면적은 2021년 4,082 ha이며, 생산량은 10,671 ton으로 주로 간식용 풋땅콩 및 볶음 땅콩으로 소비되는 견과류 중 하나이다. 땅콩은 종실 중 지방 함량이 36~54%, 단백질은 16~36%로 많아 식용기름, 버터, 시럽, 사탕, 소스 등 다양한 가공식품으로 그 활용도가 높다(Knauft와 Ozias-Akins, 1995; Saavedra-Delgado, 1989; Woodroof, 1983). 또한 각종 비타민, 미네랄, 식이섬유, 플라보노이드, phytosterol, tocopherol 등 다양한 기능성 성분들이 함유되어 있다(Francisco와 Resurreccion, 2008; Limmongkon 등, 2017). 특히 땅콩기름의 높은 불포화 지방산은 혈중 저밀도 지질 단백질 콜레스테롤 함량을 낮추고 섭취 시 심혈관질환 위험을 15% 낮추어 준다고 보고되며(Feldman, 1999; Sabaté 등, 2010), arachidin-1과 같은 stilbenoid 성분들은 인체 백혈병 세포에 항암 활성이 있는 것으로 보고되었다(Huang 등, 2010). 이처럼 다양한 생리활성을 가진 땅콩은 다양한 가공식품 제조 공정에서 땅콩 속껍질이 분리되고 대부분 버려지거나 가축 사료로 이용되고 있다. 땅콩 속껍질에는 caffeic acid, ferulic acid 및 coumaric acid와 같은 페놀산 성분과 (epi)catechin, epigallocatechin, catechin gallate 등과 같은 flavan-3-ols 화합물 및 flavan-3-ols의 폴리머 형태인 proanthocyanidin(PAC) 화합물들이 함유된 것으로 보고되고 있다(Ma 등, 2014; Yu 등, 2005, 2006). 특히 땅콩 속껍질에 함유된 PAC 계열의 화합물들이 항산화(Dong 등, 2013), 항염증, 멜라닌 생성 억제(Tatsuno 등, 2012), 전립선암 세포 억제 효능(Chen 등, 2018) 및 α-glucosidase 억제 활성(Ha 등, 2020) 등이 있다고 보고되면서 새로운 산업소재로 활용 가능성이 커고 있다. 또한 땅콩 속껍질은 예로부터 중국에서 만성 출혈과 기관지염을 치료하는 재료로 사용되어 왔다(Lou 등, 1999).

농촌진흥청에서는 수량성과 품질이 우수한 땅콩 품종을 농가에 보급해 수량(540 kg/10 a)이 높은 신팔광(Pae 등, 2016a), 안토시아닌 성분을 지닌 검은색 땅콩 흑생(Pae 등, 2017a), 단일 불포화지방산인 올레산 함량이 기존 56%에서 83%까지 높인 케이올(Pae 등, 2016b) 등 60여 땅콩 품종을 개발하였다. 또한 육성된 땅콩 품종 추출물에 대한 항산화, tyrosinase, xanthin oxidase 저해 활성 등에 관한 연구가 수행되었다(Kim 등, 2019). 개발된 땅콩 품종들은 다양한 속껍질 색깔을 고유특성으로 가지고 있어 기능성 물질의 조성 및 생리활성 정도가 다를 것으로 생각되나 이들에 관한 연구는 미흡한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 3종류의 다른 종피 색깔을 지닌 흑생(검정), 세원(적색), 다안(담갈색) 품종의 속껍질 추출물의 항산화 활성 비교와 함께 추출물에 존재하는 폴리페놀 성분을 UPLC-orbitrap mass spectrometer로 분석하여 속껍질 색깔에 따른 기능성 성분 조성과 함께 식품 영양학적 기초 자료를 제공하고자 한다.

실험재료 및 추출물 제조

본 연구에 사용된 땅콩은 농촌진흥청 국립식량과학원에서 육성한 검은색 땅콩 흑생(Pae 등, 2017a), 적색 속껍질을 가진 세원(Pae 등, 2020), 담갈색 종피색을 가진 다안(Pae 등, 2017b) 품종을 사용하였으며, 국립식량과학원 남부작물부에서 기본식물로 생산된 것을 실험재료로 사용하였다. 수확된 종자는 수분이 5~7%가 될 정도로 건조한 뒤 탈각하여 4°C에 보관하였다. 보관된 종자의 땅콩 속껍질은 수작업으로 분리하고 Tube Mill(IKA^®)로 분쇄하여 추출 시료로 사용하였다. 분쇄한 땅콩 속껍질 2 g을 80% 에탄올 500 mL 첨가하여 Digital orbital shaker(Daihan)를 이용하여 상온에서 250 rpm으로 24시간 추출하였다. 땅콩 속껍질 추출물은 rotary evaporator(EYELA N-1001S, Tokyo Rikakikai Co., Ltd.)를 이용해 농축하고 동결건조장치(EYELA FDU-2100, Tokyo Rikakikai Co., Ltd.)로 건조하였다. 건조된 추출물 분말은 각종 활성 실험을 위한 시료로 이용하였다.

시약 및 기기

본 실험에 사용된 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS), catechin, 2,2-diphenyl-1-pycrylhydrazyl(DPPH), 에탄올, formic acid, AlCl₃･6H₂O, NaNO₂, NaOH, Na₂CO₃, K₂S₂O₈, gallic acid, trolox 및 Folin-Ciocalteu phenol 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다. 분석용 메탄올 및 물은 J. T. Baker에서 구매하였다. UV-Vis spectrophotometer는 Molecular Device에서 구입한 Spectra Max M2e를 사용하였으며, UPLC-Orbitrap-MS 분석은 Q-Exactive Focus Hybrid quadrupole-orbitrap mass(Thermo Fisher Scientific)가 결합된 UPLC(Ultimate 3000, Thermo Scientific)를 이용하여 분석하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량 측정은 Celli 등(2011)의 방법에 Folin-Ciocalteu 시약이 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색되는 정도를 측정하였다. 즉, 3종류의 땅콩 속껍질 추출물이 10 mg/mL 농도가 되게 80% 에탄올에 녹인 후 각 추출물 100 μL에 2% Na₂CO₃ 용액 2 mL를 첨가한 후 3분간 방치한다. 이후 50% Folin-Ciocalteu 시약 100 μL를 가하고 실온에서 30분간 방치 후 반응 용액의 흡광도를 750 nm에서 측정하였다. 표준물질은 gallic acid를 500, 250, 100, 50, 20, 10 mg/L로 희석하여 검량선을 구하고 총 폴리페놀 함량은 시료 1 g 중에 mg gallic acid equivalents(GAE) 함량으로 계산하였다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 Celli 등(2011)의 방법을 변형하여 분석하였다. 즉, 3종류의 땅콩 속껍질 추출물이 10 mg/mL 농도가 되게 80% 에탄올에 녹인 후 각 추출물 250 μL에 증류수 1 mL와 5% NaNO₂ 75 μL를 가한 다음 5분간 방치하고 10% AlCl₃･6H₂O 150 μL를 첨가하여 6분간 반응시킨다. 이후 1 M NaOH 500 μL를 첨가하여 11분간 방치 후 반응액을 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 (+)catechin을 500, 250, 100, 50, 20, 10 mg/L로 희석하여 검량선을 구하고 총 플라보노이드 함량은 시료 1 g 중에 mg catechin equivalents(CAE) 함량으로 계산하였다.

라디칼 소거 항산화 활성 측정

땅콩 속껍질 추출물에 대한 항산화 활성은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능으로 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능 측정은 먼저 10 mg/mL 농도의 땅콩 속껍질 추출물 200 μL에 0.2 mM DPPH 용액 800 μL를 가하여 실온에서 60분간 방치한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능 측정은 Lee 등(2013)의 방법을 변형하여 분석하였다. 즉 7.0 mM 농도가 되도록 ABTS를 용해하고 여기에 K₂S₂O₈의 최종 농도가 2.5 mM이 되도록 첨가하여 하루 동안 암소에서 방치시켜 ABTS 양이온을 형성시킨다. 이후 이용액을 735 nm 흡광도 값이 1.0이 되도록 몰 흡광계수(ε=3.6×10⁴ M^-1cm^-1)를 이용하여 증류수로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 1 mL에 땅콩 속껍질 10 mg/mL 농도의 추출액 50 μL를 첨가하여 30분 후에 735 nm 흡광도 변화를 측정하였다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 평가를 위한 표준물질은 trolox를 200, 160, 140, 120, 100, 50 mg/L로 희석하여 검량선을 구하고 라디칼 소거능은 시료 1 g 중에 mg Trolox equivalent(TE) 함량으로 계산하였다.

UPLC-Orbitrap MS 분석

각기 다른 색깔을 지닌 땅콩 속껍질 추출물에 함유된 기능성 성분 분석은 Q-Exactive Focus Hybrid quadrupole-orbitrap mass가 결합된 UPLC Ultimate 3000을 이용하여 분석하였다. UPLC는 degasser, binary pump, diode-array detector 및 auto-sampler로 구성된 것을 사용하였다. 시료는 80% 에탄올에 녹인 후 0.2 μm syringe 필터를 하였다. 분리 분석에 사용한 칼럼은 Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters), 용매는 물(0.1% formic acid, 용매 A)과 메탄올(0.1% formic acid, 용매 B)을 이용한 기울기 용매 조건(0 min, 2% B; 2 min, 2% B; 25 min, 18% B; 35 min, 28% B; 50 min, 35% B; 55 min, 35% B; post run, 5 min), 유속은 0.3 mL/min으로 하여 설정하였다. Orbitrap MS는 m/z 150~1,000 사이 양이온 스캔 모드, sheath gas flow rate는 50 arbitrary units(AU), auxiliary gas flow rate는 15 AU, spray voltage 2.5 kV, capillary 온도 270°C, S-lens RF level 50, aux 가스히터 온도 400°C로 설정하였으며 auto MS² 분석은 분해능 17,500과 isolation window 3.0 m/z로 설정하여 분석하였다.

통계분석

본 연구의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 등은 3회 반복 실험하여 평균±표준편차로 표기하였으며, SAS ver. 9.4(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc.) 프로그램을 이용하여 일원 분산분석(ANOVA) 및 Tukey의 다중범위 검정으로 P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.

총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량

각기 다른 색깔을 지닌 땅콩 3품종 속껍질 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 Table 1과 같다. 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 범위는 59.8~198.0 mg GAE/g 및 30.5~118.1 mg CAE/g 범위였다. 땅콩 속껍질 색깔에 따른 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 품종은 담갈색 속껍질을 가진 다안으로 198.0 mg GAE/g이며, 다음으로는 검은색 속껍질을 가진 흑생(121.7 mg GAE/g)이었다. 적색 속껍질을 가진 세원은 59.8 mg GAE/g으로 가장 적은 총 폴리페놀 함량을 보였고 다안 품종보다 3배 이상 적은 함량을 보였다. 총 플라보노이드 함량도 비슷한 결과를 나타내었으며 다안 품종이 가장 높은 함량인 118.1 mg CAE/g을 보였고 다음으로는 흑생 48.3 mg CAE/g 및 세원 30.5 mg CAE/g 순으로 나타났다. 따라서 땅콩 속껍질 색깔에 따른 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량의 차이가 있음을 알 수 있고, 담갈색 속껍질을 가진 것이 검정 및 적색 속껍질에 비해 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 많아 항산화 활성도 우수할 것으로 판단된다. 또한 각기 다른 속껍질의 색깔은 생합성 경로 중에 발현되는 이차 대사산물 조성도 차이가 있어 성분 조성에 관한 연구도 필요하다고 사료된다.

Table 1 . Total polyphenol and total flavonoid contents of three different peanut skin colored cultivars.

Cultivar	Skin color	Total polyphenol (mg GAE/g)	Total flavonoid (mg CAE/g)
Heuksaeng	Black	121.7±1.9b	48.3±1.3b
Sewon	Dark red	59.8±1.6c	30.5±2.3c
Daan	Light brown	198.0±2.7a	118.1±1.4a

GAE, gallic acid equivalent; CAE, catechin equivalent..

Data were the mean±SD of triplicate experiment..

Values with the different superscript (a-c) within the same column are significantly different at P<0.05..

항산화 활성

땅콩 3품종의 속껍질 추출물에 대한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 땅콩 속껍질 색깔에 따른 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능은 통계적으로 유의한 차이를 보였다. DPPH 라디칼 소거능은 다안 땅콩 속껍질 추출물이 176.1 mg TE/g으로 가장 높으며, 다음으로 흑생 땅콩 속껍질 추출물이 123.2 mg TE/g, 가장 낮은 소거능은 세원 품종으로 69.2 mg TE/g이었다. 또한 ABTS 라디칼 소거능도 담갈색 속껍질을 가진 다안 품종이 161.9 mg TE/g으로 가장 높고 다음으로 검은색 종피인 흑생 품종이 146.3 mg TE/g, 마지막으로 적색 속껍질을 가진 세원 품종이 94.5 mg TE/g으로 가장 낮은 소거능을 보였다. 이러한 속껍질 색깔 추출물별 항산화 활성 결과는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량 변화와 동일한 결과를 보였다. 따라서 땅콩 속껍질 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 간의 상관관계를 분석한 결과는 Table 3과 같이 고도의 유의적 상관관계를 보였다. 총 폴리페놀 함량은 플라보노이드(r=0.963), DPPH(r=0.997), ABTS(r=0.934)와 높은 양의 상관관계를 나타내었으며, 총 플라보노이드 함량도 DPPH(r=0.944), ABTS(r=0.807)와 높은 양의 상관을 보였다. 또한 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 간에도 높은 상관(r=0.956)을 나타내었다. 이러한 결과는 Jo 등(2021)의 연구에서 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증가함에 따라 항산화 활성이 유의적으로 증가하는 결과와 일치하였다.

Table 2 . DPPH and ABTS radical scavenging activity of three different peanut skin colored cultivars (mg TE/g).

Cultivar	Skin color	DPPH radical scavenging	ABTS radical scavenging
Heuksaeng	Black	123.2±1.2b	146.3±1.2b
Sewon	Dark red	69.2±1.2c	94.5±2.0c
Daan	Light brown	176.1±5.7a	161.9±1.6a

TE, Trolox equivalent..

Data were the mean±SD of triplicate experiment..

Values with the different superscript (a-c) within the same column are significantly different at P<0.05..

Table 3 . Correlation coefficients among total polyphenol (TPC), flavonoid content (TFC), DPPH and ABTS radical scavenging activity of peanut skin extract.

Factor	TPC	TFC	DPPH	ABTS
TPC	1	0.963***	0.997***	0.934***
TFC		1	0.944***	0.807**
DPPH			1	0.956***
ABTS				1

Significant at **P<0.01 and ***P<0.001..

UPLC-Orbitrap-MS/MS 분석

땅콩 속껍질 색깔 차이에 따른 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성 차이를 보임에 따라 이들 추출물에 대한 성분 조성을 비교하고자 하였다. 추출물 성분 분석은 초고성능 액체크로마토그래피(UPLC)를 이용해 분리된 성분을 quadrupole-orbitrap mass를 통해 분석하였다. 검은색(흑생), 담갈색(다안) 및 적색(세원) 속껍질 추출물의 총 이온크로마토그래피(TIC)는 Fig. 1과 같았다. 모두 47개 페놀성 화합물이 확인되었으며 각 속껍질 색깔 차이에 따른 성분 조성도 차이가 있음을 알 수 있었다. Fig. 1의 TIC에서 특정 성분이 분리되어 나오는 시간(retention time, tR)별 MS 및 MS²에 의한 양이온 모드에서 이온화 패턴으로 예상되는 화합물은 Table 4에 제시하였다. 흑생 및 다안 땅콩 속 껍질에서 높은 TIC를 보이는 tR 13.90분 및 21.93분의 m/z 291.09 [M+H] peak는 전형적인 catechin 및 epicatechin으로 확인되었다. 반면 세원 땅콩 속껍질 추출물에서는 catechin 및 epicatechin 함량이 낮음을 알 수 있다.

Table 4 . Tentative identification of phenolic compounds in peanut skin crude extracts by UPLC-Orbitrap MS.

peak no.	tR(min)a	UV λmax (nm)	[M+H]+ (m/z)	MS/MS (m/z)b	tentative identificationc
1	9.2	278	205.1	91.05, 118.07, 132.08, 146.06	unknown
2	11.41	278	579.15	127.04, 139.04, 163.04, 247.06, 287.05, 409.09	PAC B-type dimer [(E)C→B→(E)C]
3	13.9	278	291.09	123.04, 139.04, 147.04, 161.06	catechin
4	14.97	278	579.15	127.04, 139.04, 163.04, 247.06, 287.05, 409.09	PAC B-type dimer [(E)C→B→(E)C]
5	16.11	278	434.17	85.03, 103.04, 127.04, 145.05	unknown
6	16.67	278	865.2	127.04, 247.06, 287.05, 425.08, 561.10, 713.15	PAC A-type trimer [(E)C→B→(E)C→A→(E)C]
7	17.79	278	721.16	127.04, 163.04, 247.06, 287.05	luteolin derivative
8	19.09	278	575.12	123.04, 285.04, 395.08, 423.07	PAC dimer [(E)C(C4)→luteolin or kaempferol(C8) or (C6)]
9	19.67	278	865.2	287.05, 301.07, 411.11, 533.11, 695.14, 713.15	PAC A-type trimer [(E)C→A→(E)C→B→(E)C]
10	21.44	278	865.2	287.05, 301.07, 425.08, 533.11, 695.14, 713.15	PAC A-type trimer [(E)C→A→(E)C→B→(E)C]
11	21.93	278	291.09	123.04, 139.04, 147.04, 161.06	epicatechin
12	22.42	278	864.19	127.04, 163.04, 247.06, 287.05, 425.09, 533.11, 697.15	PAC A-type trimer [(E)C→A→(E)C→A→(E)C]
13	22.91	518, 278	611.16	287.05	cyanidin-3-sophoroside
14	23.07	278	864.69	287.05, 413.09, 533.11, 659.14	PAC A-type trimer [(E)C→A→(E)C→A→(E)C]
15	24.17	278	579.15	123.04, 127.04, 163.04, 271.06, 287.05, 409.09	PAC B-type dimer [(E)C→B→(E)C]
16	24.54	278	577.13	123.04, 287.05, 299.05, 425.09	PAC A-type dimer [(E)C→A→(E)C]
17	24.75	278	865.2	127.04, 287.05, 425.09, 543.09, 577.13	PAC A-type trimer [(E)C→B→(E)C→A→(E)C]
18	25	518, 282	581.15	287.05, 454.34	cyanidin-3-sambubioside
19	25.64	278	864.19	127.04, 163.04, 247.06, 287.05, 425.09, 533.11, 697.15	PAC A-type trimer [(E)C→A→(E)C→A→(E)C]
20	25.97	278	865.2	287.05, 411.11, 453.12, 533.11, 695.14, 713.15	PAC A-type trimer [(E)C→A→(E)C→B→(E)C]
21	26.45	278	865.2	127.04, 247.06, 289.07, 425.09, 451.10, 577.13, 713.15	PAC A-type trimer [(E)C→B→(E)C→A→(E)C]
22	27.04	278	864.19	127.04, 247.06, 287.05, 425.09, 533.11, 575.12, 513.15	PAC A-type trimer [(E)C→A→(E)C→A→(E)C]
23	27.8	278	864.19	247.06, 287.05, 425.09, 561.10, 713.15	PAC A-type trimer [(E)C→A→(E)C→A→(E)C]
24	29.41	278	575.12	123.04, 285.04, 395.08, 423.07	PAC dimer [(E)C(C4)→luteolin or kaempferol(C8) or (C6)]
25	30.55	266, 354	641.13	159.03, 303.05, 479.08	quercetin-3-(feruloyl)glucoside
26	31.17	266, 354	627.15	145.05, 303.05	quercetin-3-sophoroside
27	31.37	266, 350	759.2	145.05, 303.05, 465.10	quercetin-3-sambubioside-7-glucoside
28	31.7	278	577.13	123.04, 275.05, 425.09	PCA A-type dimer [(E)C→A→(E)C]
29	32.93	278	865.2	127.04, 287.05, 425.09, 577.13	PAC A-type trimer [(E)C→B→(E)C→A→(E)C]
30	33.05	266, 354	611.12	159.03, 303.05, 394.30	quercetin derivative
31	33.54	278, 354	597.14	145.05, 303.05, 425.44,	quercetin-3-sambubioside
32	33.87	278	579.15	123.04, 127.04, 139.04, 163.04, 278.05, 409.09	PCA B-type dimer [(E)C→B→(E)C]
33	33.95	278	577.13	123.04, 247.06, 287.05, 299.05, 407.07	PCA A-type dimer [(E)C→A→(E)C]
34	34.11	278, 362	465.1	303.05	quercetin-3-galactoside
35	35.38	278, 350	787.23	129.05, 317.06, 479.12, 698.78	isorhamnetin-3-glucoside-5-rutinoside
36	36.08	278	641.17	317.06	isorhamnetin-diglucoside
37	36.37	350	479.08	303.05	quercetin-glucuronide
38	36.94	278, 350	465.1	303.05	quercetin-3-glucoside
39	37.55	266, 350	611.16	303.05	quercetin-3-rutinoside
40	38.08	278, 350	757.22	129.05, 317.06, 479.12	isorhamnetin glucoside derivative
41	42.61	274	409.09	245.04, 257.04, 287.05	unknown
42	43.72	354	479.12	303.05	quercetin-3-glucuronide
43	44.67	266	625.17	317.06	isorhamnetin-3-rutinoside
44	48.27	354	565.12	127.04, 317.06, 475.36	isorhamnetin-3-(malonoyl)glucoside
45	49.45	270	301.07	258.05, 286.05	homoeriodictyol
46	50.96	278	285.07	242.06, 270.05	isosakuranetin
47	52.52	270	287.05	153.02, 287.05	kaempferol

^aA represents retention time(t_R) of the total ion chromatograms..

^bThe most abundant ions observed in mass spectra are indicated in underline..

^cA represents an A-type bond with both (C4→C8) and (C2→O→C7) likages or (C4→C6) and (C2→O→C7) linkages; B represents a B-type bond which can be (C4→C8) or (C4→C6) linkaged; (E)C represents (epi)catechin..

Fig 1. UPLC-Orbitrap ESI/MS total ion chromatograms (TIC) of three different peanut skin colored varieties Heukseang (top), Daan (middle), and Sewon (bottom).

서로 다른 색깔을 가진 3품종의 땅콩 속껍질의 TIC로부터 MS 및 MS² fragmentation ion peak를 분석한 결과 총 21종류의 PAC 계열의 화합물이 있음을 확인하였다. PAC 화합물들은 catechin 또는 입체이성체(stereoisomer)인 epicatechin unit이 dimers 또는 polymers 형태로 결합된 화합물로 flavan 구조의 2번과 3번 위치의 입체이성체로 인해 dimers 또는 polymers 형태의 결합 시 분자량이 동일한 다양한 화합물이 존재한다. PAC A-type은 flavan-3-ol unit 구조의 C4―C8번 결합과 C2―O―C7번과 이중으로 결합된 구조 또는 C4―C6번 결합과 C2―O―C7번과 이중으로 결합된 구조를 가지는 화합물을 말한다. 반면 B-type은 flavan-3-ol unit 구조의 C4―C8번 또는 C4―C6번과 단일 결합된 구조를 갖고 있는 dimer 또는 polymer를 말한다. 먼저 m/z 579.15 [M+H] peak의 MS² fragmentation ion 중 m/z 409.09 [M-170(C₈H₈O₄)]는 Fig. 2에 제시된 것과 같이 heterocyclic ring fission(HRF)에 의해 생성된 것이며 m/z 287.05는 quinone methide fission(QM)에 의해 생성된 단편 조각임으로 볼 때, PAC B-type의 dimers[(epi)catechin→B→(epi)catechin] 화합물임을 알 수 있다. 이러한 PAC B-type dimer 화합물은 tR 11.41, 14.97, 24.17 및 33.87분에도 동일하게 확인되었다. 그리고 m/z 577.13 [M+H] peak의 MS² fragmentation ion 중 m/z 425.09 [M-152 (C₈H₈O₃)]는 Fig. 2에 제시된 것과 같이 retro-Diels-Alder fission(RDA)에 의해 생성된 것이며 m/z 287.05는 QM에 의해 생성된 단편 조각임으로 볼 때 PAC A-type의 dimers[(epi)catechin→B→(epi)catechin] 화합물임을 알 수 있다. 이러한 PAC A-type dimer 화합물은 tR 24.54, 31.70 및 33.95분에도 동일하게 확인되었다. TIC 크로마토그램에서 m/z 864.19 [M+H] peak의 MS² fragmentation ion 중 m/z 425.09는 RDA 분열에 의해 생성된 fragmentation 이온이며, m/z 287.05 peak는 QM 분열에 의해 생성된 이온 peak를 보임에 따라 PAC A-type의 trimer[(epi)catechin→A→(epi)catechin→A→(epi)catechin] 화합물임을 알 수 있다. 이러한 PAC A-type trimer 화합물은 tR 22.42, 23.07, 25.64, 27.04 및 27.80분에서 보였다. PAC 계열의 trimer 중 A-type형과 B-type형이 결합된 [(epi)catechin→A→(epi)catechin→B→(epi)catechin] 화합물의 경우 m/z 865.20 [M+H]의 분자이온 peak와 함께 MS² fragmentation에서 RDA 분열에 의한 m/z 713.15 [M-152.1(C₈H₈O₃)] 이온 peak, QM 분열에 의해 생성된 이온 peak인 m/z 287.05 및 HRF 분열에 의해 생성된 m/z 425.09 이온 peak가 확인되었다. 이러한 PAC A-type trimer 화합물은 tR 16.67, 19.67, 21.44, 24.75, 25.97, 26.45 및 32.93분에서 보였다.

Fig 2. UPLC-Orbitrap MS² fragmentation schemes of PAC B-type dimer [A: (epi)catechin→B→(epi)catechin], PAC A-type dimer [B: (epi)catechin→A→(epi)catechin], PAC A-type trimer [C: (epi)catechin→A→(epi)catechin→A→(epi)catechin] and PAC A-type trimer [D: (epi)catechin→A→(epi)catechin→B→(epi)catechin] in peanut skin.

검은색 속껍질을 가진 흑생 품종에서 tR 22.91 및 25.00분에 나타난 peak의 UPLC diode-array detector를 이용해 측정된 UV λmax 값 518 nm와 MS²의 m/z 287.05 이온 peak는 안토시아닌 계열 중 cyanidin 화합물임을 알 수 있었고, Fig. 3에 제시된 각각의 MS² fragmentation 패턴을 통해 cyanidin-3-sophoroside 및 cyanidin-3-sambubioside 화합물로 확인되었다. 이러한 검정 땅콩 속껍질의 안토시아닌 성분은 Huang 등(2019)의 연구와 일치하였다. 그리고 흑생 품종 속껍질에서는 TIC 크로마토그램 tR 30.55 및 31.17분에 나타나는 [M+H] m/z 641.13 및 627.15의 MS² fragmentation의 daughter 이온 peak인 m/z 303.05는 quercetin 구조에 의해 기인함을 알 수 있었으며, precursor 이온의 분자량과는 각각 m/z 338 및 324 차이를 보이므로 quercetin-3-(feruloyl)glucoside 및 quercetin-3-sophoroside 화합물임을 알 수 있었다. 적색 속껍질 색을 가진 세원 땅콩의 경우 다른 땅콩에 비해 TIC 크로마토그램의 catechin 및 PAC 계열 화합물 peak가 낮음을 Fig. 1에서 볼 수 있으며, tR 31.37 및 43.72분에 나타나는 [M+H] m/z 759.20 및 479.12의 MS² fragmentation의 daughter 이온 peak인 m/z 303.05는 quercetin 구조에 의해 기인함을 알 수 있다. 이 중 tR 31.37분의 MS² m/z 303.05 및 465.10의 daughter 이온 peak로부터 본 화합물은 quercetin-3-sambubioside-7-glucoside 화합물임을 확인할 수 있었고, tR 43.72분의 MS² m/z 303.05의 daughter 이온 peak로부터 본 화합물은 quercetin-3-glucuronide 화합물임을 확인할 수 있었다. 이러한 플라보노이드 성분은 Ma 등(2014) 및 Zhao 등(2017)의 연구에서와 일치하였다. 또한, 세원 품종에는 다른 품종에서보다 TIC에서 높은 peak를 보이는 tR 44.67 및 48.27분에 나타나 성분은 MS² m/z 317.06의 daughter 이온 peak로부터 본 화합물은 isorhamnetin 구조를 하고 있음을 알 수 있으며, Fig. 3에서의 MS² fragmentation pattern으로 isorhamnetin-3-rutinoside 및 isorhamnetin-3-(malonoyl)glucoside 화합물임을 확인할 수 있었다. 이처럼 속껍질 색깔 차이에 따라 폴리페놀 성분의 조성 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

Fig 3. Positive Orbitrap MS² fragmentation patterns of polyphenols. (A) MS² data of cyanidin-3-sophoroside (peak 13). (B) MS² data of cyanidin-3-sambubioside (peak 18). (C) MS² data of quercetin-3-(feruloyl)glucoside (peak 25). (D) MS² data of quercetin-3-sophoroside (peak 26). (E) MS² data of quercetin-3-sambubioside-7-glucoside (peak 27). (F) MS² data of quercetin-3-glucuronide (peak 42). (G) MS² data of isorhamnetin-3-rutinoside (peak 43). (H) MS² data of isorhmnetin-3-(malonoyl)glucoside (peak 44).

본 연구는 다양한 색깔의 속껍질을 가진 땅콩이 육성되고 재배 및 식용되고 있으나 땅콩 종피 색깔의 차이에 따른 항산화 활성 및 이차 대사산물에 대한 성분을 확인하고자 하였다. 실험에 사용한 품종은 검은색 종피를 지닌 흑생, 담갈색인 다안 및 적색 종피를 가진 세원 품종이며, 속껍질 에탄올 추출물에 대한 항산화 활성 및 UPLC-Orbitrap MS/MS를 이용한 폴리페놀 성분 분석을 하였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 속껍질 색깔 차이에 따른 통계적 유의한 차이를 보였으며 담갈색 속껍질을 가진 다안 품종(198.0 mg GAE/g 및 118.1 mg CAE/g)이 가장 높고 다음으로 검은색 속껍질을 가진 흑생 품종(121.7 mg GAE/g 및 48.3 mg CAE/g)이었으며, 적색 속껍질인 세원 품종이 가장 낮은 함량(59.8 mg GAE/g 및 30.5 mg CAE/g)을 보였다. 이러한 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 차이는 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능과 통계적 고도의 유의한 양의 상관을 보였다. 속껍질 추출물에 대한 폴리페놀 성분을 Orbitrap-MS/MS 분석한 결과 47종류의 폴리페놀 성분이 확인되었으며 21개의 PAC 계열 성분이 많음을 확인하였고 특히 담갈색 속껍질을 가진 다안 땅콩이 PAC 성분과 catechin이 높은 TIC 크로마토그램을 보였다. 따라서 다안 땅콩 속껍질 추출물이 높은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 것으로 사료된다. 검은색 속껍질을 가진 흑생 품종에서는 2가지의 안토시아닌 성분을 확인하였고 quercetin 배당체 화합물이 많이 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 땅콩 속껍질 색깔 차이에 따른 폴리페놀 성분 조성 차이를 보이며 이러한 변이가 항산화 활성에 차이를 나타냄을 처음으로 비교 분석한 결과이다. 이러한 결과를 바탕으로 땅콩은 삶거나 볶아서 속껍질도 함께 섭취하고 있어 인체에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 사료된다.

본 연구는 농촌진흥청 농업과학기술 연구개발사업(과제번호: PJ013378012018)의 지원에 의해 이루어진 것으로 이에 감사드립니다.