식이단백질은 우리 몸에 필수 아미노산을 공급하여 질소원의 균형을 맞추며 신체의 구조를 이루고 다양한 생화학적 기능을 수행한다(Kårlund 등, 2019). 그뿐만 아니라, 고단백 식이는 탄수화물과 지방의 섭취량을 줄여 체중 감량에 도움을 주며(Magkos, 2020; Phillips, 2018), 운동과 병행 시 근육 증강에 영향을 줄 수 있기 때문에 적절한 섭취가 매우 중요하다(Stokes 등, 2018). 때문에 유아기부터 청년, 노년기를 걸친 모든 생애 주기에서 식이단백질, 특히 트레오닌이나 branched-chain amino acids(BCAA)와 같은 특수 아미노산군은 근육 건강에 큰 영향을 미치는 요소라고 할 수 있다(Kitada 등, 2019; Portune 등, 2016). 식이단백질을 섭취하면 위장관에서 소화와 흡수가 일어난 뒤 세포 대사가 일어나게 되는데, 장내 미생물은 이러한 과정에서 다양한 대사산물을 생산하여 면역 조절 등 중요한 역할을 한다(Jahan-Mihan 등, 2011). 특히 단백질분해 효소를 가진 미생물들이 고분자 단백질을 저분자 단백질 또는 아미노산으로 분해하고 장관 내 상피세포에서 흡수를 촉진한다고 알려져 있으며(Peng 등, 2020; Wang과 Ji, 2019; Wikoff 등, 2009), 장내에서 단백질 분해 활성이 높은 균주로는 Bacteroides, Streptococcus, Bacillus 등이 있다. 하지만 장내 균총은 인종, 지역, 식습관 등에 따라 결정되기 때문에 장내에서 일어나는 미생물들의 단백질 대사 프로파일 또한 다양하다(Jahan-Mihan 등, 2011; Senda 등, 1985).

프로바이오틱스는 젖산이나 초산과 같은 다양한 유기산을 분비하며, 면역시스템에 이로움을 줄 수 있는 균주로써 장내에서 다양한 대사체를 분비하여 장내 균총과 상호작용을 한다고 알려져 있다(Rijkers 등, 2011). 때문에 식이단백질과 함께 프로바이오틱스를 함께 섭취하면 기존에 장내 균총이 갖는 단백질 분해능에 더하여 균주의 단백질 소화 효소에 의해 고분자 단백질의 아미노산화가 더 효율적으로 이루어질 수 있다(de Marco Castro 등, 2021). 기존 연구에 따르면 비만 마우스 모델이나 근감소 마우스 모델에서 프로바이오틱스 섭취로 인해 염증 수치가 감소하고 근육량 및 운동 퍼포먼스에 유의한 영향을 준 사례가 보고되고 있지만, 식이단백질과 프로바이오틱스의 병용투여 시너지 효과에 관한 연구는 아직 미비한 실정이다(Bindels 등, 2012; Chen 등, 2016; Jäger 등, 2016). 본 연구팀은 선행 항비만 임상 연구에서 장내 유익균과 비만 관련 마커에 유의한 효과가 있었던 프로바이오틱스 균주 7종을 선별하여 식이단백질에 대한 분해 효소의 역가를 확인하였다(Lee 등, 2014; Song 등, 2020). 또한 마우스 모델에서 장관 내 아미노산 흡수에 선별된 균주가 시너지 효과를 낼 수 있는지 확인하였고 보조제와 함께 섭취하는 프로바이오틱스의 효과를 규명하기 위해 실험을 진행하였다.

프로바이오틱스 균주 배양 및 처리

본 실험에서는 선행 항비만 연구에서 효능을 보였던 한국 성인 분변 유래 4종 Lactobacillus acidophilus CBT-LA1(KCTC 11906BP), L. rhamnosus CBT-LR5(KCTC 12202 BP), L. plantarum CBT-LP3(KCTC 10782BP), Streptococcus thermophilus CBT-ST3(KCTC 11870BP), 한국 영유아 분변 유래 3종 Bifidobacterium lactis CBT-BL3(KCTC 11904BP), B. longum CBT-BG7(KCTC 12200BP), B. bifidum CBT-BF3(KCTC 12199BP) 균주를 사용하였다(Lee 등, 2014; Song 등, 2020). 배양된 균주는 1×10¹⁰ CFU/mL 농도로 맞춰 동결건조하였고 동일한 양으로 혼합하여 복합 균주 동결건조물로 제작한 뒤 CBT 7PM(7 probiotic mix)이라고 명명한 뒤 실험에 사용하였다. 4가지의 단백질원 whey protein concentrates(WPC; Lactalis Ingredients), whey protein isolates(WPI; Hilmar Ingredients), milk protein isolate(MPI; Ingredia), isolated soy protein(ISP; ADM)을 PBS 용액에 각각 10% 현탁한 용액에 복합균주건조물을 1% 접종하여 37°C 온도에서 40시간 동안 배양하였고, 2,000×g로 10분간 원심분리 후 상등액을 채취하였다. 채취한 상등액은 0.45 μm의 필터로 여과한 뒤 세포실험 및 동물실험에 사용하였다.

Aminopeptidase 활성 측정

프로바이오틱스의 aminopeptidase 활성을 측정하기 위해 사전 연구 방법을 적용 및 변형하여 실험하였다(Mercado-Flores 등, 2004; Rossier 등, 2008). 프로바이오틱스 7종 중 Lactobacillus 속은 MRS, Bifidobacterium 속은 BL 배지를 사용하여 37°C, 16시간 배양 후 3,000×g로 10분간 원심분리하여 균체를 수집하였다. 이후 각 균주의 펠렛을 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.2로 3번 세척하였고, 아미노산 substrate에서 분해되어 나온 p-nitroanilide 분석을 통해 aminopeptidase 활성을 측정하였다(Table 1). L-Glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, cystine, lysine, arginine 그리고 histidine substrate solution 25 mM (Sigma-Aldrich Co.)에 1×10¹⁰ CFU/mL로 농도를 맞춘 개별 균주를 37°C에서 30분 동안 반응시킨 후 균체를 제외한 용액을 spectrophotometer(Shimadzu Co.)를 이용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한 L-tryptophan, L-serine, L-threonine, L-tyrosine, L-asparagine, L-glutamine, L-aspartic acid, L-glutamic acid substrate는 β-naphthylamide가 떨어져 나온 양을 측정하였고 해당 substrate solution 25 mM(Sigma-Aldrich Co.)에 개별 균주를 37°C에서 30분 동안 반응시킨 후 균체를 제외한 용액을 fluorescence spectroscopy(Promega)를 이용하여 ex=320~340 nm, em=410~420 nm의 파장에서 형광도를 측정하였다.

Table 1 . The list of substrates for enzyme activity measurement.

Enzyme activity	Substarate
Glycine amino peptidase	L-Glycine p-nitroanilide
Alanine amino peptidase	L-Alanine p-nitroanilide hydrochloride
Valine amino peptidase	L-Valine p-nitroanilide
Leucine amino peptidase	L-Leucine p-nitroanilide
Isoleucine amino peptidase	L-Isoleucine p-nitroanilide
Methionine amino peptidase	L-Methionine p-nitroanilide
Phenylalanine amino peptidase	L-Phenylalanine p-nitroanilide
Tryptophan amino peptidase	L-Tryptophan β-naphthylamide
Proline amino peptidase	L-Proline p-nitroanilide
Serine amino peptidase	L-Serine β-naphthylamide
Threonine amino peptidase	L-Threonine β-naphthylamide
Cysteine amino peptidase	L-Cystine bis-p-nitroanilide
Tyrosine amino peptidase	L-Tyrosine β-naphthylamide
Asparagine amino peptidase	L-Asparagine β-naphthylamide
Glutamine amino peptidase	L-Glutamine, β-naphthylamide hydrochloride
Aspartic acid amino peptidase	L-Aspartic acid β-naphthylamide
Glutamic acid amino peptidase	L-Glutamic acid β-naphthylamide
Lysine amino peptidase	L-Lysine p-nitroanilide dihydrobromide
Arginine amino peptidase	L-Arginine p-nitroanilide dihydrochloride
Histidine amino peptidase	L-Histidine p-nitroanilide

실험동물 및 시료 투여

실험동물은 6주령의 Sprague-Dawley 수컷 랫트 60마리를 (주)오리엔트바이오에서 공급받아 사용하였다. 일주일 적응기 동안 사육 환경은 자유 식이 및 식수로 공급했으며, 온도 24±2°C, 습도 40~60%, 조명 12시간/일 조건을 유지하였다. 모든 동물실험은 쎌바이오텍 동물실험윤리위원회의 승인(CBT-2023-01)을 받은 후 연구 지침을 준수하여 진행하였다. 실험동물은 일주일 적응기 후 6마리를 한 군으로 하여 무작위 배정하였으며, 대조군(control)은 PBS를 투여하였고 실험군들은 7PM과 단백질 시료인 WPC, WPI, ISP, MPI를 각각 투여하는 실험군과 7PM과 각각의 단백질 시료를 동시 투여하는 ISP+7PM, WPC+7PM, WPI+7PM, MPI+7PM 실험군으로 구성하였다(Fig. 1A). 일주일 적응기 동안은 단백질 성분이 포함된 사료(AIN-93G)를 공급하였으나 2주 차 실험 기간부터는 단백질 섭취 조건을 제한하기 위해 단백질 성분이 제외된 사료(AIN-93G, 0% protein)를 공급하였다(Table 2). 시료 투여 조건으로는 7PM을 투여하는 실험군에는 적응기부터 매일 1×10⁹ CFU/rat 조건으로 구강 투여하였으며 단백질 시료인 WPC, WPI, ISP, MPI는 적응기 후 60 kg 성인의 하루 단백질 섭취량 20 g을 인체 적용 섭취량(human equivalent dose)을 랫트에 적용하여 계산했으며(식 1), 2 g/kg 조건으로 매일 2주 동안 구강 투여하였다(Fig. 1B).

Table 2 . The composition of AIN-93G and AIN-93G 0% protein diet.

Product	AIN-93G	AIN-93G 0% protein
	g%	g%
Protein	20	0
Carbohydrate	64	84
Fat	7	7
Ingredient	g	g
Casein	200	0
L-Cystine	3	12
Corn starch	397.5	2389.9
Dextrose	132	528
Sucrose	100	400
Cellulose	50	0
Soybean oil	70	630
tBHQ	0.014	0
Mineral mix S10022G	35	0
Vitamin mix V10037	10	40
Choline bitartrate	2.5	0
Total	1,000	1,000

Fig 1. Mouse experimental design based on administration materials in each group. A. Oral administration material in each group. Male rats were grouped into 10 groups (n=6). B. Schematic diagram of the time schedule for acclimation and daily treatment plan. During the acclimation period, all groups were fed a standard diet, and four experimental groups (group 7, 8, 9, and 10) were pre-administrated with CBT 7PM for seven consecutive days. During the two-week experimental period, all rats were fed a zero-protein diet supplemented with dietary proteins. Four experimental groups (group 7, 8, 9, and 10) were administrated 7PM orally.

(식 1)$$Animaldose(mg/kg)=Humanequivalentdose\left(mg/kg\right)\times 6.2\left(conversionfactor\right)$$

마지막 시료 투여 후 2시간 뒤, 심장 채혈로 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 원심분리(2,000×g, 15 min, 4°C)하여 혈청을 분리 후 -70°C에 보관하여 실험에 사용하였다.

혈액 내 아미노산 정량적 분석

아미노산의 분석은 Agilent Technologies의 Automated Amino Acid Analysis를 사용하여 Agilent 1290(Agilent Technologies) HPLC에서 수행하였다(Table 3). 아미노산 분리는 Zorbax AAA 컬럼(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)을 이용하였다. 이동상 A는 10 mM NaOH로 pH 7.8로 조정된 sodium dihydrogen phosphate의 0.04 M 완충 용액이고, 이동상 B는 아세토니트릴:메탄올:물(45:45:10, v/v/v) 용액을 사용하였으며, 2.0 mL/min의 속도를 유지하였다. 컬럼 오븐 온도는 40°C이며, 아미노산 검출 파장은 338/262 nm(Ref. 390/324 nm)로 흡광도를 측정하였다. 기울기 비율은 B 0%(0분), 0%(1.9분), 57%(18.1분), 100%(18.6분), 100%(22.3분), 0%(23.2분), 0%(26.0분)로 실시하였다.

Table 3 . Agilent 1290 HPLC injection program.

Injection program for mobile phase A and B
Line	Function	Amount	Reagent
1	Borate buffer	2.5 μL
2	Draw	0.5 μL	Sample
3	Mix	Maximum speed, 2 times
4	Wait	0.5 min
5	Draw	0 μL	Water-needle wash
6	Draw	0.5 μL	OPA
7	Mix	Maximum speed, 6 times
8	Draw	0 μL	Water-needle wash
9	Draw	0.5 μL	FMOC
10	Mix	Maximum speed, 6 times
11	Draw	32 μL	Water
12	Mix	Maximum speed, 2 times
13	Inject	0.5 μL

세포배양 및 시료 처리

세포 실험에 사용된 C2C12 근아세포(myoblast)는 American Type Culture Collection에서 구입하여 사용하였으며, 37°C, 5% CO₂에서 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin(P/S)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 배지를 이용하여 배양하였다. 근관세포(myotube)로의 분화를 유도하기 위해 C2C12 근아세포가 배양접시에 80% 이상 찼을 때, 2% horse serum, 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 2주 동안 2일간 반복 교체하였다. 100 µM dexamethasone(Sigma-Aldrich Co.)의 처리를 통해 근육 약화를 유도하였으며, 예방효과 확인을 위한 조건으로 dexamethasone과 시료의 동시 처리 후 24시간 배양과 치료효과 확인을 위한 조건으로 dexamethasone을 처리 8시간 후 시료를 처리하고 16시간 배양하였다(Chang과 Kong, 2020; Jeon 등, 2022; Wang 등, 2022).

Real-time PCR 분석

근관세포로 분화된 C2C12 세포에 dexamethasone과 시료를 동시처리(예방조건) 및 후처리(치료조건)된 세포로부터 RNeasy mini kit(Qiagen)을 이용하여 total RNA를 분리하고 Nanodrop을 통해 정량한 다음, RNA 1 µg에 Prime Script™ 1st strand cDNA synthesis kit(Takara)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA와 MuRF1, Atrogin-1, MyoD, Myogenin, Myf5, Myf6 및 GAPDH에 해당하는 각각의 primers 그리고 Prime Q-Master Mix(GeNet Bio)를 혼합한 후 CFX96 System real-time PCR(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 mRNA 발현 정도를 비교 분석하였다. Primer sequences는 다음과 같다. MuRF1(forward 5′-TGCCTACTTGCTCCTTGTGC-3′, reverse 5′-CACCAGCATGGAGATGCAGT-3′), Atrogin-1(forward 5′-CTGCCTGTGTGCTTACAACT-3′, reverse 5′-TGCTCTCTTCTTGGGTAACA-3′), MyoD(forward 5′-ACGAC TGCTTTCTTCACCACTCCT-3′, reverse 5′-TCGTCTTAACTTTCTGCCACTCCG-3′), Myogenin(forward 5′-ACAGCATCACGGTGGAGGATATGT-3′, reverse 5′-CCCTGCTACAGAAGTGATGGCTTT–3′), Myf5(forward 5′-ATCTGGCTTCTCTCTCTCCAGTTG-3’, reverse 5′-TTAGGCCCTCCTGGAAGAAGTCAT-3’), Myf6(forward 5′-GCTAAGGAAGGAGGAGCAAA-3′, reverse 5′-GAAGA AAGGCGCTGAAGACT-3′), GAPDH(forward 5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′, reverse 5′-GCGGCACGTCAGATCCA-3′).

통계분석

실험 결과는 평균과 표준편차로 나타내었으며 그룹 간 통계분석은 Prism(ver. 5.0 GraphPad Software Inc.)에서 T 검정을 통해 P-value를 0.05 미만으로 확인하였다.

7종 프로바이오틱스 균주들의 aminopeptidase 활성 확인

본 실험에서는 식이단백질 분해에 있어서 프로바이오틱스의 시너지 효과를 확인하고자 하였다. 먼저 선행 연구를 통해 선별된 7종의 프로바이오틱스 균주들의 아미노산별 분해능을 확인하고자 aminopeptidase 활성을 측정하였다(Table 4). 총 21종류의 아미노산 substrate에 대한 활성은 아미노산의 곁사슬 종류에 따라 큰 차이를 보였는데, 그중 비전하 극성 곁사슬을 가진 친수성 아미노산인 serine, threonine, asparagine 그리고 glutamine에서 활성이 높게 나타났으며 전하 극성을 가진 다른 친수성 아미노산 중에서는 arginine, aspartic acid와 glutamic acid에서 높은 활성을 보였다. 비전하 무극성의 곁사슬을 가지는 소수성 아미노산들에서는 상대적으로 낮은 활성을 보였으나, tyrosine과 tryptophan에서는 여타 친수성 아미노산과 유사한 활성을 보였다. Lactobacillus속과 Bifidobacterium속 그리고 Streptococcus속 간의 aminopeptidase 활성도 큰 차이를 보였는데, 특히 L. rhamnosus CBT-LR5와 L. plantarum CBT-LP3는 glutamic acid, serine, threonine, glutamine 등에서 큰 활성을 보였다. B. lactis CBT-BL3는 arginine, glutamne, tyrosine에서 높은 aminopeptidase 활성이 관찰되었고 S. thermophilus CBT-ST3는 arginine, cysteine에서 높은 활성이 확인되었다. 이 실험을 통해 7종의 프로바이오틱스 균주는 21종 아미노산에 대한 aminopeptidase 활성을 확인하였고, 고분자 식이단백질 원료 분해능 실험에 사용하였다.

Table 4 . The measurement of the activity of 21 amino peptidase on seven probiotic species.

Amino peptidase activity	LA1	LR5	LP3	BL3	BG7	BR3	ST3
Electrically charged side chains
Arginine	863.33±21.01	1971.67±132.51	1858.00±68.79	3999.67±146.33	784.67±35.16	710.67±23.63	3146.67±112.40
Histidine	0.36±0.01	0.87±0.03	0.80±0.04	0.45±0.03	0.34±0.02	0.44±0.02	0.75±0.02
Lysine	0.79±0.05	0.88±0.07	0.48±0.05	0.76±0.08	0.61±0.04	0.99±0.05	0.85±0.02
Aspartic acid	25.63±2.50	90.23±3.70	238.67±7.77	109.00±3.61	89.97±6.96	52.70±2.02	77.33±4.43
Glutamic acid	518.67±16.62	1541.00±54.06	2357.00±51.64	69.20±6.80	167.67±5.69	134.00±12.53	877.67±61.70
Polar uncharged side chains
Serine	1116.67±35.12	2112.67±135.06	1536.67±90.74	1450.00±80.00	375.33±10.26	308.00±21.00	788.00±36.43
Threonine	1092.67±38.02	2224.00±198.37	1225.33±104.41	615.67±59.34	405.00±24.56	308.00±21.00	675.67±34.27
Asparagine	80.77±6.74	271.77±6.70	269.43±13.94	148.43±10.83	60.20±6.39	79.77±3.24	127.77±7.25
Glutamine	1540.00±50.00	3326.67±105.99	2366.67±143.64	3202.00±40.15	1081.33±8.08	1050.67±10.07	1450.00±80.00
Hydrophobic side chains
Alanine	1.91±0.06	3.09±0.11	1.48±0.16	0.39±0.01	0.13±0.01	0.12±0.01	2.84±0.07
Valine	0.55±0.01	1.97±0.06	0.19±0.01	0.23±0.02	0.18±0.01	0.16±0.01	0.15±0.01
Isoleucine	0.69±0.06	3.10±0.06	0.22±0.01	0.23±0.01	0.20±0.03	0.19±0.03	0.20±0.02
Leucine	0.91±0.05	3.11±0.11	0.92±0.04	1.51±0.02	0.98±0.05	0.90±0.05	2.75±0.24
Methionine	1.22±0.07	2.34±0.08	0.59±0.06	1.27±0.04	0.21±0.03	0.42±0.04	0.77±0.05
Phenylalanine	0.36±0.02	1.52±0.08	0.27±0.03	0.40±0.01	0.25±0.04	0.13±0.00	0.39±0.02
Tyrosine	173.67±7.23	314.33±6.03	171.67±8.02	254.67±9.07	65.33±7.37	64.33±9.29	173.33±11.68
Tryptophan	22.47±2.23	393.00±7.21	269.00±12.53	94.10±3.92	77.20±2.95	74.03±4.30	147.00±9.17
Special cases
Cysteine	121.33±8.50	172.33±10.69	334.33±20.55	55.40±5.10	30.23±1.63	52.67±11.06	154.00±11.53
Glycine	0.19±0.01	0.39±0.05	0.32±0.03	0.15±0.01	0.06±0.02	0.09±0.01	0.43±0.01
Proline	0.76±0.09	0.76±0.07	0.12±0.03	0.84±0.05	0.83±0.06	0.83±0.04	0.84±0.07

Aminopeptidase activity of seven probiotics were shown as mean±SD (standard deviation).

프로바이오틱스 복합 균주의 단백질 분해능 확인

앞서 아미노산별 aminopeptidase 활성을 보였던 7종 프로바이오틱스 균주를 동결건조하여 동일 균체 수로 혼합하여 제작된 복합물인 7PM을 이용하여 고분자 단백질 활성을 확인하였다. 본 연구에 사용된 단백질은 단백질 보충제로 가장 많이 사용되는 우유 및 콩 유래 식이단백질 원료인 WPC, WPI, MPI 그리고 ISP를 사용하였고, 7PM을 4가지의 식이단백질 원료에 처리하여 고분자 단백질이 얼마나 아미노산으로 분해되는지 HPLC를 통하여 전후 농도를 비교하였다(Fig. 2). 고분자 단백질 원료가 균주에 의해 가장 많이 분해된 아미노산으로는 glutamine, alanine, glycine, arginine이 있었으며 ISP, WPC, WPI 모두 유의한 농도 차이를 보였다. 이외에도 glutamic acid, serine, threonine, asparagine, valine 등 화학 구조 곁사슬의 특징과 무관하게 다양한 아미노산들이 분해되어 측정되었다. 한편 단백질원 중 MPI는 균주 처리와 무관하게 분해된 아미노산의 농도가 통계적으로 유의한 차이를 보이는 실험군은 확인되지 않았다. 이 실험에서 쓰인 7종의 프로바이오틱스가 속한 Lactobacillus나 Streptococcus속은 성장 시 펩타이드 혹은 아미노산을 주요 성장인자로 필요로 하여 콩이나 우유 단백질에 대한 강한 분해 활성을 보여 왔으며(Wang 등, 2021), Bifidobacterium속은 장내 미생물로 우리 몸에서 공생 시 우유 단백질 분해를 통하여 성장이 촉진된다고 알려져 있다(Nagpal 등, 2011). 이러한 단백질 분해 효소 프로파일은 균종별로 매우 다양한데(Juillard 등, 2022; Liu 등, 2010), 본 실험에 사용된 7종의 균주는 3가지 속이 고루 혼합되어 있어 다양한 유전적 형질로 인해 최종 아미노산 분해가 효과적으로 이루어지는 것으로 생각된다.

Fig 2. Evaluation of 7PM’s proteolytic activity on four dietary proteins. WPI, ISP, and MPI were used to assess the proteolytic activity of 7PM. The concentration of 19 amino acids was measured after incubating proteins with or without 7PM. ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 by Student’s t-test.

프로바이오틱스 복합 균주의 동물 혈청 내 아미노산 흡수에 미치는 영향 확인

섭취된 단백질 원료들이 위장관을 지나면서 여러 소화 효소 및 장내 미생물에 의해 저분자 물질로 분해되어 흡수되는데(Bröer와 Fairweather, 2019), 이때 함께 섭취한 프로바이오틱스가 혈류 내 흡수 정도에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 랫트를 사용하여 동물실험을 진행하였다. 동물사료 내 단백질이 미치는 영향을 제한하기 위해 단백질을 제거한 사료를 제작한 후에 그룹별로 사료와 함께 WPC, WPI, ISP 및 MPI를 각각 포함하였다. 또 다른 실험군에는 단백질들과 7종의 균주를 함께 섭취하게 하였다(Fig. 3). 실험 결과 PBS만 섭취시킨 Control과 ISP 그룹을 비교하였을 때 isoleucine, histidine, tyrosine, phenylalanine의 농도가 혈청 내에서 유의적 증가를 나타내었으며, ISP+7PM 그룹에서는 glycine, alanine을 제외한 16개의 아미노산에서 ISP 그룹보다 유의적 증가를 나타내었다. Control과 WPC 그룹 간 혈청 내 아미노산 비교에서는 histidine, phenylalanine과 glutamic acid가 유의적 증가를 나타내었으며, WPC+7PM 그룹에서는 isoleucine, aspartic acid를 제외한 16개의 아미노산에서 WPC 그룹보다 유의적 증가를 나타내었다. Control과 WPI 그룹 간 혈청 내 아미노산 비교에서는 valine, histidine, glycine, tyrosine, phenylalanine, glutamic acid와 lysine이 유의적 증가를 나타내었으며, WPI+7PM 그룹에서는 tyrosine, glutamic acid를 제외한 16개의 아미노산에서 WPI 그룹보다 유의적 증가를 나타내었다. Control과 MPI 그룹 간 혈청 내 아미노산 비교에서는 glycine, phenylalanine과 glutamic acid가 유의적 증가를 나타내었으며, MPI+7PM 그룹에서는 alanine, glutamic acid를 제외한 16개의 아미노산에서 MPI 그룹보다 유의적 증가를 나타내었다. 결과적으로 단백질 시료 단독 투여 대비 단백질 시료 및 7종의 프로바이오틱스 동시 투여 시 혈액 내 유의적으로 증가하는 아미노산들의 평균 증가율(%)을 살펴보면, ISP+7PM 그룹에서는 arginine 106.25%, tyrosine 132.10%, WPC+7PM 그룹에서는 aspartic acid 109.25%, threonine 421.95%, tyrosine 198.53%, WPI+7PM 그룹에서는 aspartic acid 126.40%, threonine 376.88%, arginine 107.57%, MPI+7PM 그룹에서는 tyrosine 182.62%의 증가율을 나타내었다(Supplementary data 1). 흥미롭게도 WPC와 WPI 그룹에서 threonine의 흡수가 가장 급격한 차이를 나타내었는데, 이는 앞선 aminopeptidase activity 결과에서 L. acidophilus CBT LA1, L. rhamnosus CBT LR5, L. plantarum CBT LP3의 높은 threonine aminopeptidase 활성 측정 결과와 상통하는 부분이다(Table 4). Threonine은 대장에서 뮤신 생성에 필수 요소이기 때문에 장관벽을 두껍게 하고 면역 작용을 조절하는 효과가 있다고 알려져 있다(Mao 등, 2011; Min 등, 2017). 때문에 본 연구에서 사용된 7종의 프로바이오틱스와 우유 유래 단백질을 함께 섭취한다면 장관벽 유지와 면역 활동 조절에 시너지 효과를 낼 가능성이 있어 추가적 검증실험에 관한 후속 연구가 필요하다.

Fig 3. Eighteen amino acid concentrations in serum following an experiment with dietary proteins and 7PM administration in rats. The concentration of amino acid in serum measured by HPLC analysis at three weeks after administration in each group (n=6). Values are expressed as mean±SD. Student’s t-test, ^aP<0.05, compared with the control; ^bP<0.05, compared with the CBT 7PM; ^cP<0.05, compared with the ISP; ^dP<0.05, compared with WPC; ^eP<0.05, compared with WPI; ^fP<0.05, compared with MPI.

Dexamethasone에 의한 C2C12 세포의 근위축 현상에 단백질과 프로바이오틱스 혼합 배양액이 미치는 영향

프로바이오틱스 처리에 의해 유의하게 증가한 아미노산을 포함하여 프로바이오틱스와 단백질 혼합물이 근육세포에 주는 영향을 확인하기 위해 골격근 세포인 C2C12 세포를 근관세포로 분화시켜 in vitro 실험을 진행하였다. Dexamethasone을 처리하여 근위축 모델을 제작하였고 근육세포생성 및 분해 관련 바이오마커에 미치는 효과를 확인하기 위해 mRNA 발현을 확인하였다. 근위축 유도 시 단백질원들 혹은 프로바이오틱스 균주 혼합시료를 동시에 24시간 동안 처리하여 mRNA 발현을 비교하는 예방효과 조건과(Fig. 4A) dexamethasone 8시간 처리를 통해 근위축 유도가 완료된 후 단백질원들 혹은 프로바이오틱스 균주 혼합 시료를 16시간 동안 처리하여 mRNA 발현을 비교하는 치료효과 조건으로 연구를 수행하였다(Fig. 4B). 모든 시료의 처리농도는 CCK-8 assay를 통해 얻은 결괏값인 C2C12 세포에 대한 세포독성이 없는 5%(v/v)로 수행되었다. 예방조건에서 dexamethasone을 처리하여 근위축이 유도된 상태에서 근육세포 생성에 관련된 전사인자들의 변화를 살펴보았을 때, 단백질 시료 단독 처리된 그룹들의 mRNA 발현량은 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았다. 하지만 control 대비 50% 감소한 MyoD의 발현량을 WPI+7PM 처리를 통해 14%로 크게 회복시켰으며, WPC+7PM 처리는 52% 감소한 Myogenin의 발현량을 14%로 회복시켰다. 또한 63% 감소한 Myf5의 발현량을 WPI+7PM 처리를 통해 24% 감소한 수치로, 60% 감소한 Myf6의 발현량을 WPI+7PM 처리를 통해 9% 감소한 발현량으로 크게 회복시켰음을 확인하였다. 근육 세포 단백질 분해 및 생장저하에 연관된 인자인 MuRF1과 Atrogin-1은 dexamethasone 처리로 인해 각각 87%, 124% 발현량이 증가하였는데, WPI+7PM의 처리를 통해 MuRF1을 21%의 수치로 감소시켰으며 MP1+7PM 처리 역시 Atrogin-1의 발현량을 33% 수준으로 크게 감소시킴을 확인하였다(Fig. 4A). 치료조건 처리에서도 예방조건의 결과와 유사하게 dexamethasone 처리 후 단백질 시료 단독 처리된 그룹들의 mRNA 발현량이 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았다. 단백질과 프로바이오틱스 균주 혼합시료를 처리하였을 때, dexamethasone에 의해 발현량이 63% 증가한 MuRF1은 WPI+7PM의 처리를 통해 18% 수준으로 감소함을 확인하였고, 발현량이 299% 증가한 Atrogin-1은 WPC+7PM 처리를 통해 86%까지 크게 감소함을 확인하였다. 또한 Control 그룹 대비 53% 수준으로 감소한 MyoD의 발현량은 WPI+7PM 처리를 통해 17%로 감소하였고, WPI+7PM의 처리를 통해 Myogenin의 발현량이 80%에서 35% 수준으로 감소하였다. Myf5의 발현량은 55% 감소한 발현량이 7% 수준으로, Myf6의 발현량은 71% 감소한 발현량이 11% 감소한 수준으로 발현량이 변화하는 등 긍정적인 효과를 나타내는 경향을 확인하였다(Fig. 4B). 종합적으로 프로바이오틱스 복합물을 통해 아미노산화가 이루어진 단백질 식이 원료는 근위축이 유도된 상태에서 근육세포 생성에 도움을 주며 근육세포 단백질의 분해 및 생장 저하를 억제할 수 있다고 사료된다.

Fig 4. Relative expression of mRNAs related to myotube differentiation of C2C12 under preventive and therapeutic conditions. (A) In the preventive condition, dexamethasone (100 μM) and either protein sample only or protein-7PM samples were simultaneously treated in myotube-differentiated C2C12 cells and incubated for 24 h. (B) In the therapeutic treatment condition, dexamethasone (100 μM) was treated in myotube-differentiated C2C12 cells for 8 h, and then either protein sample only or protein-7PM sample was treated in each group for 16 h. Values are expressed as mean±SD (n=3). Student’s t-test, ^aP<0.05, compared with the control (DEX−); ^bP<0.05, compared with the control (DEX+); ^cP<0.05, compared with the 7PM; ^dP<0.05, compared with ISP; ^eP<0.05, compared with WPC; ^fP<0.05, compared with WPI; ^gP<0.05, compared with MPI.

본 연구는 근육증가 및 체중조절을 위해 사용되는 식이단백질을 프로바이오틱스와 함께 섭취할 시, 분해와 흡수율이 증가하고 근육세포 발달에 시너지 효과를 줄 수 있는지에 대한 가능성을 규명하기 위해 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 다양한 효능을 평가하였다. 먼저 항비만 선행 연구를 통해 선별된 7종의 균주를 사용하여 21종의 아미노산에 대한 aminopeptidase 활성을 각각 관찰하였고, 이 결과를 토대로 혼합균주를 제작하였다. 네 가지 식이단백질 원료를 사용하여 복합균주가 가지는 고분자 단백질의 분해 정도를 측정하였고, 다양한 종류의 아미노산이 분해되어 나오는 것을 확인하였다. 이후 동물실험을 통해서 단백질 원료 단독 투여 대비 복합균주와 함께 투여 시 장관벽에서 혈액으로 흡수가 증가한다는 것을 serum 내 아미노산 농도 측정을 통해 확인하였다. 마지막으로 약물처리를 통해 근위축이 유도된 근육세포에 단백질과 프로바이오틱스 복합균주 배양액을 처리 시, 근육세포 성장 및 생성에 관여하는 유전자 발현이 증가하고 근세포의 단백질 분해 및 생장 저해에 대한 가능성을 확인하였다. 결론적으로 선정된 7종의 프로바이오틱스 복합물은 식이단백질과 함께 섭취하였을 때 고분자 단백질을 분해하여 체내 흡수를 촉진하고 근육 발달에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.