한국질병관리청(KDCA, 2021)에 따르면 비만은 신체적, 경제적 및 심리적인 부담을 증가시키는 세계적인 건강 문제로 우리나라의 경우 만 19세 이상 성인의 비만 유병률(연령표준화)은 2007년 31.7%에서 2019년 33.8%로 2.1% 증가하였으며, 성인의 비만율이 2018년 34.7%(남자 41.8%, 여자 25.5%)로 증가하고 있다. 비만은 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생하는 대사성 질환이며, 고혈압, 심혈관계 질환, 제2형 당뇨병 및 각종 암 등과 같은 만성 질환의 발생 가능성을 증가시키는 위험 요소이기 때문에 조기 예방이 필요하다(Visscher와 Seidell, 2001).

일반적으로 비만은 지방전구세포(preadipocytes)의 분화와 지질합성(adipogenesis)의 과정에서 발생하는 지방세포의 비대(hypertrophy) 및 과형성(hyperplasia)이 원인으로 조직 내 지방세포가 축적됨으로써 유발된다(Alessi 등, 2003). 지방세포의 과형성은 지방전구세포의 증식과 분화 과정에 의해서 유도되는데, peroxisome proliferator activated receptor γ(PPAR-γ)와 CCAAT-enhancer-binding protein α(CEBP/α)의 발현은 지방전구세포가 지방세포로 분화할 때 관여하는 것으로 알려져 있다(Liu 등, 2001; Rosen 등, 2002). 따라서 생리활성물질을 이용하여 지방세포의 분화조절을 연구하는 것은 비만과 비만 유래 대사질환의 발병을 제어하는 데 매우 중요하다(Kim, 2009).

보리(Hordeum vulgare L.)는 외떡잎식물 벼복 화본과에 속하고 보리알이 배열된 열 수에 따라 2조맥과 6조맥으로 분류하며(Jeong과 Yoo, 2014), 성숙 후 껍질과 알곡이 잘 분리되는지 여부에 따라 식품용의 쌀보리와 양조 및 맥아용으로 사용되는 겉보리로 나뉜다(Kang과 Kim, 2021). 쌀, 밀, 옥수수 등과 함께 전 세계에서 4번째로 많이 소비되는 곡류 중 하나인 보리는 우리 식생활에서도 빼놓을 수 없는 곡물로 주로 밥을 지을 때 혼반용으로 이용하며, 맥주나 식혜 또는 기타 미숫가루를 만드는 데 사용하는 등 여러 가지 용도로 활용되어 왔다. 보리는 단백질(Lee와 Park, 1972; Park, 1976), 무기질(Jung 등, 1987; Lee 등, 1983; Park, 1976), 아미노산(Cheigh 등, 1976; Jung 등, 1987; Lee 등, 1983; Park과 Yang, 1976), 지방질 성분 분석(Chun과 Lee, 1984; Shin 등, 1981), 식이섬유(Lee, 1992), 비타민(Cheigh 등, 1976) 등의 다양한 영양성분을 포함하고 있다. 일반 곡류에 비해 보리에 많이 함유된 것으로 밝혀져 있는 β-glucan은 배유 세포벽을 구성하는 주요 다당류로 체내 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추고, 체지방 축적을 억제하는 등의 성인병 예방에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Kalra와 Jood, 2000). 또한 유색보리는 일반 보리에 비해 안토시아닌 색소, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높아 항산화 효과가 뛰어나므로 유색보리 메탄올 추출물의 항산화 성분 및 활성 효과(Park 등, 2011a)를 비롯해 유색보리와 귀리를 이용한 항당뇨 개선 효과(Lee 등, 2013) 등의 연구가 진행된 바 있다.

한편, 컬러푸드에 대한 소비자의 관심이 높아지면서 유색보리의 가공 방법 역시 다양성을 모색하고 있다. 그중 유산균을 이용해 보리를 발효시키면 미생물에 의해 원재료의 성분이 분해되어 소화율 증가 및 섭취 시 식감과 관능성이 증가하는 데 도움이 되고, 새로운 대사산물 생성에 의해 보리의 기능성이 극대화될 수 있다(Kim 등, 2018). 따라서 본 연구에서는 검정보리 추출물과 검정보리에 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri를 접종하여 발효시킨 검정보리 발효추출물을 3T3-L1 세포에 각각 처리하여 지방세포 분화억제 효과를 비교하였고, 고지방식이로 비만을 유도한 마우스에 검정보리 발효추출물을 일정 농도로 경구투여한 뒤 체지방개선 효능을 평가하였다.

검정보리 추출물과 검정보리 발효추출물의 제조

본 연구에 사용된 유산균 분말은 L. plantarum(18827P), L. sakei(18826P), L. reuteri(18828P)를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 MRS broth(Difco) 배지를 이용하여 37°C에서 24시간 혼합하고 배양한 다음 동결건조하였고, 배양이 끝난 최종 혼합균주의 총 유산균 수는 3.8×109 CFU/g이었다. 검정보리쌀은 농업회사법인 청맥(주)에서 구입하여 사용하였고, 220°C에서 40분간 로스팅한 후 믹서기를 이용하여 일정하게 분쇄하였다. 발효물의 제조는 정제수에 로스팅된 검정보리쌀 분말 5%(v/w)를 첨가하여 95°C에서 60분간 살균하고, 냉각 후 유산균 분말 0.1%(v/w)를 첨가한 다음 37°C에서 48시간 배양하였다. 검정보리 추출물과 검정보리 발효추출물은 검정보리와 검정보리 발효물에 각각 50% 주정을 첨가하여 40°C에서 24시간 동안 추출한 뒤 농축 및 동결건조하여 실험재료로 사용하였다.

3T3-L1 adipocyte의 배양

실험에 사용된 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection에서 분양받아 사용하였다. 분양받은 3T3-L1 지방전구세포를 24-well plate에 1×10⁵ cells/well로 10% bovine calf serum(BCS; Gibco)과 1% penicillin/streptomycin(Gibco)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Gibco)에 2일간 배양한 후 100% confluence 상태에서 진행하였다. 2일 후 지방세포 분화유도를 위해 10% BCS와 10 μg/mL insulin, 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine(Sigma-Aldrich), 0.25 μM dexamethasone(MDI; Sigma-Aldrich)이 포함된 분화배지로 교환하여 2일간 배양하였으며, 그 후 매일 2일마다 10 μg/mL insulin이 포함된 배지로 교환해주었다. 시료의 처리는 분화유도 배지 첨가 시점부터 같이 처리하였다.

세포독성 측정

배양이 끝난 세포의 생존율은 Mosmann(1983)의 방법에 따라 MTT[3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] 환원 방법을 이용하여 측정하였다. MTT assay는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 succinic dehydrogenase에 의해 MTT tetrazolium이 formazan으로 환원되는 것을 이용하여, formazan의 농도를 흡광도 450 nm에서 측정함으로써 생존한 세포 수를 확인하는 방법이다. 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate(Falcon)에 1×10⁵ cell/well로 분주하여 16~18시간 배양한 후 농도별로 희석한 검정보리 추출물 및 검정보리 발효추출물을 24시간 처리하였다. MTT assay는 cell viability assay kit(EZ-Cytox, Gegen)을 이용하였고, 모든 well에 MTT 용액 10 μL를 가해주고 다시 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 배양하여 MTT가 환원되도록 하여, 흡광도 측정을 위해 1분 정도 부드럽게 shaking 한 뒤 microplate reader(Synergy HT, Bio-Tex)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Oil Red O 염색

검정보리 추출물 및 검정보리 발효추출물의 지방세포 분화억제 활성을 검토하기 위해 Oil Red O(Sigma-Aldrich) 시약을 사용하여 측정하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 8일 동안 분화시킨 후 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS; Gibco)으로 세척한 후 10% formaldehyde(Sigma-Aldrich) 용액으로 세포를 고정시켰다. 다시 PBS로 세척한 후 Oil Red O 용액을 첨가하여 30분간 실온에서 염색하고, Oil Red O 용액을 제거한 후 증류수로 세척하여 건조한 뒤 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한 흡광도 측정을 위해 100% isopropyl alcohol(Sigma-Aldrich)로 염색된 지방구(lipid droplet)를 용출시켜 microplate reader(Synergy HT)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 지방 생성량을 비교하였다.

실험동물의 사육환경 및 식이

실험동물은 4주령된 C57BL/6N 수컷 마우스를 (주)샘타코바이오코리아로부터 구입하여 1주일간 일반사료로 적응시켰다. 그런 다음 실험군마다 평균 체중이 약 18~20 g이 되도록 각 군당 10마리씩 5개 군으로 나누어 stainless steel bottomed cage에 4마리씩 분리 사육하였다. 실험군은 정상대조군, 고지방식이 대조군(고지방대조군), 고지방+검정보리 발효추출물 100 mg/kg/d, 고지방+검정보리 발효추출물 300 mg/kg/d 그리고 고지방+검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 군으로 나누어 8주간 경구투여를 하였다. 실험동물의 사육실 온도는 22±2°C, 습도는 50±5%로 유지하였으며 명암은 12시간 주기로 조절하였다. 실험 식이는 정상대조군이 10% kcal from fat, cat# D12450B(Research Diets Inc.)를 급여하였고, 고지방대조군은 60% kcal from fat, cat# D12492(Research Diets Inc.)를 급여하였다. 고지질이 함유된 고형사료는 냉동 보관하였고, 필터 및 자외선 살균기로 여과 살균된 정제수를 자유로이 섭취하도록 하였다. 사육 기간 중 실험동물의 체중은 주 1회 측정하였으며, 식이섭취량은 매일 일정 시간에 식이급여량과 잔량을 측정하여 산출하였다. 식이효율(food efficiency ratio: FER)은 8주간의 총 식이 섭취량에 대한 체중증가량의 비[FER＝body weight gain(g)/ food intake(g)]로 계산하였다. 본 실험은 (재)베리&바이오식품연구소 효능평가센터 동물실험윤리위원회의 허가(BBRI-IACUC-22002)를 받아 시행하였다.

해부 및 장기 적출

사육 기간이 끝난 실험동물은 희생 전 12시간 동안 절식시킨 후 안와채혈법으로 채혈하였으며, 채혈한 혈액은 즉시 2,000×g에서 10분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 분석시료로 사용하였다. 또한 간, 부고환지방, 후복부 및 신장 주변 지방은 채혈 후 즉시 적출하여 생리식염수에 헹군 다음 표면의 수분을 제거하여 중량을 측정하였고, 유전자분석을 위해 간 조직은 즉시 액체질소에 급랭하여 -70°C에 냉동 보관하였다.

혈액 생화학적 분석

혈청 내 중성지방과 총콜레스테롤은 혈청자동분석기(AU480, Beckman Coulter Inc.)로 분석하였고, aspartate transaminase(AST)와 alanine transaminase(ALT)는 혈액생화학분석기(Hitachi clinical analyzer 7180, Hitachi, Ltd.)로 분석하였다. AST와 ALT 수치는 1분당 1 μmol의 기질을 촉매작용으로 변화시킬 수 있는 효소 활성도의 국제 단위인 one international enzyme unit(U/L)으로 표기하였다(Lee, 1995). 혈청 렙틴 농도는 Mouse Leptin ELISA kit(ab100718, Abcam)을 사용하여 분석하였으며, 혈중 인슐린 함량은 Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA kit(Crystal Chem, Inc.)을 이용하여 분석하였다.

Total RNA 분리 및 유전자 정량 분석

간 조직으로부터 RNA를 추출하기 위해 실험동물의 간 10 mg을 TaKaRa MiniBEST Universal RNA extraction kit(TaKaRa Bio Inc.)을 이용하여 homogenizer로 균질화한 후 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA의 순도를 위해 A₂₆₀/A₂₈₀ ratio를 측정하였으며, 260 nm 측정값을 이용해 RNA를 정량하였다. cDNA 합성을 위해 정량한 RNA와 RNA to cDNA EcoEry Premix(oilgo dT)(TaKaRa Bio Inc.)를 섞어 사용하였다. Real-time PCR 수행은 Light Cycler 2.0 Instrument(Roche)를 사용하였고, 표준대조군(internal house keeping gene)으로 β-actin을 사용하였다. PCR 조건은 95°C에서 10분 동안 pre-running 후, 95°C에서 15초, 60°C에서 10초, 72°C에서 10초, 60°C에서 60초 간격으로 50회 반복하여 증폭하였다. 각각의 primer의 염기서열은 Table 1과 같다.

Table 1 . Primer sequence for real time RT-PCR.

Target gene	Sense primer sequence	Antisense primer
PPARγ	ATCTTAACTGCCGGATCCAC	TGGTGATTTGTCCGTTGTCT
C/EBPα	TGTTGGGGATTTGAGTCTGT	GGAAACCTGGCCTGTTGTAA
β-Actin	AGAGAAGCTGTGCTATGTT	CACAGGATTCCATACCCAAG

통계분석

본 실험으로부터 얻은 결과는 평균과 표준오차로 기록하였으며, SPSS package program software(Ver. 18, IBM)를 이용하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA test)으로 P<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였고, Duncan의 다중 범위검정을 통해 사후 검증하였다.

세포 생존율

검정보리 추출물 및 검정보리 발효추출물의 3T3-L1에 대한 세포독성을 알아보기 위해 MTT assay를 실시하였다(Fig. 1). 검정보리 추출물과 발효추출물을 0.78~2.5 mg/mL의 농도로 처리했을 때 세포독성은 나타나지 않았으나, 두 가지 추출물 모두 5 mg/mL 농도에서 세포 생존율이 약 70%까지 유의적으로 감소하였다. 이상의 결과를 토대로 추후 실험에서는 세포가 사멸하지 않고 독성이 없는 2 mg/mL 농도를 선택하여 실험에 사용하였다.

Fig 1. Cell viability of 3T3-L1 adipocytes with treatment of black barley extract (BBE) and black barley ferment extract (BBFE) at various concentrations. The values are expressed as mean±SEM of three independent experiments. Different letters (a,b) in the same extract indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test.

Oil red O 염색에 의한 세포 내 지방구 함량 측정

항비만 소재를 탐색하기 위한 in vitro 연구에서는 주로 3T3-L1 세포주를 이용하여 지방세포의 분화를 억제하거나 지방세포의 분해를 촉진하는 소재의 효능 및 기전을 연구한다. 지방구는 phospholipid monolayer에 의해 둘러싸인 중성지방으로 구성된 비활성 소낭으로써 precursor fibroblast에서부터 지방세포로의 분화 과정에서 나타나며, PPARγ와 같은 중요한 adipogenic transcription factor에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(Freytag 등, 1994; Manickam 등, 2010; Schoonjans 등, 1996). Oil Red O 염색법은 중성지방과 cholestreolester만 염색시키고 그 외 유리지방산이나 인지질은 염색시키지 않으며, 지방구가 축적된 부분은 대부분이 중성지방이기 때문에 Oil Red O로 염색이 가능하다. 분화된 3T3-L1 지방세포에 검정보리 추출물 및 검정보리 발효추출물을 2 mg/mL 농도로 처리한 후 3T3-L1 지방세포 내 생성된 중성지방의 양을 측정했다(Fig. 2). Oil Red O 염색에 의해 지방구가 축적된 부분은 선명한 붉은색을 나타내어 정상적인 세포분화를 통해 충분하게 지방이 축적되었음을 확인할 수 있는데, MDI 분화 유도제만 처리한 세포에서는 분화 유도 후 8일째 세포질 내 지방구의 형성이 활발하게 유도됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 2A). MDI와 검정보리 추출물을 함께 처리한 그룹은 MDI 분화 유도제만 처리한 그룹에 비해 유의적인 차이가 없었으며, MDI와 검정보리 발효추출물을 함께 처리한 그룹에서는 지방구의 형성이 억제되었다(Fig. 2B). 이와 유사하게 Kwon 등(2021)은 3T3-L1 전지방세포에 MDI와 보리 발효물(홍맥)을 처리하여 10일간 분화를 유도한 결과, 지방구의 성장이 농도 의존적으로 감소함을 보고하였다. 이를 통해 세포 내 지방축적을 억제하는데 검정보리 발효추출물이 검정보리 추출물보다 효과적임을 확인할 수 있었으며, 따라서 동물실험에서는 검정보리 발효추출물을 이용하여 체지방개선에 대한 효과를 입증하고자 하였다.

Fig 2. Effect of black barley ferment extract (BBE) and black barley ferment extract (BBFE) on the lipid content in 3T3-L1 cells at 8th day for adipocyte differentiation. (A) Images of lipid droplets stained with Oil Red O dye were photographed under microscope. (B) The values are expressed as mean±SEM of three independent experiments. Different letters (a-c) on the bars indicate significant differences between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test.

체중, 식이섭취량 및 식이효율의 변화

고지방식이로 비만을 유도하며 검정보리 발효추출물을 100, 300, 500 mg/kg/d 농도로 8주간 경구투여하는 동안 체중 변화를 관찰하였다(Fig. 3). 고지방식이와 함께 검정보리 발효추출물을 투여한 쥐의 체중은 정상대조군보다 빠르게 증가했으나, 고지방식이만을 섭취한 비만유도군보다는 모든 투여 농도에서 8주차에 유의적인 체중감소가 확인되었다. 특히 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d를 처리한 그룹은 고지방대조군과 비교하여 경구투여 6주차부터 실험종료 시까지 유의적인 체중감소 효과가 나타났다. 이는 비만을 유도한 백서에서 메밀과 찰보리를 섭취시킨 뒤 체중감소 효과를 보고한 Sohn 등(2007)의 결과와도 유사하다.

Fig 3. Changes of body weight in obese mice treated with black barley ferment extract (BBFE) for 8 weeks. The values are expressed as mean±SEM (n=8/group). Different letters (a-c) in the same period indicate significant differences between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test. Normal, normal control group; HF, high fat group; HF＋BBFE100, high fat＋100 mg/kg/d; HF＋BBFE300, high fat＋300 mg/kg/d; HF＋BBFE500, high fat＋500 mg/kg/d.

정상대조군과 고지방대조군 및 고지방+검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군의 5가지 그룹으로 나누어 8주간 사육 후 이들의 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율을 조사하였다(Table 2). 8주 동안 체중증가량은 고지방대조군이 2.91±0.15 g/wk로 가장 큰 체중증가를 보였으며, 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg 투여군에서는 각각 2.23±0.22, 2.3±0.21, 1.99±0.20 g/wk로 고지방대조군에 비해 낮은 체중증가량을 나타내었다. 식이섭취량은 정상대조군 9.0±0.39 g/wk, 고지방대조군 6.17±0.31 g/wk, 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군에서는 각각 6.89±0.24, 6.63±0.27, 6.91±0.31 g/wk로 고지방식이 그룹 모두 정상대조군에 비해 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 고지방식이에 포함된 식이지방이 공복감을 줄여주고, 열량 밀도가 높을수록 식이섭취량이 감소하기 때문에 발생하는 결과로 해석된다(Duane, 1997). 식이효율의 경우, 고지방대조군이 0.47±0.02%인 것에 비해 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군에서는 각각 0.32±0.03, 0.35±0.03, 0.29±0.03% 정도로 낮은 수준을 나타냈다(P<0.05). 이는 사료섭취량이 많음에도 불구하고 체중의 증가가 적어 비만 조절에 효과가 있다는 것을 의미한다(Park 등, 2011b).

Table 2 . Changes of body weight gain, food intake and food efficiency ratio (FER) in obese mice treated with black barley ferment extract (BBFE) for 8 weeks.

Group1)	Body weight gain (g/wk)	Food intake (g/wk)	FER (%)
Normal	0.97±0.08c	9.0±0.39a	0.11±0.01c
HF	2.91±0.15a	6.17±0.31b	0.47±0.02a
HF＋BBFE100	2.23±0.22b	6.89±0.24b	0.32±0.03b
HF＋BBFE300	2.3±0.21b	6.63±0.27b	0.35±0.03b
HF＋BBFE500	1.99±0.20b	6.91±0.31b	0.29±0.03b

Different superscripts (a-c) in the same column indicate significant differences between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test. The values are expressed as mean±SEM (n=8/group)..

¹⁾Normal, normal control group; HF, high fat group; HF＋BBFE100, high fat＋100 mg/kg/d; HF＋BBFE300, high fat＋300 mg/kg/d; HF＋BBFE500, high fat＋500 mg/kg/d..

간 및 지방조직의 무게

각 식이섭취군의 간 중량을 살펴보았을 때, 고지방대조군의 간 중량은 1.09±0.08 g으로 정상대조군의 0.87±0.04 g에 비해 유의적으로 증가하였고, 검정보리 발효추출물 투여군의 경우 모든 농도에서 간의 중량이 고지방대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다(Table 3).

Table 3 . Changes of liver and fat weight (epididymal, retroperitoneal, peri-renal) in obese mice treated with black barley ferment extract (BBFE) for 8 weeks (g).

Group1)	Liver weight	Fat weight
		Epididymal	Retroperitoneal	Peri-renal
Normal	0.87±0.04b	0.46±0.09c	0.12±0.04c	0.04±0.01b
HF	1.09±0.08a	2.64±0.25a	0.73±0.06a	0.34±0.04a
HF＋BBFE100	1.03±0.07ab	2.16±0.16ab	0.66±0.05ab	0.24±0.03a
HF＋BBFE300	0.99±0.06ab	2.38±0.21ab	0.72±0.04a	0.28±0.03a
HF＋BBFE500	0.97±0.06ab	1.88±0.23b	0.56±0.05b	0.24±0.05a

Different superscripts (a-c) in the same column indicate significant differences between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test. The values are expressed as mean±SEM (n=8/group)..

¹⁾Normal, normal control group; HF, high fat group; HF＋BBFE100, high fat＋100 mg/kg/d; HF＋BBFE300, high fat＋300 mg/kg/d; HF＋BBFE500, high fat＋500 mg/kg/d..

비만은 체중의 증가보다는 체지방의 증가, 특히 피하지방보다는 복강 내에 위치한 지방조직의 증가가 건강상의 위해 요인으로 작용한다고 알려져 있다(Björntorp, 1987, 1990). Després(1993)에 따르면 체지방 함량이 동일하더라도 복부지방 함량이 증가할수록 대사성 합병증이 증가한다고 보고하였다. 따라서 실험동물에서 적출한 부고환주위지방(좌/우), 후복부지방(좌/우), 신장주위지방(좌/우)의 무게를 각각 측정하였다. 부고환주위지방은 고지방대조군에서 2.64±0.25 g으로 정상대조군이 0.46±0.09 g인 것에 비해 유의적으로 증가하였다. 반면 검정보리 발효추출물 투여군에서는 부고환주위지방의 무게가 감소하는 경향을 보였으며, 특히 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군에서 1.88±0.23 g으로 고지방대조군에 비해 유의적인 감소가 관찰되었다. 후복부지방의 무게도 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군에서 고지방대조군과 비교했을 때 유의적인 감소가 나타났으며, 신장주위지방의 중량은 고지방대조군에 비해 검정보리 발효추출물의 모든 투여 농도에서 감소하는 경향을 보였다. 따라서 검정보리 발효추출물은 지방조직의 감소에 효과적인 소재라 사료되며, 이는 앞서 검정보리 발효추출물 투여가 마우스의 체중증가를 억제한 결과와도 일치한다.

혈청 내 지질 농도

검정보리 발효추출물을 8주간 투여한 후 혈청 지질 농도에 미치는 영향을 관찰하였다(Fig. 4). 혈청 내 중성지방과 총콜레스테롤 함량은 정상대조군에 비해 고지방대조군에서 유의적으로 높게 나타났다. Park 등(2005)과 Wat 등(2009)은 고지방식이 급여가 정상군과 비교하여 혈중 중성지방과 총콜레스테롤 함량을 증가시킨다고 보고하였는데, 이는 본 연구 결과와 일치한다. 중성지방의 농도는 고지방대조군에서 137.1±24.9 mg/dL였으며, 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군에서는 각각 117.3±26.4, 125.1±11.7, 106.7±13.7 mg/dL로 고지방대조군과 비교하여 14.49, 8.75, 22.15% 낮게 나타났으며, 특히 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군의 중성지방 수치는 정상대조군과 비슷한 수준으로 나타났다. 총콜레스테롤 함량은 검정보리 발효추출물 투여군에서 고지방대조군에 비해 상대적으로 낮은 수치를 나타냈으나 유의성은 없었다. Delaney 등(2003)은 고콜레스테롤증을 유발한 실험동물에 대맥과 귀리 유래의 β-glucan을 셀룰로콜레스테롤 농도와 대체한 실험에서 혈장 내 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 농도가 각각 13.5, 19.4% 감소했다고 보고하였고, Kim 등(2021)은 보리새싹 열수 추출물 100 mg/kg/d 군이 고지방식이를 섭취한 쥐에서 혈중 중성지방 및 총콜레스테롤의 농도를 저하했으며, 이는 죽상 동맥경화증과 같은 심혈관질환과 밀접한 관련이 있는 동맥경화지수(atherogenic index) 수치를 개선하는 데 도움이 된다고 보고하였다.

Fig 4. Changes of triglyceride (A) and total cholesterol (B) in obese mice treated with black barley ferment extract (BBFE) for 8 weeks. The values are expressed as mean±SEM (n=8/group). Different letters (a,b) on the bars indicate significant differences between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test. Normal, normal control group; HF, high fat group; HF＋BBFE100, high fat＋100 mg/kg/d; HF＋BBFE300, high fat＋300 mg/kg/d; HF＋BBFE500, high fat＋500 mg/kg/d.

혈청 렙틴 농도 및 인슐린 수치 변화

혈청 렙틴 농도는 정상대조군이 1.73±0.13 pg/mL인 것에 비해 고지방대조군에서 2.48±0.2 pg/mL로 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5A). 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군은 각각 2.22±0.38, 2.27±0.37, 1.99±0.25 pg/mL로 고지방대조군과 비교하여 렙틴 농도가 감소하는 경향을 나타냈으며, 특히 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군에서는 고지방대조군 대비 19.78%의 유의적인 감소를 보였다. 렙틴은 식욕과 에너지 소비율을 조절하는 호르몬으로 체지방량에 비례하여 지방조직에서 분비되며, 뇌의 시상하부에서 식욕을 조절하여 체내 지방축적과 체중증가를 억제하는 기능을 한다(Zhang 등, 1994; Sainsbury 등, 1997). 따라서 검정보리 발효추출물의 투여에 의해 체지방 축적이 억제되었기 때문에 혈청 렙틴 농도 역시 낮게 나타나는 것으로 사료된다. 렙틴은 에너지가 과잉 축적될 경우 생성이 증가하며, 체중 및 체지방과 상관관계가 높아 비만의 지표로 사용될 수 있다(Havel, 2000). 이러한 관점에서 볼 때 검정보리 발효추출물 투여군에서 렙틴의 농도가 낮은 것은 앞서 확인된 체중과 지방조직의 감소와도 관련이 있을 것이다. 혈청 내 인슐린 농도는 고지방대조군이 1.82±0.19 ng/mL로 정상대조군 1.46±0.06 ng/mL에 비해 증가하였으나, 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군에서 각각 1.69±0.14, 1.76±0.18, 1.56±0.09 ng/mL로 고지방대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다(Fig. 5B). 특히 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군에서는 인슐린 농도가 고지방대조군 대비 14.10% 정도 유의적으로 감소하였음을 확인할 수 있다. 혈청 내 인슐린 함량은 체중 및 내장지방에 비례하여 함께 증가하는 것으로 보고되어 있으며(Lee 등, 2008), 검정보리 발효추출물 투여로 인해 인슐린 수치가 낮아지는 것은 체중감소와도 관련이 있을 것으로 추측된다.

Fig 5. Changes of leptin (A) and insulin (B) in obese mice treated with black barley ferment extract (BBFE) for 8 weeks. The values are expressed as mean±SEM (n=8/group). Different letters (a-c) on the bars indicate significant differences between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test. Normal, normal control group; HF, high fat group; HF＋BBFE100, high fat＋100 mg/kg/d; HF＋BBFE300, high fat＋300 mg/kg/d; HF＋BBFE500, high fat＋500 mg/kg/d.

유전자분석

검정보리 발효추출물을 8주간 투여한 후 간 조직 내에서 지방생성에 관여하는 전사인자의 발현 변화를 확인하였다(Fig. 6). 고지방대조군의 PPARγ 유전자 발현은 정상대조군과 비교했을 때 4배 정도 높게 나타났고, 검정보리 발효추출물 투여군은 모든 농도에서 정상대조군과 유사한 수준으로 유전자 발현이 감소하였다(Fig. 6A). 또한 C/EBPα 유전자 발현 역시 정상대조군과 비교했을 때 고지방대조군에서 현저히 높은 증가율을 보였고, 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군은 고지방대조군 대비 각각 64.89, 55.39, 14.50%로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 6B). 이는 보리 발효물(홍맥)을 3T3-L1 세포에 처리했을 때 C/EBPα와 PPARγ 및 SREBP-1의 유전자 발현 수치가 MDI 처리군과 비교하여 유의적으로 감소한 것(Kwon 등, 2021)과 고지방식이로 유도된 비만 동물모델에서 β-glucan 포함 식이를 4주간 섭취시켰을 때 지방분화 관련 유전자인 PPARγ 등의 발현이 현저히 감소(Kim, 2012)했다는 이전의 연구 결과와 일치한다. 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자에는 SREBPs, PPARs, C/EBPs 등이 있다(Brun 등, 1996; Gregoire 등, 1998; Saito 등, 2009; Tontonoz 등, 1995). 지방세포 분화 초기에 인슐린이나 dexamethasone 등에 의한 호르몬 유도로 C/EBPβ가 활성화되면 분화 후기에 지방세포의 전사인자인 C/EBPα와 PPARγ의 발현이 유도된다(El-Jack 등, 1999; Fox 등, 2006; Hamm 등, 2001). C/EBPα는 PPARγ와 상호 작용하여 영향을 미치는데(Cao 등, 1991), C/EBPα는 지방조직의 특이적 유전자들의 발현 전에 증가하여 에너지 항상성을 조절하고(Long과 Pekala, 1996), PPARγ는 지질합성의 주요 조절자로 백색지방조직에서 많이 발현된다고 알려져 있다(Spiegelman, 1998). 따라서 지질합성의 주요 조절인자인 C/EBPα와 PPARγ 수치가 고지방대조군보다 검정보리 발효추출물 투여군에서 유의적으로 감소하는 것은 검정보리 발효추출물이 지방생성에 중요한 역할을 하는 유전자의 발현을 억제함으로써 비만을 조절할 수 있음을 시사한다.

Fig 6. Changes of adipogenesis-related genes expression in obese mice treated with black barley ferment extract (BBFE) for 8 weeks. Relative mRNA expression levels of PARP-γ (A) and C/EBPα (B) in liver from normal and HF mice. Different letters (a-c) on the bars indicate significant differences between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test. Normal, normal control group; HF, high fat group; HF＋BBFE100, high fat＋100 mg/kg/d; HF＋BBFE300, high fat＋300 mg/kg/d; HF＋BBFE500, high fat＋500 mg/kg/d.

간효소 수치

AST와 ALT는 간장과 심장에 다량 분포하며 간세포가 손상되었을 때 유리되어 혈중으로 분비되므로 혈장에 존재하는 이들 효소의 양은 조직세포, 특히 간 손상의 척도로 사용되고 있다. 고지방식이에 의해 지방간 현상을 보인 고지방대조군의 AST는 148.4±27.7 U/L로, 정상대조군 114.1±16.3 U/L보다 높은 값을 나타내었고, 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군은 각각 131.1±19.4, 128.7±9.97, 115.7±30.5 U/L로 농도 의존적으로 수치가 감소하는 경향을 보였다(Fig. 7A). 특히 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군은 고지방대조군에 비해 AST가 22.03% 감소하여 정상대조군과 비슷한 수치를 나타냈다. 또한 고지방대조군에서 측정된 ALT 농도는 60.7±22.8 U/L로 정상대조군 24.1±4.83 U/L보다 약 2.5배 높은 수치를 보였고, 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군은 각각 50.2±16.14, 51.7±10.2, 40.3±19.4 U/L로 고지방대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다(Fig. 7B). AST와 마찬가지로 ALT 수치 역시 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군에서 고지방대조군 대비 33.63% 감소하였다.

Fig 7. Changes of aspartate transaminase (A) and alanine transaminase (B) in obese mice treated with black barley ferment extract (BBFE) for 8 weeks. Different letters (a-c) on the bars indicate significant differences between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple comparison test. Normal, normal control group; HF, high fat group; HF＋BBFE100, high fat＋100 mg/kg/d; HF＋BBFE300, high fat＋300 mg/kg/d; HF＋BBFE500, high fat＋500 mg/kg/d.

본 연구는 검정보리 발효추출물의 항비만 효과를 알아보기 위해 지방전구세포인 3T3-L1과 4주령된 C57BL/6N종 수컷 마우스를 이용하여 실험하였다. 지방세포 분화억제 효과를 확인하기 위해 검정보리 추출물과 검정보리 발효추출물을 3T3-L1 지방세포에 처리하였다. 세포독성이 나타나지 않은 2 mg/mL의 농도에서 Oil Red O 염색을 통해 지방세포 내 중성지방의 양을 측정한 결과, 검정보리 추출물보다 검정보리 발효추출물에서 최대 20%의 지방구 감소를 보이는 지방세포 분화억제 효과를 확인하였다. 검정보리 발효추출물의 항비만 효과를 관찰하기 위해 고지방식이와 검정보리 발효추출물을 8주간 경구투여하였다. 고지방대조군은 정상대조군과 비교하여 체중, 간 및 지방조직의 무게, 혈청 내 지질 수치가 증가하였다. 반면 검정보리 발효추출물 100, 300, 500 mg/kg/d 투여군에서는 체중, 간 및 지방조직 무게, 혈중 중성지방, AST 및 ALT 수치가 고지방대조군과 비교하여 감소하는 경향을 확인하였고, 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군에서는 유의적인 감소를 확인했다. 고지방식이에 의해 증가한 혈청 중 렙틴과 인슐린은 검정보리 발효추출물 500 mg/kg/d 투여군에서 유의적으로 감소하였으며, 지방생성 관련 유전자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현은 고지방대조군과 비교 시 검정보리 발효추출물 투여군에서 억제되었다. 이러한 결과는 검정보리 발효추출물의 투여가 지방전구세포에서 지방구의 생성을 억제하며, 고지방식이를 통한 비만유도 모델에서 체중, 간 및 지방조직 무게를 감소시키고 혈중 중성지방의 농도를 유의적으로 감소시키는 지질개선 효과가 있음을 나타낸다. 따라서 검정보리 발효추출물은 체지방 감소 및 혈중 지질 대사에 긍정적 영향을 미쳐 항비만 기능성식품 소재로 활용이 가능할 것으로 사료된다.

본 연구는 중소벤처기업부 전북테크노파크 지역특화산업육성+(R&D)-지역주력육성사업(과제번호: S3092195)의 일환으로 수행되었으며 이에 깊이 감사드립니다.