골관절염(osteoarthritis)은 전 세계적으로 매우 흔한 만성 염증성 퇴행성 질환이다. 우리나라도 최근 고령화 및 비만 인구의 증가로 골관절염 유병률이 빠른 속도로 증가하고 있어(KDCA, 2022), 골관절염은 건강한 삶을 위해 예방, 완화 및 치료가 시급한 중요한 건강 문제 중의 하나로 인식되고 있다.

골관절염은 관절을 이루는 연골, 인대, 근육에 점진적으로 손상 및 소실이 일어나서 염증과 통증이 생기고, 이에 따라 골극(osteophyte) 생성, 연골하골경화(subchondral sclerosis), 골낭종(bone cysts), 관절협착(arthrostenosis) 등으로 기형과 기능 장애 등 이차적인 문제가 야기되어 삶의 질을 저하하는 질병이다(Chen 등, 2017). 골관절염의 병리로는 연골세포에서 생성된 동화인자와 이화인자 사이의 대사적 불균형과 이에 의한 연골의 퇴화와 파괴가 특징이다. 분자생물학적 수준에서는 골관절염에서의 염증 및 활막의 연골 소실과 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines), 단백질 가수분해 효소(proteolytic enzymes), 일산화질소(nitric oxide, NO) 등과의 관련성이 많이 보고되었다(Sirse, 2022). 또한 골관절염과 관련 있는 유전자와 세포 신호전달체계와의 관련성이 보고되고 있다(Ansari 등, 2020).

골관절염의 증상을 완화하고 진행 속도를 늦추기 위한 다각적인 노력이 이루어지고 있으나 골관절염의 진행을 완전히 정지시킬 방법은 아직 알려지지 않았다. 심각한 골관절염의 치료법으로 관절 치환술이 시행되고 있으나, 주로 골관절염에는 진통제, 비스테로이드성 항염증제, 코르티코스테로이드 주사 등이 처방되고 있다. 이와 같은 약물들은 치료가 아닌 일시적 통증 완화 효과를 나타내는데, 장기간 복용 시 부작용과 독성을 초래한다고 알려져 있다(Bannuru 등, 2014; Nam 등, 2014; Rovati 등, 2016). 따라서 부작용과 독성이 없으면서 골관절염 완화 및 치료 효과를 나타내는 물질 개발이 시급한 실정이다. 예로부터 안전하게 사용되어온 식물 유래 전통 약제는 부작용과 독성이 없는 골관절염 완화 및 치료제 개발의 좋은 소재가 될 수 있을 것으로 판단되어 주목되고 있으며, 이를 활용한 골관절염 완화 및 치료제 개발을 위해서는 효능을 입증하고 기전을 밝히기 위한 다각적인 연구가 필요하다.

보스웰리아(Boswellia serrata)는 인도 고산지대와 아프리카 등지에서 자생하는 감람나무과(Burseraceae) 수목이다. 보스웰리아 나무의 줄기에 상처를 낸 경우 수액이 나와 굳어 인도 유향(indian frankincense)이라 불리는 검레진(gum resin)이 생성되는데, 이는 오랫동안 만성 염증성 질환 및 관절염 치료를 위한 전통 약제로 사용되고 있다(Mannino 등, 2016). 보스웰리아 검레진에는 테르펜, 테트라사이클릭 트리테르펜산 및 트리테르펜산(보스웰릭산, boswellic acid)이 함유되어 있다. 주요 보스웰릭산은 6종으로, keto-β-boswellic acid(KBA), 3-O-acetyl-11-keto-β-boswellic acid(AKBA), α-boswellic acid, β-boswellic acid, 3-O-acetyl-α-boswellic acid 및 3-O-acetyl-β-boswellic acid가 있다(Mannino 등, 2016). 6종의 보스웰릭산은 모두 항염 효과를 나타내는데(Singh 등, 2008; Zhang 등, 2021a; Zimmermann-Klemd 등, 2020), 이 중 KBA와 AKBA가 가장 강력한 항산화 효과 및 항염 효과를 나타낸다고 보고되었다(Bharat 등, 2022). 또한 KBA와 AKBA는 골소실 감소, 골 강화, 골 형성 증가 등 뼈 대사에도 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Mariano 등, 2022).

보스웰리아 검레진은 세포실험, 동물실험 및 인체적용실험에서 골관절염을 개선함이 보고되어(Abdel-Tawab 등, 2011; Chopra 등, 2013; Kimmatkar 등, 2003; Lee 등, 2021; Majeed 등, 2019; Nam 등, 2014; Notarnicola 등, 2016; Sengupta 등, 2008; Sontakke 등, 2007) 골관절염 개선을 위해 다양한 형태로 섭취되고 있고(Borner 등, 2021; Meins 등, 2016), 우리나라에서도 몇몇 보스웰리아 검레진 추출물은 관절 및 연골 건강 개선 건강기능성 개별인정원료로 상용되고 있다. 보스웰리아뿐만 아니라 모든 천연물 유래 추출물 제조 시 원재료 원산지 및 추출 공정 변화에 따라 추출물 내의 성분 및 함량 변화가 생겨 이로 인해 안전성 및 효능에 변화가 초래될 수 있다(Borner 등, 2021). 보스웰리아 검레진 에탄올 추출물로 KBA와 AKBA를 59.73 mg/g 함유한 추출물은 과산화수소 또는 lipopolysaccharide로 유도한 연골세포의 세포사 및 염증반응을 억제하였고 monosodium iodoacetate로 유도한 골관절염을 완화함이 보고되었다(Lee 등, 2021). 그러나 원산지 및 추출 공정을 달리하여 제조한 각각의 보스웰리아 검레진 추출물은 인체에 적용하기에 앞서 안전성 평가, 효능 평가 및 작용 기전 연구가 선행되어야 한다.

본 연구는 보스웰리아 검레진 추출물 제조 공정에서 헥산으로 지방을 제거하는 과정을 추가하여 KBA와 AKBA 함량을 높인 보스웰리아 검레진 추출물인 FJH-UBS의 골관절염 개선 효능을 평가하기 위해 수행하였다. 골관절염의 염증반응과 연골 분해 과정을 반영하는 대표적인 in vitro 골관절염 모델인 interleukin(IL)-1β로 자극한 SW1353 연골세포(Cecen 등, 2019; Gebauer 등, 2005; Pang 등, 2021)에서 FJH-UBS가 골관절염과 관련된 단백질과 유전자의 발현에 미치는 영향을 분자생물학적 수준에서 조사하였다.

재료

인체 유래 연골세포인 SW1353 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하여 사용하였다. 세포배양에 사용한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin 등은 Welgene Inc.에서 구입하여 사용하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma-Aldrich Co.에서, HyperScript^TM RT master mix kit은 GeneAll Biotechnology, Griess reagent system은 Promega에서 구입하여 사용하였다. RNeasyÒ Plus Mini kit과 Rotor-Gene^TM SYBR Green kit은 Qiagen에서 구입하여 사용하였다. Recombinant human IL-1β, IL-6와 tumor necrosis factor-α(TNF-α) 측정용 enzyme-linked immunosorben assay(ELISA) kit 및 prostaglandin E2(PGE2) 측정 kit은 R&D Systems에서 구입하여 사용하였다. Matrix metalloproteinase(MMP)-1, MMP-3 및 MMP-13 측정용 ELISA kit은 Abcam에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체(p65, phospho-p65, IκBα, phospho-IκBα, ERK, phospho-ERK, p38, phospho-p38, JNK, phospho-JNK, actin)는 Cell Signaling Technology에서 구입하여 사용하였다. BCA protein assay kit은 Thermo Scientific에서, LuminataTM Forte Western HRP Substrate는 Millipore Corporation에서 구입하여 사용하였다.

보스웰리아 검레진 추출물의 제조

본 연구에서는 (주)프롬바이오에서 제공한 보스웰리아 검레진 추출물(FJH-UBS)을 시험물질로 사용하였다. 인도산 보스웰리아 검레진에 95% 주정을 가하여 환류 조건에서 50~60°C로 6시간 동안 추출하였다. 추출액을 여과, 농축한 다음 농축액에 동일 양의 헥산을 가하여 상온에서 10분간 정치 후 여과하여 지방을 제거하였다. 여과액은 70°C에서 수분 함량이 5% 이하가 되도록 건조하고 말토덱스트린(10%, w/w)을 혼합하여 FJH-UBS를 제조하였다.

FJH-UBS의 주요 지표성분인 KBA와 AKBA의 함량은 high-performance liquid chromatography로 분석하였다. FJH-UBS 내의 KBA와 AKBA의 총함량은 81.96±0.77 mg/g으로 나타났다(n=3). 기존 추출 공정으로 제조한 보스웰리아 검레진 에탄올 추출물의 KBA와 AKBA의 총함량은 59.73 mg/g으로 보고된다(Lee 등, 2021). 이는 지방 제거 공정을 통해 기존 추출물에 비해 FJH-UBS 내의 KBA와 AKBA 함량이 증가하였음을 나타낸다.

세포 배양 및 IL-1β처리에 의한 염증 유도

SW1353 세포는 DMEM에 10%(v/v) FBS, 100,000 units/L penicillin 및 100 mg/L streptomycin을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37°C 습윤한 CO₂ 배양기(5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때 phosphate buffer saline(pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA를 처리하여 세포를 계대 배양하였고, 세포배양액은 2일마다 교환하였다.

골관절염에서 나타나는 염증반응을 유도하기 위해 SW1353 세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하였다. 즉 SW1353 세포를 10% FBS를 함유한 세포배양액으로 희석하여 일정한 수로 분주하고 24시간 배양한 후 FBS가 함유되지 않는 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 2시간 동안 serum starvation 하였다. 이후 10 ng/mL IL-1β를 첨가한 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 배양하여 염증반응을 유도하였다.

세포 생존율 측정

SW1353 세포를 10% FBS를 함유한 세포배양액으로 희석하여 5×10⁴ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 배양하였다. 24시간 동안 세포를 배양한 후 다양한 농도(0~50 μg/mL)의 FJH-UBS를 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환하여 세포를 24시간 배양하였으며, 이후 MTT assay 방법(Denizot과 Lang, 1986; Lim 등, 2019)으로 세포 생존율을 측정하였다.

FJH-UBS가 10 ng/mL IL-1β로 자극된 SW1353 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 배양하였다. 24시간 동안 세포를 배양한 후 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 2시간 동안 serum starvation 하였다. 이후 10 ng/mL IL-1β와 다양한 농도(0~50 μg/mL)의 FJH-UBS를 함유한 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 24시간 배양한 후 MTT assay 방법(Denizot과 Lang, 1986; Lim 등, 2019)으로 세포 생존율을 측정하였다.

Nitric oxide(NO) 측정

SW1353 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양한 후 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 2시간 동안 serum starvation 하였다. Serum starvation 후 10 ng/mL IL-1β와 다양한 농도(5, 10, 20 μg/mL)의 FJH-UBS를 함유한 serum-free DMEM으로 세포배양액을 교환하여 세포를 24시간 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 세포배양액을 수거하여 2,400×g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 취하였다. 세포배양액 내의 NO 함량은 Griess reagent system을 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.

ELISA에 의한 단백질 함량 측정

SW1353 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주한 후 위와 동일한 방법으로 IL-1β와 FJH-UBS를 처리하여 세포를 배양하고 세포배양액을 수거하였다. 세포배양액 내의 PGE2 함량은 PGE2 측정 kit을 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다. 세포배양액 내의 IL-6, TNF-α, MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 함량은 각각의 ELISA kit을 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.

Western blot에 의한 단백질 발현 측정

SW1353 세포를 6×10⁵ cells/well이 되도록 6-well plate에 분주한 후 위와 동일한 방법으로 IL-1β와 FJH-UBS를 처리하여 세포를 배양하였다. 24시간 동안 세포를 배양한 후 세포를 수거하여 Kim 등(2022)의 방법으로 total cell lysates를 제조하였다. Total cell lysates의 단백질 함량은 BCA protein assay kit을 사용하여 측정하였다. Kim 등(2022)이 제시한 방법에 따라 western blot 분석을 수행하였으며, 각 단백질 밴드는 Luminata^TM Forte Western HRP Substrate를 사용하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 가시화하였다. 가시화된 단백질의 발현 수준은 ImageQuant^TM LAS 500 imaging system을 사용하여 정량 분석하였다.

Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)에 의한 mRNA 발현 측정

SW1353 세포를 1×10⁵ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주한 후 위와 동일한 방법으로 IL-1β와 FJH-UBS를 처리하여 세포를 24시간 동안 배양하였다. Jung 등(2022)이 제시한 바와 동일한 방법으로 RNeasy Plus Mini kit을 사용하여 total RNA를 추출하였고 micro-volume spectrophotometer(BioSpec-nano, Shimadzu)를 사용하여 total RNA의 함량과 순도를 측정하였다. HyperScript^TM RT master mix kit을 사용하여 total RNA(2 μg)로부터 complementary DNA를 제조하였고, Rotor-Gene^TM SYBR Green kit을 사용하여 Rotor-Gene 3000(Corbett Research)에서 real-time PCR을 수행하였다. 실험에 사용한 primers sequences는 Table 1에 나타내었다. 각 유전자의 발현은 Rotor-Gene 6000 series System Software program, version 6(Corbett Research)을 이용하여 정량 분석하였으며 타켓 유전자의 mRNA 발현 수준은 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase mRNA 발현량으로 보정하여 나타내었다.

Table 1 . Primer sequences used in this study.

Target gene	Forward primer	Reverse primer (5′-3′)	Genebank No.
Aggrecan	5′-GAAAGGCATCGTGTTCCATT-3′	5′-ACGTCCTCACACCAGGAAAC-3′	XM_011521314.2
COX-2	5′-AAGTCCCTGAGCATCTACG-3′	5′-TTCCTACCACCAGCAACC-3′	NM_000963.4
IL-6	5′-AGACAGCCACTCACCTCTTCAG-3′	5′-TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG-3′	XM_005249745.6
iNOS	5′-GCTCTACACCTCCAATGTGACC-3′	5′-CTGCCGAGATTTGAGCCTCATG-3′	NM_00625.4
MMP-1	5′-ATGAAGCAGCCCAGATGTGGAG-3′	5′-TGGTCCACATCTGCTCTTGGCA-3′	NM_001145938.2
MMP-3	5′-CACTCACAGACCTGACTCGGTT-3′	5′-AAGCAGGATCACAGTTGGCTGG-3′	NM_002422.5
MMP-13	5′-CCAACCCTAAACATCCAAAAAC-3′	5′-AAAAACAGCTCCGCATCAAC-3′	NM_002427.4
TNF-α	5′-CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG-3′	5′-ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC-3′	NM_000594.4
Type Ⅱ collagen	5′-CCTGAGTGGAAGAGTGGAGA-3′	5′-TCCATAGCTGAAATGGAAGC-3′	XM_047428315.1
GAPDH	5′-ATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3′	5′-GCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′	NM_008084.3

COX-2, cyclooxygenase-2; IL-6, interleukin-6; iNOS, inducible nitric oxide synthase; MMP, matrix metalloproteinase; TNF-α, tumor necrosis factor-α; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase..

통계 분석

모든 결과는 mean±SEM으로 나타내었다. 수집된 결과는 Statistical Analysis System(SAS) Window version 9.4 (SAS Institute)를 이용하여 통계 분석하였다. 각 시험군 간의 유의성 검증은 Student’s t-test 또는 분산분석(analysis of variance, ANOVA)으로 분석하였고, 시험군 간의 다중 비교는 Duncan’s multiple range test로 분석하였다. P< 0.05일 때 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

FJH-UBS가 SW1353 세포의 세포 생존율에 미치는 영향

FJH-UBS가 연골세포인 SW1353 세포에 세포독성을 야기하는지 조사하기 위해 SW1353 세포에 다양한 농도(0~50 μg/mL)의 FJH-UBS를 처리하여 세포를 24시간 배양한 후 세포 생존율을 측정하였다. FJH-UBS의 처리 농도가 증가할수록 SW1353 세포의 세포 생존율은 유의적으로 증가하였다(Fig. 1A).

Fig 1. Effect of Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) on the cell viability in SW1353 cells. (A) Cells were plated at a density of 5×10⁴ cells/well in 24-well plates with DMEM supplemented with 10% FBS. After 24 h, cells were treated with various concentration of FJH-UBS and incubated for 24 h. (B) Cells were plated at a density of 1×10⁵ cells/well in 24-well plates with DMEM supplemented with 10% FBS. After 24 h, cell monolayers were rinsed with serum-free DMEM and serum-starved for 2 h in serum-free DMEM. And then cells were treated various concentration of FJH-UBS in serum-free DMEM containing 10 ng/mL recombinant IL-1β for an additional 24 h. At the end of the treatment period, cell viability was measured by the MTT assay. Each bar represents the mean±SEM. ^*P<0.05 significantly different from IL-1β-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

FJH-UBS가 IL-1β로 염증이 유도된 SW1353 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하기 위해 10 ng/mL IL-1β와 다양한 농도(0~50 μg/mL)의 FJH-UBS를 처리하여 세포를 배양한 후 세포 생존율을 측정하였다. IL-1β를 처리한 경우 처리하지 않은 군에 비해 세포 생존율이 9.7% 감소하였다. IL-1β와 함께 5, 10 및 20 μg/mL FJH-UBS를 처리한 경우 세포 생존율은 IL-1β만을 처리한 군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. IL-1β와 함께 50 μg/mL 보스웰리아 추출물을 처리한 경우 세포 생존율은 IL-1β만을 처리한 군에 비해 유의적으로 감소하였다(Fig. 1B). IL-1β 처리하에서 FJH-UBS의 세포독성에 의한 효과를 배제하기 위해 이후 실험에서는 SW1353 세포의 세포 생존율에 영향을 미치지 않은 농도인 5, 10 및 20 μg/mL로 FJH-UBS를 처리하여 수행하였다.

FJH-UBS가 IL-1β에 의해 유도된 염증 인자의 발현에 미치는 영향

IL-1β 처리 조건에서 FJH-UBS가 SW1353 세포의 NO, PGE2 및 염증성 cytokines(IL-6, TNF-α)의 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 IL-1β와 FJH-UBS를 처리하여 세포를 배양하고 세포배양액을 수거하여 분석하였다. Fig. 2에 나타난 바와 같이 IL-1β를 처리한 경우 NO, PGE2, IL-6 및 TNF-α의 생성이 현저히 증가하였다. IL-1β 처리에 의해 증가한 NO, PGE2, IL-6 및 TNF-α 생성은 FJH-UBS 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. NO, PGE2 및 TNF-α 생성은 FJH-UBS 처리 농도 5 μg/mL부터 유의적으로 감소하였고 처리 농도에 의존적으로 감소하였다. IL-6 생성은 20 μg/mL FJH-UBS 처리에서만 유의적으로 감소하였다(Fig. 2).

Fig 2. Effect of Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) on the production of inflammatory mediators in IL-1β-stimulated SW1353 cells. Cells were plated, stimulated by IL-1β (10 ng/mL), and treated various concentrations of FJH-UBS as described in Fig. 1B. The 24-h conditioned media were collected. (A) NO production was determined using the Griess reagent system. The contents of PGE2 (B), IL-6 (C), and TNF-α (D) in the conditioned media were measured using the relevant ELISA kits. Each bar represents the mean±SEM. ^***P<0.001 significantly different from IL-1β-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

IL-1β와 FJH-UBS를 처리하여 세포를 배양한 후 total RNA를 추출하였고, real-time RT-PCR을 수행하여 FJH-UBS가 iNOS, PGE2, IL-6 및 TNF-α mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. IL-1β 처리에 의해 iNOS, PGE2, IL-6 및 TNF-α mRNA 발현이 현저히 증가하였다. IL-1β 처리에 의해 증가한 iNOS, PGE2, IL-6 및 TNF-α mRNA 발현은 FJH-UBS 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. 20 μg/mL FJH-UBS를 처리한 경우 IL-1β만을 처리한 군에 비해 iNOS, PGE2, IL-6 및 TNF-α mRNA 발현이 각각 53.8%, 61.3%, 49.5% 및 64.3% 감소하였다(Fig. 3).

Fig 3. Effect of Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) on the mRNA expressions of inflammatory mediators in IL-1β- stimulated SW1353 cells. Cells were plated, stimulated by IL-1β (10 ng/mL), and treated various concentrations of FJH-UBS as described in Fig. 1B. Total RNA was extracted, reverse-transcribed, and real-time PCR was conducted. The mRNA expressions of iNOS (A), COX-2 (B), IL-6 (C), and TNF-α (D) were normalized to that of GAPDH and represented relative to the IL-1β-untreated group. Each bar represents the mean±SEM. ^**P<0.01, ^***P<0.001 significantly different from IL-1β-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

FJH-UBS가 IL-1β에 의해 유도된 MMPs의 발현에 미치는 영향

연골세포에서 FJH-UBS가 IL-1β에 의해 유도된 MMPs의 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 IL-1β와 FJH-UBS를 처리하여 SW1353 세포를 배양한 후 세포배양액을 수거하여 세포배양액 내의 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 함량을 측정하였고, 또한 total RNA를 추출하여 mRNA 발현을 조사하였다. IL-1β 처리에 의해 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 생성(Fig. 4)과 mRNA 발현(Fig. 5)이 현저히 증가하였다. IL-1β 처리에 의해 증가한 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 생성은 FJH-UBS 처리에 의해 유의적으로 감소하였으며, IL-1β 처리에 의해 증가한 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 mRNA 발현도 FJH-UBS 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. MMP-1과 MMP-3에 비해 MMP-13 생성과 mRNA 발현이 FJH-UBS 처리에 의해 현저히 감소하였으며, 20 μg/mL FJH-UBS를 처리한 경우 IL-1β만을 처리한 군에 비해 MMP-13 생성과 mRNA 발현이 각각 45.9%, 51.7% 감소하였다(Fig. 4, Fig. 5).

Fig 4. Effect of Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) on the production of MMPs in IL-1β-stimulated SW1353 cells. Cells were plated, stimulated by IL-1β (10 ng/mL), and treated various concentrations of FJH-UBS as described in Fig. 1B. The 24-h conditioned media were collected. The contents of MMP-1 (A), MMP-3 (B), and MMP-13 (C) in the conditioned media were measured using the relevant ELISA kits. Each bar represents the mean±SEM. ^***P<0.001 significantly different from IL-1β- untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

Fig 5. Effect of Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) on the mRNA expressions of MMPs in IL-1β-stimulated SW1353 cells. Cells were plated, stimulated by IL-1β (10 ng/mL), and treated various concentrations of FJH-UBS as described in Fig. 1B. Total RNA was extracted, reverse-transcribed, and real-time PCR was conducted. The mRNA expressions of MMP-1 (A), MMP-3 (B), and MMP-13 (C) were normalized to that of GAPDH and represented relative to the IL-1β-untreated group. Each bar represents the mean±SEM. ^***P<0.001 significantly different from IL-1β-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

FJH-UBS가 IL-1β에 의해 유도된 aggrecan과 collagen 발현에 미치는 영향

FJH-UBS가 IL-1β에 의해 유도된 aggrecan과 collagen 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 IL-1β와 FJH-UBS를 처리하여 SW1353 세포를 배양한 후 total RNA를 추출하여 real-time RT-PCR을 수행하여 mRNA 발현을 조사하였다. Aggrecan과 type II collagen mRNA 발현은 IL-1β 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. IL-1β 처리에 의해 감소한 aggrecan과 type Ⅱ collagen mRNA 발현은 10, 20 μg/mL FJH-UBS 처리에 의해 유의적으로 증가하였으며, 20 μg/mL FJH-UBS를 처리한 경우 IL-1β만을 처리한 군에 비해 aggrecan과 type Ⅱ collagen mRNA 발현이 각각 41.1%, 123.0% 증가하였다(Fig. 6).

Fig 6. Effect of Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) on aggrecan and type Ⅱ collagen mRNA expressions in IL-1β-stimulated SW1353 cells. Cells were plated, stimulated by IL-1β (10 ng/mL), and treated various concentrations of FJH-UBS as described in Fig. 1B. Total RNA was extracted, reverse-transcribed, and real-time PCR was conducted. The mRNA expressions of aggrecan (A) and type Ⅱ collagen (B) were normalized to that of GAPDH and represented relative to the IL-1β-untreated group. Each bar represents the mean±SEM. ^*P<0.05, ^***P<0.001 significantly different from IL-1β-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

FJH-UBS가 IL-1β에 의해 유도된 NF-κB와 MAPK 신호전달 경로에 미치는 영향

FJH-UBS가 IL-1β에 의해 유도된 NF-κB와 MAPK 신호전달 경로에 미치는 영향을 조사하기 위해 IL-1β와 FJH-UBS를 처리하여 SW1353 세포를 배양한 후 cell lysate를 추출하여 western blotting을 실시하여 신호전달 단백질의 발현을 조사하였다. Phospho-p65와 phospho-IκBα 발현은 IL-1β 처리에 의해 현저히 증가하였다.

FJH-UBS 처리에 의해 IL-1β에 의해 증가한 phospho-p65와 phospho-IκBα 발현이 유의적으로 감소하였다. IL-1β 및 FJH-UBS는 p65 발현에 유의적인 영향을 미치지 않았다. IκBα 발현은 IL-1β 처리에 의해 유의적으로 감소하였고, 20 μg/mL FJH-UBS 처리는 IL-1β에 의해 감소한 IκBα 발현을 증가하였다(Fig. 7A). NF-κB와 IκBα의 활성을 반영하는 phospho-p65/p65 ratio와 phospho-IκBα/IκBα ratio는 IL-1β 처리에 의해 현저히 증가하였고, 이는 FJH-UBS 처리에 의해 유의적으로 감소하였다(Fig. 7B, 7C).

Fig 7. Effect of Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) on NF-kB signaling pathway in IL-1β-stimulated SW1353 cells. Cells were plated at a density of 6×10⁵ cells/well in 6-well plates, stimulated by IL-1β (10 ng/mL), and treated various concentrations of FJH-UBS as described in Fig. 1B. Cell lysates were analyzed by western blotting using the corresponding antibodies. (A) Photographs of chemiluminescent detection of the blots, which are representative of 3 independent experiments, are shown. The relative abundance of each band to its own β-actin was quantified, and the control levels were set at 1. The relative expression ratio in phospho-p65 to its own p65 (B) and phospho-IkB to its own IkB protein band were quantified, the control levels were set at 1. Each bar represents the mean±SEM. ^**P<0.05, ^***P<0.001 significantly different from IL-1β-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

IL-1β 처리에 의해 phospho-ERK, phospho-p38 및 phospho-JNK 발현은 유의적으로 증가하였다. IL-1β에 의해 증가한 phospho-ERK, phospho-p38 및 phospho-JNK 발현은 FJH-UBS 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. IL-1β 및 FJH-UBS는 ERK, p38 및 JNK 발현에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 8A). Phospho-ERK/ERK ratio, phospho-p38/p38 ratio 및 phospho-JNK/JNK ratio는 IL-1β 처리에 의해 현저히 증가하였고, 이는 FJH-UBS 처리에 의해 유의적으로 감소하였다(Fig. 8B~D).

Fig 8. Effect of Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) on MAPK signaling pathway in IL-1β-stimulated SW1353 cells. Cells were plated at a density of 6×10⁵ cells/well in 6-well plates, stimulated by IL-1β (10 ng/mL), and treated various concentrations of FJH-UBS as described in Fig. 1B. Cell lysates were analyzed by western blotting using the corresponding antibodies. (A) Photographs of chemiluminescent detection of the blots, which are representative of 3 independent experiments, are shown. The relative abundance of each band to its own β-actin was quantified, and the control levels were set at 1. The relative expression ratio in phospho-ERK to its own ERK (B), phospho-p38 to its own p38 (B), and phospho-JNK to its own JNK protein band were quantified, and the control levels were set at 1. Each bar represents the mean±SEM. ^*P<0.05, ^**P<0.01 significantly different from IL-1β-untreated group. Mean without a common letter differ significantly at P<0.05.

본 연구에서는 SW1353 연골세포에 IL-1β 처리하여 골관절염에서 동반되는 염증반응 및 연골 분해를 유도한 in vitro 골관절염 모델(Cecen 등, 2019; Gebauer 등, 2005; Pang 등, 2021)에서 FJH-UBS가 골관절염에 미치는 영향과 그 기전을 조사하였으며, FJH-UBS가 활성화된 MAPK와 NF-κB 신호전달체계를 억제하여 염증매개물질(NO, PGE2, IL-6, TNF-α) 및 MMPs(MMP-1, 3, 13)를 억제하고 연골 기질(aggrecan, collagen) 분해를 억제하여 항골관절염 효능을 나타냄을 제시하였다(Fig. 9).

Fig 9. A schematic representation of possible mechanism by which Boswellia serrata gum resin extract (FJH-UBS) exert anti-osteoarthritis effect in SW1353 cells.

관절 조직과 체액에서 염증 조절과 관련한 인자들은 여러 가지가 있으며, 그중 산화적 스트레스와 염증성 사이토카인이 골관절염 유발과 밀접한 관련이 있다. 산화적 스트레스와 항산화제 사이의 불균형은 연골과 연골세포에서 활성산소종 생성을 증가시키고 이로 인해 연골 분해가 촉진된다(Asada 등, 1999; Lepetsos와 Papavassiliou, 2016). 산화적 스트레스는 골관절염 진행과 관련된 활막 염증, 연골세포 사멸, 연골 기질 합성 억제 및 이와 관련된 세포 내 신호전달체계를 촉진한다(Hu 등, 2017). iNOS에 의해 생성된 NO와 COX-2에 의해 생성된 PGE2는 extracellular matrix(ECM) 퇴화를 유도하여 골관절염을 유발하고(Sasaki 등, 1998; Zhang 등, 2021b), IL-1β는 iNOS와 COX-2의 증가를 유도함(Sheu 등, 2015)이 보고되었다. 또한 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등은 관절 연골의 변성 및 활막 염증을 일으키고 연골세포의 사멸을 증가시키며(Alluri 등, 2020; Ding 등, 2019), 연골세포에서 ECM 성분의 합성을 억제하여 골관절염을 유발한다(Alluri 등, 2020). 골관절염 환자는 정상인에 비해 혈액, 활액 및 연골조직 내 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 농도가 높고, 증가한 IL-1β, IL-6 및 TNF-α는 프로테오글리칸의 소실과 연골 기질의 분해를 유도하여 관절 연골을 퇴화시킨다(Sirse, 2022; Wojdasiewicz 등, 2014). 본 연구에서 IL-1β는 연골세포의 NO, PGE2, iNOS, COX-2, IL-6 및 TNF-α 발현이 현저히 증가하였고, FJH-UBS는 IL-1β에 의해 증가한 NO, PGE2, iNOS, COX-2, IL-6 및 TNF-α 발현을 억제하였다(Fig. 2, Fig. 3). 이는 연골세포에서 FJH-UBS가 IL-1β에 의해 유도된 염증반응을 억제함을 나타내며, 염증 억제를 통해 골관절염을 개선할 수 있음을 제시한다.

골관절염은 ECM 분해와 밀접한 관련이 있고, ECM 분해는 다양하고 복잡한 경로를 통해 조절된다(Zeng 등, 2017). MMPs는 정상 조직의 분화, 상처 치유, 기관 형성, 혈관 형성, 조직 흡수 및 재형성 등의 과정에 관여하지만, 골 및 연골의 기질 구성성분을 파괴하는 단백질 분해 효소로 작용하여 관절 및 연골 퇴화에 중요한 역할을 담당한다. MMPs는 콜라겐, 프로테오글리칸, 오스테오넥틴, 페르레칸을 분해하여 점진적으로 골관절염을 유발한다(Amalinei 등, 2010). 여러 MMPs 중에서 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13이 골관절염에서 발현의 증가함이 관찰되었으며, 골관절염의 발생과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다. 특히 IL-1β에 의한 MMPs 생성 증가가 IL-1β에 의해 유도된 골관절염의 주된 기전 중의 하나로 알려졌다(Zeng 등, 2017). MMPs는 연골세포에서 aggrecan과 type Ⅱ collagen의 합성을 저해한다(Yamamoto 등, 2016). Type Ⅱ collagen과 연골 프로테오글리칸인 aggrecan의 응집은 건강한 연골 기질 구성에 있어 필수적인 과정으로, type Ⅱ collagen과 aggrecan의 분해와 합성 감소는 연골의 퇴화를 초래하고 골관절염을 야기한다(Robinson 등, 2016). 본 연구에서 IL-1β는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 발현을 증가시켰고, type Ⅱ collagen과 aggrecan 발현을 감소시켰다. FJH-UBS는 IL-1β에 의해 증가한 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 발현을 억제하였고, IL-1β에 의해 감소한 type Ⅱ collagen과 aggrecan 발현을 증가시켰다(Fig. 4~6). 이는 FJH-UBS가 IL-1β로 활성화된 MMPs 발현을 억제하여 연골 기질의 퇴화를 효과적으로 억제할 수 있음을 제시한다.

ECM 분해 과정은 다양한 신호전달체계를 통해 조절되는데 그중 MAPK와 NF-κB가 연골 퇴화 및 골관절염 진행에 관여한 주요한 신호전달체계임이 보고되었다(Zhang 등, 2019). MAPK 신호전달체계는 ERK, p38, JNK로 구성되며, 핵으로 세포외 자극을 전달한다. MAPK 신호전달체계가 활성화되면 염증 및 ECM 분해에 관여하는 다양한 유전자의 발현을 조절하고 ECM 퇴화를 유도하여 골관절염을 유도한다(Sondergaard 등, 2010). NF-κB는 정상 상태에서는 세포질에서 Iκ-Bα 단백질과 결합하여 불활성 상태로 존재하다가 외부 자극에 의해 Iκ-Bα 인산화되어 활성화되면 p65 단백질이 핵 안으로 이동하여 전사인자로서 다양한 유전자의 발현을 조절한다. 특히 NF-κB는 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 전사를 조절하여 NO, PGE2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 생성을 조절한다(Takada 등, 2006). 골관절염의 병인 중의 하나인 염증반응에 관여하는 다양한 염증매개물질의 발현을 조절하는 주요한 전사인자인 NF-κB의 신호전달체계 활성을 억제하는 것은 골관절염의 예방, 완화 및 치료에 있어 매우 중요하다(Mariano 등, 2022). 또한 NF-κB의 신호전달체계 활성은 순차적으로 ECM 분해인자들의 발현을 촉진하여 연골 퇴화를 유발할 수 있으므로(Jenei-Lanzl 등, 2019), NF-κB의 신호전달체계 활성 억제는 골관절염의 예방, 완화 및 치료의 중요한 타겟이 될 수 있다. 본 연구에서 IL-1β에 의해 증가한 p65, Iκ-Bα, ERK, p38, JNK 인산화는 FJH-UBS에 의해 유의적으로 감소하였다. 이는 골관절염 세포 모델에서 FJH-UBS가 MAPK와 NF-κB 신호전달체계 활성을 억제하여 염증 및 ECM 분해인자의 발현을 조절함으로써 항골관절염 효과를 나타냄을 제시한다.

다양한 종류의 보스웰리아와 보스웰리아 추출물이 골관절염 개선을 위해 사용되고 있으나, 상당수의 제품은 품질 관리 및 효능에 대한 과학적인 근거가 부족한 실정이다(Abdel-Tawab, 2018; Borner 등, 2021). 본 연구에서는 인도산 보스웰리아 검레진의 주정추출물로, 기존의 추출 공정과는 차별되는 지방 제거 과정을 추가하여 제조한 보스웰리아 검레진 추출물인 FJH-UBS의 항골관절염 효능을 조사하였다. 인체유래 연골세포인 SW1353 세포에 IL-1β를 처리하여 유도한 골관절염 세포 모델에서 FJH-UBS는 MAPK와 NF-κB 신호전달체계 활성을 억제하여 염증반응과 연골 분해를 억제함으로써 항골절염 효능을 나타냄을 입증하였다. 본 연구는 세포 수준에서 이루어진 것으로 FJH-UBS를 관절 및 연골 건강 개선제로 활용하기 위해서는 향후 FJH-UBS의 골관절염 효능을 입증할 수 있는 동물실험 및 인체적용 시험이 시행되어야 할 것으로 사료된다.

본 연구는 인체유래 연골세포인 SW1353 세포에 IL-1β를 처리하여 유도한 골관절염 세포 모델에서 인도산 보스웰리아 검레진을 주정으로 추출 후 지방 제거 공정을 추가하여 제조한 보스웰리아 검레진 추출물인 FJH-UBS의 항골관절염 효능을 평가하기 위해 실시하였다. SW1353 세포에 IL-1β 처리 시 염증매개물질인 NO/iNOS, PGE2/COX-2, IL-6 및 TNF-α 발현과 연골 기질 분해에 기여하는 MMPs (MMP-1, MMP-3, MMP-13) 발현이 증가하였다. 또한 IL-1β 처리에 의해 연골의 구성성분인 aggrecan과 type Ⅱ collagen 발현이 감소하였다. FJH-UBS는 IL-1β에 의해 증가한 NO/iNOS, PGE2/COX-2, IL-6, TNF-α, MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 발현을 감소시켰고, IL-1β에 의해 감소한 aggrecan과 type Ⅱ collagen 발현을 증가시켰다. 골관절염의 염증반응과 연골 퇴화를 조절하는 주요한 신호전달체계인 MAPK(ERK, p38, JNK)와 NF-κB(p65, Iκ-Bα)의 인산화는 IL-1β에 의해 증가하였고, 이는 FJH-UBS에 의해 감소하였다. 이 결과는 FJH-UBS가 활성화된 MAPK와 NF-κB 신호전달체계를 억제하여 염증매개물질(NO, PGE2, IL-6, TNF-α) 및 MMPs(MMP-1, 3, 13)를 억제하고 연골 기질(aggrecan, collagen) 분해를 억제하여 항골관절염 효능을 발휘함을 나타내며, 이는 FJH-UBS를 관절 및 연골 건강 개선제로의 활용 가능성을 제시한다.

본 연구에 사용한 보스웰리아 검레진 추출물인 FJH-UBS를 제공해 준 (주)프롬바이오에 감사드립니다.