인체의 골은 형성과 재형성의 과정을 통해서 항상성이 유지되는데(Lee 등, 2006; Lee와 Lee, 2004), 골의 항상성은 조골세포와 파골세포의 적절한 균형에 의해 유지되고, 이를 통해 골은 하중의 지탱과 기관보호, 조혈작용 등의 역할을 수행함으로써 정상적인 골 대사가 이루어진다(Kim 등, 2011). 골의 재형성(bone remodeling)은 일정한 주기를 통해 국소적으로 좁은 부위에서 일어남으로써 골격계의 구조가 국소적 인자 사이의 복잡한 상호작용에 의해 조절된다(Shin 등, 2008). Mouse calvaria 유래의 조골세포인 MC3T3-E1 cell은 골 형성 과정 중 세포의 증식, 분화 및 석회화 등의 대사적 특징을 가지며, 전구체로부터 전조골세포와 골내막세포, 골세포로 분화되는 과정에 속하는 세포로 알려져 있다(Lee와 Lee, 2004). 세포막의 당단백 효소인 alkaline phosphatase(ALP)는 조골세포의 분화 초기에 나타나는 표지 인자로 석회화의 선행에 관여하며(Kim 등, 2001), 전조골세포가 골세포로 분화되는 과정에서 무기질을 형성하므로 골 석회화 형성능은 조골세포 분화에 중요한 후기 표지 인자로 알려져 있다(Declercq 등, 2005). 골 형성 대사는 다양한 호르몬과 사이토카인(cytokine) 및 여러 전사 인자에 의해 조절되는데, 골세포 분화과정 동안 type I collagen, osteopontin(OPN), osteocalcin(OCN), runt-related transcription factor 2(Runx2), osterix 등의 조골세포 분화 유전자의 발현을 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진하는 역할을 한다(Im, 2008; Komori, 2005). 골 밀도 및 강도가 손상될 경우 골절의 위험이 높아 골다공증이 발생하게 되는데, 현재 이를 치료하기 위해 사용되고 있는 약물에는 골 흡수를 억제하여 골 교체율을 감소시키는 골 흡수 억제제와 골량을 증가시키는 골 형성 촉진제가 있으나, 이러한 약물들은 식도염이나 궤양, 소화 장애, 어지럼증 등의 부작용이 보고되어 있기에(Choi, 2002; Moon과 Won, 2008) 이를 보완할 수 있는 천연물 성분 및 식품 등의 대체요법이 필요한 실정이다.

식물과는 다른 2차 대사산물을 생합성 하며 다양한 기능성 물질을 함유한 해조류는 면역증진과 항염, 항균, 항암, 항바이러스 및 항산화 등의 다양한 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다(Ruberto 등, 2001; Yoo 등, 2004). 또한 열량이 낮고 비타민과 무기질, 식이섬유 등이 풍부하며, 단백질과 필수지방산, 카로티노이드 및 폴리페놀과 같은 생리활성물질을 함유하고 있다(Jeon 등, 2012; Kumar 등, 2008). 해조류로부터 분리된 페놀성 화합물과 phlorotannin 및 fucoxanthin은 항돌연변이 및 항산화 활성을 가지고, sulfated polysaccharides는 항바이러스, 항암 활성, 항고혈압 및 항혈액 응고 작용을 하며 항산화물질과 유리 라디칼 제거제로서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Yan 등, 1999; Zhang 등, 2004). 홍조류에 속하는 불등풀가사리(Gloiopeltis furcata)는 한국과 일본 및 미국 태평양 연안 등에 분포하고 있으며, 적갈색을 띠고 외부는 가죽질의 긴 막대 모양으로 속은 비어 있어 점액질이 풍부한 것으로 알려져 있고(Park 등, 2005), 불등풀가사리에 주로 함유된 다당은 sulfate 함량, 분자량, 당 골격의 sulfate 위치, 당 성분 및 glycosidic branching에 의존적으로 항산화 및 항암 등의 효과를 나타내고 있다(Wang 등, 2010). 불등풀가사리에 관한 연구로는 피부 주름 개선 효과(Lee와 Hong, 2017), 백혈병세포 증식 억제 효과(Choi 등, 2006), 암세포 증식 억제 효과(Park 등, 2005) 및 항산화 효과(Fang 등, 2010; Lee와 Hong, 2017) 등이 보고되어 있으나 조골세포를 이용한 골다공증 예방 효과에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.

따라서 본 연구에서는 불등풀가사리 추출물의 항산화 활성을 검토하며, 조골세포에 대한 분화와 골 형성에 미치는 영향을 확인하기 위해 MC3T3-E1 세포의 증식률과 ALP의 활성 및 Alizarin Red 염색법에 의한 석회화 정도를 측정하고 조골세포 관련 유전자인 OPN과 Runx2 및 osterix 단백질 발현 정도를 분석하고자 하였다.

실험재료 및 시료 제조

본 연구에 사용한 불등풀가사리는 제주도에서 채취하여 세척 후 자연 건조한 분말 형태의 제품으로 파라제주에서 구입하여 시료로 사용하였다. 불등풀가사리 분말에 10배량의 80% 에탄올(Avantor, Inc.)을 가하여 80°C에서 8시간 동안 2회 추출하였다. 추출물은 Whatman No. 2 filter paper(Whatman International Ltd.)로 2회 여과하여 rotary vacuum evaporator(EYELA N-1000, Rikakikai Co.)로 농축한 다음, 동결건조 장치(Ilshin BioBase)를 사용하여 동결건조한 후 -70°C에 보관하면서 실험에 사용하였다. 불등풀가사리 에탄올 추출물의 수율은 4.33%였다.

총 폴리페놀 함량 측정

불등풀가사리 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법(Singleton 등, 1999)에 따라 측정했으며, 표준물질로는 gallic acid(Sigma Aldrich Co.)를 사용하였다. 일정 농도의 시료를 시험관에 취하고 증류수를 가해 2 mL로 정용한 후 50% Folin-Ciocalteu reagent(Sigma Aldrich Co.) 0.3 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 5분간 실온에서 반응시켰다. 혼합물에 7.5% Na₂CO₃ 용액 0.4 mL를 가하여 혼합하고 50°C에서 5분간 발색시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 불등풀가사리 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 mg gallic acid equivalents(GAE)/g으로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

불등풀가사리 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Blois(1958)의 방법에 따라 DPPH에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 96-well plate에 시료와 150 µM DPPH(Sigma Aldrich Co.) 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후, ELISA reader(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료를 첨가하지 않은 대조군과의 흡광도 차를 비교하여 유리 라디칼의 제거 활성을 백분율(%)로 나타내었다.

$$DPPH라디칼소거활성\left(\%\right)=\left(1-\frac{시료첨가구의흡광도}{시료무첨가구흡광도}\right)\times 100$$

Superoxide dismutase(SOD) 활성 측정

불등풀가사리 에탄올 추출물의 SOD 활성은 SOD assay kit(Sigma Aldrich Co.)을 사용하여 manufacturer’s instruction에 기술된 방법에 따라 측정하였다. 농도별로 희석한 시료 20 μL를 96-well plate에 분주한 후 WST working solution 200 μL와 enzyme working solution 20 μL를 첨가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 효소 대신 20 μL의 dilution buffer를 넣고 측정하였다. SOD 활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다.

$$SOD활성\left(\%\right)=\left(1-\frac{시료첨가구의흡광도}{시료무첨가구흡광도}\right)\times 100$$

MC3T3-E1 조골세포의 배양

Mouse calvaria 유래의 조골세포인 MC3T3-E1 cell은 American Type Culture Collection(CRL-2593)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 α-minimum essential medium 배지에 10% fetal bovine serum(Thermo Fisher Scientific)과 1% penicillin(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 37°C, 5%의 CO₂ incubator(Panasonic Healthcare Holdings Co.)에서 3일마다 배지를 교환하면서 실험하였다. 분화유도를 위해 10 mM β-glycerol phosphate(Sigma Aldrich Co.)와 50 μg/mL의 L-ascorbic acid를 첨가한 분화유도 배지를 제조하여 처리했으며, 4~14일 동안 3일마다 배지를 교환하였다.

Cell proliferation 측정

세포의 증식은 Green 등(1984)의 방법에 의한 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT) assay로 측정하였다. 배양한 MC3T3-E1 cell을 5×103 cells/mL로 96-well plate에 분주하여 24시간 배양한 후, 분화유도 배지로 교환하여 7일간 배양하였다. 그 후 대조군과 함께 농도별로 준비된 불등풀가사리 추출물을 첨가한 후 CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT(0.5 mg/mL) 시약을 각각의 well에 첨가하고 CO₂ incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 생성된 불용성 formazan 결정을 용해시킨 뒤 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포증식률은 불등풀가사리 추출물의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

ALP 활성 측정

배양한 MC3T3-E1 cell을 2×104 cells/mL로 조정하여 6-well plate에 24시간 동안 배양한 후 분화유도 배지로 4일간 배양하였다. 농도별로 준비된 불등풀가사리 추출물을 첨가하여 CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 harvest 하여 0.2% triton X-100을 넣고 CO₂ incubator에서 30분간 lysis 시켰다. 단백질량은 표준시료로 bovine serum albumin(BSA)을 이용한 Bradford법(1976)을 사용하여 표준 곡선을 작성한 후 정량하였다. 얻어진 양에 100 mM p-nitrophenylphosphate(Thermo Fisher Scientific)를 첨가한 뒤 CO₂ incubator에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 3 M NaOH를 넣어 반응을 정지시켜 ELISA reader로 405 nm에서 흡광도를 측정 후 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 산출하였다(Cho, 1995).

Alizarin Red 염색법에 의한 골 석회화 형성도 측정

배양한 MC3T3-E1 cell을 5×10³ cells/mL로 조정하여 6-well plate에 24시간 동안 배양한 후 석회화 유도를 위해 분화유도 배지로 14일간 배양하였다. 농도별로 준비된 불등풀가사리 추출물을 첨가하여 CO₂ incubator에서 24시간 배양하였으며, 배양 후 70% 에탄올로 4°C에서 1시간 동안 세포를 고정시켰다. Alizarin Red solution(Sigma Aldrich Co.)은 10 mL 증류수에 40 mM이 되도록 농도를 맞춘 후 pH 4.2로 조정하였다. 세포 고정 후, Alizarin Red solution(2 mL/well)으로 10분간 염색하여 증류수로 3회 세척하였다. Inverted microscope(Olympus Optical)를 통해 nodule 형성 확인 후, 10% cetylpyridinium chloride를 포함하는 10 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 2 mL/well을 첨가하여 용해시킨 다음 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot 분석

Western blotting 분석법을 통해 대표적인 osteoblast 분화 인자인 OPN과 Runx2 및 osterix 단백질 발현 양상을 살펴보았다. MC3T3-E1 세포를 T-75 flask에 2×105 cells/mL로 분주한 후 7일간 배양한 다음 불등풀가사리 추출물을 처리하여 CO₂ incubator에서 24시간 동안 분화 배양하였다. RIPA buffer를 첨가하여 원심분리한 상층액을 취해 BSA kit(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. 정량한 값을 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamaide gel에서 전기영동을 이용하여 단백질을 분리하였다(Schägger와 von Jagow, 1987). 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride membrane에 100 V로 1시간 transfer 한 후 5% skim milk에 넣어 상온에서 1시간 정도 blocking 시킨 후 TBS-T로 15분간 3회 세척하였다. Osterix(Abcam, 1:1,000), OPN(Santacruz, 1:1,000), Runx2(Santacruz, 1:1,000)로 희석한 1차 항체를 처리하여 12시간 반응시킨 후 TBS-T로 15분간 3회 세척한 다음 2차 항체로 horseradish peroxidase와 결합한 anti-rabbit IgG와 anti-mouse IgG(Cell signaling Technology)를 1:3,000으로 희석하여 1시간 반응시켰다. 그 후 membrane을 TBS-T로 15분간 5회 세척한 다음 ECL kit(Bio-Rad)을 사용하여 Luminescent Image Analyzer Davinch-Chemi™(Davinch-K Co., Ltd.)를 통해 측정하였다.

통계처리

실험 결과는 통계 SAS package(Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc.)를 사용하여 각 시료의 평균과 표준편차를 계산하였고, 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하여 P<0.05에서 시료 간의 유의차를 검정하였다.

총 폴리페놀 함량

본 연구에서 불등풀가사리 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과(Table 1), 3.04 mg GAE/g으로 나타났다. Kim 등(2006)은 김과 괭생이모자반, 구멍쇠미역, 곰피 75% 메탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량이 각각 0.35, 7.22, 10.84, 2.44 mg GAE/g으로 갈조류인 괭생이모자반과 구멍쇠미역의 함량이 높은 것으로 보고하였고, Shin과 Kang(2021)은 긴불레기말과 털비말 및 반주름말 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량을 각각 41.84, 36.27, 47.19 mg GAE/g으로 보고하였다. 또한 Kwak 등(2005)은 파래, 김, 미역, 톳, 다시마 95% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량이 각각 8.97, 3.81, 2.43, 1.44, 1.17 mg rutin equivalent/g으로 파래의 함량이 가장 높은 것으로 보고하였고, Shin 등(2006)은 꼬시래기, 갈래곰보, 돌가사리, 진두발 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량을 각각 78.4, 62.8, 45.5, 57.5 mg caffeic acid equivalent/g으로 보고하였다. Kim과 Lee(2004)는 동결건조 톳과 50°C 열처리 건조 및 천일건조 톳의 총 폴리페놀 함량을 각각 9.76, 9.64, 6.87 mg tannic acid equivalent/g으로 동결건조 톳의 함량이 높은 것으로 보고하였는데, 이와 같은 결과는 햇빛에 의해 톳의 폴리페놀이 산화 및 파괴되어 그 함량이 감소한 것으로 판단하였다. 본 연구 결과 불등풀가사리는 같은 홍조류인 김과 일반적으로 폴리페놀 함량이 높은 것으로 알려진 갈조류인 곰피, 미역, 톳, 다시마보다 폴리페놀 함량이 높은 것으로 나타났다.

Table 1 . Total polyphenol content of Gloiopeltis furcata ethanol extract.

Sample	Total polyphenol (mg GAE/g)1)
Gloiopeltis furcata ethanol extract	3.04±0.072)

¹⁾GAE standards for gallic acid equivalent..

²⁾Mean±SD (n=3)..

천연 항산화제로 알려진 폴리페놀 화합물은 항암 및 항균 작용 등의 효과를 지니는 것으로 알려져 있는데(Park 등, 2012), 자외선, 유리 라디칼 및 기타 강력한 산화제의 형성으로 이어지는 높은 산소 농도로 인한 산화 스트레스로부터 해조류를 보호하는 데 중요한 역할을 하며, 특히 갈조류와 홍조류는 플로로탄닌(phlorotannin)이라는 폴리페놀 화합물을 함유하고 있다(Ferreres 등, 2012; Li 등, 2011). 플로로탄닌은 활성산소와 DNA 손상에 대한 강력한 억제 활성을 보이며, 유리 라디칼 소거 활성 및 DNA 손상 억제 활성이 우수하고(Ahn 등, 2007) 녹차 카테킨을 비롯한 육상 식물에서 추출한 폴리페놀보다 더 강력한 유리 라디칼 제거제로 알려져 있는데(Hemat, 2007), 활성산소종(reactive oxygen species)의 생성 억제(Zhang 등, 2006)와 알레르기, 암세포, 염증 상태 감소 및 피부 노화 예방 등에 효과가 있는 것으로 보고되어 있다(Ferreres 등, 2012). 따라서 불등풀가사리의 총 폴리페놀 함량은 플로로탄닌에서 기인하여 항산화 활성 또한 높은 것으로 사료된다.

DPPH 라디칼 소거능

알코올 등의 유기용매에서 매우 안정적인 DPPH는 항산화 기작 중에서 proton-radical scavenger에 의해 자색이 탈색되어 항산화 활성을 쉽게 확인할 수 있는 실험법이다(Park 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 불등풀가사리 추출물의 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 Fig. 1에 나타내었다. 불등풀가사리 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가했는데(P<0.05), 1,000 μg/mL 농도에서의 DPPH 라디칼 소거 활성은 92.41%의 높은 소거능을 보였다. Lee와 Hong(2017)은 불등풀가사리 유래 다당류의 DPPH 라디칼 소거능을 검토하였고, 효소 분해 구간의 DPPH 라디칼 소거 활성은 14.97~23.10%로 viscozyme 효소 구간에서 가장 높은 것으로 보고하였다. 한편, Shin 등(2006)은 70% 에탄올로 추출한 갈래곰보와 꼬시래기, 진두발, 꼬시래기 및 돌가사리 1,000 mg/mL 농도에서의 DPPH 라디칼 소거능이 각각 33.33%, 56.88%, 27.9%, 70.52%로 돌가사리의 소거능이 가장 높은 것으로 보고하였고, Kwak 등(2005)은 95% 에탄올로 추출한 톳과 미역, 다시마, 파래 및 김 1,000 mg/mL 농도에서의 DPPH 라디칼 소거능이 각각 9.47%, 1.43%, 16.61%, 35.95%, 15.48%로 파래의 소거능이 가장 높은 것으로 보고하였다. 해조류의 항산화 활성은 단일 성분이 아닌 다양한 성분이 복합적으로 존재함으로써 보호 효과 또는 상승효과가 나타나며(Shin 등, 2006), 인체의 노화와 질병을 억제하는 데 중요한 역할을 하는 라디칼 소거 작용은 페놀성 화합물에 의한 항산화 작용으로 이러한 물질들의 환원 효과가 클수록 DPPH 라디칼 소거능이 크다고 알려져 있다(Cha와 Cho, 1999; Park 등, 2012). 본 연구 결과 불등풀가사리의 DPPH 라디칼 소거능은 불등풀가사리에 함유된 플로로탄닌을 비롯한 폴리페놀 화합물에서 기인하여 항산화 효과를 나타내는 것으로 판단된다.

Fig 1. DPPH free radical scavenging activity of Gloiopeltis furcata ethanol extract. Results are mean±SD of triplicate data. Vitamin C (Vit. C, 50 μg/mL) is used as positive control. Values with different letters (a-f) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

SOD 활성

활성산소는 생체막의 인지질을 과산화시키고 유리 라디칼의 연쇄반응을 유도하여 세포노화와 암, 당뇨병, 동맥경화 등의 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다(Choi 등, 2003).

SOD는 체내에서 superoxide anion radical을 과산화수소(H₂O₂)로 전환하는 반응을 촉매하는 항산화 효소로(Kim 등, 2003) SOD에 의해 생성된 과산화수소는 peroxidase와 catalase 등에 의해 무해한 물과 산소로 전환되어 생체를 보호하는 것으로 알려져 있다(Kang, 2011). 따라서 본 연구에서는 SOD 활성을 가진 천연물 소재의 탐색을 위해 불등풀가사리 추출물의 농도에 따른 SOD 활성을 측정하여 Fig. 2에 나타내었다. 그 결과, 불등풀가사리 추출물은 10~500 μg/mL의 농도 범위에서는 유의적인 차이가 없었으나 1,000 μg/mL에서는 54.26%로 유의적으로 활성이 증가하였다(P<0.05). Shin 등(2006)은 갈래곰보와 진두발, 꼬시래기 및 돌가사리 70% 에탄올 추출물 1,000 mg/mL 농도에서의 SOD 유사 활성이 각각 20.93%, 34.59%, 22.98%, 25.48%로 진두발의 활성이 가장 높은 것으로 보고하였다. SOD 활성이 있는 물질을 탐색하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 불등풀가사리의 SOD 활성에 관한 연구는 부족한 실정이다. 본 연구 결과 불등풀가사리 추출물은 총 폴리페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD 활성이 높은 것으로 나타났기에 천연물 유래 항산화제로 충분한 가치가 있는 것으로 사료된다.

Fig 2. Superoxide dismutase (SOD) activity of Gloiopeltis furcata ethanol extract. Results are mean±SD of triplicate data. Vitamin C (Vit. C, 50 μg/mL) is used as positive control. Values with different letters (a-c) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

인체는 필요한 에너지 생산을 위해 호흡대사 과정 중 활성산소종과 같은 산화 촉진 물질을 발생시켜 일부 면역기능에 작용하여 인체를 보호하는 역할을 하지만(Lee 등, 2009), 활성산소종의 축적은 골다공증을 포함한 많은 만성 및 퇴행성 질환들을 유발한다(Almeida, 2012). 이 질환들은 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성과 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수 사이의 불균형을 초래하며, 조골세포의 세포사멸사(apoptosis) 증가 및 파골세포의 세포사멸 감소를 동반한다(Pellegrini 등, 2016). Basu 등(2001)은 55세 이상의 여성과 남성에게서 산화적 스트레스가 증가함에 따라 골밀도가 감소한다고 보고했는데, 최근에는 활성산소로 인한 산화적 스트레스와 골 건강과의 관련성에 관한 연구가 진행되고 있다. 따라서 본 연구에서도 불등풀가사리의 높은 항산화 활성이 조골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 실험을 진행하였다.

MC3T3-E1 조골세포 증식 유도

Mouse calvaria 유래 MC3T3-E1 세포는 체내에서 일어나는 조골세포의 증식과 분화 및 석회화 등의 유사한 대사적 특징을 가지고 있기에 골 형성과 관련된 연구에서 많이 사용되고 있다(Kim 등, 2011). MC3T3-E1 조골세포에서 불등풀가사리 추출물의 독성 여부를 확인하기 위해 추출물을 10~500 μg/mL까지 농도별로 처리하여 MTT 분석을 통해 세포생존율을 측정하였다. 그 결과(Fig. 3), 10, 50, 100 및 500 μg/mL 농도의 불등풀가사리 추출물로 처리된 MC3T3-E1 세포의 세포생존율은 각각 110.20%, 122.31%, 123.13% 및 75.19%로 100 μg/mL 이하에서는 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 이후 세포실험은 독성을 나타내지 않은 농도인 100 μg/mL 이하의 불등풀가사리 추출물을 처리하여 실험을 진행하였다.

Fig 3. Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on proliferation of the MC3T3-E1 osteoblastic cells by the MTT assay. Results are mean±SD of triplicate data. Values with different letters (a-d) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

ALP 활성

조골세포는 골 표면에 근접해 있으며 세포막에 당단백 효소인 ALP를 가지고 있는데, ALP는 인과 칼슘의 대사에 관여하는 효소로 기질 특이성과 염기성 pH에서 활성을 나타내며, 세포외막 및 석회화 조직에서 높은 농도로 발견되어 석회화 과정에서 무기인산의 운반과 세포분열이나 분화의 조절자 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2011; Lee 등, 2006; Lee와 Lee, 2004; Shin 등, 2008; Yun 등, 2011). 불등풀가사리 추출물의 농도에 따른 ALP 활성을 분석한 결과는 Fig. 4와 같다. 불등풀가사리 추출물을 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리했을 때 ALP 활성은 각각 118.93%, 115.21%, 79.99%로 10~50 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비해 유의적으로 증가했으나, 100 μg/mL의 농도에서는 ALP 활성이 억제되는 것으로 나타났다. Kim(2015)은 갈조류인 고리매 에탄올 추출물 50 μg/mL 농도에서 120% 이상의 ALP 활성이 있는 것으로 보고하였고, Jeon과 Kim(2011)은 갈조류인 톳 부탄올 분획물 1 μg/mL의 농도에서 120% 이상의 ALP 활성이 있는 것으로 보고하였다. 천연물의 ALP 활성에 관한 연구에서 Yun 등(2011)은 감국 에탄올 추출물 30 μg/mL 농도에서 122%로 ALP 활성이 증가하는 것으로 보고하였고, Kim 등(2020)은 1~100 μg/mL의 홍국색소 첨가에 의해 ALP 활성이 유의적으로 증가하는 것으로 보고하였으며, Shin 등(2008)은 0.01~1 μg/mL의 황금 에탄올 추출물 처리에 의해 ALP 활성이 유의적으로 증가하는 것으로 보고하였다. 또한 Lee와 Lee(2004)는 복분자 메탄올 추출물 0.1, 1, 10, 100 μg/mL의 농도에서 ALP 활성은 각각 95.6%, 100% 이상, 140% 이상, 80% 이하로 100 μg/mL 농도에서는 ALP 활성이 억제되는 것으로 나타나 본 연구와 유사한 경향이었다. 색소 물질을 함유하고 항산화 활성이 우수한 천연물 소재가 ALP 활성을 촉진하는 것으로 알려져 있는데(Kim 등, 2020), 본 연구 결과 항산화 활성이 높은 불등풀가사리 에탄올 추출물은 10~50 μg/mL의 농도에서 조골세포의 분화를 촉진하여 골밀도 유지에 도움을 줄 것으로 사료된다.

Fig 4. Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on alkaline phosphatase (ALP) activity of MC3T3-E1 osteoblastic cells during differentiation. Results are mean±SD of triplicate data. Values with different letters (a-c) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Alizarin Red 염색법에 의한 골 석회화 형성도

골 석회화 형성능은 조골세포의 분화에 중요한 표식 인자로(Shin 등, 2008; Yun 등, 2011), 식물성 염료인 Alizarin은 칼슘에 특이하게 흡착력이 높고 무기질화된 세포의 기질에 염색되므로 석회화된 양과 염색 정도가 상호 비례한다고 알려져 있다(Maeda 등, 2001; Schiller 등, 2001). 따라서 본 연구에서도 불등풀가사리 추출물이 조골세포의 분화에 작용하는 후기 표지 인자인 골 석회화에 미치는 영향을 Alizarin Red staining을 사용하여 칼슘 침착 정도를 측정하였다. 10~100 μg/mL 농도의 불등풀가사리 추출물을 처리하여 석회화 형성도를 현미경으로 관찰한 결과(Fig. 5), 대조군에 비해 calcium spot이 많이 형성된 것을 확인할 수 있었는데, 특히 10~50 μg/mL 농도에서 높은 석회화 형성능을 보였다. 불등풀가사리 추출물에 의한 석회화 정도를 수치화한 결과(Fig. 6), 모든 농도에서 대조군에 비해 높은 석회화 형성능을 보였는데, 시료 50 μg/mL 농도에서 133.86%로 최대 활성을 나타내었다. 불등풀가사리 추출물의 ALP 활성 측정에서도 50 μg/mL 농도에서 115.21%로 가장 높게 나타났는데, ALP 활성과 골 석회화 형성능과의 관련성 연구에서 ALP 활성이 높은 소재일수록 골 석회화에서도 높은 활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Seo와 Kim, 2012). 또한 우리의 이전 연구에서도 갈조류인 넓패 추출물 처리 농도에 의존적으로 골 석회화가 증가함을 보고한 바 있다(Kim 등, 2019). 본 연구 결과 불등풀가사리 추출물은 10~50 μg/mL 농도에서 초기 분화 인자인 ALP 활성을 증가시키며, 후기 분화 인자인 석회화 형성능을 향상시켜 MC3T3-E1 조골세포의 증식 촉진 효과가 있음을 시사한다.

Fig 5. Alizarin Red S staining of MC3T3-E1 cells for calcification after treatment with Gloiopeltis furcata ethanol extract for 14 days at ×10 magnification.

Fig 6. Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on mineralization of MC3T3-E1 osteoblastic cells. Results are mean±SD of triplicate data. Values with different letters (a,b) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Western blot 분석을 통한 골 형성 관련 단백질 발현

골의 형성과정은 초기 세포 증식기와 골기질 형성 및 성숙기, 석회화기로 이루어져 골세포의 분화 시에 골 관련 유전자인 type Ⅰ collagen, ALP, OPN 등의 형질표현 유전자들이 발현되는데, 이들은 시기별로 초기 세포증식, 연속적 생합성, 조직화 및 세포외기질의 석회화에 관여한다(Kim과 Koh, 2004). 골세포의 분화 및 골 형성에 관여하는 중요한 신호전달 체계는 대표적으로 transforming growth factor-β(TGF-β)와 bone morphogenetic protein(BMP), Wnt/β-catenin 등이 알려져 있으며(Marie, 2008), 이러한 신호전달 체계는 골세포 분화과정 동안 Runx2, osterix 및 distalless related homebox(Dlx) 등과 같은 골 형성 전사인자들을 발현시킨다(Park 등, 2010). 신호전달 체계 중 BMP는 BMP 수용체와 결합해 type Ⅱ 수용체가 type Ⅰ 수용체를 인산화시켜 R-smad를 활성화하고 R-smad가 Co-smad와 결합해 세포 내로 이동하여 표적 유전자를 전사하게 된다(Heldin 등, 1997). 이때 R-smad는 smad 1/5/8을, Co-smad는 smad 4의 인산화를 유도하여 활성화하며, smad 1/5는 Runx2와 직접 상호작용하여 Runx2의 활성을 높이고 smad에 의해 발현되는 Dlx5 역시 Runx2의 작용을 강화해 골 형성을 촉진하게 된다(Komori, 2005). Runx2는 골모세포의 분화과정에서 항상 높은 정도로 발현되고 여러 전사인자가 결합하여 그 작용을 항진하거나 억제하며, collagen type Ⅰ, OCN, OPN, bone sialiprotein과 같은 조골세포 분화 마커 유전자의 promoter에 결합하여 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진한다(Im, 2008). 또한 Runx2는 전구세포(osteoprogenitor)의 증식을 억제하는 작용과 함께 osterix의 증식을 촉진하는 작용을 한다(Pratap 등, 2003). 세포주기나 성장에 관련된 유전자(histone, c-fos, c-myc)와 세포 외 기질유전자(type I collagen, fibronectin, TGFβ1)가 먼저 발현한 후 osteocalcin, OPN, bone sialoprotein과 같은 골 형성 관련 유전자가 발현하게 된다(Kim 등, 2000). 골세포의 특징적인 mRNA 양상으로는 OPN, ALP, osterix, Runx2 등이 있으며, 이들은 골세포 계열의 세포에서 발현되어 골세포 분화의 표지 인자라고 알려졌다(Leboy 등, 1991). 따라서 분자 수준에서 세포 분화 정도를 확인하기 위해 분화시킨 조골세포에 불등풀가사리 추출물을 0~50 μg/mL의 농도로 각각 처리하여 조골세포 관련 유전자인 OPN, Runx2, osterix를 western blotting 분석을 통해 검토하였다. 그 결과(Fig. 7), OPN과 Runx2 및 osterix의 발현은 불등풀가사리 추출물을 처리했을 때 농도 의존적으로 증가했는데(P<0.05), 불등풀가사리 추출물 50 μg/mL 농도에서의 OPN과 Runx2 및 osterix의 발현은 분화 대조군에 비해 각각 1.26배, 2.13배, 2.87배 증가하였다. Lee(2016)는 불레기말(Colpomenia sinuosa)이 osterix와 Runx2, collagen Ⅰ 및 ALP의 발현을 증가시켜 조골세포 분화과정 중의 골 결절 형성 초기에 효과가 있는 것으로 보고하였다.

Fig 7. Expression of bone osteoblast genic gene (osterix, OPN, Runx2) during differentiation of MC3T3-E1 cells treated with the Gloiopeltis furcata ethanol extract. Results are mean±SD of triplicate data. Values with different letters (a-d) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. β-Actin was used as the internal control.

한편 Ji 등(2010)은 10 μg/mL 농도의 머위 추출물을 처리한 MC3T3-E1 조골세포에서의 OPG mRNA 발현 정도가 대조군보다 2.1배 높게 나타나 골 형성을 증가시키는 중요한 매개물의 가능성을 보고하였다. 본 연구 결과 불등풀가사리 추출물은 조골세포에 발현하는 분화 인자의 단백질 수준을 조절하여 그 발현을 증가시킴으로써 조골세포 분화과정 중의 골 형성에 도움을 줄 것으로 판단된다.

본 연구에서는 불등풀가사리 추출물의 항산화 활성을 검토하고, 조골세포에 대한 분화와 골 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MC3T3-E1 세포의 증식률과 ALP의 활성 및 골 석회화 정도를 측정하고 OPN과 Runx2 및 osterix 단백질 발현 정도를 분석하였다. 불등풀가사리 추출물의 총 폴리페놀 함량을 gallic acid를 표준물질로 사용하여 측정한 결과 3.04 mg GAE/g으로 나타났다. 불등풀가사리 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였고(P<0.05), 1,000 μg/mL 농도에서 대조군과 비교하여 최대 92.41%로 나타났으며, SOD 활성은 1,000 μg/mL에서 54.26%로 나타났다(P<0.05). 불등풀가사리 추출물이 MC3T3-E1 조골세포의 성장에 미치는 영향을 MTT 분석법으로 확인한 결과, 100 μg/mL로 처리 시 123.13%로 나타나 높은 조골세포 성장률을 보였다. MC3T3-E1 조골세포에서 불등풀가사리 추출물의 농도에 따른 ALP 활성은 추출물 10 및 50 μg/mL 농도에서 각각 118.93%, 115.21%로 무첨가군에 비해 증가하였다(P<0.05). Alizarin Red 염색법에 의한 석회화 형성도를 현미경으로 관찰한 결과 불등풀가사리 추출물 처리에 의해 calcium spot이 많이 형성되었으며, 석회화 정도를 수치화한 결과 모든 농도에서 대조군에 비해 높은 석회화 형성능을 보였는데, 시료 50 μg/mL 농도에서 133.86%로 최대 활성을 보였다. MC3T3-E1 조골세포에서의 OPN과 Runx2 및 osterix 단백질 발현량은 불등풀가사리 추출물 50 μg/mL 농도에서 분화 대조구보다 각각 1.26배, 2.13배, 2.87배 증가하였다. 이상의 결과에서 불등풀가사리 추출물은 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 조골세포 증식, ALP 활성, 골 석회화 형성 및 조골세포 분화 인자의 단백질 수준을 조절하여 그 발현을 증가시키는 것으로 확인되어 기능성 제품 개발을 위한 소재로써 충분한 가치가 있는 것으로 생각된다.

본 논문은 부산광역시(2022년도 BB21+사업)의 지원을 받아 수행된 연구결과이며 이에 감사드립니다.