커피는 전 세계의 대표적인 기호식품 중 하나로 브라질, 베트남, 콜롬비아 및 인도네시아 등을 포함한 여러 국가에서 재배되고 있으며, 국제커피기구(International Coffee Organization)에 따르면 2021년 기준 전 세계적으로 약 1억 2,950만 자루(60 kg/자루)의 커피가 수출되었다고 보고되었다(ICO, 2022). 최근 커피산업의 발달로 커피 소비량이 급격히 증가함에 따라 커피에 대한 연구는 나날이 증가하는 추세(Kang 등, 2016)이며, 국내에서도 커피 재배와 생산량이 증가하고 있어 커피 생두 이외의 커피체리 부산물의 이용성에 대한 연구가 필요한 실정이다.

커피체리(coffee cherry)는 커피콩(green bean), 은피(silver skin), 내과피(parchment), 펙틴층(pectin layer), 과육(mesocarp) 및 외피(outer skin)로 구성되어 있다(Nam 등, 2017). 수확된 커피체리는 가공방식에 따라 natural, washed 및 semi-washed 등과 같은 이름이 붙게 되는데, 이러한 가공 과정 중 발생하는 부산물이 커피 펄프이다. 커피 펄프는 커피 열매의 약 50% 무게를 차지하고 탄수화물(21~32%), 단백질(5~15%), 지방(2~7%) 및 무기질(9%)이 풍부하며 탄닌, 폴리페놀 및 카페인을 함유하고 있다고 보고되어있다(Cruz, 2014; Das와 Venkatachalapathy, 2016). 그러나 현재까지 산업체의 많은 부분에서 커피 펄프는 수질과 토양, 동식물상에 중대한 환경영향을 끼치는 폐기물로 대부분 처리된다(Carmen 등, 2020). 한편, 커피 펄프의 이용성에 대한 고려로 버섯 재배, 퇴비화, 바이오가스 생산, 바이오에탄올 생산 등의 이용이 알려졌지만(Blinová 등, 2017) 커피 펄프에 함유된 기능성 성분과 이에 대한 이용성에 대한 연구는 미미한 실정이며, 커피 펄프에 함유된 caffeoyl ester류를 비롯한 페놀성 화합물의 항산화 활성이 일부 보고되어있다(Angeloni 등, 2021; Murthy와 Naidu, 2012).

커피 펄프의 주된 폴리페놀 성분 중 하나인 chlorogenic acid는 quinic acid와 특정 trans-cinnamic acid의 잔기 사이에 형성된 에스테르 계열 화합물이다(Clifford, 2000). 지금까지 식물 중에 존재하는 chlorogenic acid 이성질체는 주로 chlorogenic acid(3-O-caffeoylquinic acid, 3-CQA), neochlorogenic acid(5-O-caffeoylquinic acid, 5-CQA), cryptochlorogenic acid(4-O-caffeoylquinic acid, 4-CQA), isochlorogenic acid A(3,5-dicaffeoylquinic acid, 3,5- DCQA), isochlorogenic acid B(3,4-dicaffeoylquinic acid, 3,4-DCQA) 및 isochlorogenic acid C(4,5-dicaffeoylquinic acid, 4,5-DCQA)의 형태로 존재한다고 알려져 있다(Clifford 등, 2005). 커피 펄프에 함유된 페놀성 화합물로는 mono-caffeoylquinic acid type인 3-CQA, 4-CQA, 5- CQA 이외에도 3,5-DCQA, 3,4-DCQA 및 4,5-DCQA와 같은 dicaffeoylquinic acid도 일부 보고되고 있다. CQA 및 DCQA의 구성성분인 caffeic acid는 항산화 활성(Chen과 Ho, 1997), 항암(Huang 등, 1988), 항염증(Paciello 등, 2020) 등의 기능성을 가지며, 생체이용률이 CQA에 비해 높은 것으로 보고되었다(Olthof 등, 2001). Kim과 Baik(2015)은 chlorogenic acid로부터 caffeic acid로의 전환을 위해 유산균의 cinnamoyl esterase 활성을 적용하였다. Cinnamoyl esterae 활성을 보유한 유산균을 이용하여 커피 펄프로부터 caffeic acid 획득량을 증대시킬 수 있다면, 커피 펄프의 효용성을 증가시킬 것이라 기대된다.

본 연구에서는 커피 열매로부터 잉여 산물로 처리되는 커피 펄프의 이용성 증대를 위한 연구의 일환으로 커피 펄프에 함유된 페놀성 화합물의 최대 추출 수율을 위해 에탄올 농도를 선정하였으며, 에탄올 추출물에 대해 용매의 극성차를 이용하여 용매 분획법으로 추출하고 폴리페놀 성분들의 함량 및 항산화 활성을 분석하였다. 또한 커피 펄프를 이용하여 cinnamoyl esterase 활성을 보유한 유산균의 선발 및 발효 적용에 따른 커피 펄프 유산균 발효물의 caffeic acid의 변화량을 분석하였다. 이와 같은 연구로부터 커피 펄프에 함유된 페놀성 화합물의 항산화 활성과 커피 펄프의 유산균 발효 특성을 분석하여 커피 펄프의 이용성에 대한 기초자료로 사용하고자 한다.

실험재료 및 시약

본 연구에 사용된 커피체리 펄프는 커피 체험 농장 산하 농원(Icheon, Korea)에서 2021년 4월에 수확한 커피체리를 구매하여 bean을 제거하였다. 커피체리 펄프는 동결건조기(FD, Ilshin Lab Co., Ltd., Dongducheon, Korea)를 이용하여 건조한 후 분말 형태로 제조한 것을 CCP라고 명명하였으며, -20°C에 보관하며 실험에 사용하였다.

본 연구에 사용된 (±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-caboxylic acid(Trolox), 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2′-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), gallic acid, quercetin, L-ascorbic acid 및 Folin-Ciocalteu reagent 등은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 추출 및 분획에 이용된 에탄올, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol은 대정화금(Siheung, Korea)에서 구입하였다. HPLC 분석에 이동상으로 사용된 acetonitrile과 acetic acid는 J.T. Baker Co.(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. 균주 배양에 이용된 Lactobacilli MRS agar와 Lactobacilli MRS broth를 Difco Co.(Sparks, MD, USA)에서 구입하여 사용하였고, 유산균 대조군으로 사용된 Lactobacillus rhamnosus GG를 (재)발효미생물산업진흥원(Sunchang, Korea)에서 연구용으로 제공받아 사용하였다. 그 밖의 시약들은 analytical 및 HPLC grade를 사용하였다.

커피체리 펄프 에탄올 추출물 및 용매분획물 제조

CCP의 추출은 에탄올의 부피 비율을 총 6단계(0%, 20%, 40%, 60%, 80% 및 100%)로 하여 진행되었다. CCP 분말에 각각의 에탄올 용매를 중량비에 대해 100배수를 첨가하고 12시간, 상온에서 교반 추출하였다. 추출액은 원심분리기(Avanti J-26 XP, Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)를 이용해 원심분리(4°C, 10,000×g, 10분)하여 상등액을 취하였다. 상등액에 유입된 불용성분을 제거하고자 여과(Advantec No. 2, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)하고 회전감압농축기(RV 10, IKA^® Korea Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 용매를 완전히 제거한 후 이를 동결 건조하여 에탄올 추출 농도 선정을 위한 분석시료로 사용하였다. 용매분획물은 CCP 80% 에탄올 추출물(CEE)을 증류수 25배수에 혼탁하여 극성이 다른 각각의 용매 즉, n-hexane, chloroform, ethyl acetate와 n-butanol로 순차적으로 가해 n-hexane fraction(CHF), chloroform fraction (CCF), ethyl acetate fraction(CEF), n-butanol fraction (CBF)과 잔류 aqueous fraction(CAF)을 얻어내어 여과 및 감압 농축한 후 동결 건조하여 분말 형태로 얻어 -20°C에서 보관하면서 분획물의 분석시료로 사용하였다.

항산화 성분 및 항산화 활성

총 페놀성 화합물 함량(total phenolic content, TPC)은 ISO 14502-1(2005)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 1 mL에 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 5 mL를 첨가하여 3분간 반응시킨 후에 7.5% Na2CO3 4 mL를 첨가하였다. 이 반응액을 암소에서 반응(23°C, 1시간)시킨 후 분광광도계(UV-2550, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 765 nm에서 흡광도를 측정했으며, TPC는 gallic acid를 표준물질로 하여 시료 g당 mg gallic acid로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량(total flavonoid content, TFC)은 Zhishen 등(1999)의 방법을 이용하였다. 시료 1 mL에 5% NaNO2 150 μL를 첨가하여 상온에서 5분간 반응시킨 후에 10% AlCl3 300 μL를 첨가하였다. 이 반응액에 1 N NaOH 1 mL와 증류수 550 μL를 첨가한 후 510 nm에서 흡광도를 측정했으며, TFC는 quercetin을 표준물질로 하여 시료 g당 mg quercetin으로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능은 Kano 등(2005)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 100 μL에 100 μM DPPH 용액 2 mL를 첨가하여 암소에서 20분간 반응시킨 후 515 nm에서 흡광도를 측정했으며, 대조구로는 Trolox를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음 식에 의해 얻어진 결과에서 산출하여 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능은 50%의 소거능을 나타내는 시료의 농도(IC₅₀, mg/mL)로 값을 나타냈다.

$$DPPHradicalscavengingactivity\left(\%\right)=\frac{Absorbanc{e}_{control}-Absorbanc{e}_{sample}}{Absorbanc{e}_{control}}\times 100$$

ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(1999)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 30 μL에 ABTS 라디칼 용액 3 mL를 첨가하여 암소에서 6분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정했으며, 대조구로는 Trolox를 사용하였다. ABTS 라디칼 소거능은 다음 식에 의해 얻어진 결과에서 산출하여 나타내었다. ABTS 라디칼 소거능은 50%의 소거능을 나타내는 시료의 농도(IC₅₀, mg/mL)로 값을 나타냈다.

$$ABTSradicalcationscavengingactivity\left(\%\right)=\frac{Absorbanc{e}_{control}-Absorbanc{e}_{sample}}{Absorbanc{e}_{control}}\times 100$$

커피체리 펄프 유산균 발효

CCP의 유산균 발효에 이용된 균주로는 선행연구를 통해 김치에서 분리 동정된 Lactobacillus plantarum JBLAB 0101(LPL0101), L. paracasei JBLAB1402(LPA1402)와 상업용 유산균인 L. rhamnosus GG(LGG) 등 3종이었다. 유산균은 MRS agar에서 활성화 확인 후 MRS broth에서 전배양(37°C, 120 rpm, 15 h)시켜 CCP가 2% 함유된 MRS broth(CMB)에 1%(v/v) 접종하였다. 유산균이 접종된 CMB의 초기 생균수는 6 log CFU/mL가 되도록 전배양액의 균주 농도를 분광광도계(UV-1601, Shimadzu)를 이용하여 조절하였다. 유산균이 접종된 CMB 실험구는 진탕배양(37°C, 120 rpm, 10 d) 기간 동안 2일 간격으로 배양액을 일정량 회수하여 생균수, 이화학적 특성 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다.

커피체리 펄프 유산균 발효물의 이화학적 특성

커피체리 펄프 유산균 발효물의 이화학적 특성은 유산균 배양액을 접종하여 발효 일차별로 수용성 고형분, pH, 총산도를 분석하여 이화학적 특성으로 분류하였다. 수용성 고형분 함량(soluble solids)은 당도계(PAL-1, Atago, Tokyo, Japan)로 측정한 후 °Brix 단위로 표기하였다. pH는 pH meter(PP-20, Sartorius, Gottingen, Germany)를 사용하여 측정했으며, 총산도(total acidity)는 시료 1 mL에 0.1 N NaOH를 첨가하여 pH 8.3에 도달할 때까지 소모된 적정량(mL)을 lactic acid의 환산계수(0.009)를 곱하여 백분율(%)로 산출하였다.

HPLC를 이용한 페놀성 화합물 분석

용매 분획물 및 유산균 발효물의 HPLC를 이용한 페놀성 화합물 함량 분석은 Tsao 등(2003)의 방법을 변형하여 사용하였다. 용매 분획물인 CEE 및 CEF는 80% 에탄올에 재용해하여 분석하였고, 3종의 유산균이 각각 접종된 유산균 발효물은 메탄올을 이용해서 적정 농도로 희석한 후 분석에 이용하였다. 용액은 분석에 앞서 0.22 μm membrane filter(Futecs Co., Ltd., Daejeon, Korea)로 여과하여 HPLC system(e2695, Waters, Milford, MA, USA)으로 분석하였다. 컬럼은 Waters X-bridge(4.6×250 mm, 5 μm, Waters)를 사용하였고, 컬럼 온도는 35°C, 유속은 0.8 mL/min, 시료 주입량은 10 μL였다. 검출기는 photodiode array detector(Waters 996, Waters), 검출파장은 324 nm를 사용하였다. 이동상은 1% acetic acid가 첨가된 water(용매 A)와 acetonitrile(v/v, 용매 B)이었으며, 농도 경사는 0~5분은 용매 A를 92%로 유지, 5~20분은 80%로 감소, 20~28분은 60%로 감소, 28~35분은 30%로 감소시키고 45분까지 10%로 유지하도록 설정하였다. 표준 검량선을 작성하여 표준물질의 농도와 peak area의 상관회귀식을 얻어 직선성(linearity), 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)를 계산하였다(Table 1). 페놀성 화합물 분석에 이용된 표준물질은 3-chlorogenic acid(caffeoylquinic acid, CQA), 4-CQA, 5-CQA, 3,4-dicaffeoylquinic acid(DCQA), 3,5-DCQA, 4, 5-DCQA 및 caffeic acid였으며, 정량분석을 위해 각 표준물질을 Table 1의 농도 범위에서 peak area에 대한 검량회귀식을 얻었다. 검량회귀식을 이용하여 CEE와 CEF의 페놀성 화합물의 함량(mg/g) 및 유산균 발효 CMB의 페놀성 화합물의 함량(μg/mL)을 산출하였다.

Table 1 . Linearity, limit of detection, and limit of quantification of standard materials.

Standard materials1)	Concentration range(µg/mL)	Linear regression equation	Recovery(%)	Linearity(R2)	LOD2) (µg/mL)	LOQ3) (µg/mL)
5-CQA	12.5∼100	y＝37422x－136311	101.02	0.9988	4.61	13.98
3-CQA	12.5∼100	y＝38205x－122054	101.08	0.9979	6.14	18.6
4-CQA	12.5∼100	y＝40253x＋10362	99.91	0.9993	3.63	11
Caffeic acid	0.78∼3.13	y＝78205x－205	100.23	0.9997	0.1	0.31
4,5-DCQA	6.25∼100	y＝28261x－14784	100.41	1	0.56	1.69
3,5-DCQA	6.25∼100	y＝56528x－29291	100.39	1	0.51	1.56
3,4-DCQA	6.25∼100	y＝38065x－14493	100.2	1	0.29	0.87

¹⁾CQA: caffeoylquinic acid, DCQA: dicaffeoylquinic acid..

²⁾LOD: limit of detection based on 3.3×σ/S of method blanks..

³⁾LOQ: limit of quantification based on 10×σ/S of method blanks..

통계 분석

각 실험은 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 SPSS package program(Version 12.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료 간의 유의성은 P<0.05 수준에서 one-way ANOVA로 분산 분석한 후 Duncan’s multiple range test로 비교하였다.

커피체리 펄프 에탄올 추출 농도 선정

동결건조된 CCP 분말을 이용하여 에탄올 농도를 6단계로 달리하여 용매추출을 실시하였고, 항산화 성분(TPC, TFC)의 함량 및 항산화 활성(DPPH, ABTS 라디칼 소거능)을 비교한 결과는 Table 2와 같다. 에탄올 농도별 CCP 추출물의 TPC는 40.40~46.55 mg gallic acid equivalent/g (mg GAE/g)의 범위로 차이를 나타내었다. TPC는 80% 에탄올 추출물이 46.55 mg GAE/g으로 가장 높은 함량을 보였으며, 40% 에탄올 추출물(45.40 mg GAE/g), 100% 에탄올 추출물(44.80 mg GAE/g), 60% 에탄올 추출물(43.80 mg GAE/g), 20% 에탄올 추출물(41.90 mg GAE/g), 0% 에탄올 추출물(40.40 mg GAE/g)의 순이었다. 농도별 CCP 에탄올 추출물의 TFC는 7.96~113.42 mg quercetin equivalent/g(mg QE/g)의 범위로 차이를 나타내었다. TFC는 80% 에탄올 추출물이 113.42 mg QE/g으로 가장 높은 함량을 보였으며, 40% 에탄올 추출물(91.69 mg QE/g), 60% 에탄올 추출물(83.15 mg QE/g), 100% 에탄올 추출물(66.88 mg QE/g), 20% 에탄올 추출물(23.04 mg QE/g), 0% 에탄올 추출물(7.96 mg GAE/g)의 순이었다. CCP 80% 에탄올 추출물의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능은 IC₅₀값으로 표현했을 때, 각각 2.38 mg/mL와 5.23 mg/mL로 가장 낮아 다른 농도의 에탄올 추출물보다 높은 활성을 보였다. Kim 등(2018)의 연구에서 추출용매(80% 에탄올, 80% 메탄올, hot water)별 커피 생두 추출물의 항산화 성분(TPC, TFC) 및 항산화 활성(DPPH, ABTS 라디칼 소거능)을 비교했는데, 80% 에탄올 커피 생두 추출물에서 항산화 성분 및 활성에 대해 가장 높은 값을 나타내어 본 연구 결과와 유사한 경향을 보였다. Li 등(2017)의 연구에서 고구마 잎에 99% 에탄올을 이용하여 1차 추출을 진행하고 60% 에탄올을 이용하여 2차 추출을 진행했을 때, 총 페놀성 화합물 함량 및 총 플라보노이드 함량이 높게 제시되었고, 이는 고구마 잎의 주요 생리활성물질인 chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid 및 3,4-dicaffeoylquinic acid 등이 더 효과적으로 추출되었다고 판단된다. 본 연구에서 커피체리 펄프를 0, 20, 40, 60, 80 및 100% 농도의 에탄올로 추출하여 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량을 비교했을 때, 80%의 에탄올 추출물에서 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량이 가장 높은 것으로 나타났고, 항산화 활성이 가장 높아 커피 펄프 페놀성 화합물의 추출을 위한 최적 에탄올 농도로 선정되었다.

Table 2 . Antioxidant component and antioxidant activities of different EtOH concentration extracts from coffee cherry pulp (CCP).

EtOH concentration(%)	Antioxidant component1)		Antioxidant activity (IC502) mg/mL)
	TPC (mg GAE/g)	TFC (mg QE/g)	DPPH	ABTS
0	40.40±0.14a3)4)	7.96±0.41a	>10e	>10e
20	41.90±0.14b	23.04±0.27b	>10e	>10e
40	45.40±0.28e	91.69±1.90e	2.88±0.02b	5.91±0.04b
60	43.80±0.28c	83.15±0.22d	3.11±0.00c	6.01±0.11c
80	46.55±0.07f	113.42±1.09f	2.38±0.01a	5.23±0.01a
100	44.80±0.28d	66.88±1.63c	4.45±0.05d	7.96±0.01d

¹⁾TPC is an abbreviation for mg gallic acid equivalent antioxidant component and it’s unit is mg of gallic acid in 1 g sample. TFC is an abbreviation for mg quercetin equivalent antioxidant component and it’s unit is mg of quercetin in 1 g sample..

²⁾IC₅₀ is the concentration of the sample required to scavenging 50% of radical (DPPH IC₅₀, 0.09 mg TEAC/mL; ABTS IC₅₀, 0.27 mg TEAC/mL)..

³⁾Values are mean±SD (n=2)..

⁴⁾Different small letters (a-f) in the same column indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

커피체리 펄프 용매분획별 항산화 성분 및 항산화 활성

선정된 80% 에탄올을 이용하여 추출된 CCP 에탄올 추출물의 수율은 추출물 건물량을 CCP 건물량에 대한 백분율(%, w/w)로 나타냈을 때 55.63%였다. CCP 분획물의 수율은 분획물 건물량을 추출물 건물량에 대한 백분율(%, w/w)로 나타내었으며, CAF의 수율은 73.85%로 가장 높았고 CBF(17.48%), CEF(2.65%), CCF(1.97%) 및 CHF(1.70%) 순이었다(Fig. 1). CEE로부터 얻은 용매별 분획물의 항산화 성분(TPC, TFC) 및 항산화 활성(DPPH, ABTS 라디칼 소거능)을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 용매 분획별 TPC는 25.71~627.50 mg GAE/g의 범위로 차이를 나타내었다. TPC는 CEF에서 627.50 mg GAE/g으로 가장 높은 함량을 보였으며, 이는 CEE에 비해 약 13.48배 높은 수준이었다. 그다음으로 CBF(115.23 mg GAE/g), CHF(108.61 mg GAE/g), CCF(59.10 mg GAE/g) 및 CAF(25.71 mg GAE/g)의 순서로 함량의 차이를 나타냈다. 용매 분획별 TFC는 20.28~1,632.31 mg QE/g의 범위로 차이를 나타내었다. TFC 역시 CEF에서 1,632.31 mg QE/g으로 가장 높은 함량을 보였으며, 이는 CEE에 비해 14.47배 높은 수준이다. 그다음으로 CBF(303.00 mg QE/g), CHF(96.85 mg QE/g), CCF(40.73 mg QE/g) 및 CAF(20.28 mg QE/g)의 순서로 함량의 차이를 나타냈다. 각 용매별 분획물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능은 IC₅₀값으로 표현하였으며, DPPH 라디칼 소거능의 경우 0.17~9.82 mg/mL의 범위를 나타냈다. CEF에서 IC₅₀값이 0.17 mg/mL로 가장 낮아 다른 분획들보다 항산화 활성이 높게 평가되었으며, CHF(0.96 mg/mL), CBF(1.08 mg/mL), CCF(5.81 mg/mL) 및 CAF(9.82 mg/mL)의 순으로 IC₅₀값이 높아져 DPPH 라디칼 소거능의 차이를 보였다. 양성대조구로 이용된 Trolox의 DPPH 라디칼 소거능 IC₅₀값은 CEF보다 낮아 0.09 mg/mL로 분석되었다. ABTS 라디컬 소거능의 경우 0.34~10 mg/mL의 IC₅₀값이 확인되었으며, CEF에서 0.34 mg/mL로 가장 낮아 다른 분획들보다 높은 활성을 보였다. 이외 각 분획에서 ABTS 라디칼 소거능 IC₅₀값은 CHF(2.33 mg/mL), CBF(4.24 mg/mL), CCF(6.94 mg/mL) 및 CAF(>10 mg/mL)의 순으로 나타났다. 양성대조구로 이용된 Trolox의 ABTS 라디칼 소거능 IC₅₀값은 0.27 mg/mL로 나타나 CEF보다 낮았다. Joo(2020)는 왕벚나무 껍질의 에탄올 추출물과 용매 분획물의 항산화 성분(TPC, TFC)과 항산화 활성(DPPH, ABTS 라디칼 소거능)을 비교했는데, 각 시료의 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물에 비해 높은 함량의 항산화 성분과 높은 항산화 활성을 나타내어 본 연구 결과와 유사한 경향을 보였다. 본 연구에서는 CEE로부터 CHF, CCF, CEF, CBF 및 CAF를 얻어 총 페놀성 화합물, 총 플라보노이드, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 확인한 결과, CEF에서 가장 높은 함량과 활성을 보이는 것을 확인하였으며, 이는 용매의 극성차에 의해 분획된 분획물 중 에틸아세테이트에 용해되는 페놀성 화합물이 함유되었기 때문으로 판단된다.

Table 3 . Antioxidant component and antioxidant activities of different solvent fractions from CEE¹⁾.

Solvent fraction2)	Antioxidant component3)		Antioxidant activity (IC504) mg/mL)
	TPC (mg GAE/g)	TFC (mg QE/g)	DPPH	ABTS
CHF	108.61±0.10c5)6)	96.85±1.09c	0.96±0.01b	2.33±0.02b
CCF	59.10±0.07b	40.73±0.27b	5.81±0.00d	6.94±0.14d
CEF	627.50±1.06e	1,632.31±1.36e	0.17±0.00a	0.34±0.00a
CBF	115.23±0.04d	303.00±1.36d	1.08±0.00c	4.24±0.06c
CAF	25.71±0.00a	20.28±0.03a	9.82±0.03e	>10e

¹⁾CEE: CCP 80% EtOH extract..

²⁾CHF: CCE hexane fraction, CCF: CCE chloroform fraction, CEF: CCE ethyl acetate fraction, CBF: CCE butanol fraction, and CAF: CCE aqueous fraction..

³⁾TPC is an abbreviation for mg gallic acid equivalent antioxidant component and it’s unit is mg of gallic acid in 1 g sample. TFC is an abbreviation for mg quercetin equivalent antioxidant component and it’s unit is mg of quercetin in 1 g sample..

⁴⁾IC₅₀ is the concentration of the sample required to scavenging 50% of radical (DPPH IC₅₀, 0.09 mg TEAC/mL; ABTS IC₅₀, 0.27 mg TEAC/mL)..

⁵⁾Values are mean±SD (n=2)..

⁶⁾Different small letters (a-e) in the same column indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

Fig 1. Extraction and fractionation procedure of CCP.

커피체리 펄프 유산균 발효물 생균수 및 이화학적 특성

CCP가 2% 함유된 MRS broth에 활성시킨 유산균을 1% 접종하였을 때, 생균수는 LPL0101, LPA1402 및 LGG 균주 접종구에서 각각 5.94, 6.12 및 6.18 log CFU/mL로 약 10⁶~10⁷ CFU/mL 수준이었으며, 발효 2일 차에서 각각 8.64, 9.71 및 9.93 log CFU/mL로 가장 높은 생균수를 나타낸 이후 4일 차부터 감소하여 각각 미검출, 7.39 및 7.31 log CFU/mL를 보였고 6일 차부터는 전부 검출되지 않았다(결과 미제시). LPL0101, LPA1402 및 LGG 균주를 이용하여 발효한 CMB의 배양기간별 이화학적 특성에 대한 결과는 Table 4와 같다. 수용성 고형분 함량은 발효 0일 차에 유산균 비첨가구인 CMB(control)가 7.20°Brix로 나타나 유산균 첨가구(7.15~7.20°Brix)와 유의적인 차이가 없었다(P<0.05). 발효 2일 차에서 control구를 제외한 유산균이 접종된 CMB에서 수용성 고형분 함량이 감소하여 5.95~6.20°Brix의 값을 나타내었으며, LGG 균주를 이용하여 발효시킨 CMB가 5.95°Brix로 다른 균주에 비해 낮은 값을 나타내었고, 뒤이어 LPA1402 및 LPL0101 균주를 이용하여 발효시킨 CMB가 각각 6.15 및 6.20°Brix 순이었다. 이는 발효 10일 차까지 비슷한 경향을 나타내었다. pH는 발효 0일 차에 control이 6.24로 나타나 유산균 첨가구(6.24~6.26)와 비슷한 값을 나타내었다. 발효 2일 차에서 control구를 제외한 유산균이 접종된 CMB에서 모두 pH가 감소하여 3.64~3.76의 값을 나타내었으며, LPA1402 균주를 이용하여 발효시킨 CMB가 3.64로 다른 균주에 비해 낮은 값을 나타내었고, 뒤이어 LGG 및 LPL0101 균주를 이용하여 발효시킨 CMB가 각각 3.71 및 3.76의 값을 나타내어 이와 같은 경향은 발효 10일 차까지 지속되었다. 총산도는 발효 0일 차에 control이 0.42%를 나타내 유산균 첨가구(0.43~0.47%)와 비슷한 값을 보였다. 발효 2일 차에서 control구를 제외한 유산균이 접종된 CMB에서 총산도가 증가하여 2.48~2.77%의 값을 나타내었으며, LPA1402를 이용하여 발효시킨 CMB가 2.77%로 가장 높은 값을 나타내었고, 이어서 LPL0101 및 LGG 균주를 이용하여 발효시킨 CMB가 각각 2.60 및 2.48% 순으로 총산도의 차이를 보였다. 이와 같은 경향은 발효 10일 차까지 지속되었으며, 접종된 유산균의 생육이 2일까지 가능하고 LPL0101 및 LGG 균주의 생육은 4일까지 가능하였으나 이후 사멸되어 이화학적 특성 변화가 없는 것으로 판단되며, 생성된 효소 및 산에 의한 페놀성 화합물의 변화를 분석하기 위해 10일 차까지 발효를 유지하였다.

Table 4 . Physicochemical properties of CMB¹⁾ fermented by various lactic acid bacteria with different fermentation period.

Physicochemical properties	Strain2)	Fermentation time (day)
		0	2	4	6	8	10
Soluble solid (°Brix)	Control	7.20±0.003aA3)-5)	7.25±0.08cAB	7.40±0.00cC	7.40±0.00dC	7.30±0.00dABC	7.35±0.08cBC
	LPL0101	7.15±0.08aC	6.20±0.00bA	6.30±0.00bAB	6.30±0.00cAB	6.30±0.00cAB	6.35±0.08bB
	LPA1402	7.20±0.00aB	6.15±0.08bA	6.25±0.08bA	6.20±0.00bA	6.20±0.00bA	6.20±0.00bA
	LGG	7.15±0.08aB	5.95±0.08aA	6.05±0.08aA	6.10±0.00aA	6.10±0.00aA	5.95±0.08aA
pH	Control	6.24±0.00aF	6.20±0.01dE	6.15±0.01dD	6.10±0.01dC	6.04±0.00dB	6.02±0.01dA
	LPL0101	6.26±0.00bB	3.76±0.01cA	3.76±0.01cA	3.76±0.00cA	3.76±0.00cA	3.76±0.00cA
	LPA1402	6.25±0.01aC	3.64±0.01aA	3.66±0.01aB	3.65±0.00aB	3.65±0.00aB	3.65±0.00aB
	LGG	6.24±0.00aD	3.71±0.00bA	3.73±0.01bB	3.73±0.00bB	3.74±0.01bBC	3.74±0.00bC
Total acidity (%)	Control	0.42±0.01aA	0.44±0.02aA	0.50±0.01aB	0.49±0.02aB	0.49±0.02aB	0.50±0.02aB
	LPL0101	0.47±0.03bA	2.60±0.04cB	2.55±0.03bB	2.58±0.02cB	2.59±0.02bB	2.60±0.00cB
	LPA1402	0.44±0.02abA	2.77±0.02dB	2.89±0.02cC	2.91±0.02dC	2.88±0.04cC	2.90±0.02dC
	LGG	0.43±0.01abA	2.48±0.01bB	2.58±0.03bE	2.51±0.02bBC	2.56±0.03bE	2.53±0.02bCD

¹⁾CMB: MRS broth contained CCP..

²⁾Control: unfermented CMB, LPL0101: CMB fermented by L. platarum JBLAB0101, LPA1402: CMB fermented by L. paracasei JBLAB1402, LGG: CMB fermented by L. rhamnosus GG..

³⁾Values are mean±SD (n=2)..

⁴⁾Different small letters (a-d) in the same column indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

⁵⁾Different capital letters (A-F) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

커피체리 펄프 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 용매분획물 페놀성 화합물 분석

CCP 에탄올 추출물과 이 추출물을 이용해 용매 분획하여 얻은 분획물의 페놀성 화합물을 HPLC system을 사용하여 분석하였다. Standard mixture, CEE 및 CEF의 페놀성 화합물의 검출결과를 보여주는 크로마토그램은 Fig. 2와 같다. CCP standard mixture 구성분은 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-DCQA, 3,5-DCQA, 4,5-DCQA 및 caffeic acid 총 7종이었다. 커피체리로부터 생두를 제거하고 남은 펄프의 페놀성 화합물은 chlorogenic acid(3-, 4-, 5-), DCQA(3,4-, 3,5-, 4,5-) 및 caffeic acid 등이 보고되어있다(Esquivel 등, 2020; Myo 등, 2021; Ramirez-Martinez, 1988). HPLC system에 의해 분리 검출된 페놀성 화합물의 확인은 표준시약의 머무름시간과 비교하였을 때, 5-CQA(6.55 min), 3-CQA(10.32 min), 4-CQA(11.57 min), caffeic acid(13.56 min), 4,5-DCQA(24.05 min), 3,5-DCQA(24.61 min), 3,4-DCQA(26.15 min)로 확인되었으며(Fig. 2A), 각 표준시약을 이용하여 직선성, 검출한계, 검량한계 및 선형회귀식을 산출한 결과는 Table 1에 제시하였다. HPLC system에 의해 확인되는 머무름시간과 PDA 검출기를 이용한 spectrum 확인을 통해 CEE와 CEF의 페놀성 화합물을 추정하였고, 선형회귀식을 이용하여 산출된 정량 분석 결과는 Table 5와 같다. CEE의 5-CQA, 3-CQA 및 4-CQA의 함량은 에탄올 추출물인 CEE 건물량을 기준으로 각각 1.06, 15.05 및 0.61 mg/g을 나타내었고, CEF의 5-CQA, 3-CQA 및 4-CQA의 함량은 에틸아세테이트 분획물인 CEF 건물량을 기준으로 각각 4.01, 62.75 및 1.47 mg/g을 나타내었다. 즉 CEF의 5-CQA, 3-CQA 및 4-CQA의 함량은 CEE에 비해 각각 약 3.78배, 4.17배 및 2.41배 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한 CEE의 4,5-DCQA, 3,5-DCQA 및 3,4-DCQA의 함량은 각각 1.22, 20.10 및 0.26 mg/g을 나타냈으며, CEF의 4,5-DCQA, 3,5-DCQA 및 3,4-DCQA의 함량은 각각 34.82, 72.26 및 7.26 mg/g을 나타냈다. 이는 CEF의 4,5-DCQA, 3,5-DCQA 및 3,4-DCQA의 함량이 CEE에 비해 각각 약 28.54배, 3.60배 및 27.92배 증가하였음을 나타낸다. Caffeic acid는 CCP 에탄올 추출물에서 0.02 mg/g의 함량을 보였으며, 에틸아세테이트 분획물에서 0.66 mg/g을 나타내어 CEF의 함량이 CEE에 비해 33배 증가함이 확인되었다. CQA는 항균, 항바이러스, 항곰팡이독성, 항암 및 항산화와 같은 기능성이 보고되어 식품, 제약, 화장품 등의 기능성 소재로 이용되고 있다(Belščak-Cvitanović과 Komes, 2017). Im 등(2015)의 연구에서는 떡쑥 에탄올 추출물에 함유된 페놀성 화합물을 분석하였을 때, 3,5-DCQA 및 4,5-DCQA가 분리 동정되었고, Park 등(2017)의 연구에서는 곰취에서 3,5-DCQA가 분리됨을 보고하였다. 이와같이 식물체에 함유된 DCQA는 항산화 활성이 우수한 것으로 알려져 커피 펄프 에틸아세테이트 분획물에 대한 DCQA의 검출은 항산화 활성을 기대하게 하였다.

Table 5 . Comparison of phenolic compound contents for CEE and CEF.

Sample1)	Phenolic compound contents (mg/g)
	Chlorogenic acid (CQA)2)			Dicaffeoylquinic acid (DCQA)			Caffeic acid
	5-CQA	3-CQA	4-CQA	4,5-DCQA	3,5-DCQA	3,4-DCQA
CEE	1.06±0.003)	15.05±0.12	0.61±0.01	1.22±0.02	20.10±0.04	0.26±0.00	0.02±0.00
CEF	4.01±0.01	62.75±0.05	1.47±0.04	34.82±0.23	72.26±0.31	7.26±0.16	0.66±0.01

¹⁾CEE: CCP 80% EtOH extract, CEF: CCP ethyl acetate fraction..

²⁾CQA: caffeoylquinic acid..

³⁾Values are mean±SD (n=2)..

Fig 2. HPLC chromatogram of 80% EtOH extract and ethyl acetate fraction from CCP. (A) standard materials (peak number: 1, 5-CQA; 2, 3-CQA; 3, 4-CQA; 4, caffeic acid; 5, 4,5-DCQA; 6, 3,5-DCQA; 7, 3,4-DCQA) mixtures, (B) CCP 80% EtOH extract (5 mg/mL), (C) CCP ethyl acetate fraction (1 mg/mL).

결과적으로 에틸아세테이트 분획물에서 가장 큰 폭의 증가를 보인 3-CQA, 3,5-DCQA 및 4,5-DCQA를 포함한 CCP의 페놀성 화합물의 증가로 인해 항산화 활성이 향상되는 것으로 추정된다.

커피체리 펄프 유산균 발효물의 페놀성 화합물 분석

CCP를 2% 함유한 MRS broth에 유산균 3종을 각각 발효시켜 10일 후 발효물의 페놀성 화합물의 조성변화를 HPLC system을 사용하여 검출된 크로마토그램은 Fig. 3과 같다. 유산균 비접종구(control), 유산균 접종구 LPL0101, LPA1402 및 LGG를 10일간 발효시킨 후 페놀성 화합물의 조성 변화를 분석하였고, 이에 대한 정량결과는 Table 6과 같다. Control에 함유된 3-CQA, 4-CQA 및 5-CQA의 함량은 각각 27.27, 15.93 및 22.69 μg/mL였고, 유산균 접종구에서는 발효에 의해 모든 함량이 감소함을 확인하였다. 감소 비율은 LPL0101의 경우 3-CQA 8.32%, 4-CQA 13.56% 및 5-CQA 3.61%, LPA1402는 3-CQA 16.61%, 4-CQA 17.89% 및 5-CQA 7.76%, LGG는 각각 3-CQA 18.41%, 4-CQA 22.16% 및 5-CQA 6.43% 감소하였다. LGG를 이용하여 발효하였을 때 5-CQA를 제외한 3-CQA 및 4-CQA에서 가장 많이 감소하였다. 또한 control의 3,4-DCQA, 3,5-DCQA 및 4,5-DCQA의 함량은 각각 2.47, 1.49 및 3.42 μg/mL를 나타냈으며, 유산균 접종구 모두 발효에 의해 감소하였다. 모든 유산균 접종구에서 4,5-DCQA 및 3,5-DCQA 감소량은 39.60~45.61% 수준이었으나, 3,4-DCQA의 감소량은 유산균 별로 차이가 있어 LPL0101 65.18%, LPA1402 59.51% 및 LGG 73.68%로, LGG로 발효하였을 때 가장 많이 감소하였다. 이에 반해 발효 이후 caffeic acid의 함량은 발효 전(0.75 μg/mL)에 비해 LGG 접종구에서 1.51 μg/mL로 두 배가량 증가하였으며, CQA 및 DCQA로부터 전환된 caffeic acid의 함량으로 추정된다.

Table 6 . Effect of phenolic compound contents of CMB fermented by various lactic acid bacteria after 10 days.

Sample1)	Phenolic compound contents (μg/mL)
	Chlorogenic acid (CQA)2)			Dicaffeoylquinic acid (DCQA)			Caffeic acid
	5-CQA	3-CQA	4-CQA	4,5-DCQA	3,5-DCQA	3,4-DCQA
Control	22.69±0.39c3)4)	27.27±0.22c	15.93±0.25d	3.42±0.08b	1.49±0.01d	2.47±0.04d	0.75±0.02b
LPL0101	21.87±0.09b	25.00±0.02b	13.77±0.12c	1.95±0.02a	0.90±0.01c	0.86±0.01b	0.41±0.02a
LPA1402	20.93±0.03a	22.74±0.51a	13.08±0.11b	1.92±0.02a	0.88±0.01b	1.00±0.03c	1.00±0.07c
LGG	21.23±0.16a	22.25±0.13a	12.40±0.21a	1.86±0.01a	0.86±0.01a	0.65±0.00a	1.51±0.05d

¹⁾Control: unfermented CMB, LPL0101: CMB fermented by L. platarum JBLAB0101, LPA1402: CMB fermented by L. paracasei JBLAB1402, LGG: CMB fermented by L. rhamnosus GG..

²⁾CQA: caffeoylquinic acid..

³⁾Values are mean±SD (n=2)..

⁴⁾Different small letters (a-d) in the same column indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

Fig 3. HPLC chromatogram of CMB fermented by various lactic acid bacteria after 10 days. (A) CMB fermented by LGG, (B) CMB fermented by LPA1402, (C) CMB fermented by LPL0101, (D) unfermented CMB. Peak number: 1, 5-CQA; 2, 3-CQA; 3, 4-CQA; 4, caffeic acid; 5, 4,5-DCQA; 6, 3,5-DCQA; 7, 3,4-DCQA.

Lai 등(2009)의 연구에서 cinnamoyl esterase는 식물체의 chlorogenic acid와 같은 hydroxycinnamic acid의 ester 결합 부분에 작용하여 분해할 수 있으며, 저분자의 형태로 전환되어 생체이용률을 향상시킬 수 있다고 하였다. Guglielmetti 등(2008)과 Kim과 Baik(2019)은 cinnamoyl estarase 작용을 하는 유산균을 밝혔는데, 여기에는 L. plantarum, L. paracasei 및 L. rhamnosus를 포함하고 있다. 따라서 본 연구 결과에서 CCP에 함유된 페놀성 화합물인 chlorogenic acid를 포함한 이성질체는 LPL0101, LPA 1402 및 LGG를 이용한 유산균 발효 시 감소하고, LPL1402 및 LGG를 이용하여 발효했을 때 분해 산물인 caffeic acid는 증가하는 것으로 보아 유산균의 cinnamoyl estarase 효소작용으로 인한 페놀성 화합물 조성의 변화로 판단된다.

본 연구에서는 커피체리 펄프에 함유된 항산화 성분의 최대 추출 및 항산화 활성을 위한 에탄올 농도를 선정하여 에탄올 추출물을 얻은 이후 용매의 극성차이에 의한 분획을 하였다. 커피체리 펄프의 항산화 성분으로는 총 페놀성 화합물 함량과 총 플라보노이드 함량을 비교 분석했을 때, 80% 에탄올 농도에서 각각 46.55 mg GAE/g과 113.42 mg QE/g으로 가장 높게 나타났다. 커피체리 펄프 80% 에탄올 추출물(CEE)을 이용해 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 순으로 용매 분획을 진행하여 회수된 분획에 대한 항산화 성분 함량을 비교하였다. 각 분획물 중 총 페놀성 화합물 함량과 총 플라보노이드 함량은 ethyl acetate 분획물(CEF)이 가장 높아 각각 627.50 mg GAE/g과 1,632.31 mg QE/g이었으며, DPPH 라디칼 소거능 및 ABST 라디칼 소거능에 대한 IC50값이 각각 0.17 mg/mL와 0.34 mg/mL로 분획물 중 가장 낮아 항산화 활성이 높게 평가되었다. CEE에 함유된 페놀성 화합물을 HPLC system으로 분석한 결과 3-chlorogenic acid 15.05 mg/g, 4-chlorogenic acid 0.61 mg/g, 5-chlorogenic acid 1.06 mg/g, 3,4-dicaffeoylquinic acid 0.26 mg/g, 4,5-dicaffeoylquinic acid 1.22 mg/g, 3,5-dicaffeoylquinic acid 20.10 mg/g, caffeic acid 0.02 mg/g이었으며, CEF의 경우 3-chlorogenic acid 62.75 mg/g, 4-chlorogenic acid 1.47 mg/g, 5-chlorogenic acid 4.01 mg/g, 3,4-dicaffeoylquinic acid 7.26 mg/g, 4,5-dicaffeoylquinic acid 34.82 mg/g, 3,5-dicaffeoylquinic acid 72.26 mg/g, caffeic acid 0.66 mg/g으로 산출되었다. 특히, CEF에 함유된 3-chlorogenic acid와 3,5-dicaffeoylquinic acid의 함량이 CEE보다 3배 이상 증가하여 항산화 성분의 함량과 항산화 활성에 영향을 주었을 것으로 예측되었다. CCP가 함유된 MRS broth에 cinnamoyl esterase 유전자를 보유한 것으로 알려진 유산균을 접종하여 발효시킨 발효물에 대한 페놀성 화합물의 조성변화를 분석한 결과 CQA 및 DCGA의 함량은 감소했으나, Lactobacillus paracasei JBLAB1402 및 L. rhamnosus GG를 이용하여 발효했을 때, caffeic acid의 함량이 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과를 토대로 커피체리 펄프에 함유된 페놀성 화합물의 조성과 유산균 발효를 통한 생체이용률 증가 기능성 소재의 확보에 관한 연구의 기초자료로 활용될 것으로 기대된다.

본 논문은 농림축산식품부 유용미생물은행 구축사업(과제명: 농축산･식품 마이크로바이옴 통합 바이오 뱅크 구축, MIFI 2021-1)의 연구비 지원으로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.