비만은 다인성 질환 중의 하나로 지방생성의 주요 경로는 백색 지방 조직의 과도한 축적 및 저장으로 에너지 불균형과 관련이 있다(Liu 등, 2018). 또한 전 세계적으로 비만 유병률은 모든 연령대에서 증가하고 있다. 따라서 적절하게 균형 잡힌 식사와 생리활성 물질의 섭취는 비만 예방에 매우 중요한 요소이다(Prostek 등, 2016).

후성유전적 조절은 생리활성 식품 성분의 생체 내 작용을 매개하는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2022). 예를 들면, epigallocatechin gallate(EGCG)는 DNA methyltransferases와 histone deacetylases와 상호작용하여 후성유전적 변화를 조절하였다(Negri 등, 2018). 현재까지 지방 세포 모델을 사용하여 지방 세포 분화에서 다양한 분자 메커니즘이 확인되었는데, 지방전구세포에서 지방세포로의 발달 과정은 전사 인자의 배열 중 특히 CCAAT/enhancer-binding protein(C/EBP)과 peroxisome proliferator-activated receptor γ 2(PPARγ2)에 의해 제어된다(LeBlanc 등, 2016). 하지만 GCN5, P300/CBP-associated factor(PCAF)를 매개로 한 H3K37ac가 지방생성에서 PPARγ 전사의 초기에 필수적임을 입증한 연구는 없다(Kim 등, 2022). 지방세포는 지질 항상성 및 에너지 대사와 관련하여 비만에 중요한 역할을 하며, 3T3-L1 세포는 지방전구세포로 지방세포로의 분화 및 지질축적 평가를 위해 사용되는 세포모델이다(Liu 등, 2018). CCAAT/enhancer-binding protein α(C/EBPα)와 PPARγ는 분화 과정에서 활성화되고 함께 지방 표현형과 포도당 및 지질대사에 관여하는 지방 특이적 유전자 발현의 downstream을 촉진한다(Shang 등, 2007). 최근 연구에 따르면 PPARγ의 전사 활성은 일반적인 adipogenesis의 전사 조절뿐 아니라(Jang 등, 2018) 후성유전학적으로 steroid receptor coactivators, CREB-binding protein(CBP), p300과 같은 histone acetyltransferases(HATs)에 유전자 전사를 촉진하는 복합체들과 함께 co-activator로의 상호작용이 연구되었다(Lefterova 등, 2014).

후성유전학적 조절과 관련하여 단백질의 메틸화에 따른 히스톤 변형에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다. 단백질을 형성하는 아미노산 중 아르기닌 메틸화는 세포 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, protein arginine methyltransferase(PRMT) family에 의해 아르기닌의 메틸화가 일어난다. PRMT 중 Ⅱ형으로 분류되는 PRMT5, PRMT7, PRMT9 효소들은 ω-N^G-monomethylarginines와 ω-N^G, N’^G-dimethylarginines의 형성을 촉매한다. 또한, PRMT5에 의해 메틸화된 단백질이 interleukin-2와 cyclin E1과 같은 유전자 발현 조절에 중요하며 히스톤과 전사 관련 인자들의 메틸화를 통해 유전자 전사에게 영향을 줄 수 있다(Wolf, 2009)는 연구가 있다.

Selenium(Se)은 영양에 필수적인 미량 원소로 사람과 동물의 생리적 현상에 영향을 주는 것으로 알려졌다. 사람에게는 케샨병 및 카신-벡 증후군 증상과 연관이 있으며 쥐, 돼지, 양과 같은 동물에서는 간 괴사, 심장 괴사 및 근이영양증 등과 관련이 있다(Johnson 등, 2000). 또한, 미량 영양소로서 Se는 비타민 흡수 조절, 신체 대사 조절, 항종양, 노화 방지 등 다양한 생물학적 기능을 보유하고 있어 중요한 역할을 하며, 인체의 면역 체계를 개선하고 각종 질병을 예방한다(Wang 등, 2017). 최근 지방 조직에서 Se의 지방생성, 지방분해, 산화스트레스 및 염증과 같은 중요한 분자 메커니즘 연구로 Se의 효능이 확인되었으며 Se 결핍과 과잉은 모두 지방 조직 기능 장애와 대사 변화의 징후에 기여할 수 있고 비만의 효과에서 중요하다(Fontenelle 등, 2022). Hauffe 등(2022)의 연구에 의하면 3T3-L1 지방세포에서 selenite가 palmitate로 유도된 인슐린 저항성을 개선하고 diet-induced obese 마우스에 selenite가 첨가된 식이를 먹였을 때 high fat diet을 먹인 대조군 마우스에 비해 체중, 포도당 내성 및 인슐린 감수성이 변하지 않았다는 연구 결과가 있다. 또한 Kim 등(2021)의 연구에서 암 환자에게 고용량의 sodium selenite(SS)를 투여했을 때 방사선치료와 화학요법의 효과를 증가시키고 방사선 부작용과 약물 내성을 줄이는 데 효과적이다는 연구 결과가 있다.

따라서 본 연구에서는 80여 종의 아미노산, 지방산, 비타민, 미네랄을 대상으로 RAW264.7 세포에서 항염증 효과, AML-12 세포에서 지질축적 억제, in vitro HAT 활성 효과를 실험한 스크리닝 선행 연구(Park 등, 2023)를 통해 지질축적 억제와 HAT 활성 억제 효과가 뛰어난 SS를 선정하였다. Se의 항산화 및 면역 개선에 관한 연구는 활발히 되었지만, 지질축적 억제 및 지방생성 전사 인자를 억제할 수 있는 후성유전 조절 효소에 의한 항비만 효능에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 이에 관한 후속 연구로 SS의 후성유전 조절 효소인 PRMT와 specific HAT의 효소활성을 확인하고 항비만 효능을 세포 수준에서 확인할 수 있는 3T3-L1 세포를 사용하여 SS의 비만과 후성유전학적 조절 기능에 관한 연구를 수행하였다.

실험재료

본 실험에 사용된 SS, EGCG, 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), insulin, dexamethasone, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), Oil Red O 염색 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Dulbecco’s modifed Eagle’s medium(DMEM), bovine calf serum(BCS), fetal bovine serum(FBS), antibiotics/antimycotics, Dulbecco’s-phosphate buffered saline(DPBS)은 Welgene Inc.(Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다.

In vitro PRMT 활성 측정

SS와 EGCG의 PRMT 효소활성을 측정하기 위해 PRMT activity assay kit(EpiGentek, Famingdale, NY, USA)을 구매하여 제공하는 효소활성 분석 재료들과 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다. PRMT 효소 공급원으로 HeLa cell nuclear extract(NE; BioVision Inc., Waltham, MA, USA)를 사용했으며 96-well plate에 SS와 EGCG를 1, 5, 10 μM의 농도로 실험을 진행하였고 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

In vitro total HAT 활성 측정

In vitro total HAT 활성을 측정하기 위해 HAT activity assay kit(BioVision Inc.)을 이용하였다. HAT 효소의 공급원으로 NE를 이용했으며 kit에서 제공되는 효소활성 분석 재료들과 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다. PRMT 활성 측정과 같은 농도로 진행했으며 37°C incubator에서 75분 incubation 후 microplate reader를 사용하여 440 nm 파장에서 흡광도 값을 측정하여 HAT 활성을 계산하였다.

3T3-L1 세포 배양 및 지질축적 유도

3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection(CL-173; Manassas, VA, USA)에서 분양받아 10% BCS와 1% antibiotics/antimycotics를 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포를 12-well plate에 7×10⁴ cells/mL의 농도로 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 조건에서 100% confluent 상태가 되도록 2일 배양하였다. 배지 제거 및 교체 후 2일간 추가 배양한 다음 10% FBS가 첨가된 MDI cocktail(0.5 mM IBMX, 1 μg/mL insulin, 1 μM dexamethasone)로 옮겨 SS를 처리하였다. 2일 후부터 1 μg/mL 인슐린이 포함된 DMEM 배지와 SS를 동시에 처리하며 2일에 한 번씩 교체하여 4일간 추가 배양하였다.

MTT assay

3T3-L1 세포를 24-well plate에 8×10⁴ cells/mL의 농도로 분주하였다. 24시간 후에 기존 배지를 제거한 후 SS(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40 μM)를 농도별로 처리하였다. 48시간 후에 배지를 제거하고 MTT solution을 500 μg/mL의 농도로 첨가해 2시간 동안 추가 배양하여 형성된 formazan을 dimethyl sulfoxide에 녹인 후 570 nm에서 microplate reader를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

Oil Red O staining

3T3-L1 세포의 지질축적 억제를 평가하기 위해 Oil Red O 염색법으로 정량 및 현미경으로 세포를 관찰하였다. 세포의 분화는 지질축적 유도의 방법과 동일하게 10일간 분화시켰다. 세포를 DPBS로 2회 세척하고 3.7% formalin으로 실온에서 고정시켰다. DPBS로 2회 세척 후 60% isopropyl alcohol(IPA)로 10분 방치하였다. 60% IPA를 제거한 후 Oil Red O 용액으로 실온에서 30분간 염색하였다. 용액을 제거한 후 증류수로 4회 세척하고 현미경으로 염색된 세포를 관찰한 후 스캐너를 이용하여 사진을 얻었다. 100% IPA로 Oil Red O 용액을 녹여 96-well plate에 100 μL씩 옮겨 500 nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하여 지질축적 억제율을 계산하였다.

Triglyceride 함량 측정

세포의 분화는 지질축적 유도 방법과 동일하게 10일간 분화시킨 후 세포를 회수하였다. Triglyceride assay kit(Abcam, Cambridge, UK)을 이용하여 제공되는 프로토콜에 따라 효소활성을 측정하였다. 5% NP-40을 세포에 넣어 균질화하였다. 균질화된 세포를 90°C 항온수조에서 3분간 가열한 후 식히는 과정을 3회 반복하였다. Centrifuge를 이용하여 상층액을 새 튜브에 옮겼다. 실험 전 증류수로 시료를 희석한 다음 시료와 standard를 총부피 50 μL로 맞춰 96-well plate에 넣었다. 다음 각각 lipase 2 μL를 넣은 후 실온에서 20분간 incubation 하였다. 이후에 triglyceride assay buffer 46 μL, triglyceride probe 2 μL, triglyceride enzyme mix 2 μL를 혼합하여 모든 well에 넣어 실온에서 1시간 incubation 하였고 microplate reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총단백질은 BCA assay(iNtron Biotechnology, Inc., Seongnam, Korea)로 최종 정량하였다.

Western blot

3T3-L1 세포에서 지방합성 관련 단백질 발현을 확인하기 위해 western blot으로 발현량을 확인하였다. 3T3-L1 세포는 10% BCS와 1% antibiotics antimycotic solution이 포함된 DMEM 배지를 사용했으며 6-well plate에 2×10⁵ cells/mL로 분주하여 지질축적 유도 방법과 동일하게 10일간 분화시킨 후 세포를 회수하였다. 세포를 원심분리(13,000 rpm, 1분)한 후 cell lysis buffer(Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA)를 사용하여 용해하였다. 단백질 정량은 BCA assay(iNtron Biotechnology, Inc.)를 사용하여 정량하였다. 15 μg의 단백질을 6~10% SDS page gel에 전기영동 하였으며 항체[PRMT5(Upstate Biotechnolgy, Inc., Lake Placid, NY, USA), PCAF(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), fatty acid synthase(FAS), ATP citrate lyase(ACLY), PPARγ, actin(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), C/EBPα, acetyl-CoA carboxylase(ACC; Cell Signaling Technology, Inc.)]를 이용하여 단백질의 발현량을 확인하였다.

Real-time PCR

3T3-L1 세포에 MDI, 인슐린, SS를 위에서 언급한 농도와 방법을 동일하게 처리하여 DPBS로 2회 세척하고 원심분리(13,000 rpm, 1분)하여 pellet을 얻었다. RNA extraction solution(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)을 사용하여 pellet에서 RNA를 추출한 후 1 μg의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다(Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan). Real-time PCR 분석은 SYBR Green(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany), primer, cDNA, rnase free water를 넣어 총부피 20 μL로 분석했으며 다음과 같은 조건으로 시행하였다(Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR detection System, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). PCR은 95°C에서 10분, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 65°C에서 5초로 39 cycle로 시행하였다. 각 유전자의 발현량은 β-actin 발현량을 기준으로 상대적 정량을 하였다. 본 실험에 사용된 프라이머는 Table 1과 같다.

Table 1 . Primer sequences for real-time PCR.

Gene	Forward (5′→3′)	Reverse (5′→3′)
PCAF	TGTCATTGGTGGTATCTGT	ATATGTGAGGAAGTTGAGGAT
CBP	GACCGCTTTGTTTATACCTGC	TCTTATGGGTGTGGCTCTTTG
p300	GTTGCTATGGGAAACAGTTATGC	TGTAGTTTGAGGTTGGGAAGG
PPARγ	CCACCAACTTCGGAATCAGCT	TTTGTGGATCCGGCAGTTAAGA
C/EBPα	TACCGAGTAGGGGGAGCA	TCATTTTTCTCACGGGGCC
ACLY	ACATTGCAGACCTGGATGCCA	TTAAGGAGGAAGTTGGCAGT
ACCα	GCTGGAGAAGCAACTGACAGAG	AGCTGGAACACTGCCAACTAGG
FAS	AGAAGCCATGTGGGGAAGATT	AGCAGGGACAGGACAAGACAA
β-Actin	CTAAGGCCAACCGTGAAAG	ACCAGAGGCATACAGGGACA

통계 분석

본 실험 결과는 GraphPad Prism(version 8.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 통계적 검증을 했으며 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며 각 실험군 간의 통계적 유의성은 ANOVA를 사용하여 검정하였다.

SS의 in vitro PRMT 및 total HAT 활성 억제

SS의 in vitro PRMT와 total HAT 활성 조절을 평가하기 위해 비교 대상으로 EGCG를 사용하여 농도별(1, 5, 10 μM)로 준비하여 측정하였다. In vitro PRMT 및 HAT 활성 측정 결과 SS는 통계적으로 유의하게 PRMT와 HAT 활성을 억제하였다(Fig. 1). NE를 처리한 대조군을 100%로 하여 비교했을 때, SS를 처리한 경우 동일 농도인 10 μM에서 EGCG보다 약 62% PRMT 활성을 억제했으며, HAT 활성의 경우에도 동일 농도인 10 μM에서 EGCG보다 약 97% 억제하였다. SS와 EGCG 모두 in vitro PRMT와 HAT 활성을 유의적으로 억제하였고(P<0.0001), 특히 고농도에서 EGCG보다 SS의 억제 활성이 더 뛰어난 것을 확인하였다. Specific HAT인 PCAF, CBP, p300은 transcriptional co-activators로 많은 요인에 의해 전사 활성화에 관여한다. 전사 인자 수준에서 이러한 co-activators는 DNA 결합, 단백질 간의 상호 작용을 비롯한 여러 과정에서 전사 인자 활성을 조절하는 것으로 보고되었다(Song 등, 2003). 히스톤 라이신 잔기의 아세틸화와 후성유전적인 변형은 일반적으로 유전자 활성화와 관련이 있는데, specific HAT인 GCN5와 PCAF는 지방생성 과정 동안 PPAR의 upstream에서 기능을 하고 이들은 C/EBPβ를 아세틸화하여 C/EBPα의 발현을 순차적으로 활성화한다. 또한 PCAF의 knockdown은 지방세포 분화를 감소시켰다(Kim 등, 2022).

Fig 1. In vitro (A) protein arginine methyltransferase (PRMT) activity and (B) total histone acetyltransferase (HAT) activity regulated by sodium selenite (SS) compared with epigallo catechin gallate (EGCG 1, 5, 10 μM). All data are expressed as mean±SD from of each group. Asterisk (*) indicates a significant difference compared with nuclear extract (NE) (**P<0.01, ****P<0.0001).

SS의 3T3-L1 지방세포에서의 세포독성 평가 및 specific HAT 유전자 발현 조절

앞서 확인된 in vitro total HAT 활성 측정을 통해 SS의 HAT 활성 억제능을 확인하였다(Fig. 1). 이러한 억제능이 세포독성에 의한 영향인지 확인을 위해 3T3-L1 지방세포에서 SS를 농도별(0.1, 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40 μM)로 처리하여 MTT를 측정했으며, SS 20 μM 이상에서 세포독성을 확인하였다(Fig. 2A). 이 결과는 앞서 SS에 의한 PRMT와 HAT 활성 억제가 독성에 기인한 것이 아님을 확인한 것이며, 이후 실험에서는 세포독성이 없는 농도인 10 μM까지 처리하여 분석을 진행하였다. 또한 3T3-L1 세포에서 MDI와 인슐린을 처리하여 분화시키는 과정에서 specific HAT인 PCAF, CBP, p300의 유전자 발현량을 qRT-PCR을 통해 확인하였다(Fig. 2B). MDI와 인슐린을 처리한 양성대조군과 음성대조군의 발현량 차이는 PCAF가 약 3배 차이가 났으며, SS 10 μM 처리에서 유의적으로 PCAF의 유전자 발현량을 억제하였다(P<0.001). CBP와 p300의 발현량은 양성대조군과 음성대조군의 차이가 미미했으며, SS에 의해 농도 의존적으로 억제되지 않았고 SS 5 μM 처리에서 증가하였다. 또한 SS 10 μM을 처리했을 때 CBP와 p300은 억제되지 않았으며 양성대조군과 비슷한 수준의 발현량을 보였다. Wiper-Bergeron 등(2007)의 연구에 의하면 3T3-L1 지방세포에 재조합된 p300, GCN5, PCAF의 지방생성 조절 인자인 C/EBPβ의 아세틸화 조절의 단백질 발현을 확인한 결과 재조합된 p300은 C/EBPβ의 아세틸화를 초래하지 않았지만 재조합된 GCN5와 PCAF는 C/EBPβ의 아세틸화를 촉진한다는 연구 결과가 있다. 따라서 3T3-L1 지방세포에서 지방생성 관련 유전자의 아세틸화를 초래하는 것은 PCAF이며 SS는 PCAF의 발현을 억제하였다.

Fig 2. Sodium selenite (SS; 1, 5, 10 μM) suppressed significantly mRNA expression P300/CBP-associated factor (PCAF) among specific HATs in MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes by qRT-PCR. (A) Cell viability in none MDI-treated 3T3-L1 preadipocytes and less than 20 μM, the cell viability was more than 80%. (B) SS suppressed mRNA expression P300/CBP-associated factor (PCAF) in none cytotoxicity concentration among specific HATs that are PCAF, CREB-binding protein (CBP), p300 in MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes by qRT-PCR. All data are expressed as mean±SD from of each group. Asterisk (*) indicates a significant difference compared to MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes (**P<0.01, ***P<0.001).

SS의 지질축적 억제 및 triglyceride(TG) 조절

3T3-L1 전지방세포에서 MDI를 처리하여 지방세포로 분화 중 HAT 활성 억제가 지질축적 억제 활성에 관여한다는 보고가 있다(Hwang 등, 2017). 따라서 본 연구에서는 specific HAT 활성 억제를 보인(Fig. 2) SS의 지질축적과 TG 억제를 3T3-L1 지방전구세포에 MDI와 인슐린을 처리와 분화를 통해 확인하였다. 3T3-L1 지방세포에서 지방축적 억제와 TG 농도는 세포독성이 없는 농도(SS 1, 5, 10 μM)로 처리했으며, 지방세포로의 분화는 MDI, 인슐린을 SS와 동시에 6일 동안 2일 간격으로 처리하여 분화하였다. 지질축적 억제는 Oil Red O 염색법을 통해 염색 후 현미경으로 확인하였다(Fig. 3A, 3B). 지질축적 억제를 확인한 결과, 음성대조군에 비해 MDI 처리 양성대조군의 지질축적량은 약 3.7배 많았으며 양성대조군에 비해 SS 10 μM을 처리했을 때 약 13%의 감소율을 보였다. 현미경으로 확인한 결과 고농도인 SS 10 μM 처리에서 지방구의 크기와 Oil Red O solution의 염색된 지방세포의 수가 현저히 감소한 것을 확인하였다. 또한 TG를 정량했을 때 SS 10 μM 처리에서 MDI 처리 양성대조군에 비해 약 16% TG 농도가 감소하였다. 지방 조직의 TG는 생체 내에서 초과한 에너지의 장기적인 저장소이고 지방세포의 지방 저장은 전신 에너지 균형에 따라 조절되며 지방세포 내의 지방구(lipid droplet)는 분화된 지방세포에서 중성지방의 합성과 세포 내의 지방축적에 관여한다(Frayn 등, 2003; Lee 등, 2011). 종합적으로 SS는 3T3-L1 지방세포에서 지질축적과 TG 농도를 농도 의존적으로 억제하였다.

Fig 3. Sodium selenite (SS) attenuated a lipid accumulation and triglyceride (TG) in MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes. (A, B) SS inhibited a lipid accumulation in a concentration-dependent manner in MDI-induced 3T3-L1 cells by Oil red O staining and microscopy. (C) SS decreased TG concentration significantly related to results of lipid accumulation. All data are expressed as mean±SD from of each group. Asterisk (*) indicates a significant difference compared to MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes (*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001).

SS의 PRMT5 및 PCAF 단백질 발현 조절

PRMT 활성 측정에 사용한 EpiGentek 사의 kit은 PRMT Type Ⅱ specific으로 PRMT5와 PRMT9을 특정적으로 측정할 수 있다. 3T3-L1 세포에서 PRMT5를 과발현시켰을 때 지방생성 유전자의 발현과 분화를 향상시켰다는 연구가 있으며, PPARγ의 전사 활성을 조절하는 co-repressor로서 기능이 보고되었다(Jang 등, 2018; LeBlanc 등, 2016). 반면 PRMT9은 Raposo와 Piller(2018)의 연구에 의하면 전립선암 세포주인 LNCaP에서 PRMT9과 결합하고 PRMT9의 knockdown은 전립선 특이항원의 세포 성장과 발현을 억제한다고 밝혔으며 PRMT9은 세포 주기와 성장에 관계가 있는 PRMT이다. 따라서 PRMT family 중 3T3-L1에서 지방세포로의 분화에 관여하는 PRMT5와 앞서 나온 specific HAT 활성 억제 결과에 의하면 SS가 PCAF의 mRNA 발현을 억제(Fig. 2A)했기에 PRMT5와 PCAF의 단백질 발현을 western blot으로 확인하였다(Fig. 4). SS는 3T3-L1 지방세포에서 PRMT5와 PCAF의 단백질 발현을 모두 농도 의존적으로 억제하였다. 단백질 밴드를 β-actin으로 정량했을 때 특히 SS 10 μM 처리에서 PRMT5와 PCAF의 발현을 각각 약 23%로 유의하게 감소시켰다(P<0.05). 이는 SS의 처리가 in vitro와 3T3-L1 지방세포 안에서도 PRMT와 HAT 활성 억제를 조절한다고 할 수 있다. 하지만 PRMT5는 메틸화 효소이므로 메틸화에 의한 항비만 효능인지에 관한 후속 연구가 필요하다.

Fig 4. Western blot analysis and quantification of (A) PRMT5 and (B) PCAF obtained triplicate samples and normalized to β-actin. And all samples harvested in MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes during 6 days differentiation. All data are expressed as mean±SD from of each group. Asterisk (*) indicates a significant difference compared to MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes (*P<0.05).

SS의 지방생성 및 지질생성 인자 단백질 발현 조절

3T3-L1 전지방세포에서 MDI 처리로 분화하여 adipogenesis와 lipogenesis의 과정에 관여하는지 확인하기 위해 관련 marker들을 단백질 발현을 통해 확인하였다(Fig. 5). 3T3-L1 전지방세포에서 앞서 같은 방법으로 분화시켰으며 MDI를 처리한 양성대조군에서 PPARγ, C/EBPα의 단백질 발현이 증가하였고 SS를 처리했을 때 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 5A). Lipogenesis의 과정에 관여하는 marker인 ACLY, ACC, FAS의 단백질 발현량을 측정한 결과 모두 SS 10 μM 처리에서 발현량이 감소하였다(Fig. 5B). PPARγ와 C/EBPα는 지방세포에서 중요한 지방 전사 인자로 알려져 있으며, SS는 PPARγ, C/EBPα 조절을 통해 항비만 효과를 나타낼 수 있다(El-Magd 등, 2022). 비만은 단순히 체중 증가에 의한 것이 아니라 체내에 지방 조직이 축적되어 대사 장애를 동반하는데 지방축적은 지방생성(lipogenesis)과 지방분해(fatty acid oxidation) 간의 균형에 의해 결정된다. 지방생성과 관련된 전사 인자의 활성화는 지방축적을 촉진하는데, sterol regulatory element-binding protein-1c, FAS, stearoyl CoA desaturase-1과 같은 전사 인자는 지방생성 유전자의 발현을 조절한다. 또한 지방축적은 citrate synthase, ACLY에 의해 증가하며 시트르산을 미토콘드리아로 이동시켜 지방 생산을 촉진한다(Hwang 등, 2021). ACC는 지방산 생합성의 속도 제한 단계인 아세틸-CoA의 카르복실화를 촉매하여 말로닐-CoA를 형성하며, ACC의 활성은 인산화 형태와 효소량의 변화에 의해 조절된다(Watanabe 등, 1998). Lee 등(2018)의 연구에 의하면 AMP-activated protein kinase의 자극에 의해 ACC를 인산화하여 효소활성을 억제해 세포 내 말로닐-CoA를 감소시키지만, 본 연구에서는 ACC가 인산화 형태가 되기 전 total 형태에서 음성처리군 대비 양성처리군에서 ACC의 발현이 증가하였고 농도 의존적으로 ACC의 단백질 발현이 변화하였기 때문에(Fig. 5B) 하위 경로인 FAS에 영향을 주었다고 할 수 있다.

Fig 5. Sodium selenite (SS) decreased the protein level of (A) adipogenesis and (B) de novo lipogenesis factors by immunoblotting in MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes. And quantification of the factors obtained triplicate samples and normalized to β-actin. All data are expressed as mean±SD from of each group. Asterisk (*) indicates a significant difference compared to MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001).

종합적으로 SS 10 μM 처리에서 지방생성 및 지질생성에 관련된 전사 인자들의 단백질 발현 억제를 통해 SS의 항비만 효능을 확인하였고 유전자 발현 또한 SS에 의해 조절됨을 확인하였다.

SS의 지방생성 및 지질생성 인자 유전자 발현 조절

앞서 확인된 SS의 지방생성 전사 인자 및 지질생성 인자의 단백질 발현 억제(Fig. 5)를 통해 SS의 항비만 효능을 확인하였다. 추가로 유전자 발현도 억제하는지 확인하기 위해 3T3-L1 전지방세포에서 MDI 처리로 분화하여 adipogenesis와 lipogenesis의 과정에 관여하는 단백질과 같은 marker들의 유전자 발현을 qRT-PCR로 확인하였다(Fig. 6). 그 결과 단백질 발현과 동일하게 지방생성 전사 인자인 PPARγ와 C/EBPα(Fig. 6, upper panel)의 유전자 발현량을 농도 의존적으로 억제했으며, 지방산 합성 과정에 관여하는 ACLY, ACCα, FAS의 유전자 발현을 고농도인 SS 10 μM 처리에서 모두 억제했지만 농도 의존적이지는 않았다(Fig. 6, lower panel). ACC는 두 가지 isoform이 존재하는데 ACC_α와 ACC_β가 있다. ACC_α는 white adipose tissue, 간을 포함한 지방 조직에 있고 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환하며, ACC_β는 말로닐-CoA의 조절을 통해 아실-CoA를 미토콘드리아로 전달하는 것에 관여한다(Peng 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 지방 조직에 풍부하며 아세틸-CoA에서 말로닐-CoA로의 전환에 관여하는 ACC_α의 유전자 발현을 확인하였다. 종합적으로 고농도인 SS 10 μM 처리에서 지방생성 및 지질생성에 관련된 전사 인자들의 유전자 발현 억제를 통해 SS의 항비만 효능을 확인하였고 항비만 소재로서의 활용 가능성을 보였다. 하지만 PRMT5는 메틸화 효소이므로 메틸화에 의한 항비만 효능 확인 추가실험과 동물실험을 통한 SS의 항비만 효능의 후속 연구가 필요하다.

Fig 6. Sodium selenite (SS) decreased the mRNA level of adipogenesis and de novo lipogenesis factors by qRT-PCR in MDI-induced 3T3-L1 preadipocytes. SS suppressed mRNA expression of adipogenic transcription factors that are peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) and CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα) by qRT-PCR (upper panel). SS decreased the mRNA expression of de novo lipogenesis factors that are ATP citrate lyase (ACLY), acetyl-CoA carboxylase (ACC), and fatty acid synthase (FAS) by qRT-PCR (lower panel). All fold change were respectively quantificated and normalized by β-actin. All data are expressed as mean±SD from of each group. Asterisk (*) indicates a significant difference compared to MDI-induced in 3T3-L1 preadipocytes (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001).

본 연구에서는 SS의 후성유전 조절 효소인 PRMT5와 HAT 활성의 억제를 통한 항비만 효과를 확인하기 위해 3T3-L1 지방세포에 MDI를 처리하여 지질축적 및 TG 억제능을 평가하였다. SS는 세포독성에 영향을 미치지 않는 농도인 10 μM까지 처리했으며 지질과 TG 농도를 유의하게 억제하였다. 따라서 SS는 항비만 효능이 있음을 확인하였다. In vitro PRMT와 HAT 활성 억제능을 측정하기 위해 EGCG를 대조군으로 사용하여 평가하였다. PRMT와 HAT 활성 효소 억제능은 SS 처리가 EGCG에 대비하여 각각 62%, 97% 억제하였다. 또한 3T3-L1 지방세포에서 specific HAT인 PCAF, CBP, p300의 유전자 발현량을 qRT-PCR로 확인한 결과, PCAF의 발현량이 SS 10 μM 처리에서 현저히 감소하였다. 3T3-L1 지방세포에서 adipogenesis에 관여하는 인자인 PPARγ와 C/EBPα, lipogenesis에 관여하는 인자들(ACLY, ACC, FAS)의 단백질과 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과 SS 10 μM 처리에서 adipogenesis 및 lipogenesis 관련 인자들의 단백질과 유전자 발현이 유의하게 억제됨을 확인하였다. 따라서 SS는 PRMT5와 HAT 활성 억제를 통해 항비만 효능을 나타낸다고 할 수 있다.

본 연구는 한국식품연구원 사업연구비(과제번호 E0210601-02)의 지원을 받아 수행한 연구 결과로 이에 감사드립니다.