사과(Malus domestica)는 전 세계적으로 많은 소비가 이루어지는 과일 중 하나로, 다양한 영양성분을 비롯하여 생리활성물질을 다량 함유하고 있어 우수한 식품으로 평가되고 있다(Boyer와 Liu, 2004). 그리고 사과의 섭취는 심혈관 질환을 비롯한 만성질환 및 대사성 증후군을 예방하는 데 도움을 준다고 보고되고 있다(Nagasako-Akazome 등, 2007; Hyson, 2011). 특히, 사과박에는 과육보다 6배 이상 높은 페놀화합물을 보유하고 있는 것으로 보고되고 있으며 높은 항산화력을 지니고 있다고 알려져 있다(Henríquez 등, 2010). 최근에는 사과를 이용한 가공식품의 수요가 증가함에 따라 그 부산물인 사과박의 양도 증가하고 있으나, 일부는 사료로 이용되고 있으며 껍질 대부분이 폐기되는 것으로 보고되고 있다(Heidarisafar 등, 2016; Tian 등, 2018).

사과의 주요 생리활성물질인 플라보노이드는 천연 화합물로 항산화, 항염증, 항알레르기, 항바이러스 효과 등 다양한 생리활성을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다(Mendes 등, 2012). 플라보노이드의 생리활성은 플라보노이드의 구조에 따라 결정되는 것으로 보고되고 있으며, 특히 수산화기(-OH, hydroxyl 그룹)와 당의 결합 위치와 그 수가 중요한 요소로 작용하고 있는 것으로 보고되고 있다(Heim 등, 2002). 사과에 함유된 플라보노이드는 주로 쿼세틴(quercetin)을 기본 구조로 한 다양한 배당체 플라보노이드(glycoside flavonoid)를 함유하고 있으며(Wach 등, 2007), 배당체 플라보노이드보다 비배당체 플라보노이드(aglycone)가 뛰어난 생리활성을 지닌 것으로 보고되고 있다(Alia 등, 2006; Manach 등, 1997). 비배당체 플라보노이드의 높은 생리활성은 작용기의 변화를 통해 화학적 특성의 변화를 야기하여 용해도에 영향을 미치고 이 변화는 세포막에서의 흡수율을 증가시키며, 흡수된 플라보노이드는 세포 내 효소의 활성에도 영향을 미쳐 체내에서 높은 활성에 기여하는 것으로 알려져 있다(Tsuchiya, 2010). 따라서 배당체 플라보노이드를 다량 함유한 식품소재로부터 고기능성 소재의 개발을 위해 비배당체 플라보노이드로 전환하기 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 그중 미생물과 효소를 이용한 생물학적 방법을 이용한 방법에 관한 연구가 주로 이루어져 있다(Cruz-Zúñiga 등, 2016; Kato 등 1983; Shin 등, 2016). 특히 산처리를 이용한 배당체 플라보노이드의 어글리콘화는 생물학적 방법과 비교했을 때 간단한 방법으로 전환을 유도할 수 있으며, 그 효율도 매우 높은 것으로 알려져 있다(Srivastava 등, 2015). 하지만 사과박을 이용한 플라보노이드의 구조적 전환을 통한 고기능성 소재 개발 및 이를 위한 최적화 연구는 아직 부족한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 사과박에 함유된 배당체 플라보노이드를 비배당체 플라보노이드로의 전환을 통해 향상된 기능성을 갖는 소재를 탐색하고자 한다. 본 연구에서는 배당체 플라보노이드를 비배당체 플라보노이드로의 전환을 위한 산처리 방법에 대한 최적 조건을 탐색하고 이를 통해 생리활성이 증가한 소재를 개발하고자 하였다.

재료 및 시약

본 실험에 사용한 사과박은 2018년에 재배된 국내산 사과를 청주지역 대형마트에서 구매하여 사용하였다. 사과박은 동결 건조 후 마쇄하여 -80°C에서 보관하며 사용하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS) 및 penicillin-streptomycin-neomycin antibiotic solution은 Gibco(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO), gallic acid, (+)-catechin, Trolox^®, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), potassium ferricyanide, ferric chloride 및 2ʹ,7ʹ-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA) 등은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

사과박의 산처리 및 추출물 제조

동결 건조된 사과박 3 g을 0.1 M HCl(80% 에탄올), 0.5 M HCl(80% 에탄올), 1.0 M HCl(80% 에탄올) 그리고 80% 에탄올을 이용하여 75°C 항온수조에서 환류 냉각관을 장착하여 2시간 동안 가수분해하였다. 반응 후 여과지(No.2, Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 고형분을 분리하였으며, 분리된 추출액은 0.5 M NaOH(80% 에탄올)를 사용하여 pH 7.0으로 중화하였다. 중화된 추출액은 40°C 이하에서 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 용매를 제거하였다. 이후 추출물을 제조하기 위해 물에 재용해한 후, 에틸아세테이트를 혼합한 뒤 30분간 정치하여 분획하였다. 정치 후 분획된 에틸아세테이트층을 취하였으며 이 과정을 3회 반복하였다. 분획된 에틸아세테이트층은 40°C 이하에서 감압농축기를 이용하여 용매를 모두 제거한 후 DMSO에 재용해하여 추출물을 제조하였다. 제조된 추출물은 질소 충진 후 -80°C에서 보관하여 실험에 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Velioglu 등(1998)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 시료에 2% Na₂CO₃ 용액 2 mL를 가하여 3분간 방치한 후, Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 가하였다. 5분간 방치 후 720 nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선 작성은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)의 농도와 흡광도로 나타내었으며, 시료의 총 폴리페놀 함량은 추출물 1 g 중 mg gallic acid equivalent로 나타내었다.

사과박의 rutin 및 quercetin HPLC 분석

사과 껍질의 처리에 따른 플라보노이드 조성 및 함량을 분석하기 위하여 HPLC(Jasco System, Tokyo, Japan)를 이용하였다. 분석에 사용된 칼럼은 Luna 5U C18 column(250 mm×4.6 mm)(Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 사용하였으며, flow rate는 1.0 mL/min이었고 용매는 A: water:o-phosphoric acid(99.5:0.5, v/v)와 B: acetonitrile:water:o-phosphoric acid(50:49.5:0.5, v/v)를 사용하였다. 시료의 주입량은 20 μL로 UV 검출기를 이용하여 255 nm에서 측정하였다. 용매 기울기는 시간에 따라 0~5 min 90:10, 5~23 min 18:82, 23~28 min 90:10으로 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Kim 등(2002)의 방법을 변형하여 측정하였다. 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 추출물 50 μL를 가하여 정확히 30분 후 흡광도의 변화를 520 nm에서 측정하였다. Trolox^®를 이용하여 검량선을 작성한 후, 시료의 항산화력은 1 mL 중의 mg Trolox^® equivalent antioxidant capacity로 나타내었다.

환원력 측정

환원력은 Mau 등(2002)의 방법에 따라 측정하였다. 1 mg/mL 농도 이하의 추출물 250 μL에 0.2 mM sodium phosphoate buffer(pH 6.6) 250 μL, 1% potassium ferricyanide(K₃Fe(CN)₆) 250 μL를 각각 혼합하여 50°C에서 20분 동안 반응시킨 후 10% trichloroacetic acid(CCl₃COOH)를 가하였다. 위 반응액을 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 그 상등액 500 μL에 증류수 500 μL를 혼합하여 0.1% ferric chloride(FeCl₃･6H₂O) 100 μL를 가한 후 반응액의 흡광도 값을 700 nm에서 측정하였다.

세포배양 및 세포 생존율 및 산화적 스트레스에 대한 보호 효과

HepG2 세포는 10% FBS, 100 unit/mL penicillin, 50 μg/mL streptomycin을 함유한 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2가 공급되는 incubator(Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 37°C로 배양하였다. 생존율을 측정하기 위하여 96-well plate에 1×10⁵ 농도로 세포를 각 well에 분주하였다. 12시간 후 배지를 버리고 PBS를 이용하여 2회 반복 세척한 후 배지와 각 추출물(50 μg/mL)을 혼합하여 각 well에 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후 세포는 PBS를 이용하여 2회 반복 세척하고 200 μM tert-butyl hydroperoxide(TBHP)로 3시간 동안 산화적 스트레스를 유도한 후 세포 생존율을 측정하여 추출물에 대한 보호 효과를 측정하였다. 세포 생존율은 MTT를 이용하여 측정하였다. 추출물 처리 후 MTT 1 mg/mL를 처리하여 2시간 동안 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 세포 내 형성된 formarzan을 DMSO에 재용해하여 microplate reader(BioTek Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.

세포 내 reactive oxygen species(ROS) 억제 활성 측정

간세포에서 생성된 ROS의 양을 측정하기 위해 DCFH-DA를 이용한 방법을 응용하여 실시하였다(Kim과 Lee, 2017). 96-well plate에 1.0×10⁶ cells/well 농도의 간세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 각 추출물을 50 µg/mL씩 처리하였다. 24시간 처리 후 각 well에 25 µM의 DCFH-DA를 20 µL씩 첨가하였다. 2시간 후 fluorescent spectrophotometer(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)를 이용하여 여기 파장(excitation wavelength) 485 nm와 방출 파장(emission wavelength) 530 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 내 생성된 ROS의 함량을 측정하였다.

Malondialdehyde(MDA) 함량 측정

MDA 함량 측정은 thiobarbituric acid(TBA)법으로 측정하였다(Buege와 Aust, 1978). 6-well plate에 1.0×10⁶ cells/well 농도의 간세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 각 추출물을 50 µg/mL씩 처리하였다. 24시간 후 200 mM의 TBHP로 3시간 동안 산화적 스트레스를 유도하였다. 배지 제거 후 세포를 취하여 초음파 처리한 후 4°C, 10,000 rpm(9,800×g)에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리한 후 상등액 200 µL에 15% trichloroacetic acid와 0.375% TBA를 혼합한 용액을 200 µL 첨가하고 100°C에서 15분 동안 가열하였다. 반응 후 4°C, 13,000 rpm(16,600×g)에서 5분간 원심분리하여 상등액 200 µL를 취하여 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA 농도는 1.56×10⁵ M^-1cm^-1의 흡광계수를 이용하여 정량하였고, 그 결과는 단백질 mg당 MDA의 nmol로 표현하였다.

항산화 효소 활성 측정

6-well plate에 1.0×10⁶ cells/well 농도의 간세포를 24시간 동안 배양한 후 각 추출물을 50 µg/mL씩 처리하였다. 24시간 후 200 mM의 TBHP로 3시간 동안 산화적 스트레스를 유도하였다. 배지를 제거한 후 PBS를 이용하여 2회 세척한 다음 세포를 취하고 원심분리하여 PBS를 제거하였다. PBS를 제거한 cell pellet에 cold buffer(50 mM potassium phosphate with 1 mM EDTA, pH 7.5)를 이용하여 균질화하였다. 이후 원심분리(9,800×g, 5 min)한 뒤 상등액을 이용하여 효소활성 측정에 이용하였다. Glutahione reductase(GR), glutathione peroxidase(GPx), catalase(CAT), 그리고 superoxide dismutase(SOD)의 각 항산화 효소의 활성은 Cayman(Ann Arbor, MI, USA) assay kit을 이용하여 제공된 실험방법에 따라 측정하였다.

통계분석

통계분석은 SAS ver. 9.4(SAS Institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 수행했으며, 데이터 간의 유의성은 one-way analysis of variance 분석 후 ANOVA의 Duncan’s multiple range test에 의해 P<0.05 수준에서 검증하였다.

사과박의 산처리에 의한 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 변화

플라보노이드는 구조에 따라 분류되고, 구조에 따라서 생리활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Atmani 등, 2009). 플라보노이드에 결합하는 당은 화학적 성질을 결정하는 요인으로 작용하고 있지만, 생리활성에는 부정적인 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다(Thilakarathna와 Rupasinghe, 2013; Tripoli 등, 2007). 따라서 플라보노이드를 다량 함유한 소재를 이용하여 생리활성을 향상시키기 위한 플라보노이드의 구조적 변환에 관한 연구가 진행되고 있다(Yang 등, 2021; da Silva 등, 2013). 본 연구에서는 다량의 플라보노이드를 함유하고 있지만, 가공과정에서 대부분 폐기되고 있는 사과박에 적절한 처리 방법을 적용하여 사과박에 대한 활용도 증가시킴으로써 이를 활용한 고기능성 소재를 개발하고자 하였다.

이전 연구에서 플라보노이드의 구조변환을 위한 산의 종류와 용매의 조성을 확인했을 때, 100% 물을 사용하는 것보다 80% 에탄올을 사용했을 때 플라보노이드의 구조 전환율이 더 뛰어난 것을 확인했으며, 유기산보다는 무기산이 전환에 더 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다(Yang 등, 2019). 이러한 연구 결과를 바탕으로 본 연구에서는 사과박에 80% 에탄올에 용해한 HCl을 농도(0.1 M, 0.5 M, 1.0 M)별로 처리하였다. 처리 후 HCl을 제거하기 위하여 NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 중화시켰다. 이후 에틸아세테이트를 이용하여 분획하고 중화 과정 중 생성된 염을 제거하여 정제된 추출물을 제조하였다. 정제된 추출물의 폴리페놀(Fig. 1)과 플라보노이드(Table 1)의 함량 및 조성의 변화를 측정하였다. 그 결과 비처리군의 폴리페놀 함량은 41.82±0.59 mg GAE/g of residue 함량을 나타내었으며, 0.1 M은 83.78±2.52 mg/g, 0.5 M에서는 95.94±5.05 mg/g을 나타내어 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타내었다. 반면, 가장 높은 농도인 1.0 M에서는 57.06±0.62 mg/g으로 오히려 감소하였다. 1.0 M 처리군에서 폴리페놀 함량이 감소한 것은 과도하게 높은 무기산의 처리가 폴리페놀의 기본 구조의 변화를 야기하여 그 함량을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(Koşar 등, 2005). 사과박의 주요 플라보노이드 성분인 quercetin 유도체에 대한 함량 변화는 HPLC를 이용하여 측정하였다. 그 결과 비처리군에서는 rutin이 가장 높은 150.1±3.0 mg/g of residue로 나타났으며 quercetin-3-glucoside의 함량이 114.5±8.9 mg/g이었고 quercetin은 가장 낮은 35.3±0.5 mg/g 순으로 나타났다. 0.5 M의 처리군에서 rutin은 검출되지 않았으며, quercetin-3-glucoside의 함량은 4.0±1.0 mg/g으로 비처리군과 비교했을 때 약 28배 감소하는 경향을 나타내었다. 하지만 어글리콘 형태인 quercetin의 함량은 206.6±1.0 mg/g으로 약 5.85배가 증가하였다. 전체적인 플라보노이드의 함량은 처리농도에 따라 감소하는 경향을 나타내었다. Rutin의 분자량은 quercetin의 약 2배로 산처리한 추출물량의 감소한 플라보노이드의 질량은 플라보노이드에 결합한 당의 제거에 의한 것으로 유추될 수 있다. 하지만 1.0 M HCl을 처리한 사과박 시료보다 0.5 M을 처리한 대조군에서 quercetin 함량이 더 높은 것은 플라보노이드가 구조적으로 강산보다 약산성(pH 3~5)에서 안정하다는 보고에 따라 과도한 농도의 산처리보다 플라보노이드의 전환을 위한 적절한 산처리의 농도가 필요하다고 판단된다(Friedman과 Jürgens, 2000).

Table 1 . Flavonoid content of polyphenol rich fraction of apple peel extract treated with different HCl concentration treatment.

	Rutin	Quercetin-3-glucoside	Quercetin
	mg/g of residues
80% EtOH	150.1±3.0a1)2)	114.5±8.9a	35.3±0.5d
0.1 M HCl	106±0.7b	100.3±5.8b	50.2±1.5c
0.5 M HCl	ND3)	4.0±1.0c	206.6±1.0a
1.0 M HCl	ND	ND	193.3±3.3b

¹⁾Values are expressed as the mean±standard error (n=3)..

²⁾Different letters mean that values are significantly different in column (P<0.05, ANOVA’s Duncan test)..

³⁾ND means the not detected..

Fig 1. The change of polyphenol and antioxidant activities of apple peel treated with different HCl concentration (0, 0.1, 0.5, and 1.0 M). A, polyphenol; B, DPPH radical scavenging activity; C, reducing power. Each value is expressed as the mean±standard error (n=3). Different letters above bars indicate a significant difference (by ANOVA’s Duncan test, P<0.05).

사과박의 산처리에 의한 항산화 활성 변화

플라보노이드는 식물에서 만들어지는 대표적인 2차 대사산물로 다양한 생리활성을 보유하고 있는 것으로 보고되고 있다(Middleton, 1996; Yao 등, 2004). 특히, 플라보노이드는 높은 항산화 활성을 지닌 것으로 알려져 있으며 그 활성은 구조에 따라 결정된다고 보고되고 있다(Heim 등, 2002). 따라서 사과박에 산처리 후 구조가 변환된 플라보노이드가 항산화 활성에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 제조된 추출물을 이용하여 라디칼 소거능과 금속이온에 대한 환원력을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능을 평가했을 때 비처리군의 라디칼 소거능은 0.21 TEAC mg/mL로 나타났으며, 산처리 농도에 따라서 활성이 변화하였다. 0.5 M HCl 농도까지는 그 활성이 증가하였고 1.0 M 처리군에서는 비처리군보다 높은 활성을 나타내었지만, 0.5 M보다는 낮은 라디칼 소거능을 나타내었다. 금속이온에 대한 환원력을 측정했을 때 산처리하지 않은 사과박 추출물도 높은 항산화력을 보유하고 있었으나 산처리의 농도가 증가할수록 환원력이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 라디칼 소거능과 유사하게 0.5 M HCl 처리한 시료가 가장 뛰어난 환원력을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. 고농도인 1.0 M HCl은 오히려 환원력이 감소하는 경향을 보였는데 이는 감소한 플라보노이드로 인한 것으로 예상된다. 이러한 결과를 통해 플라보노이드의 전환에 있어서 적절한 산처리의 농도를 결정하는 것이 중요한 요소로 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

사과박의 산처리에 의한 간세포 보호 효과 및 항산화 효소 활성 변화

산처리에 의한 사과박의 플라보노이드 구조변화가 세포 시스템에서도 영향을 미치는지 알아보고자 산화적 스트레스와 밀접한 관련이 있는 간세포를 이용하여 보호 효과를 측정하였다. 사과박 추출물에 대한 독성을 측정했을 때, 모든 추출물을 50 μg/mL의 농도로 처리하면 독성을 나타내지 않았다(Fig. 2A). 이후 동일 농도의 추출물을 사용하여 실험을 진행하였다. 간세포에 각 추출물을 처리한 후 산화적 스트레스를 유발하는 TBHP 500 μM을 3시간 동안 자극을 유도한 후 생존율을 측정하였다. 그 결과 산화적 스트레스로 인해 세포 생존율은 50%였으나 사과박 추출물을 처리한 대조군에서는 유의적으로 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 산처리한 사과박 추출물은 기존의 사과박 추출물보다 뛰어난 보호 효과를 지니고 있었으며, 0.5 M 처리한 추출물이 가장 뛰어난 보호 효과를 지니고 있었다. 반응산소종(ROS)은 hydroxyl radical(･OH), super oxide radical(O^2-), hydroperoxyl radical(HO^2-), singlet oxygen(¹O₂), hydrogen peroxide(H₂O₂)와 같은 다양한 활성 산소와 자유라디칼을 의미하는 것으로 ROS의 증가는 세포막 지질층의 산화, 세포 단백질 변성, DNA 손상 등을 유도하여 체내에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Burton과 Jauniaux, 2011; Finkel, 2003). 따라서 사과박 추출물 및 산처리한 사과박 추출물이 간세포에서 ROS의 생성에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다(Fig. 3A). 그 결과 산화적 스트레스를 유도했을 때 ROS의 생성량이 152 RFU로 나타났다. 이후 추출물을 처리한 뒤 산화적 스트레스를 유도했을 때 ROS의 생성량을 비교한 결과, 산을 처리하지 않은 추출물을 처리했을 때는 대조군과 통계적인 차이를 나타내지 않았다. 0.1 M의 산을 처리한 추출물의 경우 대조군과 비교했을 때 87.5%로 감소했으며, 0.5 M의 경우에는 가장 낮은 78.9%의 억제율을 나타내었다. 하지만 1.0 M은 ROS 억제 효과(95.4%)가 감소하였다. 이러한 결과는 세포 내 지질과산화물 생성에서도 유사한 결과를 나타내었다. 지질과산화물은 다양한 경로를 통해 생성되는 것으로 알려져 있으며, 생체 내에서 불포화지방산의 methylene(-CH₂-)기로부터 수소가 탈취되고 다시 산소와 결합한 peroxy radical이 다시 수소를 탈취하는 일련의 연쇄 반응의 부산물이 지질과산화를 촉진함으로써 최종산물인 MDA 함량이 증가한다고 보고되고 있다(Habashy 등, 2019). 따라서 MDA는 지질과산화물의 지표로써 활용될 뿐만 아니라 산화적 스트레스에 대한 지표로써도 활용된다. 정상세포의 MDA를 측정한 결과 0.75 nmol/mg protein이었으나, TBHP를 통해 산화적 스트레스를 유도했을 때 3.59 nmol/mg protein으로 증가하였다. 농도별 산처리한 사과 껍질 추출물을 처리했을 때 모든 실험군에서 유의적인 억제 효과를 나타내었으며, 특히 0.5 M HCl 처리군에서 1.53 nmol/mg protein으로 가장 높은 억제율을 보였다. 반면, 1.0 M로 처리했을 때는 오히려 1.79 nmol/mg protein으로 증가하는 결과를 나타내었다(Fig. 3B). 이러한 결과를 통해 사과박에 대한 적절한 산처리 방법은 세포 내 산화적 스트레스를 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 산처리한 사과박과 세포 내 항산화 효소의 활성에 미치는 영향을 알아보고자 SOD, CAT, GR, GPx와 같은 항산화 효소들의 활성 변화를 평가하였다. SOD는 산화적 스트레스로 유발되는 세포 내 과잉으로 생성되는 O2-를 H2O2와 산소로 변환시키고 CAT는 H2O2를 산소와 물로 변환시키는 역할을 하며, GPx는 지질과산화물을 분해하는 작용을 한다. GR은 GPx의 반응 중 oxidized glutathione(GSSH)을 환원시켜 reduced glutathione(GSH)으로 전환하는 효소로, GSH의 산화･환원 사이클(redox cycle)은 세포질 내 과산화물의 환원반응에 핵심 기작으로 알려져 있다. 따라서 항산화 효소의 활성 변화는 산화적 스트레스에 대한 지표로 활용되고 있다(Habashy 등, 2019; Sies, 1993; Vives‐Bauza 등, 2007). HepG2 세포에 산화적 스트레스를 유도한 후, 농도별 산처리 사과 껍질 추출물을 처리했을 때 항산화 효소 활성 변화를 측정한 결과는 Table 2에 나타내었다. GR, GPx, CAT, SOD와 같은 항산화 효소는 외부에 영향이 없을 경우 산화-환원의 균형을 유지하고 있으나, THBP와 같은 산화적 스트레스를 유도할 경우 그 효소의 활성이 증가한다. 산화적 스트레스를 유발한 세포에 산처리한 사과박 추출물(0~1.0 M HCl)을 처리했을 때 모든 항산화 효소의 활성이 감소했으며, 0.5 M HCl 처리군에서 항산화 효소의 활성이 가장 낮았다. 이러한 결과는 추출물의 전처리 과정에서 산화적 스트레스를 유발하는 물질의 생성을 억제함으로써 관련 효소의 활성이 감소하는 것으로 예상된다. 따라서 본 실험 결과를 통해 quercetin 함량이 가장 높게 나타난 0.5 M HCl 처리 사과박 추출물이 가장 뛰어난 생리활성을 보이는 것을 규명함으로써 사과박에 함유된 배당체 플라보노이드를 비배당체 플라보노이드로의 전환을 통해 생리활성이 증대된 추출물 제조에 활용할 수 있으며, 또한 배당체 플라보노이드를 다량 함유한 식품소재에 대한 고기능성 신소재 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Table 2 . Effect of apple peel treated different HCl concentration on antioxidant enzyme activities in HepG2 cells.

Samples	Glutathione reductase	Glutathione peroxidase	Catalase	Superoxide dismutase
	(μmol min−1 mg−1 protein)
Control	29.43±4.40c1)2)	4.26±0.81d	7.02±4.48d	1.05±0.38c
TBHP	82.45±12.38a	15.75±4.30a	61.77±10.20a	1.88±0.09a
TBHP＋80% EtOH	76.69±4.95a	14.92±1.67ab	54.45±8.56a	1.82±0.07ab
TBHP＋0.1 M HCl	57.84±13.01b	11.72±2.80bc	32.65±11.06b	1.84±0.08ab
TBHP＋0.5 M HCl	52.37±10.34b	9.60±1.55c	8.73±3.45c	1.56±0.11b
TBHP＋1.0 M HCl	52.63±2.16b	10.40±0.23c	16.77±3.46c	1.66±0.10ab

¹⁾Values are expressed as the mean±standard error (n≥3)..

²⁾Different letters mean that values are significantly different in column (P<0.05, ANOVA’s Duncan test)..

Fig 2. The cell viability and protective effect on oxidative stress induced by tert-butyl hydroxyperoxide acid in HepG2 cell of apple peel treated with different HCl concentration (0, 0.1, 0.5, and 1.0 M). A, cell viability; B, protective effect on oxidative stress. Each value is expressed as the mean±standard error (n≥3). Different letters above bars indicate a significant difference (by ANOVA’s Duncan test, P<0.05).

Fig 3. The inhibitory effect of lipid peroxidation and formulation of ROS induced by oxidative stress in HepG2 cell of apple peel treated with different HCl concentration (0, 0.1, 0.5, and 1.0 M). A, malondialdehyde content; B, intracellular ROS formation. Each value is expressed as the mean±standard error (n≥3). Different letters above bars indicate a significant difference (by ANOVA’s Duncan test, P<0.05).

본 연구는 배당체 플라보노이드가 풍부한 사과박을 산처리 방법을 이용하여 플라보노이드의 구조변환을 통한 고기능성 소재를 개발하고자 하였다. 이에 사과박에 다양한 농도별 산처리 후 추출물을 제조하여 phytochemical 함량 변화 및 항산화 활성을 측정하였다. 또한, HepG2 세포를 이용하여 추출물의 산화적 스트레스에 대한 간세포 보호 효과를 측정하였다. 그 결과 농도별 산처리에 따른 사과박 추출물의 총 폴리페놀 함량은 0.5 M HCl 처리군에서 가장 높은 95.94±5.05 mg GAE/g residue의 함량을 나타내었으며, 1.0 M HCl 처리군에서는 오히려 감소하는 경향을 보였다. 또한, 농도별 산처리에 따른 DPPH 라디칼 소거능과 금속이온에 대한 환원력에서도 유사한 경향을 나타내었다. 세포 시스템을 이용한 평가 시스템에서도 0.5 M HCl을 처리하여 얻은 사과박 추출물이 가장 뛰어난 보호 효과를 나타내었으며, ROS의 형성 억제에서도 유사한 결과를 확인하였다. 이러한 추출물의 항산화 활성은 세포 내 항산화 효소의 활성 조절에 관여함으로써 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 나타낸 것으로 판단된다. 또한, 산처리한 사과박의 증가한 생리활성은 산처리를 통해 증가한 rutin의 어글리콘 물질인 quercetin 함량과 매우 밀접한 관련이 있음을 확인하였다. 본 연구 결과를 바탕으로 배당체 플라보노이드를 다량 함유한 식품소재를 대상으로 적절한 산처리 방법의 적용은 어글리콘으로의 변환을 유도하여 기능성이 향상된 소재 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.