최근 코로나19 팬데믹의 지속으로 인해 사람들의 오랜 마스크 생활으로 화장품 소비의 감소 등 생활 방식이나 소비 방식에 변화가 발생하였다. 하지만 스킨케어 제품이나 미용식품의 경우 큰 타격 없이 꾸준히 소비되고 있다. 또한 다양한 스킨케어 제품이 등장하고 있지만 화장품 안전성과 함유 성분에 관한 소비자의 관심이 증가하고 있다(Han, 2013). 인위적인 화학물질에 비해 안전한 천연물질을 이용해 화장품 소재 및 제품개발 연구가 진행되고 있으며(Son, 2003), 이러한 트렌드에 힘입어 화장품 산업에서 생약을 포함한 식물 원료, 해양 원료 등의 다양한 자연유래 소재들을 원료로 사용하는 천연화장품 및 미용식품이 인기를 끌고 있다(Bok, 2022).

왓소니아(Selaginella martensii)는 석송식물문의 Sellaginella 속에 속하며 온대, 열대, 사막 등의 다양한 지역에서 700종 이상 서식하고 있다(Jermy, 1986). 부처손속의 S. martensii는 상록 다년생 양치식물이며, 남아메리카 대륙 및 뉴질랜드에서 서식한다. S. martensii는 분지마다 rhizophore의 모습을 가지며 잎이 하얗게 변하는 특성으로 ‘frosty fern’이라 불린다. 두 개의 복엽과 배엽이 한 쌍을 이루며 줄기는 반복적으로 분지되는데, 분지마다 분열조직에서 잎이 없는 원통형의 rhizophore가 나타나고, 그 끝에 뿌리가 형성되어 하얗게 보이는 것이다(Webster와 Steeves, 1967). Selaginella 속은 의학적 가치가 높은 양치식물로 많은 종에서 유용한 기능성 물질이 있으며, 알칼로이드(alkaloid), 페놀(phenolic), 테르페노이드(terpenoid) 등과 같은 다양한 천연물질을 포함하고 있다(Ma 등, 2001).

Selaginella 속 식물을 활용한 연구에서 추출물 중에 함유된 biflavone인 ginkgetin과 biflavonoids류에서 항암효과 등의 기능성을 밝혀낸 바 있으며, 이외의 Selaginella 속의 식물에서 항암 약리성분과 기능성이 보고되었으나(Park, 2020) 많은 연구가 진행되어 있지는 않다. 알칼로이드, 페놀, 테르페노이드 등 다양한 종류의 2차 대사산물을 함유하고 있어 식물유래 천연물 소재로써 개발 가치가 높은 Selaginella 종류의 하나인 왓소니아(S. martensii)를 대상으로 기능성을 탐색하고 기능성 화장품이나 미용식품 등의 제품에 적용하는 것도 매우 큰 의미가 있을 것으로 판단된다.

따라서 본 연구에서는 왓소니아 추출물을 이용하여 기능성 화장품 소재로의 활용이 적합한지 확인하기 위하여 antioxidant activity, elastase, collagenase 및 hyaluronidase 등의 피부미용 관련 효소의 억제 활성과 astringent 효과 등을 측정하여 왓소니아를 기능성 화장품 및 미용식품 소재로 활용하기 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.

실험 재료

본 연구에서 사용된 왓소니아는 경기도 고양시에 소재한 무호화훼에서 2022년 6월에 구매하여 줄기, 잎, 뿌리 부분을 수확하고 45°C dry oven(FO600M, Jeiotech)에서 건조한 후 40 mesh로 분쇄하여 분말로 제조한 후 4°C에 보관하면서 시료로 사용하였다.

왓소니아 추출물 제조

시료의 최적 추출조건을 설정하기 위해 추출용매로 distilled water(DW)와 에탄올 등 두 개의 용매를 사용해 추출을 진행하였으며, 열수 추출의 경우 DW 200 mL에 S. martensii 건조 분말 1 g을 넣고 100 mL가 될 때까지 가열해서 끓인 후 24시간 동안 상온의 진탕 배양기(WIS-20, Daihan Scientific)에서 200 rpm으로 교반 추출하였으며, 에탄올 추출은 에탄올 용액 10~100% 농도별로 100 mL에 S. martensii 건조 분말 1 g을 넣고 24시간 동안 상온에서 200 rpm으로 교반 추출했다. 이후 3,243×g에서 30분간 원심분리기(FLETA 40, Hanil Science)를 이용해 원심분리한 후 Whatman No. 41 필터(Whatman Inc.)를 포함한 감압여과기(EYELA A-3S, Tokyo Rikakikai)를 이용해 여과한 후 필요에 따라 감압농축기(Buchi Rotavapor R-200, Buchi Labotechnik AG)로 농축하여 액상상태의 시료(phenolics)로 사용하였다. 동결건조물(solid)의 경우 여과한 시료를 동결건조하여 분말상태의 시료로 사용하였다(Jo 등, 2016).

Total phenolic compounds(TPC) 측정

TPC는 Folin과 Denis(1912)의 방법에 준하여 측정하였다. 시료 1 mL에 100% 에탄올 1 mL와 DW 5 mL를 첨가하고 1 N Folin reagent 0.5 mL를 넣어 vortex mixer(VM- 10, Daihan Scientific)로 잘 섞어주고 5분간 방치한 뒤 5% Na₂CO₃ 1 mL를 첨가해 섞고 1시간 동안 암실에 방치한 뒤 spectrophotometer(Optizen 3220UV, Mecasys)를 이용해 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. TPC 함량은 gallic acid를 이용한 표준곡선(y＝0.0119x-0.0483, R²=0.9937)으로부터 양을 산출하였다.

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 라디칼의 소거 활성은 Blois(1958)의 방법에 준하여 측정하였다. 시료 추출액 1 mL에 60 µg/mL DPPH 용액 3 mL를 첨가하여 vortex 한 후 실온에서 15분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 positive control로 butylated hydroxyanisole(BHA)을 사용하였으며, DPPH 라디칼 소거 효과는 [(대조구의 흡광도－반응구의 흡광도)/대조구의 흡광도]×100으로 값을 산출하였다.

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline 6-sulphonic acid)(ABTS) 라디칼 decolorization activity 측정

ABTS 라디칼 소거 효과는 Fellegrini 등(1999)의 방법에 준하여 측정하였다. 7 mM ABTS와 140 mM K₂S₂O₈를 섞은 후 방치하여 라디칼이 생성된 ABTS solution을 만들고 흡광도가 734 nm에서 0.68~0.72가 되도록 조정하였다. ABTS solution 4 mL와 시료 200 μL를 흔들어 섞어 1분 30초 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 BHA를 사용하였으며, ABTS 라디칼 소거 효과는 [1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)]×100으로 값을 산출하였다.

Antioxidant protection factor(PF) activity 측정

PF 효과는 Andarwulan과 Shetty(1999)의 방법에 준하여 측정하였다. β-Carotene 50 mg과 chloroform 50 mL의 혼합액을 증류시킨 후 linoleic acid 100 μL, Tween 40 920 μL, H₂O₂ 880 μL와 DW 250 mL를 첨가하여 emulsion을 제조하였다. 시료 추출액 0.1 mL와 emulsion 5 mL를 혼합하여 50°C에서 30분간 반응시킨 후 냉각한 다음 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 butylated hydroxytoluene(BHT)을 사용하였으며, PF 값은 반응구의 흡광도/대조구의 흡광도를 사용하여 값을 산출하였다.

Thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 저해 효과 측정

TBARS 저해 효과는 Buege와 Aust(1978)의 방법에 준하여 측정하였다. 5% linolic acid와 1% Tween 40을 넣어 hand mixer로 섞은 emulsion 용액을 50°C water bath에서 12시간 반응시켰다. 100 mL stock solution에 thiobarbituric acid reagent 4 mL를 첨가해 혼합하여 끓는 물에 15분간 중탕한 뒤 10분 동안 냉각하였다. 그 후 20분간 원심분리하여 10분간 방치한 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 positive control로 BHT를 사용하였으며, TBARS 저해 효과는 [1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)]×100을 사용하여 값을 산출하였다.

Elastase 저해 효과 측정

Elastase 저해 효과는 Kraunsoe 등(1996)의 방법에 준하여 측정하였다. 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 1 mL에 0.8 mM N-suc-(Ala)₃-p-nitroanilide 0.1 mL를 첨가한 혼합액에 시료 추출물 0.1 mL와 porcine pancreatic elastase 0.1 mL를 넣고 섞어 37°C에서 20분간 반응시킨 후 5분간 실온에서 냉각하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 epigallocatechin-3-gallate(EGCG)를 사용하였으며, elastase 저해 효과는 [1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)]×100을 사용하여 값을 산출하였다.

Collagenase 저해 효과 측정

Collagenase 저해 효과는 Wunsch와 Heidrich(1963)의 방법에 준하여 측정하였다. 4 mM CaCl₂에 0.1 M Tris-HCl buffer(pH 7.5)를 첨가한 용액에 0.4 mM 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg 0.25 mL와 일정 농도로 희석한 시료 추출액 0.1 mL를 혼합한 용액에 collagenase 0.15 mL를 넣어 25°C에서 20분간 반응시켰다. 이 혼합액에 6%의 citric acid 0.5 mL를 첨가하여 반응을 정지시키고 ethyl acetate 1.5 mL를 첨가한 후 용액의 상등액만을 취해 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 EGCG를 사용하였고, collagenase 저해 효과는 [(대조구의 흡광도－반응구의 흡광도)/대조구의 흡광도]×100을 사용하여 값을 산출하였다.

Hyaluronidase(HAase) 저해 효과 측정

HAase 저해 효과는 Dorfman과 Ott(1948)의 방법에 준하여 측정하였다. 시료액 0.5 mL와 enzyme buffer(pH 6.9) 5 mL로 녹인 enzyme(hyaluronidase from ovine tests 1,000 U)과 0.3 M sodium phosphate buffer(pH 5.3)를 38°C water bath에서 5분간 방치한 후 0.3 M sodium phosphate buffer로 녹인 substrate(0.4% hyaluronic acid)를 38°C water bath에서 45분 동안 반응시켰다. 종료시약인 albumin 용액을 5 mL 넣어 5분 반응시킨 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 tannic acid를 사용하였고 HAase 저해 효과는 [1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)]×100을 사용하여 값을 산출하였다.

Astringent activity 측정

Astringent 효과는 Lee 등(2002)의 방법에 준하여 측정하였다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질 hemoglobin을 사용하여 원심분리 용기에 시료와 헤모글로빈 용액을 2:1의 비율로 넣어서 혼합한 후, 35,000×g에서 원심분리기(FO 600M, Jeiotech)로 분리하여 혈액 단백질을 가라앉히고, 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 tannic acid를 사용하였고, astringent 효과는 [(대조구의 흡광도－반응구의 흡광도)/대조구의 흡광도]×100을 사용하여 값을 산출하였다.

통계처리

본 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 모든 실험 결과는 평균±표준편차(mean±standard deviation)로 표현하였다. 자료의 통계처리는 SPSS 22 for windows(Statistical Package for Social Science) 프로그램을 이용하였고, 시료 간의 유의차는 t-test를 실시하여 P<0.01 수준에서 비교 분석하였으며 분산분석(ANOVA)과 Duncan의 다중범위검정(Duncan’s multiple range test)을 실시하여 P<0.05 수준에서 비교 분석하였다.

왓소니아 추출물의 TPC 함량 비교

식물에 분포된 phenolic compounds는 다양한 식품영양학적 특성을 가지며 관능적 특성뿐만 아니라 항산화 활성 등 다양한 생물학적 활성을 가진다(Choi와 Lee, 1993). 본 연구에서는 왓소니아 추출물에서 생리활성을 가지는 TPC 함량을 정량하였으며, 용매로 열수(DW)와 에탄올로 추출한 추출물의 TPC 함량을 비교하였다. 그 결과, Fig. 1과 같이 80% 에탄올 추출물에서 TPC 함량이 3.65 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, 열수 추출물은 2.92 mg/g으로 나타났다. 이는 추출에 사용된 에탄올의 농도에 따라 총 페놀성 물질의 함량이 다르게 용출되기 때문으로 판단되며, 이러한 결과를 바탕으로 가장 높은 TPC 함량을 나타낸 물과 80% 에탄올을 용매로 사용하여 추출물을 제조한 후 실험을 진행하였다.

Fig 1. Total phenolics content of Selaginella martensii. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a-g) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

왓소니아로부터 추출한 고형분과 추출물의 생리활성 비교

왓소니아로부터 제조한 추출분말을 기준으로 한 동결건조 고형물과 TPC 함량을 기준으로 하는 추출 TPC가 생리활성에 미치는 영향을 비교하였다. Phenolics의 수율은 80.02%로 측정되었으며, 왓소니아 추출물의 고형분과 phenolics을 100 μg/mL의 동일 함량으로 처리한 후 DPPH 및 ABTS 라디칼 저해 활성을 측정한 결과, phenolics의 경우 Fig. 2A와 같이 열수 추출물과 80% 에탄올 추출물에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 각각 88.74%와 100%로 나타났으며, 열수 추출 고형분과 80% 에탄올 추출 고형분에서는 각각 13.30%와 14.55%의 낮은 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타나 phenolics에 비해 약 7배 정도의 낮은 활성을 나타내었다. ABTS 라디칼 저해 활성 또한 Fig. 2B에서와 같이 100 μg/mL 농도에서 열수 추출물과 에탄올 추출물에서 각각 100%와 82.73%의 저해 효과를 나타내었다. 반면 열수 추출 고형분과 80% 에탄올 추출 고형분에서는 매우 낮은 ABTS 라디칼 소거능을 나타내어, 왓소니아의 생리활성은 용출된 TPC에 의해 효능이 좌우되는 것으로 판단되었다. 이러한 결과를 바탕으로 열수 추출물과 80% 에탄올 추출물 모두 phenolics를 사용하여 실험을 진행하였다.

Fig 2. Comparison of radical scavenging activity by concentration of phenolics and solid from Selaginella martensii. (A) DPPH radical scavenging activity (100 μg/mL), (B) ABTS radical scavenging activity (100 μg/mL). Values are presented as mean±standard deviation (n=3). The significant difference from the control group was verified at P<0.05 by Student’s t-test.

왓소니아 추출물의 항산화 효과

안정한 상태의 라디칼인 DPPH는 산화방지물질로부터 전자나 수소와 반응했을 때, nonradical로 전환되면서 흡광도가 변화하는 성질이 있어, DPPH 라디칼 소거 활성은 천연물의 항산화 활성을 측정하는 데 사용된다(Lee 등, 2007). DPPH 라디칼 소거 활성 측정을 통한 왓소니아 추출물의 항산화 활성을 확인해 본 결과, Fig. 3A와 같이 열수 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL의 농도에서 70.38%, 79.76%, 81.17%, 79.47%의 효과를 나타내었고, 80% 에탄올 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL의 농도에서는 78.21%, 94.53%, 100%, 100%의 효과를 나타내었다. Positive control로 사용된 BHA는 동일한 농도에서 67.42%, 67.66%, 71.03%, 67.98%로 측정되었으며, 이는 BHA에 비해 왓소니아 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 높다는 것을 알 수 있다. Lee 등(2021)의 연구에서는 항산화 활성이 우수하다고 널리 알려진 생강(Zingiber officinale Roscoe)의 70% 에탄올 추출물의 DPPH 소거 활성을 측정한 결과, 400 μg/mL의 농도에서 생강잎 추출물은 88.78%, 줄기 추출물은 70.12%, 뿌리 추출물은 65.52%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 보고하였다. 이상의 결과로 본 실험에 사용된 왓소니아 전초의 에탄올 추출물이 100 μg/mL 농도에서 100%의 소거능을 나타내어 DPPH 라디칼에 대한 우수한 산화 억제력을 가지고 있음이 확인되었다.

Fig 3. Antioxidant activities of DPPH radical scavenging activity (A), ABTS radical scavenging activity (B), antioxidant protection factor (C), and TBARS inhibition activity (D) of Selaginella martensii. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a’-c’, A-C, α-γ) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

ABTS 라디칼 소거 활성은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 자유라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 청록색이 탈색되는 원리를 이용한 항산화 활성 측정 방법이다(Kim 등, 2009). 왓소니아 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 통한 항산화 효능을 확인해 본 결과, Fig. 3B와 같이 열수 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL 농도에서 72.10%, 93.68%, 99.13%, 98.26%의 효과를 나타내었고, 80% 에탄올 추출물 25, 50, 75, 100 μL/mL 농도에서는 42.57%, 55.79%, 65.11%, 80.21%의 효과를 나타냈다. 전체적으로 에탄올 추출물보다는 열수 추출물의 효과가 매우 높았으며, positive control인 BHA는 동일 농도에서 17.47%, 70.27%, 98.99%, 98.99 %로 이와 비교했을 때 특히 저농도에서 왓소니아 추출물이 높은 수치를 보여주었다. 이에, 저농도에서 BHA에 비해 왓소니아 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성이 높다는 것을 알 수 있다. Um과 Ryu(2022)의 연구에 따르면 허브 식물인 애플민트의 에탄올 추출물의 경우 위와 동일한 농도에서 10~50%의 효과를 보고한 것과 비교하였을 때 왓소니아가 우수한 ABTS 라디칼 저해 효과를 가졌음을 확인하였다. DPPH와 ABTS 라디칼의 실험에서 추출물의 저해 양상이 다르게 나타나는데, 이는 phenolic compounds가 선택적으로 라디칼의 기질에 작용하며, 시료의 종류마다 라디칼 소거능이 차이 난다고 판단된다(Choi 등, 2015).

지용성 물질에 대한 항산화 효과를 나타내는 PF 효과를 측정한 결과, Fig. 3C와 같이 열수 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL의 농도에서 1.08, 1.11, 1.24, 1.27 PF 값을 나타내었고, 80% 에탄올 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL의 농도에서는 1.01, 1.08, 1.09, 1.13 PF 값을 나타내었다. Positive control인 BHT는 같은 농도에서 1.14, 1.11, 1.14, 1.34 PF 값을 나타내었다. 이는 왓소니아 추출물의 PF 값이 농도 의존적으로 유의하게 증가했음을 나타냈다. Kim 등(2023)에 따르면 소인제(Aeonium sedifolium) 잎의 열수 추출물에서의 PF 값이 0.95~1.08로 보고되었다. 이와 비교하였을 때 왓소니아의 지용성물질에 대한 항산화력이 우수하다고 판단된다.

활성산소는 지질 및 단백질을 손상시켜 세포 손상을 초래해 노화 및 뇌혈관계 등과 같은 만성질환의 원인이 되며, 여러 활성산소 중 TBARS는 활성산소에 의한 지질손상의 지표로 많이 사용되고 있다(Cho 등, 2005). 왓소니아 추출물의 TBARS 저해 효과는 Fig. 3D와 같이 열수 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL 농도에서 34.28%, 84.51%, 93.13%, 96.09%의 효과를 나타내었고, 80% 에탄올 추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL 농도에서는 67.00%, 84.44%, 91.72%, 91.31%의 효과를 나타냈다. Positive control인 BHT는 68.28%, 81.28%, 82.02%, 91.78%로 특히 열수 추출물의 25 μg/mL를 제외한 모든 농도에서 BHT보다 항산화 효과가 우수한 결과를 나타내었다. Kim 등(2010)의 연구에 의하면 산삼배양근의 1~20 mg/mL 농도에서 열수 추출물은 4.7~ 24.9%의 효능을 나타내었고, 70% 에탄올 추출물은 9.2~ 66.6%의 효능을 보였다. 이와 비교하여 왓소니아는 기보고된 산삼배양근보다 낮은 농도에서 더 높은 지용성 물질에 대한 항산화 활성을 보이는 것을 확인하였다. 종합적으로 왓소니아는 수용성, 지용성 물질에 대한 항산화 활성이 뛰어나 기능성 화장품 원료 및 미용 소재로의 활용이 가능할 것으로 판단된다.

왓소니아 추출물의 elastase 저해 효과

백혈구의 과립 효소 중 하나인 elastase는 elastin을 분해하는 역할을 한다. Elastase가 이상 조직에서 활성이 증가하면 조직파괴의 직접적인 원인이 되고 이로 인해 피부의 주름 및 탄력성 소실을 유발한다. 또한 진피 내 피부 탄력을 유지하는 기질 단백질인 elastin의 분해에 영향을 주며, 따라서 elastase 저해는 피부의 주름을 개선하는 효과를 기대할 수 있다(Kang 등, 2021). 왓소니아 추출물의 elastase 저해 효과는 Fig. 4와 같이 열수 추출물 200, 400 μg/mL 농도에서 22.8%, 31.9%의 효과를 나타내었으나 에탄올 추출물에서는 효과가 없었다. Positive control인 EGCG는 200, 400 μg/mL 농도에서 70.87%, 99.09%의 효과를 나타내어 결과적으로 positive control보다는 효과가 낮으나 열수 추출물에서 주름 개선 효과를 보이고 있음을 확인할 수 있다. Cho 등(2010)은 5 mg/mL 농도의 솔순[pine bud(Pinus densiflora)] 열수 추출물은 15%의 저해 효과를 나타내었음을 보고하였다. 이상의 결과와 비교하였을 때 왓소니아의 elastase 저해 활성이 우수하다고 판단된다. 따라서 주름 개선 화장품 원료로의 활용 가능성을 확인할 수 있었다.

Fig 4. Elastase inhibition rate of Selaginella martensii. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a’-d’, A,B) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. ND: not detected.

왓소니아 추출물의 collagenase 저해 효과

Collagen은 피부의 진피층에 존재하며 피부를 지지한다. 유해환경에 의한 스트레스, 자외선으로 인한 광노화와 같은 외적 요인과 노화에 따른 세포 활성 감소 같은 내적 요인들로 인해 collagenase의 활성이 증가하면 collagen이 분해되어 피부 기질이 파괴되면서 주름을 생성할 수 있다(Lee 등, 2018). 왓소니아 추출물의 collagenase 저해 활성을 알아본 결과 collagenase 저해 효과는 Fig. 5에서와 같이 열수 추출물 200, 400 μg/mL의 농도에서 18.39%, 41.60%의 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 효과가 없었다. Positive control인 EGCG의 collagenase 저해 활성이 28.37%, 35.11%, 55.07%, 83.53%로 농도 의존적으로 나타남에 비해 열수 추출물은 200 μg/mL 이상의 농도에서 collagenase 억제 효과를 나타내었으며, 에탄올 추출물에서는 collagenase 저해 효과가 관찰되지 않았다. Vu 등(2020)의 연구에 의하면 참도박(Grateloupia elliptica) 열수 추출물은 1,000 μg/mL 농도에서 9.0%를 나타냈다고 보고하였다. 이와 비교하였을 때 왓소니아의 collagenase 저해 효과가 저농도에서 더욱 뛰어났다. 이상의 결과로 200 μg/mL 이상의 왓소니아의 열수 추출물에서 주름 생성 억제 효과를 확인하여 향후 주름 개선을 위한 기능성 화장품에 적용이 가능할 것으로 사료된다.

Fig 5. Collagenase inhibition rate of Selaginella martensii. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a’-d’, A,B) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. ND: not detected.

왓소니아 추출물의 HAase 저해 효과

Hyaluronic acid는 세포 외 기질의 중요 구성분 중 하나로 50% 이상은 피부에서 발견된다. HAase는 disodiumcromoglycate를 비롯한 여러 항알레르기, 항염증 약물에 의해 활성이 억제된다. 따라서 HAase의 활성 저해는 hyaluronic acid의 분해를 억제해 항염증 및 항알레르기 효과를 기대할 수 있다(Ahn과 Hong, 2005). 왓소니아 추출물의 HAase 저해 효과는 Fig. 6과 같이 열수 추출물 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도에서 11.04%, 21.64%, 55.46%, 75.17 %의 효과를 나타내었으며, 동일한 농도의 80% 에탄올 추출물에서 17.23%, 32.38%, 54.42%, 75.91%의 높은 저해 효과를 나타내어 HAase 저해 효과가 농도 의존적으로 나타나는 것으로 확인되었다. Positive control로 사용된 tannic acid는 동일 농도에서 5.77%, 91.47%, 94.78%, 88.41%로 항염증 효과를 나타내었다. Lee 등(2018)의 연구에 따르면 딸기 잎을 80% 에탄올 추출물로 제조하여 활성을 측정한 결과 1.25 mg/mL의 농도에서 44.12±3.92%의 활성을 나타내어 결과적으로 저농도에서의 추출물 효과가 특히 뛰어났음을 확인하였고, 열수 추출물과 80% 에탄올 추출물 모두 우수한 항염증 효과가 있어 염증 개선용 화장품 원료로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.

Fig 6. Hyaluronidase inhibition rate of Selaginella martensii. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a’-d’, A-D, α-γ) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

왓소니아 추출물의 모공축소(수렴작용) 측정

수렴작용의 원리는 고분자 플라보노이드와 가교 결합을 형성해 피부가 수축하는 현상이다. 수렴 작용은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키며, 수렴제는 수렴 작용을 통해 피부와 점막 혈관을 수축시키고 점액의 분비를 억제한다. 수렴제의 수렴 효과는 헤모글로빈 단백질과 수렴제의 결합 정도에 따라 수렴 효과의 정도를 확인할 수 있다(Lee와 An, 2010). 왓소니아 추출물의 astringent 효과는 Fig. 7과 같이 에탄올 추출물에서는 효과가 나타나지 않지만, 열수 추출물 400 μg/mL 농도에서 19.78%의 효과가 확인되었다. 따라서 모공축소 효과를 위한 기능성 화장품으로 활용하기 위해서는 열수 추출물이 효과적일 것으로 판단되었다.

Fig 7. Astringent activity rate of Selaginella martensii. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). ND: not detected.

본 연구에서는 왓소니아(Selaginella martensii)를 이용하여 항산화, 모공 수축, 피부 주름 및 항염증 효과에 관여하는 효소 생성 저해 효과를 측정하였다. 왓소니아의 열수 추출물은 2.92 mg/g, 80% 에탄올 추출물은 3.65 mg/g의 phenolic을 함유하는 것으로 측정되었다. 왓소니아 추출물의 항산화 효능 중 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성은 열수와 80% 에탄올 추출물 100 μg/mL 농도에서 각각 79.47%, 100.00% 및 98.26%, 80.21%로 높은 활성을 보였다. 또한 antioxidant protection factor와 TBARS 억제 효과는 100 μg/mL 농도의 열수 및 에탄올 추출물에서 각각 1.27, 1.13 PF와 96.09%, 91.31%의 매우 높은 항산화 활성을 나타내었다. 왓소니아 추출물이 피부 미용에 관여하는 생리활성 효소에 미치는 영향을 측정한 결과, 피부 주름 생성에 관여하는 elastase와 collagenase 저해 활성은 열수 추출물에서만 400 μg/mL에서 각각 31.94%와 41.60%의 저해 효과를 나타내어 주름 생성 억제 효과를 확인하였다. 항염증 효과를 나타내는 hyaluronidase 저해 활성은 400 μg/mL에서 열수 추출물과 80% 에탄올 추출물 모두 75.00% 이상의 효과를 내었다. 모공수축 효과를 나타내는 astringent 효과를 측정한 결과, 400 μg/mL 농도의 열수 추출물에서 19.78%의 효과를 보였다. 위의 결과를 종합해 보면 왓소니아 열수 추출물은 매우 우수한 항산화 효과와 주름개선 및 항염증 활성을 나타내어 기능성 화장품 원료의 활용이 가능하다고 판단되며, 추가로 세포 실험상에서의 기작연구가 필요할 것으로 보인다. 또한 식품 원료로써 왓소니아가 등재될 시 미용식품 소재로의 활용 또한 가능할 것으로 기대된다.