구아바(Psidium guajava L.)는 도금양목 도금양과(Myrtaceae)에 속하는 쌍떡잎식물로 열대 및 아열대 지방에 널리 분포하고 있으며, 국내에는 제주도에 자생하는 것으로 알려져 있다(Gutierrez 등, 2008). 구아바잎, 열매 및 뿌리는 오래전부터 이용되어 왔으며 주로 설사, 당뇨병 예방 및 치료에 사용되어 왔다(Arima와 Danno, 2002). 특히, 구아바잎에는 α-pinene, β-bisabolene, β-selinene, nerolidol 등의 정유 성분과 quercetin, guaijaverin, kaempferol, myricetin, ellagic acid, gallic acid 등과 같은 폴리페놀 화합물이 존재한다고 보고되고 있다(Kumar 등, 2021; Ogunwande 등, 2003). 다양한 생리활성 성분을 함유한 구아바잎은 항산화, 항염증, 항균(Shaheena 등, 2019), 항알레르기(Kim 등, 2007), 항당뇨(Luo 등, 2019), 설사 개선(Ojewole 등, 2008) 등에 효과가 있다고 보고된 바 있다. 특히, guaijaverin은 구아바잎에서 특징적으로 검출되는 생리활성물질로 항당뇨(Eidenberger 등, 2013), 항균(Prabu 등, 2006), 항말라리아(Houel 등, 2016) 등에 효능이 있다고 알려져 있다.

차나무(Camellia sinensis L.)는 차나무과(Theaceae) 동백나무속(Camellia)에 속하는 다년생 상록관목으로 우리나라를 비롯하여 일본, 중국, 인도 등에 널리 분포되어 있다. 녹차의 주요성분은 카페인과 차 카테킨으로 차 카테킨은 catechin(C), epicatechin(EC), gallocatechin(GC), epigallocatechin(EGC), catechin gallate(CG), epicatechin gallate(ECG), gallocatechin gallate (GCG) 및 epigallocatechin gallate(EGCG) 8종으로 구성되어 있으나 EC, ECG, EGC 및 EGCG 4종을 흔히 차 카테킨이라 부른다(Cheon 등, 2018; Ng 등, 2023). 녹차의 생리활성 및 약리효능은 대부분 차 카테킨 성분에서 기인한다고 알려져 있으며, EGCG가 전체 차 카테킨의 절반 이상을 차지한다고 보고되고 있다(Seo 등, 2019). EGCG는 항산화(Boulmokh 등, 2021), 항염증, 항암(Li 등, 2022), 항비만(Carrasco-Pozo 등, 2019), 항당뇨(Suliburska 등, 2012), 이상지질혈증 개선(Kang 등, 2010), 기억력 개선(Guo 등, 2017) 등의 다양한 생리활성이 알려져 있다.

위의 우수한 생리활성을 근거로 구아바잎과 녹차잎을 활용한 기능성 소재 개발 가능성이 제시되고 있으며, 그중 항알레르기 기능성 소재로 개발하려는 시도가 진행되고 있다(Kim 등, 2007). 기능성 소재 개발을 위해서 지표성분 설정과 원료 표준화 및 규격화에 대한 분석연구가 선행되어야 하며, 원료의 품질과 기능성을 판단할 수 있는 지표성분 함량의 기준 및 규격 설정을 위한 분석법 유효성 검증 자료가 요구된다(Xu 등, 2019). 구아바･녹차잎 추출복합물의 지표성분 분석연구가 일부 보고된 바 있으나 지표성분 설정 근거가 미비하여 자료로 활용하기에 제한적인 부분이 있다. Kim 등(2007)은 구아바잎의 gallic acid, 녹차잎의 EGCG를 지표성분으로 설정한 high performance liquid chromatography(HPLC) 개별분석법을 제시하였으나 분석법에 대한 유효성 검증이 이뤄지지 않았으며, Khan 등(2011)은 구아바잎의 ellagic acid, 녹차잎의 EGCG를 확인하는 thin layer chromatography 분석법을 개발하였으나 HPLC에 비해 낮은 정확도, 분리능 및 재현성의 한계를 가지고 있다. 위의 두 연구를 제외하고는 구아바･녹차잎 추출복합물로부터 지표성분을 분석할 수 있는 분석법을 보고한 연구는 현재까지 전무한 실정이며, Tr1 세포 활성화를 조절하는 유력 물질인 guaijaverin(Seo 등, 2008)과 항알레르기 활성 성분으로 알려진 EGCG(Fujimura 등, 2007)를 각 원료의 지표성분으로 선정하여 HPLC 동시분석법을 개발한 연구는 본 연구가 처음이다.

따라서 본 연구에서는 50% 발효주정을 용매로 하여 구아바잎과 녹차잎을 각각 추출한 후 각 추출물을 일정 비율로 혼합하여 제조한 구아바･녹차잎 추출복합물(ILS-F-2301)을 항알레르기 기능성 소재로 개발하기 위해 구아바잎과 녹차잎에서 유래된 guaijaverin과 EGCG를 지표성분으로 선정하였고, 하나의 분석법으로 지표성분을 동시에 검출할 수 있는 HPLC 동시분석법을 확립하였다. 또한, 유효성 검증을 통해 원료 표준화 및 품질관리의 기초 자료로 활용하고자 한다.

재료 및 시약

본 실험에 사용한 구아바잎과 녹차잎은 대연제약에서 수급받아 사용하였다. 구아바잎과 녹차잎을 각각 분쇄(SMX- M41KP, Shinil Electronics)한 후 50% 발효주정(Duksan Chemical Co.)을 이용하여 100±5°C에서 3시간 동안 환류추출(Man8036, SciLab Korea Co.)하였다. 추출물은 여과 및 감압 농축한 후 진공건조(V049, Memmert)하여 분말로 제조한 것을 사용하였다. 위의 방법으로 얻어진 각 추출물을 일정한 비율로 혼합한 것을 시료(ILS-F-2301)로 사용하였다. 분석에 사용한 표준품은 guaijaverin(Chemfaces Co.)과 EGCG(Sigma-Aldrich Co.)(Fig. 1)이며, 용매는 HPLC grade로 J.T. Baker에서 구입하여 사용하였다. Formic acid(Junsei Co.) 시약은 guaranteed grade(순도 98.0%)로 구입하여 사용하였다.

Fig 1. Chemical structures of (A) guaijaverin and (B) epigallocatechin gallate (EGCG).

시료 조제

표준용액 조제: 표준물질 guaijaverin과 EGCG를 각각 5 mg과 10 mg씩 취한 다음 guaijaverin은 메탄올 10 mL, EGCG는 50% 메탄올 2.5 mL에 용해하여 500 μg/mL와 4 mg/mL의 표준원액을 조제하였다. 각각의 희석용매로 희석하여 3.125~50 μg/mL와 0.25~4 mg/mL 범위의 표준용액을 조제하고 이를 HPLC로 분석하여 표준검량선을 작성하였다.

시험용액 조제: ILS-F-2301을 0.25, 0.5 및 1 g씩 취한 다음 50% 에탄올 50 mL를 가하여 20분 동안 초음파 추출하여 각각 5, 10 및 20 mg/mL 농도가 되도록 조제하였다. 각 용액을 0.45 μm PTFE membrane syringe filter(Advantec Co.)로 여과한 것을 시험용액으로 사용하였다.

HPLC 분석

Guaijaverin과 EGCG를 분리 분석하기 위해 vial sampler(1260 vial sampler), column oven(1260 multicolumn thermostat), 다중파장 검출기(photodiode array detector, PDA)와 quantanary pump가 장착된 Agilent 1260 Infinity Ⅱ HPLC(Agilent Technologies) 시스템을 사용하였다. 컬럼은 YMC-Triart C18(4.6×250 mm, 5 μm, YMC Inc.)을 사용하였고, 이동상은 0.1% formic acid가 포함된 증류수(A)와 메탄올(B)을 사용하였다. 유속은 0.8 mL/min, 컬럼온도는 30°C로 유지하였다. 검출파장은 254 nm(guaijaverin)와 280 nm(EGCG)로 설정하였으며 기울기 용리 방법(gradient elution mode)으로 시료 10 μL를 주입하여 Table 1과 같은 조건으로 분석하였다.

Table 1 . HPLC conditions for the quantitative analysis of guaijaverin and EGCG.

Item	Condition
HPLC system	Agilent 1260 Infinity Ⅱ system
Column	YMC-Triart C18 column (5 μm, 4.6×250 mm)
Column temp.	30°C
Flow rate	0.8 mL/min
Injection volume	10 μL
UV detection	254 nm (guaijaverin), 280 nm (EGCG)
Run time	70 min
Mobile phase (Gradient)	A: 0.1% formic acid in water
	B: Methanol
	Time (min)	% A	% B
	0	80	20
	5	80	20
	20	70	30
	25	65	35
	30	60	40
	40	60	40
	50	57	43
	55	57	43
	60	20	80
	65	80	20
	70	80	20

분석법 검증

분석법의 유효성 검증은 ‘건강기능식품 기능성 원료 인정 신청을 위한 제출자료 작성 가이드(MFDS, 2023)’를 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision)을 조사하고 직선성 검증으로 구한 기울기(slope)와 표준편차(standard deviation)를 통해 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 산출하였다. 이를 바탕으로 ILS-F- 2301의 지표성분인 guaijaverin과 EGCG의 분석법 검증을 시행하였다.

특이성: 특이성은 불순물, 분해물, 배합성분 등의 혼재 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력을 의미한다. HPLC로 표준용액과 시험용액에 함유된 guaijaverin과 EGCG가 다른 물질과 간섭없이 분리되었는지 확인하며, 해당 성분에 대한 피크 머무름시간(retention time, RT) 및 UV spectrum을 비교 분석하였다.

직선성: 직선성은 검체 중 분석대상물질의 양에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 뜻한다. 정확도 및 정밀도를 확인할 수 있는 범위의 5가지 농도(guaijaverin: 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 μg/mL, EGCG: 0.25, 0.5, 1, 2 및 4 mg/mL)로 조제된 표준용액을 3회 반복 조제하였으며, HPLC로 측정한 농도별 검출 성분의 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였다. 이때 결정계수(coefficient of determination, R²) 값이 0.990 이상인지 여부를 확인하였다.

정확성: 정확성은 측정값이 이미 알고 있는 참값이나 표준값에 근접한 정도를 말한다. 직선성에 의해 산출된 시험용액의 지표성분 함량을 구한 다음 지표성분 함량의 50, 100 및 150% 농도가 되도록 표준용액을 시험용액에 첨가하여 HPLC로 농도별 3회 반복 측정하였다. 각 검액에 첨가된 실측값과 이론값에 대한 회수율(%)을 구하여 정확도를 확인하였다.

회수율(%)＝[(C－B)/ A]×100

A: 첨가한 분석대상물질의 농도(이론치)

B: 검체 함유된 분석물질의 농도

C: Spiking 시험용액 중 분석대상물질의 농도

정밀성: 정밀성은 균일한 검체를 여러 번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에 따라 측정했을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성을 의미하며, 반복성과 재현성 측정을 통해 확인하였다. 반복성(repeatability)의 경우, 실험실 내에서 동일한 시험자가 5, 10 및 20 mg/mL 농도로 조제한 시험용액에 대해 HPLC로 5회 반복 측정하였고, 재현성(reproducibility)의 경우, 동일 실험실에서 다른 시험자와 다른 시험일에 10 mg/mL 농도의 시험용액을 조제하여 HPLC로 5회 반복 측정하였다. 각 결괏값의 표준편차를 결괏값의 평균으로 나눈 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 구하여 정밀성을 판단하였다.

검출한계 및 정량한계: 검출한계는 시료 중에 존재하는 분석대상물질의 검출 가능한 최소량을 뜻하며, 정량한계는 정확도와 정밀도를 가진 분석대상물질의 정량 가능한 최소량을 말한다. 직선성을 통해 산출된 검량선의 기울기 평균값(S)과 y절편의 표준편차(σ)에 근거하여 검출한계와 정량한계를 계산하였다.

σ: y절편의 표준편차

S: 검량선 기울기의 평균값

ILS-F-2301의 지표성분 함량 측정

ILS-F-2301 0.5 g을 취한 다음 50% 에탄올 50 mL를 가하여 20분 동안 초음파 추출한 후 0.45 μm PTFE membrane syringe filter로 여과하였다. 이 과정을 각 시료당 3회 반복하여 시험용액을 조제하였으며, 각각의 용액을 HPLC로 측정하여 표준품의 검량선으로부터 guaijaverin과 EGCG의 함량을 mg/g 단위로 환산하여 산출하였다.

분석조건의 확립

ILS-F-2301의 구성 원료인 구아바잎과 녹차잎에서 특이적으로 검출되는 지표성분 guaijaverin과 EGCG에 대한 분석법 확립을 위해 HPLC 분석에 필요한 컬럼, 이동상 종류 및 조성, UV 검출파장을 최적화하고(Table 1), 이에 대한 분석법 검증을 실시하였다.

특이성 확인

본 연구에서 확립된 분석조건으로 공시험용액, 표준용액과 ILS-F-2301 시험용액의 HPLC 크로마토그램을 비교하여 피크 분리 여부를 확인한 결과, guaijaverin과 EGCG 피크가 시험용액의 다른 물질과 간섭 없이 분리된 단일 피크로 검출되었으며, 공시험용액의 용매 피크에 대한 간섭 영향도 없음을 확인하였다(Fig. 2). 표준용액과 시험용액의 피크 RT가 EGCG는 22.6분대, guaijaverin은 53.3분대로 일치하였으며, UV spectrum을 비교한 결과, guaijaverin은 200 ~400 nm, EGCG는 200~350 nm 범위에서 동일한 spectrum을 나타내는 것을 확인하였다(Fig. 3). 이러한 결과를 토대로 본 시험법은 특이성이 있음을 확인하였다.

Fig 2. HPLC chromatograms of (A) blank (50% EtOH), (B) standard solution, and (C) ILS-F-2301. 1, EGCG; 2, guaijaverin.

Fig 3. Photo diode array spectrums of (A) guaijaverin standard solution, (B) EGCG standard solution, (C) guaijaverin in ILS-F-2301, and (D) EGCG in ILS-F-2301.

직선성 확인

표준물질 guaijaverin과 EGCG를 각각 메탄올과 50% 메탄올에 녹여 표준용액을 제조한 다음 희석하여 HPLC로 분석한 결과, guaijaverin은 3.125~50 μg/mL, EGCG는 0.25 ~4 mg/mL 범위에서 직선성을 보였다. 검량선의 R² 값은 guaijaverin이 1, EGCG가 0.9997로 나타났으며, 모두 0.990 이상으로 해당 농도 범위에서 우수한 직선성을 나타내었다(Fig. 4).

Fig 4. Calibration curves for (A) guaijaverin and (B) EGCG.

정확성 확인

ILS-F-2301 시험용액의 guaijaverin과 EGCG의 농도는 각각 10 μg/mL, 1 mg/mL였으며, 기준농도의 50, 100 및 150%에 해당하는 표준용액을 시험용액에 첨가하여 회수율 시험용액을 조제하였다. 동일한 HPLC 조건에서 농도별로 3회 반복 분석하고 회수율은 지표성분 농도를 고려하여 guaijaverin은 90~108%, EGCG는 95~102%를 기준으로 하였다(AOAC, 2002). 각 시험용액에 대한 3개 농도의 회수율은 guaijaverin이 100.17~104.86%, EGCG가 97.92~ 99.40%로 기준에 부합하는 것으로 나타나 본 시험법의 정확도를 확인하였다(Table 2).

Table 2 . Recovery of analytical method for guaijaverin and EGCG in ILS-F-2301.

Analyte	Level	Concentration of the standard sample (μg/mL)		Recovery (%)
		Added	Recovered	Mean±SD	RSD1)
Guaijaverin	Low (50%)	5.00	5.24±0.052)	104.86±1.09	1.04
	Medium (100%)	10.00	10.24±0.05	102.42±0.52	0.51
	High (150%)	15.00	15.03±0.20	100.17±1.35	1.35
EGCG	Low (50%)	500.00	497.02±4.48	99.40±0.90	0.9
	Medium (100%)	1,000.00	993.10±5.99	99.31±0.60	0.6
	High (150%)	1,500.00	1,468.87±12.85	97.92±0.86	0.87

¹⁾Relative standard deviation..

²⁾Values are recovered & mean±standard deviation in triplicate (n=3)..

정밀성 확인

반복성: 시료 농도에 따른 반복성을 확인하기 위해 ILS- F-2301을 5, 10 및 20 mg/mL로 3개 농도를 조제하여 동일 HPLC 조건으로 5회 반복 측정한 결과, guaijaverin과 EGCG의 RSD는 각각 0.43~0.81%, 0.19~0.40%로 나타났다(Table 3). 이는 지표성분 함량을 고려하여 설정된 기준(guaijaverin: 3% 이내, EGCG: 1.5% 이내)에 부합하는 것으로 나타나 반복성이 있음을 확인하였다(AOAC, 2002).

Table 3 . The precision of analytical method for guaijaverin and EGCG in ILS-F-2301.

Precision			Sample concentration (mg/mL)	Guaijaverin		EGCG
				Mean±SD (mg/g)	RSD1) (%)	Mean±SD (mg/g)	RSD (%)
Intra-day	Repeatability	User A	5	1.03±0.012)	0.61	111.45±0.24	0.21
			10	1.06±0.00	0.43	115.37±0.46	0.4
			20	1.04±0.01	0.81	114.02±0.22	0.19
	Reproducibility	User A	10	1.04±0.00	0.39	114.10±0.19	0.16
		User B	10	1.02±0.01	1.38	114.63±0.22	0.19
Inter-day	Reproducibility	User A	10	1.02±0.013)	0.68	114.82±0.60	0.52

¹⁾Relative standard deviation..

²⁾Values are mean±standard deviation in quintuplicate per day (n=5)..

³⁾Values are mean±standard deviation in quintuplicate per day for three days (n=5)..

재현성: 동일 실험실에서 다른 시험자 및 다른 시험일에 따른 재현성을 확인하기 위해 ILS-F-2301을 10 mg/mL로 조제하여 5회 반복 측정한 결과, guaijaverin과 EGCG의 RSD는 각각 0.39~1.38%, 0.16~0.52%로 AOAC(2002) 기준(guaijaverin: 6% 이내, EGCG: 3% 이내)에 부합하는 것으로 나타나 재현성이 있음을 확인하였다(Table 3). 위의 결과를 통해 본 시험법의 정밀도를 확보하였다.

검출한계 및 정량한계

직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기와 y절편을 통해 기울기 평균값과 y절편의 표준편차를 계산하고 이를 통해 검출한계 및 정량한계를 구한 결과는 Table 4와 같다. Guaijaverin의 경우 S는 24.79, σ는 3.28로 검출한계와 정량한계는 각각 0.44, 1.32 μg/mL였으며, EGCG의 경우 S는 14,883.00, σ는 96.69로 검출한계와 정량한계는 각각 21.44, 64.97 μg/mL로 확인되었다.

Table 4 . The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) for guaijaverin and EGCG analysis in ILS-F-2301.

Analyte	Concentration range (μg/mL)	S1)	σ2)	LOD (μg/mL)	LOQ (μg/mL)
Guaijaverin	3.125∼50.000	24.79	3.28	0.44	1.32
EGCG	250∼4,000	14,883.00	96.69	21.44	64.97

¹⁾The mean value of slop for calibration curve (n=3)..

²⁾The standard deviation of y-intercept for calibration curve (n=3)..

ILS-F-2301의 guaijaverin과 EGCG 함량

본 시험법의 검증과정을 통해 개발된 HPLC 분석법이 ILS-F-2301 지표성분 guaijaverin과 EGCG의 정량분석법으로 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확도 및 정밀도를 갖고 있음을 확인하였다. 검증된 분석법을 이용하여 ILS-F-2301의 지표성분 함량을 분석한 결과, guaijaverin과 EGCG의 평균 함량은 추출물 g당 각각 1.03 mg과 114.73 mg이었으며(Table 5), 건강기능식품 기능성 원료 인정 규정에 따라 80~120%의 지표성분 함량 범위를 고려할 경우 guaijaverin은 0.82~1.24 mg/g, EGCG는 91.79~137.68 mg/g으로 확인되었다(MFDS, 2023).

Table 5 . Content of guaijaverin and EGCG in ILS-F-2301.

No.	Guaijaverin		EGCG
	Mean±SD (mg/g)	RSD1) (%)	Mean±SD (mg/g)	RSD (%)
Lot. 1	1.04±0.002)	0.33	113.76±0.44	113.76±0.44
Lot. 2	1.03±0.01	0.57	116.13±0.15	116.13±0.15
Lot. 3	1.02±0.00	0.26	114.30±0.16	114.30±0.16
Total (Lot. 1+2+3)	1.03±0.01	1.15	114.73±1.10	0.96

¹⁾Relative standard deviation..

²⁾Values are mean±standard deviation in triplicate (n=3)..

본 연구에서는 HPLC를 이용하여 구아바･녹차잎 추출복합물(ILS-F-2301)을 기능성 원료로 개발하기 위한 원료 표준화의 일환으로 ILS-F-2301의 지표성분을 guaijaverin과 EGCG로 설정하고 이에 대한 HPLC 분석법을 확립하여 유효성 검증을 실시하였다. Guaijaverin과 EGCG의 분석을 위해 0.1% formic acid가 첨가된 물과 메탄올을 이동상으로 하고 C18 column을 사용하여 기울기 용리법으로 분리하고 각 물질의 최대흡수파장을 고려하여 254 nm(guaijaverin)와 280 nm(EGCG)에서 검출하였다. 분석법 유효성 검증은 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성 등을 통해 확인하였다. 표준용액과 ILS-F-2301의 피크 머무름시간과 UV spectrum이 일치하였으며, 다른 물질과 간섭없이 피크가 분리된 것으로 나타나 특이성을 확인하였다. Guaijaverin과 EGCG 검량선의 결정계수(R²)는 0.990 이상으로 높은 직선성을 보였으며, 검출한계는 guaijaverin이 0.44 μg/mL, EGCG가 21.44 μg/mL였고 정량한계는 guaijaverin이 1.32 μg/mL, EGCG가 64.97 μg/mL로 확인되었다. ILS-F-2301에 표준물질을 3개 농도로 첨가하고

분석한 회수율은 guaijaverin이 100.17~104.86%, EGCG가 97.92~99.40%로 나타나 정확성이 있는 것을 확인하였다. ILS-F-2301의 정밀도 측정 결과, guaijaverin과 EGCG의 상대표준편차(RSD)는 각각 0.39~1.38%, 0.16~0.52%로 나타나 본 분석법은 정밀성이 있음을 확인하였다. 이상의 결과로 ILS-F-2301의 지표성분인 guaijaverin과 EGCG의 HPLC 분석법이 신뢰성 있음을 검증하였다. 따라서 본 연구를 통해 확립된 시험법이 향후 ILS-F-2301의 원료 또는 제품의 품질관리를 위한 기초 자료로 활용될 것으로 기대된다.