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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52(12): 1233-1240

Published online December 31, 2023 https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.12.1233

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Anti-Atopic Dermatitis Effects of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus Extracts

Chang-Eui Hong and Su-Yun Lyu

College of Pharmacy and Research Institute of Life and Pharmaceutical Sciences, Sunchon National University

Correspondence to:Su-Yun Lyu, College of Pharmacy and Research Institute of Life and Pharmaceutical Sciences, Sunchon National University, 255, Jungang-ro, Suncheon-si, Jeonnam 57922, Korea, E-mail: suyun96@yahoo.com

Received: September 14, 2023; Revised: September 26, 2023; Accepted: October 11, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

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Acanthopanax divaricatus var. albeofructus is known for its potential health benefits and has been used in traditional medicine. This study was undertaken to investigate the effects of A. divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of atopic dermatitis-related cytokines and immunoglobulin E. Extracts of fruit, leaves, roots, and stems were prepared. All four extracts significantly inhibited the secretion of inflammatory cytokines, including those of interleukin (IL)-8 and tumor necrosis factor-alpha, and the secretion of immunoglobulin E. In addition, extracts dose-dependently increased Th1 cytokine (IL-2) levels. Taken together, our findings suggest that A. divaricatus var. albeofructus extracts might be able to improve atopic dermatitis by modulating the immune system.

Keywords: Acanthopanax divaricatus var. albeofructus, atopic dermatitis, cytokine, immunoglobulin E

서 론

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아토피 피부염은 재발이 잦은 만성 염증성 피부 질환이며(Brunner 등, 2018), 손상된 표피 장벽, 심한 피부 염증, 피부 감염 및 가려움증 등의 특징을 갖고 있다(Orzołek과 Galus, 2021). 이 질환은 건조한 습진 모양의 병변으로 나타나며, 심한 가려움증과 함께 수면의 질 저하 등 삶의 질에도 부정적인 영향을 미친다(Furue 등, 2019). 이 병변은 만성으로 진행되면서 태선화(lichenification)된 두꺼운 플라그 모양으로 변한다(Eichenfield 등, 2014; Suárez 등, 2012). 아토피 피부염은 어린이의 약 20%, 성인의 약 10%에 영향을 미치는 것으로 알려져 있고, 소아 환자의 경우 돌이 되기 전에 60%가 이 피부염 질환을 앓는다(Brunner 등, 2018). 각질세포(keratinocyte)는 환경 알레르겐, 피부 긁음, 세균 감염 등의 영향을 받아 염증성 사이토카인(cytokine) 및 thymic stromal lymphopoietin과 같은 단백질을 방출한다(Furue 등, 2018).

아토피 피부염의 주된 원인은 사람의 도움 T(T-helper, Th) 1 세포와 Th2 세포의 불균형이다(Meagher 등, 2002). 아토피 피부염의 초기 단계에서는 Th2 세포가 우세하게 작용하며 이 단계에서 인터루킨(interleukin, IL)-4, IL-13이 관여한다(Lee 등, 2015). Th1 세포의 활성이 억제되므로 Th1 사이토카인인 IL-2, 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ)는 감소하게 되는 반면, Th2 사이토카인인 IL- 4, IL-5, IL-6 등은 더욱 증가하게 된다(Baek 등, 2007). 이렇게 아토피 피부염 초기 단계에서는 Th2 세포 반응이 우세하다가 만성 피부염으로 가게 되면 Th1 반응이 우세하게 된다(Bieber, 2008).

종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)는 자극된 T 세포, 비만세포, 대식세포 등에서 분비되어 감염 부위에서 항원을 제거하지만, 중증 감염에서는 너무 많은 양이 생산되어 병리학적 질병을 유발하게 된다(An과 Kim, 2009). TNF-α가 염증의 주요 촉진자로 알려지면서, 임상에서는 아토피 피부염이나 건선 환자에게 infliximab, etanercept 등의 TNF-α blocking agent를 사용하기도 한다(Vergara 등, 2002). 다만 TNF-α를 blocking 함으로써 면역 체계의 불균형을 야기하여 Th2 쪽으로 더 기울어져 아토피 피부염이나 비염, 천식 등을 더 악화시킬 수도 있다고 우려하고 있다(Eyerich 등, 2011).

Th2 세포는 초기 아토피 피부염 단계를 조절하며, 여기에는 IL-4, IL-13이 관여한다(Lee 등, 2015). 영유아 초기에 발병하는 아토피 피부염은 총 면역글로블린(immunoglobulin, Ig) E 분비의 증가에 의한 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염은 피부 장벽 기능 이상과 filaggrin 유전자 변이뿐 아니라 비정상적인 IgE 분비에 의해서도 더 악화된다(Furue 등, 2019). 특히 일부 아토피 피부염 타입(외인성, 영유아, 아시아인)에서는 내인성 아토피 피부염 환자보다 더욱 높은 IgE 분비와 IL-22, Th1 분비 증가를 보여준다(Beck 등, 2014; Guttman-Yassky와 Krueger, 2018; Lee 등, 2015). IL-8은 C-X-C motif chemokine ligand 8(CXCL8)이라고도 부르며, 염증 세포를 모으는 케모카인(chemokine)이다. 사람 IL-8은 ‘호중구-유도 펩타이드(neutrophil-attracting peptide)’라고도 불리면서 염증 부위에 호중구와 호염구를 유도하는 것으로 알려져 있다(Baggiolini와 Clark-Lewis, 1992; Gilmartin 등, 2008; Larsen 등, 1989; van Damme 등, 1989). IL-8은 lipopolysaccharide(LPS), IL-1, TNF-α 자극 후 단핵구, 내피세포, 상피세포, 섬유아세포, 각질형성세포 등 다양한 세포에서 생성된다(Baggiolini 등, 1989; Leclere 등, 2011). 특히 IL-8 발현은 아토피 피부염, 건선, 기저세포암 병변에서 증가하고 있다(Carvalho 등, 2010).

흰털 오가피(Acanthopanax divaricatus var. albeofructus; Araliaceae)는 한국, 중국, 일본 등에 분포되어 있으며 인삼과 유사한 활성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다(Kang 등, 2001). 뿌리, 줄기, 잎 등을 포함한 전초는 한국에서 건강 보조제로도 널리 섭취되고 있으며, 특히 스트레스, 염증, 고혈압, 암을 포함한 다양한 질환에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Brekhman과 Dardymov, 1969; Lyu 등, 2012). 최근 들어 흰털 오가피가 알츠하이머로부터 보호 효과가 있다는 연구도 발표되었고(Yan 등, 2014), 폐의 염증을 낮춰준다는 보고도 있다(Lee 등, 2016). 그러나 흰털 오가피가 아토피 피부염에 미치는 영향에 관한 연구는 수행된 적이 없다. 본 실험에서는 흰털 오가피 부위별 추출물들의 아토피관련 사이토카인 및 IgE 조절 기능을 알아보고자 한다.

재료 및 방법

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실험 재료

충남 천안시에 소재하는 (주)수신오가피에서 재배하여 채취한 흰털 오가피의 잎, 줄기, 뿌리, 열매를 선별하여 세척한 후 건조하여 열수로 추출한 분말을 제공받았다. 오가피 분말을 멸균 증류수에 용해시킨 용액을 0.8, 0.45, 그리고 0.22 μm의 pore size를 갖고 있는 멤브레인 필터에 순차적으로 여과하여 사용하였다.

집먼지진드기

집먼지진드기(Dermatophagoides farinae)는 연세대 의과대학 알레르기 연구소에서 구입하여 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에 녹이고 0.22 μm 멤브레인 필터에 여과하여 사용하였다.

세포 배양

사람 각질형성세포인 HaCaT, 사람 B세포인 U266B1, 그리고 사람 상피세포인 Caco-2는 America Type Culture Collection에서 분양받아 사용하였으며, 사람 단핵구 세포인 THP-1과 사람 T 세포인 Jurkat은 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin (GibcoBRL)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(GibcoBRL) 배지로 배양하였다. Caco-2 세포는 10% FBS(GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin(Gibco BRL)이 첨가된 Eagle’s minimum essential medium(GibcoBRL) 배지로 배양했으며, U266B1, THP-1, Jurkat 세포는 FBS (GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin(Gibco BRL)이 첨가된 RPMI-1640(GibcoBRL) 배지를 사용하였다. 모든 세포는 CO2 incubator(Sanyo, 5% CO2, 95% air, 37°C)에서 배양하였다.

사이토카인 측정

사이토카인 분비 변화를 측정하기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 세트(IL-2, IL-8, TNF-α, IgE)는 BD Biosciences에서 구입하였다. Capture antibody를 coating buffer(0.1 M sodium carbonate, pH 9.5)에 희석하여 96-well plate에 분주한 후 4°C에서 24시간 두었다. Plate를 PBS/Tween-20으로 3회 세척한 후 1% bovine serum albumin으로 blocking 한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였다. PBS/Tween-20으로 3회 세척 후 standard와 샘플을 분주하고 2시간 동안 상온에서 방치하였다. 다시 PBS/Tween-20으로 5회 세척하고 detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase를 mix 하여 분주한 후 1시간 동안 상온에 방치하였다. 마지막으로 PBS/Tween-20으로 5회 세척 후 TMB substrate reagent(BD Biosciences)를 분주한 후 상온에서 30분 방치하였다. 이후 stop solution(1 M phosphoric acid)으로 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

결과 통계 처리는 Minitab Express 1.5.2를 이용하였으며, 유의차 검증은 Dunnet’s test에 따라 분석하였다. 유의성 검증은 P<0.05인 것을 유의하다고 간주하였다.

결과 및 고찰

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세포에 대한 흰털 오가피의 독성

흰털 오가피 추출물이 세포 독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 우선 Caco-2, HaCaT, THP-1, Jurkat, U266B1 세포에 각각 감 추출물인 열매, 줄기, 잎, 뿌리 추출물을 농도별로 처리하고 48시간 동안 37°C에서 CO2 incubator에 배양하여 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과 네 가지 추출물 모두 0.8 mg/mL에서 세포들에 대하여 80% 이상의 생존율을 보여, 추후 실험은 상기 농도 이하로 진행하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Viability of cells when treated with Acanthopanax divaricatus var. albeofructus (A) fruit, (B) leaf, (C) root, and (D) stem extracts. Various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts were added to cells and incubated for 48 h at 37°C (5% CO2), and viability was measured by MTT assay.

흰털 오가피 추출물이 IL-2에 미치는 영향

사람의 도움 T 세포는 두 가지로 나눌 수 있는데, Th1 세포는 IL-2와 IFN-γ를 생성하며 지연형 과민반응에 관여한다(Romagnani, 1991; Umetsu 등, 1988). 반면, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10 등을 생성하며 아토피 질환에 관여한다(Cooper, 1994; Gajewski 등, 1990). 즉, 아토피 피부염 초기에는 Th1 세포 활성이 감소하며, 이 세포에 의해 유도되는 IL-2와 IFN-γ는 감소하게 된다(Matsumoto 등, 1999; Mutou 등, 2007). 실제로 아토피 피부염을 가진 어린이의 자극된 말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cells)를 분석한 결과 IL-2 mRNA 양과 단백질 생산량이 대조군에 비해 감소한다는 연구 결과도 있다(Yamamoto 등, 1997). 본 실험에서 사람 T-세포에 흰털 오가피의 열매, 잎, 뿌리, 줄기 추출물을 농도별로 처리하니 모든 부위 추출물에서 유의성 있게 IL-2 분비가 증가하였다. 특히 100 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비해 열매 추출물은 2.16배, 잎 추출물은 1.52배, 뿌리 추출물은 1.80배, 줄기 추출물은 1.46배 IL-2 분비량을 증가시켰다(Fig. 2). 이는 흰털 오가피 추출물이 아토피 면역 반응 중 Th1 반응을 증가시켰다고 볼 수 있다. 그러나 상기했듯이 급성 아토피 피부염 단계에서는 Th2 세포 반응이 우세하지만, 만성 아토피 피부염 단계로 갈수록 Th1 반응이 우세하게 되므로(Bieber, 2008) 흰털 오가피 추출물을 만성 단계에서 사용하는 것은 자제해야 할 것으로 보인다.

Fig. 2. Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of interleukin (IL)-2 in Jurkat. The secretion of IL-2 was induced by treatment of 10 pg/mL lipopolysaccharide (LPS), phytohemagglutinin, and 10 ng/mL phorbol myristate acetate. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and IL-2 secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

흰털 오가피 추출물이 TNF-α분비에 미치는 영향

아토피 피부염의 경우 사이토카인 분비 이상, 특히 TNF-α의 과다 분비와 관련이 있다. 여러 요인에 의해 TNF-α 신호 전달이 계속되면 염증이 지속적으로 나타나거나 세포 자살을 일으킬 수 있다(Guttman-Yassky 등, 2011; Kayserova 등, 2012). 실제로 TNF-α와 Th2 사이토카인(IL-4, IL-13, IL-31)이 표피 형태 생성, 증식, 분화 및 각질층 지질 특성에 미치는 영향을 조사한 결과, TNF-α와 Th2 사이토카인 모두 아토피 피부염을 유발했다는 연구 결과도 있다(Danso 등, 2014). 이러한 연구 결과를 바탕으로 현재 anti-TNF-α therapy(i.e. etanercept, infliximab)를 아토피 피부염에 적용하고 있으나, 부작용 역시 보고되고 있어 사용에 주의가 필요하다(Lebas 등, 2007; Mangge 등, 2003; Ruiz-Villaverde와 Galán-Gutierrez, 2012). 본 실험에서는 사람 각질형성세포인 HaCaT 세포에 집먼지진드기(D. farina)를 2 μg/mL 농도로 처리하고 흰털 오가피 부위별 추출물을 처리하여 TNF-α 분비를 측정하였다. 그 결과, 흰털 오가피 추출물 100 μg/mL에서 대조군에 비해 열매 추출물은 23.6%, 잎 추출물은 18.7%, 뿌리 추출물은 34.1%, 줄기 추출물은 25.9%씩 TNF-α 분비량을 감소시켰다(Fig. 3A). 또한 사람 단핵구인 THP-1 세포에서 TNF-α의 분비량 변화를 실험한 결과, 흰털 오가피 추출물 100 μg/mL의 농도에서 대조군에 비해 열매 추출물은 20.3%, 잎 추출물은 17.9%, 뿌리 추출물은 17.5%씩 TNF-α 분비량을 감소시켰다(Fig. 3B). 사람 단핵구보다 사람 각질형성세포에서 TNF- α 분비량이 더 많이 감소하였는데, 특히 집먼지진드기는 염증성 사이토카인의 분비를 증가시켜 아토피 피부염이나 천식 등을 유발하고, 특이적인 IgE 분비까지 증가하여 질환을 더 악화시키는 것으로 알려져 있다(Maeda 등, 2009). 본 실험에서 집먼지진드기로 인해 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α 분비가 흰털 오가피 추출물로 인해 감소했으므로, 관련 염증성 사이토카인(IL-8) 및 면역글로블린(IgE)의 분비에 미치는 영향도 함께 조사했다.

Fig. 3. Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of TNF-α in (A) HaCaT and (B) THP-1 cells. The secretion of TNF-α was induced by treatment of 2 μg/mL house dust mite (Dermatophagoides farinae) and 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) for HaCaT and THP-1 cells, respectively. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and TNF-α secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

흰털 오가피 추출물이 IgE 및 IL-8에 미치는 영향

IL-4는 Th2 세포 분화 및 IgE 생성 등에 중요한 역할을 한다. CD4+ cord blood T 세포를 조사한 결과, IL-4 농도가 증가해 있으면 아토피 피부염 발병 위험이 높아진다(Herberth 등, 2010). IL-4를 과발현하는 transgenic 마우스는 IgE와 IgG1 분비가 증가하였고 피부에서 염증 세포가 증가하였으며, 피부 내 박테리아 감염도 나타났다(Chan 등, 2001). 즉, 아토피 피부염에서 중요한 biomarker 중 하나가 IgE이며, 아토피 피부염 환자의 80~90%에서 높은 농도의 혈중 IgE가 나타난다(Baek 등, 2007; Meagher 등, 2002). 또한 아토피 피부염의 중등도에 따라 IgE 분비가 변화하며, 특히 가려운 정도를 나타내는 biomarker가 되기도 한다(Lee 등, 2006). 본 실험에서는 사람 B세포인 U266B1 세포에서 IgE 분비량을 측정하였는데, 100 µg/mL의 흰털 오가피 부위별 추출물 처리 결과 대조군에 비해 열매, 잎, 뿌리, 줄기 처리군에서 각각 25.9%, 9%, 33.8%, 15.1%씩 유의성 있게 IgE 분비가 감소하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of immunoglobulin (Ig) E in U266B1 cells. The secretion of IgE was induced by treatment of 4 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) and 100 U/mL interleukin-4. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and IgE secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

IgE와 관련하여 IL-8은 아토피 피부염 환자 대부분에서 검출되며, 특히 심한 아토피 피부염의 경우 경증에 비해 IL-8 분비량이 매우 많다고 보고되어 있다. 또한 아토피 피부염이 개선되면 IL-8 농도가 감소하며, 이에 따라 IgE 생산도 감소한다(Kimata와 Lindley, 1994). 이에 더해 사람 비만세포, 호염구, 그리고 IgE-결합 단핵구 역시 IgE-교차 결합에 반응하여 IL-8을 생성하며, 이는 IgE-매개성 알레르기 염증에서 IL-8의 중요한 역할을 시사한다(Gilmartin 등, 2008; Möller 등, 1993; Novak 등, 2001; Pecaric-Petkovic 등, 2009; Pyle 등, 2013). IL-8의 유전자는 아토피 염증 환경에서 여러 가지 요인에 의해 발현이 조절된다. 일반적으로 LPS 및 TNF-α 등은 IL-8 생산을 증가시키고, IL-10은 IL-8 생산을 억제하며 자가 조절 역할을 한다 (Pawankar, 2003).

본 실험에서는 흰털 오가피의 부위별 추출물들이 사람 상피세포, 각질형성세포, 단핵구 모두 IL- 8의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있었다(Fig. 5). 특히 사람의 상피세포인 Caco-2 세포에서 열매와 줄기 추출물은 각각 최고 30.0%와 13.3%까지 IL-8 분비를 억제할 수 있었으며, 사람 각질형성세포인 HaCaT 세포에서 열매와 뿌리 추출물은 각각 최고 20.6%와 16.1%까지 IL-8 분비를 감소시킬 수 있었다. 또한 단핵구인 THP-1 세포에서는 열매, 잎, 뿌리, 줄기 추출물이 각각 최고 27.9%, 37.5%, 30.2%, 17.2 %씩 IL-8 분비를 감소시킬 수 있었다. 결론적으로 본 연구에서 흰털 오가피 추출물이 사람 각질형성세포, T 세포 등에서 TNF-α 분비를 억제하였고 이는 IL-8 분비 저해로 이어졌으며, 이어서 IgE 생산이 억제되었다는 것을 짐작해 볼 수 있으며 이는 아토피 피부염 개선으로도 이어질 수 있으리라 사료된다. 다만 본 연구에서는 세포 자극을 위해 LPS를 사용했으며, 이는 급성 염증 유발 모델을 형성하므로 만성 질환 모델과 다소 차이가 있다. 그러므로 추후 만성 질환 모델을 만들어 추가로 연구하는 것이 필요하다.

Fig. 5. Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus on the secretion of interleukin (IL)-8 in (A) Caco-2, (B) HaCaT, and (C) THP-1 cells. The secretion of IL-8 was induced by treatment of 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS). Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus for 48 h and IL-8 secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

요 약

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종합해보면, 흰털 오가피 추출물은 Th1 세포를 활성화하고 Th2 세포를 억제하며 IgE 분비도 억제하여 면역을 조절할 수 있는 능력이 있음을 증명하였다. 특히 흰털 오가피 추출물 중 열매 추출물이 아토피 피부염과 관련하여 가장 뛰어난 효과를 보여주었다. 다만, Th1 세포 활성화로 초기 아토피 피부염에는 효과적일 수 있으나, 만성 피부염 사용에서는 주의가 필요하다. 위 결과를 바탕으로 흰털 오가피가 아토피 피부염 개선에 효과적일 수 있음을 확인할 수 있었다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2023; 52(12): 1233-1240

Published online December 31, 2023 https://doi.org/10.3746/jkfn.2023.52.12.1233

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

흰털 오가피 추출물의 항아토피 피부염 효과

홍창의․유수연

순천대학교 약학과 및 생명약학연구소

Received: September 14, 2023; Revised: September 26, 2023; Accepted: October 11, 2023

Anti-Atopic Dermatitis Effects of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus Extracts

Chang-Eui Hong and Su-Yun Lyu

College of Pharmacy and Research Institute of Life and Pharmaceutical Sciences, Sunchon National University

Correspondence to:Su-Yun Lyu, College of Pharmacy and Research Institute of Life and Pharmaceutical Sciences, Sunchon National University, 255, Jungang-ro, Suncheon-si, Jeonnam 57922, Korea, E-mail: suyun96@yahoo.com

Received: September 14, 2023; Revised: September 26, 2023; Accepted: October 11, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Acanthopanax divaricatus var. albeofructus is known for its potential health benefits and has been used in traditional medicine. This study was undertaken to investigate the effects of A. divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of atopic dermatitis-related cytokines and immunoglobulin E. Extracts of fruit, leaves, roots, and stems were prepared. All four extracts significantly inhibited the secretion of inflammatory cytokines, including those of interleukin (IL)-8 and tumor necrosis factor-alpha, and the secretion of immunoglobulin E. In addition, extracts dose-dependently increased Th1 cytokine (IL-2) levels. Taken together, our findings suggest that A. divaricatus var. albeofructus extracts might be able to improve atopic dermatitis by modulating the immune system.

Keywords: Acanthopanax divaricatus var. albeofructus, atopic dermatitis, cytokine, immunoglobulin E

서 론

아토피 피부염은 재발이 잦은 만성 염증성 피부 질환이며(Brunner 등, 2018), 손상된 표피 장벽, 심한 피부 염증, 피부 감염 및 가려움증 등의 특징을 갖고 있다(Orzołek과 Galus, 2021). 이 질환은 건조한 습진 모양의 병변으로 나타나며, 심한 가려움증과 함께 수면의 질 저하 등 삶의 질에도 부정적인 영향을 미친다(Furue 등, 2019). 이 병변은 만성으로 진행되면서 태선화(lichenification)된 두꺼운 플라그 모양으로 변한다(Eichenfield 등, 2014; Suárez 등, 2012). 아토피 피부염은 어린이의 약 20%, 성인의 약 10%에 영향을 미치는 것으로 알려져 있고, 소아 환자의 경우 돌이 되기 전에 60%가 이 피부염 질환을 앓는다(Brunner 등, 2018). 각질세포(keratinocyte)는 환경 알레르겐, 피부 긁음, 세균 감염 등의 영향을 받아 염증성 사이토카인(cytokine) 및 thymic stromal lymphopoietin과 같은 단백질을 방출한다(Furue 등, 2018).

아토피 피부염의 주된 원인은 사람의 도움 T(T-helper, Th) 1 세포와 Th2 세포의 불균형이다(Meagher 등, 2002). 아토피 피부염의 초기 단계에서는 Th2 세포가 우세하게 작용하며 이 단계에서 인터루킨(interleukin, IL)-4, IL-13이 관여한다(Lee 등, 2015). Th1 세포의 활성이 억제되므로 Th1 사이토카인인 IL-2, 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ)는 감소하게 되는 반면, Th2 사이토카인인 IL- 4, IL-5, IL-6 등은 더욱 증가하게 된다(Baek 등, 2007). 이렇게 아토피 피부염 초기 단계에서는 Th2 세포 반응이 우세하다가 만성 피부염으로 가게 되면 Th1 반응이 우세하게 된다(Bieber, 2008).

종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)는 자극된 T 세포, 비만세포, 대식세포 등에서 분비되어 감염 부위에서 항원을 제거하지만, 중증 감염에서는 너무 많은 양이 생산되어 병리학적 질병을 유발하게 된다(An과 Kim, 2009). TNF-α가 염증의 주요 촉진자로 알려지면서, 임상에서는 아토피 피부염이나 건선 환자에게 infliximab, etanercept 등의 TNF-α blocking agent를 사용하기도 한다(Vergara 등, 2002). 다만 TNF-α를 blocking 함으로써 면역 체계의 불균형을 야기하여 Th2 쪽으로 더 기울어져 아토피 피부염이나 비염, 천식 등을 더 악화시킬 수도 있다고 우려하고 있다(Eyerich 등, 2011).

Th2 세포는 초기 아토피 피부염 단계를 조절하며, 여기에는 IL-4, IL-13이 관여한다(Lee 등, 2015). 영유아 초기에 발병하는 아토피 피부염은 총 면역글로블린(immunoglobulin, Ig) E 분비의 증가에 의한 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염은 피부 장벽 기능 이상과 filaggrin 유전자 변이뿐 아니라 비정상적인 IgE 분비에 의해서도 더 악화된다(Furue 등, 2019). 특히 일부 아토피 피부염 타입(외인성, 영유아, 아시아인)에서는 내인성 아토피 피부염 환자보다 더욱 높은 IgE 분비와 IL-22, Th1 분비 증가를 보여준다(Beck 등, 2014; Guttman-Yassky와 Krueger, 2018; Lee 등, 2015). IL-8은 C-X-C motif chemokine ligand 8(CXCL8)이라고도 부르며, 염증 세포를 모으는 케모카인(chemokine)이다. 사람 IL-8은 ‘호중구-유도 펩타이드(neutrophil-attracting peptide)’라고도 불리면서 염증 부위에 호중구와 호염구를 유도하는 것으로 알려져 있다(Baggiolini와 Clark-Lewis, 1992; Gilmartin 등, 2008; Larsen 등, 1989; van Damme 등, 1989). IL-8은 lipopolysaccharide(LPS), IL-1, TNF-α 자극 후 단핵구, 내피세포, 상피세포, 섬유아세포, 각질형성세포 등 다양한 세포에서 생성된다(Baggiolini 등, 1989; Leclere 등, 2011). 특히 IL-8 발현은 아토피 피부염, 건선, 기저세포암 병변에서 증가하고 있다(Carvalho 등, 2010).

흰털 오가피(Acanthopanax divaricatus var. albeofructus; Araliaceae)는 한국, 중국, 일본 등에 분포되어 있으며 인삼과 유사한 활성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다(Kang 등, 2001). 뿌리, 줄기, 잎 등을 포함한 전초는 한국에서 건강 보조제로도 널리 섭취되고 있으며, 특히 스트레스, 염증, 고혈압, 암을 포함한 다양한 질환에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Brekhman과 Dardymov, 1969; Lyu 등, 2012). 최근 들어 흰털 오가피가 알츠하이머로부터 보호 효과가 있다는 연구도 발표되었고(Yan 등, 2014), 폐의 염증을 낮춰준다는 보고도 있다(Lee 등, 2016). 그러나 흰털 오가피가 아토피 피부염에 미치는 영향에 관한 연구는 수행된 적이 없다. 본 실험에서는 흰털 오가피 부위별 추출물들의 아토피관련 사이토카인 및 IgE 조절 기능을 알아보고자 한다.

재료 및 방법

실험 재료

충남 천안시에 소재하는 (주)수신오가피에서 재배하여 채취한 흰털 오가피의 잎, 줄기, 뿌리, 열매를 선별하여 세척한 후 건조하여 열수로 추출한 분말을 제공받았다. 오가피 분말을 멸균 증류수에 용해시킨 용액을 0.8, 0.45, 그리고 0.22 μm의 pore size를 갖고 있는 멤브레인 필터에 순차적으로 여과하여 사용하였다.

집먼지진드기

집먼지진드기(Dermatophagoides farinae)는 연세대 의과대학 알레르기 연구소에서 구입하여 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에 녹이고 0.22 μm 멤브레인 필터에 여과하여 사용하였다.

세포 배양

사람 각질형성세포인 HaCaT, 사람 B세포인 U266B1, 그리고 사람 상피세포인 Caco-2는 America Type Culture Collection에서 분양받아 사용하였으며, 사람 단핵구 세포인 THP-1과 사람 T 세포인 Jurkat은 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin (GibcoBRL)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(GibcoBRL) 배지로 배양하였다. Caco-2 세포는 10% FBS(GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin(Gibco BRL)이 첨가된 Eagle’s minimum essential medium(GibcoBRL) 배지로 배양했으며, U266B1, THP-1, Jurkat 세포는 FBS (GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin(Gibco BRL)이 첨가된 RPMI-1640(GibcoBRL) 배지를 사용하였다. 모든 세포는 CO2 incubator(Sanyo, 5% CO2, 95% air, 37°C)에서 배양하였다.

사이토카인 측정

사이토카인 분비 변화를 측정하기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 세트(IL-2, IL-8, TNF-α, IgE)는 BD Biosciences에서 구입하였다. Capture antibody를 coating buffer(0.1 M sodium carbonate, pH 9.5)에 희석하여 96-well plate에 분주한 후 4°C에서 24시간 두었다. Plate를 PBS/Tween-20으로 3회 세척한 후 1% bovine serum albumin으로 blocking 한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였다. PBS/Tween-20으로 3회 세척 후 standard와 샘플을 분주하고 2시간 동안 상온에서 방치하였다. 다시 PBS/Tween-20으로 5회 세척하고 detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase를 mix 하여 분주한 후 1시간 동안 상온에 방치하였다. 마지막으로 PBS/Tween-20으로 5회 세척 후 TMB substrate reagent(BD Biosciences)를 분주한 후 상온에서 30분 방치하였다. 이후 stop solution(1 M phosphoric acid)으로 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

결과 통계 처리는 Minitab Express 1.5.2를 이용하였으며, 유의차 검증은 Dunnet’s test에 따라 분석하였다. 유의성 검증은 P<0.05인 것을 유의하다고 간주하였다.

결과 및 고찰

세포에 대한 흰털 오가피의 독성

흰털 오가피 추출물이 세포 독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 우선 Caco-2, HaCaT, THP-1, Jurkat, U266B1 세포에 각각 감 추출물인 열매, 줄기, 잎, 뿌리 추출물을 농도별로 처리하고 48시간 동안 37°C에서 CO2 incubator에 배양하여 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과 네 가지 추출물 모두 0.8 mg/mL에서 세포들에 대하여 80% 이상의 생존율을 보여, 추후 실험은 상기 농도 이하로 진행하였다(Fig. 1).

Fig 1. Viability of cells when treated with Acanthopanax divaricatus var. albeofructus (A) fruit, (B) leaf, (C) root, and (D) stem extracts. Various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts were added to cells and incubated for 48 h at 37°C (5% CO2), and viability was measured by MTT assay.

흰털 오가피 추출물이 IL-2에 미치는 영향

사람의 도움 T 세포는 두 가지로 나눌 수 있는데, Th1 세포는 IL-2와 IFN-γ를 생성하며 지연형 과민반응에 관여한다(Romagnani, 1991; Umetsu 등, 1988). 반면, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10 등을 생성하며 아토피 질환에 관여한다(Cooper, 1994; Gajewski 등, 1990). 즉, 아토피 피부염 초기에는 Th1 세포 활성이 감소하며, 이 세포에 의해 유도되는 IL-2와 IFN-γ는 감소하게 된다(Matsumoto 등, 1999; Mutou 등, 2007). 실제로 아토피 피부염을 가진 어린이의 자극된 말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cells)를 분석한 결과 IL-2 mRNA 양과 단백질 생산량이 대조군에 비해 감소한다는 연구 결과도 있다(Yamamoto 등, 1997). 본 실험에서 사람 T-세포에 흰털 오가피의 열매, 잎, 뿌리, 줄기 추출물을 농도별로 처리하니 모든 부위 추출물에서 유의성 있게 IL-2 분비가 증가하였다. 특히 100 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비해 열매 추출물은 2.16배, 잎 추출물은 1.52배, 뿌리 추출물은 1.80배, 줄기 추출물은 1.46배 IL-2 분비량을 증가시켰다(Fig. 2). 이는 흰털 오가피 추출물이 아토피 면역 반응 중 Th1 반응을 증가시켰다고 볼 수 있다. 그러나 상기했듯이 급성 아토피 피부염 단계에서는 Th2 세포 반응이 우세하지만, 만성 아토피 피부염 단계로 갈수록 Th1 반응이 우세하게 되므로(Bieber, 2008) 흰털 오가피 추출물을 만성 단계에서 사용하는 것은 자제해야 할 것으로 보인다.

Fig 2. Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of interleukin (IL)-2 in Jurkat. The secretion of IL-2 was induced by treatment of 10 pg/mL lipopolysaccharide (LPS), phytohemagglutinin, and 10 ng/mL phorbol myristate acetate. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and IL-2 secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

흰털 오가피 추출물이 TNF-α분비에 미치는 영향

아토피 피부염의 경우 사이토카인 분비 이상, 특히 TNF-α의 과다 분비와 관련이 있다. 여러 요인에 의해 TNF-α 신호 전달이 계속되면 염증이 지속적으로 나타나거나 세포 자살을 일으킬 수 있다(Guttman-Yassky 등, 2011; Kayserova 등, 2012). 실제로 TNF-α와 Th2 사이토카인(IL-4, IL-13, IL-31)이 표피 형태 생성, 증식, 분화 및 각질층 지질 특성에 미치는 영향을 조사한 결과, TNF-α와 Th2 사이토카인 모두 아토피 피부염을 유발했다는 연구 결과도 있다(Danso 등, 2014). 이러한 연구 결과를 바탕으로 현재 anti-TNF-α therapy(i.e. etanercept, infliximab)를 아토피 피부염에 적용하고 있으나, 부작용 역시 보고되고 있어 사용에 주의가 필요하다(Lebas 등, 2007; Mangge 등, 2003; Ruiz-Villaverde와 Galán-Gutierrez, 2012). 본 실험에서는 사람 각질형성세포인 HaCaT 세포에 집먼지진드기(D. farina)를 2 μg/mL 농도로 처리하고 흰털 오가피 부위별 추출물을 처리하여 TNF-α 분비를 측정하였다. 그 결과, 흰털 오가피 추출물 100 μg/mL에서 대조군에 비해 열매 추출물은 23.6%, 잎 추출물은 18.7%, 뿌리 추출물은 34.1%, 줄기 추출물은 25.9%씩 TNF-α 분비량을 감소시켰다(Fig. 3A). 또한 사람 단핵구인 THP-1 세포에서 TNF-α의 분비량 변화를 실험한 결과, 흰털 오가피 추출물 100 μg/mL의 농도에서 대조군에 비해 열매 추출물은 20.3%, 잎 추출물은 17.9%, 뿌리 추출물은 17.5%씩 TNF-α 분비량을 감소시켰다(Fig. 3B). 사람 단핵구보다 사람 각질형성세포에서 TNF- α 분비량이 더 많이 감소하였는데, 특히 집먼지진드기는 염증성 사이토카인의 분비를 증가시켜 아토피 피부염이나 천식 등을 유발하고, 특이적인 IgE 분비까지 증가하여 질환을 더 악화시키는 것으로 알려져 있다(Maeda 등, 2009). 본 실험에서 집먼지진드기로 인해 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α 분비가 흰털 오가피 추출물로 인해 감소했으므로, 관련 염증성 사이토카인(IL-8) 및 면역글로블린(IgE)의 분비에 미치는 영향도 함께 조사했다.

Fig 3. Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of TNF-α in (A) HaCaT and (B) THP-1 cells. The secretion of TNF-α was induced by treatment of 2 μg/mL house dust mite (Dermatophagoides farinae) and 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) for HaCaT and THP-1 cells, respectively. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and TNF-α secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

흰털 오가피 추출물이 IgE 및 IL-8에 미치는 영향

IL-4는 Th2 세포 분화 및 IgE 생성 등에 중요한 역할을 한다. CD4+ cord blood T 세포를 조사한 결과, IL-4 농도가 증가해 있으면 아토피 피부염 발병 위험이 높아진다(Herberth 등, 2010). IL-4를 과발현하는 transgenic 마우스는 IgE와 IgG1 분비가 증가하였고 피부에서 염증 세포가 증가하였으며, 피부 내 박테리아 감염도 나타났다(Chan 등, 2001). 즉, 아토피 피부염에서 중요한 biomarker 중 하나가 IgE이며, 아토피 피부염 환자의 80~90%에서 높은 농도의 혈중 IgE가 나타난다(Baek 등, 2007; Meagher 등, 2002). 또한 아토피 피부염의 중등도에 따라 IgE 분비가 변화하며, 특히 가려운 정도를 나타내는 biomarker가 되기도 한다(Lee 등, 2006). 본 실험에서는 사람 B세포인 U266B1 세포에서 IgE 분비량을 측정하였는데, 100 µg/mL의 흰털 오가피 부위별 추출물 처리 결과 대조군에 비해 열매, 잎, 뿌리, 줄기 처리군에서 각각 25.9%, 9%, 33.8%, 15.1%씩 유의성 있게 IgE 분비가 감소하였다(Fig. 4).

Fig 4. Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of immunoglobulin (Ig) E in U266B1 cells. The secretion of IgE was induced by treatment of 4 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) and 100 U/mL interleukin-4. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and IgE secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

IgE와 관련하여 IL-8은 아토피 피부염 환자 대부분에서 검출되며, 특히 심한 아토피 피부염의 경우 경증에 비해 IL-8 분비량이 매우 많다고 보고되어 있다. 또한 아토피 피부염이 개선되면 IL-8 농도가 감소하며, 이에 따라 IgE 생산도 감소한다(Kimata와 Lindley, 1994). 이에 더해 사람 비만세포, 호염구, 그리고 IgE-결합 단핵구 역시 IgE-교차 결합에 반응하여 IL-8을 생성하며, 이는 IgE-매개성 알레르기 염증에서 IL-8의 중요한 역할을 시사한다(Gilmartin 등, 2008; Möller 등, 1993; Novak 등, 2001; Pecaric-Petkovic 등, 2009; Pyle 등, 2013). IL-8의 유전자는 아토피 염증 환경에서 여러 가지 요인에 의해 발현이 조절된다. 일반적으로 LPS 및 TNF-α 등은 IL-8 생산을 증가시키고, IL-10은 IL-8 생산을 억제하며 자가 조절 역할을 한다 (Pawankar, 2003).

본 실험에서는 흰털 오가피의 부위별 추출물들이 사람 상피세포, 각질형성세포, 단핵구 모두 IL- 8의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있었다(Fig. 5). 특히 사람의 상피세포인 Caco-2 세포에서 열매와 줄기 추출물은 각각 최고 30.0%와 13.3%까지 IL-8 분비를 억제할 수 있었으며, 사람 각질형성세포인 HaCaT 세포에서 열매와 뿌리 추출물은 각각 최고 20.6%와 16.1%까지 IL-8 분비를 감소시킬 수 있었다. 또한 단핵구인 THP-1 세포에서는 열매, 잎, 뿌리, 줄기 추출물이 각각 최고 27.9%, 37.5%, 30.2%, 17.2 %씩 IL-8 분비를 감소시킬 수 있었다. 결론적으로 본 연구에서 흰털 오가피 추출물이 사람 각질형성세포, T 세포 등에서 TNF-α 분비를 억제하였고 이는 IL-8 분비 저해로 이어졌으며, 이어서 IgE 생산이 억제되었다는 것을 짐작해 볼 수 있으며 이는 아토피 피부염 개선으로도 이어질 수 있으리라 사료된다. 다만 본 연구에서는 세포 자극을 위해 LPS를 사용했으며, 이는 급성 염증 유발 모델을 형성하므로 만성 질환 모델과 다소 차이가 있다. 그러므로 추후 만성 질환 모델을 만들어 추가로 연구하는 것이 필요하다.

Fig 5. Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus on the secretion of interleukin (IL)-8 in (A) Caco-2, (B) HaCaT, and (C) THP-1 cells. The secretion of IL-8 was induced by treatment of 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS). Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus for 48 h and IL-8 secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

요 약

종합해보면, 흰털 오가피 추출물은 Th1 세포를 활성화하고 Th2 세포를 억제하며 IgE 분비도 억제하여 면역을 조절할 수 있는 능력이 있음을 증명하였다. 특히 흰털 오가피 추출물 중 열매 추출물이 아토피 피부염과 관련하여 가장 뛰어난 효과를 보여주었다. 다만, Th1 세포 활성화로 초기 아토피 피부염에는 효과적일 수 있으나, 만성 피부염 사용에서는 주의가 필요하다. 위 결과를 바탕으로 흰털 오가피가 아토피 피부염 개선에 효과적일 수 있음을 확인할 수 있었다.

Fig 1.

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Fig 1.Viability of cells when treated with Acanthopanax divaricatus var. albeofructus (A) fruit, (B) leaf, (C) root, and (D) stem extracts. Various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts were added to cells and incubated for 48 h at 37°C (5% CO2), and viability was measured by MTT assay.
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Fig 2.

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Fig 2.Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of interleukin (IL)-2 in Jurkat. The secretion of IL-2 was induced by treatment of 10 pg/mL lipopolysaccharide (LPS), phytohemagglutinin, and 10 ng/mL phorbol myristate acetate. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and IL-2 secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.
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Fig 3.

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Fig 3.Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of TNF-α in (A) HaCaT and (B) THP-1 cells. The secretion of TNF-α was induced by treatment of 2 μg/mL house dust mite (Dermatophagoides farinae) and 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) for HaCaT and THP-1 cells, respectively. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and TNF-α secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.
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Fig 4.

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Fig 4.Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus extracts on the secretion of immunoglobulin (Ig) E in U266B1 cells. The secretion of IgE was induced by treatment of 4 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) and 100 U/mL interleukin-4. Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus extracts for 48 h and IgE secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.
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Fig 5.

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Fig 5.Effect of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus on the secretion of interleukin (IL)-8 in (A) Caco-2, (B) HaCaT, and (C) THP-1 cells. The secretion of IL-8 was induced by treatment of 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS). Cells were treated with various concentrations of A. divaricatus var. albeofructus for 48 h and IL-8 secretion was measured. Asterisks represent significant differences between control and sample-treated groups at ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.
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