측백나무는 상록성 겉씨식물로, 한국을 비롯해 일본과 중국 등 아시아 지역에 주로 분포되어 자생한다. 방약합편에 의하면 측백나무의 잎, 즉 측백엽 혹은 백엽은 이질과 같은 감염성질환 치료와 각혈, 토혈, 코피를 멈추게 하는 효과가 있다고 한다(Park, 2017). 현대에 이르러 과학적 실험과 평가가 이루어진 바에 의하면, 측백엽은 항산화능(Ahn 등, 2011)을 지니며 in vitro 혹은 in vivo 연구에서 항균(Abdallah와 Elsharkawy, 2019; Al-Ani 등, 2011), 항염(Fan 등, 2012; Kim 등, 2011), 항암(Biswas 등, 2011; Breeta 등, 2018; Ojeswi 등, 2010) 등의 효과를 나타냈다.

한편, 측백엽의 당질 및 지질대사에 미치는 영향에 대해서는 매우 드물게 연구된 바 있는데, Dash 등(2014)은 streptozotocin으로 유도한 당뇨 동물모델에 열수 추출로 얻은 측백엽 추출물을 28일 동안 매일 100 및 200 mg/kg의 양을 먹인 결과, 당뇨 대조군 동물에 비해 혈당 수치와 혈중 very low density lipoprotein(VLDL) 및 low density lipoprotein(LDL) 콜레스테롤 수치가 감소한 것으로 나타났다. 하지만 이 연구에서 당질 및 지질대사와 밀접하게 관련된 인슐린 및 아디포넥틴의 농도가 측정되지 않은 제한점이 있다.

인슐린은 혈당 증가에 따라 췌장의 베타세포에서 분비되어 근육 및 간으로 당을 유입하고 간에서의 당신생과정(gluconeogenesis)을 억제하며 지방 조직에서는 지방생합성(de novo lipogenesis)을 촉진한다(Choi, 2009). 인슐린 저항성(insulin resistance)은 제2형 당뇨병의 병인으로 잘 알려져 있으며 고혈당 및 이상지혈증의 결과를 초래한다. 아디포넥틴은 지방세포에서 분비되는 아디포카인(adipokine)의 일종으로 인슐린 감수성(insulin sensitivity) 조절에 기여함으로써 인슐린 저항성과 연관된다(Park, 2005). 이에 측백엽 섭취로 인한 당질 및 지질대사의 변화가 인슐린 저항성 및 인슐린 감수성의 변화로 인한 것인지 평가할 필요가 있다. 본 연구에서는 당뇨를 유도하지 않은 정상 동물에서 측백엽 추출물이 혈중 인슐린, 아디포넥틴, 당질 및 지질대사의 생리적 지표, 염증인자 및 간 기능 검사 지표에 어떤 영향을 미치는지 분석하고자 했다.

측백엽 추출물

측백엽은 경상남도에서 재배된 것을 경남생약농협협동조합으로부터 구매하여, 100 g을 분쇄한 후 1 L의 에탄올을 사용하여 상온에서 48시간 동안 침지하였다. 침지액을 20 μm의 여과지로 여과한 후 여과액을 감압농축(n-1300, Sunil Eyela)하여 초저온 냉동고(-70°C 이하)에 1시간 냉동 보관한 후, 동결건조(FDU-2110, Sunil Eyela)하여 분말 형태로 제조하였다. 추출수율(동결건조 후 건물 중량/원료 건물량의 비율 %)은 5.4%로 나타났다. 제조된 추출물은 -70°C에서 보관하면서 실험 시료로 사용하였다.

동물실험

24주령의 당뇨가 유도되지 않은 Sprague Dawley 수컷 백서(Central Lab. Animal Inc.) 19마리를 실험군(n=10)과 대조군(n=9)에 무작위로 배치하였다. 본 실험에서 당뇨가 유도된 실험동물을 사용하지 않은 이유는 당뇨 유도 방법에 따라 혈중 아디포넥틴 농도가 다르게 나타나며, 고인슐린혈증 상태가 유도되면 아디포넥틴 발현이 억제되므로(Jung과 Park, 2004) 아디포넥틴의 일차적인 역할인 인슐린 감수성을 조절하는 역할이 제한될 수 있기 때문이다.

실험군에는 측백엽 에탄올 추출물 12 mg/kg을 3 mL의 생리식염수에 녹여 24주 동안 매일 일정한 시각에 경구투여하였으며, 대조군은 동일한 양의 생리식염수를 투여하였다.

동물 사육실 조건은 항온(22±1°C), 항습(50±10%) 및 12시간 간격의 일정한 광주기를 유지하였다. 식이(Teklad 2018, Envigo)와 물은 실험 기간에 자유롭게 섭취(ad libitum)하도록 하였다. 체중은 일주일에 한 번 일정한 시각에 측정하였으며, 24주간 실험 후 24시간 동안 절식시킨 다음 흡입마취하여 심장 채혈하였고, 채혈한 전혈과 혈장은 -70°C에서 보관하였다. 본 동물실험은 국민대학교 동물실험윤리위원회의 심의 승인(KMU-2020-04)되었다.

생리 지표 분석

채혈한 혈장 혹은 혈청 내 인슐린, 아디포넥틴, tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) 농도는 ELISA kits(Mercodia; R&D System) 및 분광광도계(SpectraMax 190)를 이용하여 분석하였고, high-sensitivity C-reactive protein(hs-CRP)과 aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), alkaline phosphatase(ALP) 등의 간기능검사 지표, 총빌리루빈, 혈당, 총콜레스테롤, high-density lipoprotein(HDL) 콜레스테롤, 중성지방 등은 Cobas c502 Analyzer(Roche Diagnostics)를 이용하여 분석하였다.

통계처리

본 연구에서 모든 자료의 처리 및 분석은 SAS 프로그램(SAS 9.4, SAS Institute)을 사용하였으며, 양측검정 0.05 수준에서 통계적 유의성을 평가하였다. 군 각각의 분석값은 평균과 표준편차로 나타냈으며, 두 군간 분석값의 비교는 t-test 방법을, 각 군 내에서 생리 지표 간의 상관관계는 Spearman’s rank 분석법을 이용하였다. 상관관계 분석에서 상관관계 계수 및 편상관관계(partial correlation) 계수를 구하였다. 아디포넥틴이 지방조직에서 분비되므로 그 농도가 체중의 영향을 받고, 인슐린 농도는 혈당의 영향을 받으므로 48주째 최종 체중과 혈당 수치를 보정할 필요가 있어 편상관관계 분석을 추가하였다.

체중 비교

Table 1은 실험군 및 대조군 각각에 포함된 백서의 체중 평균값을 나타낸다. 군 간의 체중 차이가 당질 및 지질대사 지표의 차이를 초래할 가능성이 있으므로 3회 측정한 체중을 비교하였다. 실험 시작 시점인 24주령, 실험 기간 중간 시점인 36주령, 실험 종료 시점인 48주령의 체중은 실험군과 대조군 사이에서 유의한 차이가 없었다.

Table 1 . Comparison of the body weight of rats between an experimental group administered with Platycladus orientalis leaf extract and a control group.

	Age	Experimental group (n=10)	Control group (n=9)	P-value1)
Baseline body weight (g)	24 weeks	543.5±33.9	555.6±36.6	0.46
Midpoint body weight (g)	36 weeks	630.6±36.1	637.4±58.8	0.76
Endpoint body weight (g)	48 weeks	632.9±37.1	653.6±65.9	0.40

Data are presented as mean±standard deviation..

¹⁾t-test was used..

당대사 및 지질대사 지표 비교

Table 2는 실험군과 대조군의 당질 및 지질대사 지표값을 비교한 결과이다. 즉, 측백엽 추출물 투여가 당질 및 지질대사 지표를 어떻게 변화시켰는지를 평가하고자 두 군 백서의 혈액에서 분석한 생리 지표의 농도를 비교하였다. 그 결과, 실험군은 대조군에 비해 혈중 아디포넥틴 농도가 평균 23%가량 유의적으로 높게 나타났고(P<0.05), 혈당은 평균적으로 14%가량 낮게 나타나(P=0.06) 경계성 수준(P<0.10)의 유의성(borderline statistical significance)이 확인되었다. 혈중 인슐린, 총콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, 중성지방 농도는 실험군과 대조군 사이의 유의적인 차이가 없었다.

Table 2 . Comparison of biomarkers of glucose and lipid metabolism in blood between an experimental group administered with Platycladus orientalis leaf extract and a control group.

Biomarkers	Experimental group (n=10)	Control group (n=9)	P-value1)
Fasting glucose (mg/dL)	171.7±11.5	195.8±32.1	0.06
Fasting insulin (ng/mL)	0.60±0.35	1.13±1.53	0.33
Adiponectin (ng/mL)	14,241.0±3,033.2	11,531.7±1,765.4	0.03
Total cholesterol (mg/dL)	105.6±16.4	112.2±29.7	0.55
HDL cholesterol (mg/dL)	63.0±10.6	63.7±16.9	0.63
Triglyceride (mg/dL)	89.8±20.5	99.7±37.9	0.48

HDL, high-density lipoprotein..

Data are presented as mean±standard deviation..

¹⁾t-test was used..

간기능 검사 지표 및 염증성 지표 비교

측백엽 추출물 투여의 독성 여부를 평가하기 위해 혈중 간 기능 검사 지표 및 염증성 지표 농도를 분석하였다. Table 3에 나타난 바와 같이 간 기능 지표인 AST, ALT, ALP 및 총빌리루빈 농도와 염증성 지표인 IL-1β, TNF-α, hs-CRP 농도를 실험군과 대조군 간 비교한 결과, 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

Table 3 . Comparison of biomarkers of liver function and inflammatory parameters in blood between an experimental group administered with Platycladus orientalis leaf extract and a control group.

Biomarkers	Experimental group (n=10)	Control group (n=9)	P-value1)
AST (IU/L)	265.8±73.3	376.1±219.6	0.18
ALT (IU/L)	106.0±60.8	209.8±173.4	0.12
ALP (IU/L)	4.7±2.4	5.9±2.5	0.30
Bilirubin (mg/dL)	0.06±0.05	0.07±0.05	0.49
Interleukin-1β (pg/mL)	5.86±3.91	7.27±5.32	0.51
TNF-α (pg/mL)	2.44±1.02	2.68±1.10	0.63
Hs-CRP (mg/L)	0.10±0.16	0.09±0.10	0.79

AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; TNF-α, tumor necrosis factor-alpha; Hs-CRP, high-sensitivity C-reactive protein..

Data are presented as mean±standard deviation..

¹⁾t-test was used..

아디포넥틴과 생리 지표 사이의 상관성

측백엽 추출물 투여로 인해 차이가 나타난 아디포넥틴 농도가 어떤 생리 지표에 영향을 미쳤는지를 평가하기 위해, 실험군과 대조군 각각에서 혈중 아디포넥틴과 다른 생리 지표 간의 상관관계를 분석하였고 그 결과가 Table 4에 나타난 바와 같다. 실험군에서 혈중 아디포넥틴 농도는 AST 및 ALT와 유의적인 음의 상관관계(P<0.05)를 나타냈다. 대조군에서는 혈중 아디포넥틴과 ALP 농도가 양의 상관관계(P<0.05)를 나타냈다.

Table 4 . Correlations between blood levels of adiponectin and other biomarkers in experimental and control rats.

Biomarkers vs adiponectin	Experimental group (n=10)		Control groups (n=9)
	Spearman’s Rho	P-value1)	Spearman’s Rho	P-value
Fasting glucose	0.59	0.08	0.19	0.62
Fasting insulin	−0.60	0.07	0.64	0.06
Total cholesterol	0.19	0.60	0.60	0.09
HDL cholesterol	0.21	0.56	0.42	0.26
Triglyceride	−0.60	0.07	0.10	0.80
AST	−0.73	0.02	0.65	0.06
ALT	−0.67	0.03	0.47	0.21
ALP	0.42	0.22	0.72	0.03
Bilirubin	0.12	0.74	0.18	0.65
Interleukin-1β	−0.30	0.91	−0.63	0.07
TNF-α	−0.49	0.40	0.33	0.38
Hs-CRP	0.55	0.10	0.55	0.12

HDL, high-density lipoprotein; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; TNF-α, tumor necrosis factor-alpha; Hs-CRP, high-sensitivity C-reactive protein..

¹⁾Spearman’s rank correlation analysis was used..

Table 5는 실험동물의 최종 체중 및 혈당치를 보정한 상태에서 혈중 아디포넥틴과 다른 생리 지표 간의 상관관계를 분석한 결과이다. 실험군에서 혈중 아디포넥틴 수치가 인슐린, 중성지방, AST 수치 및 IL-1β와 유의적인 음의 상관관계(P<0.05)를 나타냈다. 반면, 대조군에서는 혈중 아디포넥틴과 AST 농도 사이에 양의 상관관계(P<0.05)를 나타냈다.

Table 5 . Partial correlations between blood levels of adiponectin and other biomarkers in experimental and control rats.

Biomarkers vs adiponectin	Experimental group (n=10)		Control groups (n=9)
	Spearman’s Rho	P-value1)	Spearman’s Rho	P-value
Fasting insulin	−0.75	0.03	0.72	0.07
Total cholesterol	−0.08	0.86	0.60	0.15
HDL cholesterol	−0.07	0.87	0.41	0.36
Triglyceride	−0.86	0.007	0.07	0.89
AST	−0.79	0.02	0.76	0.04
ALT	−0.54	0.17	0.57	0.18
ALP	0.37	0.37	0.73	0.06
Bilirubin	0.09	0.84	0.26	0.57
Interleukin-1β	−0.73	0.04	−0.71	0.07
TNF-α	−0.45	0.27	0.31	0.50
Hs-CRP	0.60	0.11	0.52	0.23

HDL, high-density lipoprotein; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; TNF-α, tumor necrosis factor-alpha; Hs-CRP, high-sensitivity C-reactive protein..

¹⁾Partial correlation analysis controlling for weight at 48 weeks and fasting glucose was used..

아디포넥틴과 간기능 검사 지표 사이의 관계

실험군과 대조군 각각에서 혈중 아디포넥틴과 AST 농도 사이의 관계를 산포도와 추세선으로 나타냈다(Fig. 1). 실험군에서는 강한 음의 상관관계를 나타내는 추세선이 관찰된 반면, 대조군에서는 양의 상관관계를 나타내는 추세선이 관찰되었다.

Fig 1. Scatter plots and trend lines for the relationship between blood levels of aspartate aminotransferase and adiponectin in the control and experimental groups. Filled circles indicate data for experimental rats and open circles for control rats. A solid line indicates a trend line for experimental rats and a dashed line for control rats. AST, aspartate aminotransferase.

본 연구에서 측백엽 에탄올 추출물 12 mg/kg/d를 실험군 백서에 24주 동안 경구 투여한 결과, 대조군에 비해 혈중 아디포넥틴 농도가 평균적으로 23%가량 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 혈당은 대조군에 비해 실험군에서 평균적으로 14%가량 경계성 수준의 유의성으로 감소한 결과를 나타냈다. 각 군에서 48주째의 체중 및 공복 혈당치를 보정한 후 상관관계를 분석한 결과, 실험군에서만 혈중 아디포넥틴 농도는 인슐린 및 중성지방, IL-1β, 간기능 검사 지표인 AST 농도와 유의적인 음의 상관관계를 나타냈다. 이러한 결과는 측백엽 추출물이 인슐린 감수성을 증가시켜 당질 및 지질대사에 유리한 영향을 미친 것으로 해석된다.

1995년 이후로 항당뇨 효과를 나타내는 식물에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔고, 우리나라에서 자라는 식물 중 화살나무잎, 두충나무잎, 명월초, 쇠뜨기 등이 항당뇨 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Chan 등, 2012). 국립생물자원관(National Institute of Biological Resources, 2023)의 정보에 의하면 측백나무는 정선, 영월, 단양, 대구, 안동, 영양 등에 자생하며, 그 약용 효과는 잎과 열매를 중심으로 보고된 바 있다(Rajpurohit 등, 2022). 측백엽의 혈당 저하 효과는 드물게 연구되어 Dash 등의 연구(2014)에서만 관련 결과가 보고된 바 있다. 독성이 없을 것으로 평가된 측백엽 열수 추출물 100 mg/kg/d 및 200 mg/kg/d를 28일 동안 매일 당뇨 실험군에게 먹인 결과, 용량에 상관없이 유의한 혈당 감소 효과가 나타났다. 비록 정상 동물 및 혈당 치료제를 먹인 당뇨 동물모델의 혈당만큼 감소하진 않았지만, 혈당 치료제를 먹이지 않은 당뇨 대조군에 비해 측백엽 추출물을 먹인 두 군 모두에서 평균 혈당이 거의 1/2로 감소하였고, 간 기능을 반영하는 효소인 ALT, AST, ALP 등이 감소하였다. 또한 측백엽 추출물 섭취로 VLDL 및 LDL 콜레스테롤 수치가 감소하였고, 특히 200 mg/kg을 먹인 실험군은 평균 LDL 콜레스테롤 수치가 당뇨 대조군에 비해 1/2로 감소한 결과를 나타냈다(Dash 등, 2014). 이러한 결과는 인슐린 저항성 혹은 인슐린 감수성 개선의 결과로 추측되는데, 앞선 연구에서는 혈중 인슐린과 인슐린 감수성을 나타내는 아디포넥틴이 분석되지 않았다.

당뇨병의 병인으로 여겨지는 인슐린 저항성은 고혈당을 초래할 뿐만 아니라, 지방 조직의 유리지방산 분해 증가로 간에서 다량의 VLDL이 생성되어 혈중 VLDL 수치가 높아지게 된다. 또한 인슐린 저항성으로 인한 cholesterol ester transfer protein 활성화로 콜레스테롤 대신 중성지방이 풍부해진 HDL이 생성되고 hepatic lipase의 작용으로 HDL 수치는 낮아지는 반면, 작고 밀도가 높은 LDL 수치는 증가하는 이상지혈증이 나타난다(Choi, 2009). 생체 조직, 특히 근육과 간이 인슐린에 반응하는 정도를 인슐린 감수성이라고 하는데, 인슐린 감수성이 낮은 근육 조직은 일정 수준의 혈당을 낮추려면 상대적으로 더 많은 인슐린이 필요하다. 한편 지방 조직에서 분비되는 아디포넥틴, 렙틴(leptin), 레지스틴(resistin), TNF-α, IL-6 등과 IL-1β가 유도하는 케메린(chemerin)을 아디포카인이라고 한다(Kralisch 등, 2009; Park, 2005). 아디포카인은 인슐린 감수성에 영향을 미치는데, 주로 아디포넥틴은 간에서 당과 지방 생산을 억제하고 근육 조직에서 지방산 산화를 촉진함으로써 인슐린 감수성을 높이는 바람직한 영향을 미친다(Park, 2005).

본 연구 결과에서 체중과 공복 시 혈당 수치를 보정한 상태에서 측백엽을 섭취한 실험군의 혈중 아디포넥틴 수치는 인슐린, 중성지방, AST, IL-1β 농도와 유의한 음의 상관관계를 나타냈는데, 이는 인슐린 감수성, 특히 간 조직에서의 인슐린 감수성을 나타낸 것으로 해석된다. 또한 대조군에 비해 실험군에서 증가한 아디포넥틴 농도가 관찰된 것은 측백엽 내 성분이 직접적으로 아디포넥틴 생산을 촉진한 것으로 여겨지는데, 아디포넥틴 생산 증가는 아디포넥틴 유전자인 ADIPOQ의 발현이 상향 조절된 결과로 추측된다. 이전 연구(Flachs 등, 2006)에서 오메가-3계 다불포화지방산인 eicosapentaenoic acid 및 docosahexaenoic acid 섭취가 ADIPOQ 발현을 자극하여 직접적으로 아디포넥틴 생산을 증가시킨 결과를 보고했는데, 측백엽 내 성분, 특히 정유(essential oil) 성분이 이와 같은 유사한 작용을 했을 것으로 여겨진다. 본 연구에서는 Dash 등의 연구(2014)에서 사용한 측백엽 추출물 투여 용량의 10%가량에 해당하는 소량을 정상 실험동물에게 장기간 투여하여 향상된 인슐린 감수성을 관찰하였다. 대조군에 비해 실험군에서 낮거나 유사한 간 기능 검사 지표 수치가 관찰된 결과는 사용한 용량과 장기간의 투여가 간에 해로운 영향을 미치지 않은 것을 시사한다.

측백엽은 정유 성분인 모노테르펜(monoterpene) 및 디테르펜(deterpene)과 함께 플라보노이드, 리그난 등의 여러 가지 활성 성분을 포함한다(Rajpurohit 등, 2022). 모노테르펜은 혈당을 감소시키는 항당뇨 효과가 있다고 제의된 바 있고(Habtemariam, 2018), 모노테르펜인 camphene은 아디포넥틴의 생산을 촉진하는 것으로 보고된 바 있다(Kim 등, 2014). 본 연구에서 나타난 측백엽의 인슐린 감수성 향상 효과가 모노테르펜과 같은 정유 성분 때문인지를 추후 연구에서 구명할 필요가 있다.

본 연구 결과를 해석할 때 고려할 점은 당뇨가 없는 정상 동물모델에서 도출된 결과이므로 당뇨가 유도된 동물모델에서는 다른 결과가 도출될 수 있다. 추후 연구에서 측백엽 추출물이 이미 발생한 당뇨의 병태생리에 어떤 영향을 미칠지 연구되어야 할 것이며, 인간대상 연구에서 혈당 개선을 위한 건강기능식품 소재로서의 유효성 및 안전성이 심도 있게 평가되어야 할 것이다.

본 연구는 당뇨가 없는 정상 동물모델 19마리(24주령)를 실험군(n=10) 및 대조군(n=9)에 무작위로 할당하여 실험군에는 측백엽 에탄올 추출물 12 mg/kg을 식염수에 녹여 매일 경구 투여하여 24주 동안 지속하였고 대조군에는 식염수만 동일한 기간에 경구 투여하였다. 실험 종료 시 혈액을 채취하여 당질 및 지질대사 지표와 간 기능 및 염증성 지표를 분석 비교한 결과, 실험군은 대조군에 비해 혈중 아디포넥틴 농도가 평균적으로 23%가량 유의적으로 높게 나타났고(P<0.05), 혈당은 평균적으로 14%가량 낮게 나타나(P=0.06) 경계성 수준(P<0.10)의 유의성이 확인되었다. 각각의 군에서 동물모델의 체중 및 혈당치를 보정한 후 생리 지표 간에 상관관계를 분석한 결과, 실험군에서는 혈중 아디포넥틴 농도가 인슐린 및 중성지방, IL-1β, 간 기능 검사 지표인 AST 농도와 유의적인 음의 상관관계(P<0.05)를 나타냈고, 대조군에서는 혈중 아디포넥틴 농도가 AST 농도와 유의적인 양의 상관관계(P<0.05)를 나타냈다. 이러한 결과는 측백엽 추출물이 인슐린 감수성을 반영하는 아디포넥틴의 생성을 촉진한 것으로 추측되므로 혈당 개선을 위한 기능성 소재로서의 활용 가능성을 보였다.

이 논문은 2022년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(NRF-2019R1A2C2084000).