배나무속(Pyrus spps.)은 장미과에 속하는 목본식물로서 일본배(Pyrus pyrifolia N.)와 서양배(Pyrus communis L.)가 대표적이고, 한국에서는 일본배를 기반으로 하여 신고, 추황, 황금, 원황 등의 다양한 품종으로 개량되어 재배되고 있으며 2022년 25만 톤에 이르는 양이 생산될 정도로 가장 많이 소비되는 과실류의 하나이다. 중국 내 동속의 배나무 열매 10종에 대하여 성분을 분석한 결과 품종에 따른 차이는 있으나 항산화 및 항염증 작용을 하는 생리활성 성분들로서 껍질에는 arbutin이 다량 함유되어 있고, 과육에는 rutin, ferulic acid, p-coumaric acid, ursolic acid 및 chlorogenic acid 등이 공통으로 함유된 것으로 나타났다(Li 등, 2014).

배나무 열매는 알코올 및 대사산물에 의하여 기능의 장애가 발생할 수 있는 신체 주요 기관을 보호하고 숙취해소에 도움을 줄 수 있다(Lee 등, 2012; Wang 등, 2016). 아울러 불용성 식이섬유에 의해 포만감을 줄 뿐만 아니라 장내미생물 군집에 긍정적 영향을 줌으로써 비만을 예방하는 데 기여하고(Chang 등, 2017), 혈중 지질의 농도를 낮추기도 하며(Leontowicz 등, 2003), DNA 손상 억제 및 항암효과가 확인된 바 있다(Yang 등, 2005). Dextran sulfate sodium을 투여하여 대장염을 유발한 마우스에 돌배나무 열매 추출물을 경구 투여한 경우 염증성 사이토카인인 interleukin(IL)-1β와 염증반응의 지표인 myeloperoxidase 활성이 감소하여 대장염 개선 및 치료의 가능성을 보였다(Lee 등, 2021). 특히 배나무 열매 추출물 또는 열매에서 정제한 pectin을 천식이 유발된 마우스에 투여한 경우 알레르기성 천식 증상이 억제되어(Chung 등, 2012; Lee 등, 2004) 기관지 또는 호흡 기능 개선 및 치료 물질로 검토될 수 있다.

염증은 조직의 손상이나 외부로부터의 감염 등으로부터 생체를 보호하고 회복하기 위한 반응으로서 다양한 생리학적 또는 병리학적인 영역에 동반된다(Medzhitov, 2008). 특히 염증이 적절히 조절되지 않거나 만성화되는 경우 비만, 만성폐쇄성폐질환, 천식, 신경질환 등 다양한 질환의 원인이 될 수 있어(Nathan과 Ding, 2010) 염증의 억제나 예방 효과를 가지는 소재 발굴을 위한 다양한 연구가 진행되어 왔다. 병원성 미생물의 세포막에 일반적으로 존재하는 지질다당류 성분인 lipopolysaccharide(LPS)를 이용하여 대식세포를 자극하는 것은 대표적인 자연면역(innate immunity) 및 염증 유발 모델로서 일반화되었다(Page 등, 2022). LPS에 의해 유도된 대식세포는 phagocytic 반응과 관련된 산화질소(nitric oxide, NO) 생성을 위해 inducible nitric oxide synthase(iNOS)를 생산하고(Aktan, 2004), 염증반응 시 발열과 통증 등을 유발하는 prostaglandin 생산에 직접적으로 관여하는 cyclooxygenase-2(COX-2) 등의 생산이 증대된다(Kapoor 등, 2005). 또한, 대식세포는 백혈구가 관여하는 면역 및 염증반응 활성화를 위해 IL-1β, IL-6, tumor necrosis factor(TNF)-α 등의 신호 전달 물질인 cytokines를 분비함으로써 체내 염증반응을 조절한다(Fujiwara와 Kobayashi, 2005). 염증반응에서 이들 물질은 mitogen-activated protein kinases(MAPKs) 경로 내 extracellular signal-regulated kinase(ERK), c-Jun N-terminal kinase(JNK), p38 등 단백질의 인산화에 의해 활성화되고(Zong 등, 2012), LPS로 자극된 대식세포에서 염증반응 조절 효과에 관한 연구의 일반적인 지표로 활용되고 있다.

따라서 농업현장에서 적과되어 폐기되는 배 미숙과(immature pear flesh, IPF)에 대하여 염증 억제 효능 등 다양한 임상적 효과가 검증된다면 농가와 산업체 양측 모두에서 부가가치 창출이 가능할 것으로 기대하여 LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 배 미숙과 추출물(immature pear extract, IPE)의 항염증 효과를 확인하는 연구를 수행하였다.

시료 추출 및 제조

미숙과는 완전히 익지 않은 열매로서 포괄적인 개념이나 본 연구에서는 과실의 착생수가 과다하여 솎아내는 것으로 정의하였다. 본 연구에 사용한 시료는 배나무(Pyrus pyrifolia Nakai)의 신고 품종 열매로서 2022년 경상남도 진주시 소재 농가로부터 만개일로부터 약 45일이 지난 후 적과하여 솎아낸 IPF와 정상 재배하여 출하된 배 완숙과(mature pear flesh, MPF)를 구입하였고 사용하기 전 냉동 보관하였다. IPE는 IPF 중량의 5배 부피비의 정제수를 추출용매로 하여 100°C에서 4시간 동안 추출하였다. 추출액은 여과하여 60°C에서 감압농축하였으며, 농축액의 고형분과 말토덱스트린을 3:7의 비율로 혼합하고 분무건조 하여 분말을 얻었다.

총 폴리페놀 함량 분석

총 폴리페놀 함량은 대한민국 건강기능식품공전의 방법에 따라 분석하였다. IPF와 MPF를 분쇄기로 곱게 갈아 균질화하고 각각 칭량하여 50 mL 튜브에 취하였다. 여기에 증류수를 소량 가하고 30분간 초음파 추출한 다음 총부피를 50 mL가 되게 증류수를 첨가하여 시험용액으로 사용하였다. 증류수 7.5 mL에 표준용액, 시험용액을 1 mL씩 취한 후, Folin-Ciocalteu’s phenolreagent(Sigma-Aldrich Co.) 시약 0.5 mL를 가한 후 35% Na₂CO₃(Junsei Chemical Co., Ltd.)를 넣고 혼합하여 암소에서 30분간 방치한 후 760 nm 파장의 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 tannic acid(ChemFaces Biochemical Co., Ltd.)를 사용하여 표준곡선을 작성한 후 폴리페놀 함량을 구하였으며, tannic acid equivalent(μg TAE/g)로 나타내었다.

DPPH(2,2-diphenyl-1-1-picryhydrrazyl) 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Bondet 등의 방법(1997)을 참고하여 측정하였다. IPF와 MPF 각 시료를 분쇄기로 곱게 갈아 균질화한 것을 분석 시료로 하였다. DPPH(Thermo Fisher Scientific Inc.)는 메탄올에 녹여 2 mM 농도로 제조하여 사용하였다. 표준물질로 ascorbic acid(ChemFaces Biochemical Co., Ltd.)를 사용하였으며, 시료 또는 표준용액 20 μL와 DPPH 시약 180 μL를 혼합한 후, 15분간 방치하여 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 표준곡선에 대입하여 구하였으며, ascorbic acid equivalent(mg AAE/g)로 나타내었다.

High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 이용한 arbutin 함량 분석

IPF, MPF 및 IPE에 함유된 arbutin 함량을 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 법으로 분석하였다. 분석 시에는 가변 파장 측정기(variable wavelength detector)가 장착된 HPLC(1200 series, Agilent Technologies Inc.)를 사용하였다. IPF와 MPF를 분쇄기로 곱게 갈아 균질화하여 분석 시료로 하였고, IPE는 분말 그대로를 사용하였다. 시험용액 제조를 위하여 50 mL 용량플라스크에 각 시료를 정밀히 취하고 전처리 용매로서 10 mM KH₂PO₄와 acetonitrile이 98.9:1.1로 혼합된 용매를 25 mL 첨가하여 10분간 초음파 추출하였다. 파쇄 및 균질화된 용액에 다시 전처리 용매를 첨가하여 50 mL 표 선까지 채우고 충분히 흔들어 준 후 0.45 μm membrane filter로 여과하여 분석에 사용하였다. 표준물질로서 arbutin(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 구매하였고 시험용액의 전처리 용매를 사용하여 450 μg/mL의 농도로 제조하였다. 분석 조건으로서 이동상 용매는 전처리 용매와 동일하게 하고 유속 0.8 mL/min, 고정상 온도 30°C, 주입량 10 μL, 자외부 280 nm를 검출파장으로 하였다. 고정상은 Capcellpak C18 UG120(4.6 mm×250 mm, 5 μm, Osaka Soda Co., Ltd.)을 사용하였다.

세포배양

본 실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다. 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(Welgene Inc.)에 10% fetal bovine serum (Welgene Inc.)과 1% penicillin-streptomycin(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 혼합한 배양액을 사용하여 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다.

세포 생존율 측정

IPE의 농도별 투여 시 RAW 264.7 세포의 생존율을 확인하기 위하여 water-soluble tetrazolium(WST) assay를 실시하였다. RAW 264.7 세포를 96-well plate에 최종 농도 5×10⁴ cells/well이 되도록 분주하고 24시간 배양한 후 각 시료를 농도별로 제조하여 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 및 반응 종료 후 세포 생존율 측정을 위해 EZ-CYTOX(Daeillab Service Co., Ltd.)를 사용하였으며, 제조사의 protocol에 따라 측정하였다. 흡광도는 microplate reader(SPECTROstar Nano^®, Chayon Laboratories Inc.)로 측정하였으며, 무첨가군의 흡광도 값을 기준으로 시료를 농도별로 첨가한 군의 상대적인 세포 생존율을 비교하였다.

NO 농도 측정

RAW 264.7 세포를 96-well plate에 1×10⁵ cells/well이 되도록 분주하여 24시간 배양한 다음 상등액을 제거한 뒤 무혈청 배지를 분주하고 시료를 농도별로 제조하여 처리하였다. 시료 처리 1시간 후 1 μg/mL LPS(Sigma-Aldrich Co.)를 처리하여 24시간 배양하였다. 반응 종료 후 상등액을 취하여 시료로 사용하였으며, Griess reagent 시약을 제조하고 이와 1:1로 혼합하여 540 nm 파장의 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite(Sigma-Aldrich Co.)의 농도별 표준곡선을 이용하여 NO의 농도를 구하였다.

단백질 분리 및 western blot 분석

RAW 264.7 세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well이 되도록 분주하여 24시간 배양한 다음 상등액을 제거한 뒤 무혈청 배지를 분주하고 시료를 농도별로 제조하여 처리하였다. 시료 처리 1시간 후 1 μg/mL LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 상등액을 제거한 뒤 cold-PBS(Welgene Inc.)로 2회 세척하고 RIPA lysis buffer(ATTO Co., Ltd.)에 protease/phosphatase inhibitor cocktail(Cell Signaling Technology Inc.)을 첨가하여 단백질을 분리하였다. 각 추출한 단백질은 BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 정량한 다음 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 한 후 PVDF membrane(Merck & Co., Inc.)으로 전이시켰다. 각 membrane은 5% bovine serum albumin에 넣고 1시간 동안 좌우 교반하여 반응시킨 후, 1차 항체 iNOS, COX-2(ABclonal Science Inc.), ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38(Cell Signaling Technology Inc.)을 4°C에서 12시간 동안 반응시켰다. Tris buffered saline with Tween 20(TBST, TransLab Co.) 용액으로 세척한 후, 2차 항체는 goat anti-rabbit IgG(TransLab Co.) 또는 goat anti-mouse IgG(TransLab Co.)로 실온에서 1시간 30분 반응시켰다. 이후 TBST로 3번 세척 후 이미지 분석장비(Chemi Doc^TM Imaging Systems, Bio-Rad Laboratories Inc.) 및 전용 프로그램(Image Lab, ver. 4.0, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용하여 단백질의 양을 확인하였다. 단백질의 양을 비교하기 위하여 이미지 프로그램(ImageJ 1.54d, NIH)을 이용하여 수치화하였다.

Pro-inflammatory cytokine(IL-1β, IL-6, TNF-α) 측정

염증성 사이토카인은 단백질 측정과 같은 방법으로 세포를 배양한 후 각 well에서 세포 배양액을 회수하였다. 수거한 상등액은 측정 전까지 -70°C에서 보관하였고, mouse IL-1 beta ELISA kit, mouse IL-6 ELISA kit(ABclonal Science Inc.), mouse TNF-α ELISA kit(R&D Systems Inc.)을 사용하여 측정하였으며, 각 cytokine 함량은 표준물질의 반응으로부터 얻어진 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 실시하여 각 측정값의 평균과 표준편차를 산출하고 그룹 간의 차이는 SPSS 26 for Windows(IBM Co.) 프로그램을 이용하여 Mann-Whitney U test 또는 Duncan’s multiple range test with one-way ANOVA로 유의확률 5% 수준에서 검정하였다.

IPF와 MPF의 총폴리페놀 함량 및 DPPH 소거능 비교

폴리페놀은 식물의 대사산물 중에 가장 많이 존재하며 동물이나 사람이 반드시 섭취해야 하는 물질군으로서(Bravo, 1998), 페놀산, 플라보노이드, 이소플라본, 네오플라보노이드, 플라보놀, 안토시아닌 등의 하위 그룹으로 분류된다(Tsao, 2010). 폴리페놀은 다양한 연구에서 면역 조절 역할 및 그 기전이 잘 입증되어 염증성 질환의 예방과 치료에서의 역할이 중요할 수 있다(Yahfoufi 등, 2018). 폴리페놀이 풍부한 식품을 섭취하는 것은 생체 내 효소 활성과 세포 증식 및 신호 전달 경로 등의 다양한 생리적 과정 조절에 도움이 되며(Luca 등, 2020), 심혈관 및 뇌 기능 증진 등 건강상 이점이 기대되고 있다(Fraga 등, 2019). 폴리페놀과 그 대사산물은 장내미생물 군집의 균형을 조절함으로써 장 건강을 유지하는 데 도움을 주기도 한다(Cardona 등, 2013).

IPF의 총폴리페놀 함량은 946 μg TAE/g으로 MPF의 264 μg TAE/g보다 약 3.6배 높은 수치로 분석되었다(Fig. 1). 이는 배나무의 열매가 성장하면서 수분의 함량이 높아져 단위 중량당 성분 함량은 낮아지는 것으로, 성장 과정에서 생리활성 성분이 비례하여 증가하지 않는 것으로 해석된다. 따라서 폴리페놀과 그 대사산물을 목적 물질로 하는 원료 또는 제품 제조 시 효율을 검토하기 위해서는 가장 높은 함량을 보이는 시기가 추가로 확인되어야 할 것이다. 자유라디칼로서 DPPH를 사용하여 이를 제거하는 활성을 측정하는 것은 항산화능을 확인하는 주요한 방법으로 사용되고 있으며(Mishra 등, 2012), IPF는 1.718 mg AAE/g으로 MPF의 0.819 mg AAE/g보다 약 2배의 활성을 보였다(Fig. 2). 폴리페놀과 마찬가지로 성숙한 과실에 수분의 함량이 비교적 높아진 것이 그 원인으로 사료된다. 상기의 결과로부터 적과로 솎아내는 IPF에 생리활성 및 항산화 성분이 비교적 많이 함유되어 있으므로 단일성분 동정 및 효능 연구가 추가로 수행된다면 기능성 식품과 제약 산업에서 유의미한 원료가 될 것으로 기대된다.

Fig 1. Comparison of total polyphenol content in IPF and MPF. IPF is harvested 45 days after full bloom, and MPF is mature fruit. Each sample was pulverized and analyzed by an official test method. Measurements are expressed as mean and standard deviation. IPF, immature pear fresh; MPF, mature pear fresh; TAE, tannic acid equivalent. ^*P<0.05 is the comparison between IPF and MPF by Mann-Whitney U test.

Fig 2. Comparison of DPPH scavenging activity in IPF and MPF. IPF is harvested 45 days after full bloom, and MPF is mature fruit. Each sample was pulverized and analyzed. Measurements are expressed as mean and standard deviation. IPF, immature pear fresh; MPF, mature pear fresh; AAE, ascorbic acid equivalent. ^*P<0.05 is the comparison between IPF and MPF by Mann-Whitney U test.

IPF, MPF 및 IPE의 arbutin 함량

Arbutin(CAS No. 497-76-7)은 분자량 272.25 g/mol의 하이드로퀴논과 D-포도당의 화합물로서 뛰어난 항산화 작용으로 멜라닌 합성을 억제하여 피부 미백을 유지하는 데 도움이 되고(Boo, 2021), 방사선에 의한 세포 사멸과 염증 억제 등의 보호효과가 있으며(Sadeghinezhad 등, 2022), 우리나라를 비롯한 많은 국가에서 기능성 화장품의 원료로 사용되고 있다. 이외에도 유방암, 간암, 전립선암 및 피부암 등을 억제하고(Nahar 등, 2022), 항염증 효과에 의해 급성 신장 질환을 개선할 수 있으며(Zhang 등, 2021), 장내미생물 군집에 유익한 변화를 주기도 한다(Ma 등, 2022). Arbutin의 다양한 활용을 위하여 산업용은 화학적 합성에 의존하고 있으나 작업이 복잡하고 품질에 관한 문제가 있어 효율이 높은 미생물 발효에 의한 생합성 공정 개발을 위해 노력하고 있다(Xu 등, 2022). 배 열매는 성장에 따라 페놀성분과 arbutin 함량이 감소하므로(Zhang 등, 2007) 적과되어 폐기되는 미숙과의 활용은 유용물질의 자원화에 기여할 수 있으며, 특히 arbutin은 IPF 및 IPE에 대한 품질관리의 지표로 활용할 수 있어 함량 정보가 유의미할 것으로 생각된다.

MPF의 arbutin 함량은 0.052 mg/g이었고, IPF는 MPF의 약 42배인 2.219 mg/g으로 분석되었다. 이는 배나무 열매가 성장하는 단계 중 특정 시기를 기점으로 성분의 축적보다 수분의 함량 증가가 두드러지는 것으로 이해할 수 있다. IPE의 arbutin 함량은 10.466 mg/g으로 IPF 중량 대비 수득률이 약 19%인 것을 감안하면 추출 등 제조과정에서의 손실은 없는 것으로 사료된다. HPLC 분석 시 arbutin의 머무름시간은 10~11분이고, 표준물질과 IPE의 해당 피크에 대한 UV 스펙트럼의 동질성이 확인되었다(Fig. 3).

Fig 3. Chromatograms of MPF, IPF, IPE, and arbutin standard analyzed by HPLC. (A) Analytical chromatogram of IPF and has a retention time of 10.620 min. (B) Analytical chromatogram of MPF and has a retention time of 10.600 min. (C) Analytical chromatogram of IPE and has a retention time of 10.486 min. (D) Analytical chromatogram of arbutin standard and has a retention time of 10.509 min. The upper right graphs of (C) and (D) are the UV spectra of the peak corresponding to arbutin. IPF, immature pear fresh; MPF, mature pear fresh; IPE, immature pear extract.

IPE가 RAW 264.7 대식세포의 생존율에 미치는 영향

IPE가 세포시험계에 미치는 독성을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에 최대 500 μg/mL 농도로 처리한 후 WST assay를 실시하여 세포의 생존율을 비교하였다. 모든 농도의 시료 처리군에서 정상군 대비 세포 생존율의 유의한 변화 없이 유사한 수준으로 관찰되었다(Fig. 4).

Fig 4. Viability of RAW 264.7 macrophages following IPE treatment. RAW 264.7 macrophages were cultured for 24 h, treated with IPE at each concentration, and then cultured for 24 h to perform the WST assay. Measurements were expressed as percentage mean and standard deviation based on the IPE untreated group. Each groups were evaluated at the significance probability level of 0.05 by Duncan’s multiple range test with one-way ANOVA, and there was no statistically significant result. IPE, immature pear extract.

이로부터 RAW 264.7 세포에 대하여 IPE의 독성이 발현되는 것은 500 μg/mL의 농도를 상회함을 의미하므로 이후의 시험에서는 500 μg/mL를 최대농도로 하였다.

IPE의 NO 생성 억제 효과

NO는 면역 및 염증과 관련된 다양한 세포에서 생성되고 감염성 유기체에 의한 독성을 방어하는 물질로서 작용하기도 한다(Coleman, 2001). 그러나 과잉 생성될 경우 바람직하지 않은 염증을 유도하는 매개 물질로 작용할 수 있으며, 조직의 손상 등 외부의 자극 및 장애에 의해 정상보다 많은 양이 생성될 수 있다(Sharma 등, 2007). LPS는 대식세포를 자극하여 염증반응을 유발할 수 있는 물질로서 iNOS가 발현되어 NO가 생성되도록 유도한다(Kim 등, 2005).

IPE를 최대 500 μg/mL 농도까지 투여한 RAW 264.7 세포에 염증반응 유도를 위하여 LPS를 처리한 후 NO를 측정하였다. LPS를 처리한 군에서 정상군에 비하여 NO가 유의하게 증가하여 염증반응이 적절히 유도되었음이 확인되었다. LPS와 함께 IPE를 100 μg/mL 처리한 군에서는 NO 생성 정도가 유의한 차이를 보이지 않았으며, 250 및 500 μg/mL를 처리한 군에서는 유의하게 감소하였다(Fig. 5). 따라서 LPS에 의해 과도하게 생성된 NO의 감소는 IPE의 생리활성에 의해 세포 내 염증반응이 억제되고 정상상태로의 회복이 촉진되는 것으로 해석할 수 있다.

Fig 5. NO production inhibitory effect of IPE treatment on RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 macrophages were cultured for 24 h, treated with IPE for 1 h at each concentration, and then treated with LPS and cultured for another 24 h. After the end of the culture, NO in the supernatant was measured. Measurements were expressed as mean and standard deviation. Each groups were evaluated at the significance probability level of 0.05 by Duncan’s multiple range test with one-way ANOVA, and different letters on the bars indicate statistical significant between groups. LPS, lipopolysaccharide; IPE, immature pear extract.

IPE의 iNOS와 COX-2 발현 억제 효과

NOS의 3가지 동형체 중 칼슘(calcium)과 칼모듈린(calmodulin)에 독립적인 형태가 iNOS로서 높은 수준으로 발현되는 경우 염증반응이 증가하고 결합 조직 손상에 관여할 수 있으며(Papi 등, 2019), 타 동형체보다 염증에 가장 크게 관여하는 것으로 알려져 있다(Zamora 등, 2000). iNOS는 면역 세포 외에도 내피세포 및 섬유아세포 등의 비면역 세포에서도 일부 발현될 수 있으며, 병원체의 사멸에 관여할 뿐만 아니라 T 세포 활성 억제와 같은 면역 조절의 역할도 가진다(Xue 등, 2018). COX-2는 염증 및 기타 생리학적 자극 및 성장 인자에 대한 반응으로 발현되어 통증을 매개하고 염증 과정을 지원하는 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생성에 관여하며(Simon, 1999), 다양한 세포에서 LPS 및 cytokines에 의해 생성이 유도될 수 있다(Barrios-Rodiles 등, 1999).

LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 IPE에 의해 세포와 조직에서 염증반응을 매개하는 iNOS와 COX-2가 어떤 변화가 있는지 관찰하였다. LPS에 의해 iNOS와 COX-2의 발현 정도가 정상군에 비하여 유의하게 증가하였다. LPS와 함께 IPE를 100, 250, 500 μg/mL 농도로 투여한 군 모두에서 iNOS의 발현이 유의하게 감소하였다. COX-2는 IPE 250과 500 μg/mL 농도 투여군에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았고, IPE 100 μg/mL 농도 투여군에서는 증가하였으나(Fig. 6) 이보다 고농도 투여 시에는 증가하지 않은 것으로 볼 때 시험계 내의 국소적인 현상인 것으로 사료되므로 염증반응이 증가한 것으로 평가하기에는 무리가 있다. 다만, COX-2의 발현은 아라키돈산(arachidonic acid) 대사경로와 관련되어 있으므로(Wang 등, 2019) 추후 연구에서는 이에 대한 지표를 추가 분석한다면 보다 폭넓은 해석이 가능할 것으로 생각된다. 따라서 IPE는 염증반응에 관여하는 인자 중 COX-2의 발현에는 영향을 주지 않고 iNOS의 발현을 억제하는 경로에 작용하여 항염증 기능성을 나타내는 것으로 판단된다.

Fig 6. Effects of IPE on the expression of iNOS and COX-2 in RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 macrophages were cultured for 24 h, treated with IPE for 1 h at each concentration, and then treated with LPS and cultured for another 24 h. After the end of the culture, the cells were lysed and the protein expression level was measured by western blot analysis. (A and B) Measurements were expressed as percentage mean and standard deviation based on the IPE untreated group. Each groups were evaluated at the significance probability level of 0.05 by Duncan’s multiple range test with one-way ANOVA, and different letters on the bars indicate statistical significant between groups. (C) Each band is a developed image of the expression level of the protein. LPS, lipopolysaccharide; IPE, immature pear extract; iNOS, inducible nitric oxide synthase; COX, cyclooxygenase.

IPE의 염증성 사이토카인 활성 억제 효과

IL-1β는 선천 면역체계에서 생성되는 사이토카인으로서 염증반응의 핵심 매개체로 작용하여(Dinarello, 1996) 감염 및 손상에 대하여 생체 방어에 중요한 역할을 한다(Lopez-Castejon과 Brough, 2011). IL-1β는 미생물뿐만 아니라 비미생물적 분자도 감지하여 외부의 침입

또는 감염 부위에 2차 염증과 관련된 유전자의 발현을 매개 및 활성화한다(Weber 등, 2010). IL-6도 IL-1β와 마찬가지로 염증반응을 매개하여 면역 및 생체 항상성에 기여할 수 있도록 한다(Heinrich 등, 2003). TNF-α는 종양세포의 괴사를 매개하는 역할 외에도 염증반응을 조절하여 생체 항상성이 유지되도록 한다(Zelová와 Hošek, 2013). 그러나 감염 또는 조직 손상에 의한 만성 염증 질환에서 이와 같은 염증성 사이토카인의 과도한 발현은 자가면역질환, 골 및 연골 파괴, 혈관 신생, 다발성 섬유증, 세포의 노화, 발암 등에 크게 관여할 수 있으며(Holbrook 등, 2019; Kang 등, 2015; Kuilman 등, 2008), 면역과 호르몬 등의 변화가 동반되는 노화 과정에서 염증성 사이토카인은 더욱 바람직하지 않은 결과를 초래할 수 있다(Michaud 등, 2013). 따라서 생체 내의 사이토카인의 발현을 적절한 수준으로 유지하는 것이 중요하다.

RAW 264.7 세포에 IPE를 500 μg/mL의 농도까지 투여한 후 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하였고 각 염증성 사이토카인을 측정하였다. LPS만 처리한 군에서는 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α가 정상군 대비 유의하게 증가하였다. IL-1β는 IPE 100 μg/mL 농도 투여군에서 유의한 변화가 없었으나 250, 500 μg/mL 농도 투여군에서는 유의하게 감소하였으며, IL-6와 TNF-α는 100, 250, 500 μg/mL의 농도 투여군 모두 유의하게 감소하였다(Fig. 7). 과도하게 발현된 염증성 사이토카인이 억제되면 만성염증 및 이로 인한 질환의 발생 가능성을 낮출 수 있으므로 IPE는 항염증 소재로서의 활용 가능성이 높은 것으로 사료된다.

Fig 7. Effects of IPE on the expression of inflammatory cytokines in RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 macrophages were cultured for 24 h, treated with IPE for 1 h at each concentration, and then treated with LPS and cultured for another 24 h. After the end of the culture, the cells were lysed and the protein expression level was measured according to the protocol of the kit. Measurements were expressed as mean and standard deviation. Each groups were evaluated at the significance probability level of 0.05 by Duncan’s multiple range test with one- way ANOVA, and different letters on the bars indicate statistical significant between groups. LPS, lipopolysaccharide; IPE, immature pear extract; IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor.

IPE의 MAPKs 경로 조절

세포 내 신호 전달 인자로서 MAPKs 중 ERK, JNK 및 p38은 사이토카인, 호르몬, 산화적 스트레스 등의 자극에 의해 활성화되고 염증성 사이토카인의 활성을 유도하여 염증성 질환을 일으키는 원인이 되기도 하며(Chen 등, 2018), 세포 증식, 분화, 생존, 사멸 등에 관여하여 과발현될 경우 알츠하이머나 근위축성 측삭 경화증 및 다양한 암을 유발할 수 있다(Kim과 Choi, 2010, 2015). MAPKs 활성의 억제는 염증성 사이토카인의 합성과 신호 전달을 감소시킬 수 있기 때문에 항염증 치료의 주요 타겟으로 연구되고 있다(Kaminska, 2005). MAPKs는 세포의 핵 내부로 들어가 nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells(NF-κB) 유전자를 발현시키게 되고 이로부터 염증성 사이토카인의 활성을 조절하지만 NF-κB가 비정상적인 경우에는 자가면역과 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 죽상경화증 등 다양한 염증성 질환을 유발할 수 있다(Barnabei 등, 2021; Liu 등, 2017).

LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 ERK, JNK, p38의 인산화가 촉진되어 활성이 증가하였고, IPE를 250, 500 μg/mL 농도로 투여한 경우 각 인자의 인산화가 유의하게 억제되었다(Fig. 8). p-ERK와 p-JNK는 250 및 500 μg/mL 농도 투여군 간의 유의함은 없었으나 LPS 처리군에 비하여 뚜렷한 발현 감소를 보였으므로 해석에 어려움은 없을 것으로 사료된다. 따라서 IPE는 MAPKs 경로에 관여하여 염증성 사이토카인의 생성 및 활성을 억제하고 항염증 작용을 하는 것을 의미하며, 생체 내에서 기전이 동일하게 확인된다면 각종 염증성 질환 개선 식품이나 치료제 원료로의 개발 가능성이 높을 것으로 사료된다.

Fig 8. Effects of IPE on the expression of MAPKs in RAW 264.7 macrophages. RAW 264.7 macrophages were cultured for 24 h, treated with IPE for 1 h at each concentration, and then treated with LPS and cultured for another 24 h. After the end of the culture, the cells were lysed and the protein expression level was measured by western blot analysis. (A, B, and C) Measurements were expressed as mean and standard deviation for each percentage. Each groups were evaluated at the significance probability level of 0.05 by Duncan’s multiple range test with one-way ANOVA, and different letters on the bars indicate statistical significant between groups. (D) Each band is a developed image of the expression level of the protein. LPS, lipopolysaccharide; IPE, immature pear extract; ERK, extracellular signal-regulated kinase; JNK, jun N-terminal kinase; p38, p38 mitogen-activated protein kinase.

본 연구는 단핵구 또는 대식세포로서 염증과 면역 등에 관여하는 마우스의 RAW 264.7 세포를 이용한 실험모델에서 배 미숙과 추출물(IPE)의 항염증 효과를 확인하기 위하여 실시되었다. 세포독성을 나타내지 않는 범위의 농도로 IPE를 투여한 후 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하였다. LPS는 대식세포를 자극하여 염증반응을 촉진하는 인자를 생성하였고, IPE 투여 시 MAPKs의 인산화가 억제되어 염증성 사이토카인의 발현과 NO의 생성이 감소하는 신호 전달 경로에 작용하는 것으로 확인되었다. 이는 생체 내외의 다양한 원인에 의해 바람직하지 않게 일어나는 과도한 염증반응을 IPE가 조절하여 정상상태로 회복할 수 있도록 함을 의미한다. 따라서 적과되어 폐기되는 배 미숙과를 이용한 추출물에 새로운 가치를 부여하고 항염증 소재로서 제품화에 활용하는 것은 산업적으로 매우 바람직한 일이 될 것이다.

이 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 고부가가치식품기술개발사업의 지원을 받아 연구되었음(122027-2).