발효(fermentation)는 유산균, 효모, 곰팡이 등 유용 미생물을 천연식품에 주입하여 식품 내 기능 성분을 생성 또는 증진시키거나 원료의 활용을 다양화하는 방법으로, 발효가 진행될수록 미생물이 분비하는 amylase, hydrolases, lipase 등의 각종 효소가 활성화되어 다양한 생화학 반응을 유도하게 된다(Bae 등, 2019). 이에 따라 식품 내 성분 조성에 변화가 발생하게 되어 항산화 및 면역 기능 활성화 등 체내 생리조절기능에 도움을 줄 수 있으며, 또한 식품의 맛과 풍미 등 관능적 기호도를 증진시킬 수 있다(Bae 등, 2019; Kang 등, 2021). Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae)는 인체에 대한 안전성을 입증받은 GRAS(generally regarded as safe)급의 효묘균주로 제빵 및 주류 발효에 주로 사용되며 헥산, 효소, 미네랄 등의 생산을 위한 원료로 이용되고 있다(Lee 등, 2009). S. cerevisiae로 커피원두 추출물을 발효하여 염증 유발 인자의 억제능을 측정한 연구에서는 커피 추출물 내 iNOS 및 COX-2 유전자 발현량 저해 등의 항염증 효능이 효모 발효를 통해 더욱 증가한 것을 확인하였다(Park 등, 2023). Bacillus subtilis(B. subtilis)는 주로 콩을 이용한 발효에 사용되는 유익균으로 부패균의 성장을 억제하여 발암 촉진물질의 생성을 저해하고 유기산 생성을 촉진하여 장을 자극함으로써 체내 소화를 돕는다(In과 Lee, 2004). Seo 등(2017)은 B. subtilis 균주를 이용하여 뽕잎을 발효하였을 때 총 유리아미노산 함량 및 항산화 활성이 무발효군에 비해 증가하였으며, 발효과정 중 단백질이 저분자 펩타이드로 분해됨에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였다고 보고하였다. 유산균은 유제품, 김치, 장류 등 다양한 식품의 발효에 사용되는 유용한 미생물로서 대사물질인 lactic acid에 의해 발효 식품 내 pH가 감소하여 미생물 생육을 억제하고 식품의 보존력을 향상시킨다(Kim 등, 2009). 유산균을 이용한 발효 연구로는 골드키위 발효물의 항산화 효능 증진 연구(Ryu 등, 2018), 유산균발효에 의한 현미상황버섯균사체 추출물의 β–glucan 함량 및 주름개선 효과 증진 연구(Kim 등, 2016) 등 다양하게 보고되어 있다. 이처럼 현재 유용 균주들을 통해 다양한 식품을 발효함으로써 식품의 기능성 및 보존력, 영양적 품질 등을 향상시키기 위한 연구들이 활발하게 진행되고 있다.

눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara)는 쌍떡잎식물 장미목 장미과(Rosaceae)의 다년생 초본식물로 한국, 중국 및 일본 내 고산지대에 주로 분포하며 특히 울릉도의 대표적인 산채 자원으로 널리 알려져 있다(Youn 등, 2012). 눈개승마는 주로 삼나물이라는 이름으로 불리며 사포닌을 다량 함유하고 있어 성인병 예방에 도움을 주고 전초의 경우 편도선염 치료, 해독 등의 효능을 지니고 있어 약용으로도 이용된다(Kim 등, 2011b). 또한 눈개승마는 다량의 무기질 및 식이섬유뿐만 아니라 페놀성 화합물, monoterpenoids, salicylaldehyde 등의 생리활성성분이 함유되어 있고(Kim 등, 2015; Kim 등, 2018), 이러한 기능 성분들이 체내 유해 산소를 억제함으로써 면역 증진 및 항산화, 항암 등에 효과를 보인다고 보고되었다(Kim 등, 2013b). 현재 눈개승마 관련 연구로는 뇌신경세포 독성에 대한 보호효과(Park 등, 2017), 흑색종세포의 멜라닌 생성억제로 인한 미백효과(Kim 등, 2013a), 건조방법 따른 항산화 효과(Kim 등, 2018) 등이 보고되어 있으나 대부분 눈개승마를 유기용매 또는 증류수로 추출하여 시료로 사용하였고 유용 미생물을 이용하여 발효를 진행한 연구는 미비한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 생리활성성분이 풍부한 눈개승마를 여러 유용 균주를 이용하여 발효시킨 후 각 발효물의 이화학적 특성 및 항균 활성을 확인하여 새로운 기능성 식품 소재로써 이용 가능성을 탐색하고자 하였다.

사용 균주

눈개승마 발효에 사용된 균주는 B. subtilis KACC 14549, S. cerevisiae KACC 48234, Levilactobacillus brevis(L. brevis) KACC 18270, Lacticaseibacillus casei(L. casei) KACC 12413, Lactiplantibacillus plantarum(L. plantarum) KACC 18510으로 농업유전자원센터(Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양받아 사용하였다. B. subtilis는 nutrient broth(Difco Laboratories), S. cerevisiae는 YM broth(Difco Laboratories), L. brevis, L. casei, L. plantarum은 Lactobacilli MRS broth(Difco Laboratories)에서 24시간 주기로 3회 계대 배양 후 분광광도계(xMark^TM Microplate Absorbance Spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories Inc.)를 이용해서 600 nm에서 흡광도 값이 0.4~0.6(1×10⁵ CFU/mL) 범위 안에 들게 하여 발효 균주로 사용하였다.

눈개승마 발효물 제조

본 실험에 사용한 눈개승마는 강원도 양구군 해안면에서 2022년 5월에 재배한 생채를 구입하여 수세 후 물기를 제거한 것을 50°C의 열풍건조기에서 24시간 건조하였고 열풍건조 된 시료를 -24°C에서 냉동보관하며 실험에 사용하였다. 눈개승마 발효물의 제조는 1.5 L의 증류수에 30 g의 glucose(Junsei Chemical Co., Ltd.)와 7.5 g의 peptone (Difco Laboratories)을 넣고 교반한 뒤 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하여 실온에서 서서히 식힌 다음 건조된 눈개승마 50 g과 미리 활성화한 5종의 발효 균주를 각각 10 mL 주입하였다. B. subtilis(BS), S. cerevisiae(SC)는 30°C, L. brevis(LB), L. casei(LC), L. plantarum(LP)은 37°C에서 24시간 동안 배양한 후 배양액을 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하고 멸균된 배양액을 원심분리기로(LaboGene 416, LaboGene^TM) 원심분리(2,700×g, 10 min)한 뒤 여과(Whatman No. 2, Whatman International Ltd.)하여 동결건조(FD8508, Ilshin Lab Co., Ltd.)시킨 후 -50°C deep freezer(FR-300CW, Daehan CRYO Co.)에 보관하면서 실험에 사용하였다. 눈개승마의 무발효 대조군은 건조 눈개승마 50 g을 1.5 L의 증류수로 실온에서 24시간 추출한 후 원심분리(2,700×g, 10 min) 및 여과(Whatman No. 2)한 다음 동결건조하여 얻은 분말(이하 무발효군)을 사용하였다.

눈개승마 발효물의 수율

동결건조 분말의 수율은 제조한 발효 및 무발효 눈개승마 추출물을 동결건조하여 건조중량을 구한 후 추출물 조제에 사용한 원료 중량에 대한 백분율로 나타내었고 각 시료는 30% 메탄올(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)에 녹여 원하는 농도로 제조한 후 실험에 사용하였다.

사용균주에 따른 눈개승마 발효액의 배양 특성

균주 성장에 따른 발효액의 pH 변화는 24시간 배양 후 멸균된 발효액을 여과(Whatman No. 2)한 다음 pH meter (pH-200L, iSTEK Inc.)를 이용하여 측정하였다. 혼탁도 측정은 24시간 배양 후 멸균 및 여과된 발효액 1 mL를 취해 분광광도계(xMark^TM Microplate Absorbance Spectrophotometer)를 이용해서 600 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 발효 정도를 확인하였다. 생균수 측정은 24시간 배양한 눈개승마 발효액을 멸균수에 희석하여 충분히 혼합한 후 BS, LB, LC, LP는 plate count agar(Difco Laboratories), SC는 potato dextrose agar(Difco Laboratories)에 분주한 다음 각각 37°C, 30°C에서 24~48시간 배양하여 생균수를 측정하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

눈개승마 무발효군 및 발효군(BS, SC, LB, LC, LP)의 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis(1912) 법을 응용하여 측정하였다. 각 시료 40 μL에 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)와 증류수를 1:2(v/v)의 비율로 섞은 혼합액 40 μL를 첨가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후 10% Na₂CO₃(w/v, Duksan Chemical Co.) 용액 600 μL를 섞어 실온에서 1시간 동안 암실에서 반응시키고 분광광도계(xMark^TM Microplate Absorbance Spectrophotometer)를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 표준물질인 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 검량선을 작성한 후 시료 1 g에 대한 mg gallic acid equivalents(GAE)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

눈개승마 무발효군 및 발효군(BS, SC, LB, LC, LP)의 총 플라보노이드 함량 측정은 Zhishen 등(1999)의 방법을 사용하여 측정하였다. 시료 125 μL에 증류수 500 μL와 5% NaNO₂(w/v, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) 37.5 μL를 넣어 섞은 후 실온에서 5분간 방치하였다. 이후 10% AlCl₃･6H₂O(w/v, Junsei Chemical Co.) 75 μL를 넣고 6분간 방치한 다음 1 M NaOH(Daejung Chemical & Metals Co., Ltd.) 250 μL를 가하여 실온에서 11분간 반응시킨 후 분광광도계(xMark^TM Microplate Absorbance Spectrophotometer)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 표준물질로 catechin hydrate(Sigma- Aldrich Co.)를 사용하여 검량선을 작성한 후 시료 1 g에 대한 mg catechin equivalents(CE)으로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 100 μL에 0.2 mM DPPH(Sigma-Aldrich Co.) solution 100 μL를 첨가하여 혼합한 다음 실온의 암실에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계(xMark^TM Microplate Absorbance Spectrophotometer)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 시료 희석용매인 30% 메탄올을 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였고 DPPH 라디칼 소거 활성을 아래의 식을 이용하여 백분율로 나타낸 후 50%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내는 시료의 농도인 IC₅₀(inhibitory concentration)값으로 나타내었다. 양성대조군으로 기존의 항산화제인 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co.)를 사용하여 비교하였으며 DPPH 라디칼 소거 활성은 아래의 식에 따라 산출하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성 측정

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS) 라디칼 소거 활성은 Fellegrini 등(1999)의 방법을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 140 mM K₂S₂O₈(Samchun Pure Chemical Co.) 88 μL에 증류수 5 mL를 가한 후 ABTS diammonium salt tablet(Sigma- Aldrich Co.) 2알을 넣어 실온의 암실에서 12~16시간 동안 방치하고 이를 95% 에탄올(Samchun Pure Chemical Co.)과 1:88(v/v)의 비율로 섞어 분광광도계(xMark^TM Microplate Absorbance Spectrophotometer)를 이용하여 734 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절하여 solution으로 사용하였다. 시료 50 μL에 ABTS solution 1 mL를 가한 후 2분 30초간 실온의 암실에서 반응시킨 다음 분광광도계를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 희석용매인 30% 메탄올을 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였고 ABTS 라디칼 소거 활성을 아래의 식을 이용하여 백분율로 나타낸 후 50%의 소거 활성을 나타내는 시료의 농도인 IC₅₀값으로 나타내었다. 양성대조군으로 기존의 항산화제인 ascorbic acid (Samchun Pure Chemical Co.)를 사용하여 비교하였으며 ABTS 라디칼 소거 활성은 아래의 식에 의해 산출하였다.

FRAP 활성 측정

Ferric reducing antioxidant power(FRAP)는 Benzie와 Strain(1996) 방법을 참고하여 측정하였다. FRAP solution은 300 mM acetate buffer(pH 3.6)와 40 mM HCl(Samchun Pure Chemical Co.)에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2- pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.), 20 mM FeCl₃･6H₂O(Samchun Pure Chemical Co.)를 각각 10:1:1 (v/v/v)의 비율로 섞은 후 37°C의 incubator(650D, Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 10분간 반응시켜 제조한 후 시약으로 사용하였다. 시료 30 μL에 증류수 90 μL와 FRAP solution 900 μL를 넣고 37°C incubator에서 10분간 반응시킨 후 분광광도계(xMark^TM Microplate Absorbance Spectrophotometer)를 이용하여 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP value는 FeSO₄･7H₂O(Samchun Pure Chemical Co.)를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 대입하여 환산하였으며, 시료 1 g에 들어있는 FeSO₄･7H₂O의 M 함량으로 나타내었다.

항균 활성 측정

항균 활성은 각 유해 균주를 대상으로 disc diffusion assay(Bauer 등, 1966)를 통해 측정하였다. 항균 활성 측정에 사용된 균주는 gram positive bacteria인 Bacillus cereus (B. cereus) KCTC 1012, Bacillus subitilis(B. subtilis) KACC 14549, Staphylococcus aureus(S. aureus) KCTC 3881과 Gram negative bacteria인 Escherichia coli(E. coli) KCTC 2441, Enterobacter cloacae(E. cloacae) KCTC 1685, Salmonella enterica Typhimurium(S. Typhimurium) KCTC 2515, Pseudomonas aeruginosa(P. aeruginosa) KCTC 1636의 총 7종을 생물자원센터 및 농업유전자원센터에서 분양받아 사용하였다. 배지는 휴면 상태의 균주들을 Table 1의

Table 1 . List of strains used for antimicrobial experiments.

	Strains	Media1)	Temp. (°C)
Gram positive bacteria	Bacillus cereus	NA/NB	30
	Bacillus subtilis	NA/NB	30
	Staphylococcus aureus	NA/NB	30
Gram negative bacteria	Escherichia coli	NA/NB	30
	Enterobacter cloacae	NA/NB	30
	Salmonella enterica Typhimurium	NA/NB	37
	Pseudomonas aeruginosa	NA/NB	37

¹⁾NA: nutrient agar, NB: nutrient broth..

조건으로 생육 배양하였다. 분양받은 균주를 nutrient broth에 접종하고 30°C에서 24시간씩 3회 계대 배양하고 분광광도계(xMark^TM Microplate Absorbance Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.4~0.6(1×10⁵ CFU/mL) 범위 안에 들게 한 후 항균 활성 측정을 위한 균주로 사용하였다. 활성화된 각 균주를 nutrient agar에 100 μL씩 분주한 뒤 멸균된 spreader로 도말하여 항균 시험용 평판배지를 준비하였다. 시험용액의 농도 disc당 5, 10 mg이 되도록 paper disc(8 mm)에 천천히 흡수시킨 후 건조 과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 뒤 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 24시간 동안 30°C와 37°C의 incubator에서 배양하였다. 이후 disc 주변에 생성된 생육 저해환(clear zone)의 직경(mm)을 측정하여 항균력을 비교하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 실시한 후 그 평균값으로 나타내었으며 얻은 결과는 SPSS 26.0(Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc.)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 측정값 간의 유의성 검증은 95% 유의수준(P<0.05)에서 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 통하여 검증하였다.

눈개승마 발효물의 수율

5종의 유용 미생물을 이용하여 발효시킨 눈개승마 발효물의 수율은 Table 2에 나타내었다. 발효물 중에서는 BS 발효군이 18.07%로 가장 높은 수율을 보였으며, LC 발효군(17.33%), SC 발효군(16.69%), LB 발효군(16.31%), LP 발효군(16.12%) 순으로 높은 수율이 나타나 무발효군에 비해 발효군의 수율이 증가하는 경향을 보였다. 이는 Bae 등(2019)의 명월초를 여러 유용 균주로 발효한 연구에서 발효군의 수율이 무발효군에 비해 증가하였으며 BS를 이용한 명월초 발효물의 수율이 가장 높았다는 연구 결과와 일치하였다. 발효물들의 수율이 무발효군에 비해 증가한 이유는 눈개승마의 발효가 진행됨에 따라 미생물별 가수분해 효소가 활성화되면서 lactic acid, 페놀성 화합물 등의 대사산물 생성량 증가에 영향을 받은 것으로 사료된다(Kim 등, 2009).

Table 2 . The yield of fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara extracts by various microorganism (%).

Microorganism1)	Yield
Control	3.35
BS	18.07
SC	16.69
LC	17.33
LB	16.31
LP	16.12

¹⁾Control: non-fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara, BS: B. subtilis, SC: S. cerevisiae, LC: L. casei, LB: L. brevis, LP: L. plantarum..

눈개승마 발효물의 배양 특성

다양한 유용 미생물을 통해 발효시킨 눈개승마의 발효 정도를 확인하기 위해 24시간 동안 발효시킨 눈개승마 발효액의 배양 특성 결과를 Table 3에 나타내었다. 무발효 대조군 pH는 5.40±0.01로 나타났으며 발효군의 pH는 3.55~4.96 범위에서 나타나 눈개승마를 발효했을 때 pH가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(P<0.05). Park 등(2023)의 연구에서는 커피 원두 추출물을 S. cerevisiae로 발효했을 때 발효 전보다 acetic acid의 함량이 유의적으로 증가하였으며, 이와 같은 결과가 발효물의 총산도 및 pH 변화에 기인한 것이라고 보고하였다. 본 연구 결과에서도 눈개승마의 발효가 진행됨에 따라 미생물의 유기물 분해에 의해 유기산의 생성량이 증가한 것으로 사료된다. 또한 눈개승마 발효물 중 BS 발효군이 4.96±0.00으로 가장 높은 pH 값을 보였는데 Kim 등(2013b)의 연구에서도 BS 균주를 이용한 발효물의 pH가 가장 높게 측정되어 BS 발효군의 경우 pH 변화에 미치는 영향이 적은 것으로 판단된다고 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 보였다. 이처럼 발효물 간 pH 차이가 발생한 이유는 미생물별 효소 가수분해에 따른 아미노산, 유리지방산, 펩타이드 등 대사산물 생성량에서 차이가 발생하기 때문으로 사료된다(Kim 등, 2011a).

Table 3 . pH value, turbidity, and viable cell count in the broth of fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara extracts by various microorganism.

Microorganism1)	pH	Turbidity4)	Viable cell count (log CFU/mL)
Control	5.40±0.01a2)3)	0.12±0.00f	－
BS	4.96±0.00b	0.50±0.00c	5.18±0.17d
SC	4.10±0.01c	0.39±0.00e	7.22±0.03c
LC	3.55±0.01f	0.42±0.00d	8.27±0.02b
LB	3.64±0.02d	0.58±0.00b	8.69±0.05a
LP	3.62±0.00e	0.90±0.00a	8.62±0.07a

¹⁾Control: non-fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara, BS: B. subtilis, SC: S. cerevisiae, LC: L. casei, LB: L. brevis, LP: L. plantarum..

²⁾Mean±SD (n=3)..

³⁾Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..

⁴⁾Turbidity measurement based on OD₆₀₀ in the broth of Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara extracts fermented by microorganism..

발효 시간이 경과함에 따라 부유된 미생물의 양이 증가하는 정도는 발효물의 흡광도를 600 nm에서 측정함으로써 판단할 수 있다(Alpen과 Mandel, 1960). 눈개승마 발효물의 혼탁도 측정 결과 0.12~0.90으로 나타났고 무발효군(0.12±0.00)에서 가장 낮았으며 LP(0.90±0.00)에서 가장 높은 혼탁도를 보였다(P<0.05). Bae 등(2019)의 연구에서 명월초를 LP로 발효했을 때 혼탁도가 가장 높았다고 보고하여 본 연구 결과와 유사한 경향을 보였고, 이에 따라 LP를 이용한 발효 시 흡광도에 영향을 미치는 부유물의 생성이 증가하는 것으로 판단된다.

미생물의 생장에 있어서 눈개승마 발효액이 미치는 영향을 확인하기 위해 24시간 동안 발효 후 각 발효물의 생균수를 측정한 결과 5.18~8.69 log CFU/mL로 나타났고, LB 발효군(8.69±0.05 log CFU/mL)과 LP 발효군(8.62±0.07 log CFU/mL)에서 유의적으로 가장 높았으며 BS 발효군(5.18±0.17 log CFU/mL)이 가장 낮게 나타나 다른 균주들에 비해 유산균으로 발효했을 때 비교적 높은 생균수를 보였다(P<0.05). 따라서 24시간 동안 발효시킨 눈개승마 발효액의 pH, 혼탁도, 생균수를 측정한 결과를 통해 눈개승마 발효가 잘 진행됨을 확인하였으며, 이 중 유산균이 자기 증식에 있어서 눈개승마를 가장 효과적으로 이용하는 것으로 사료된다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

눈개승마 발효물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 총 폴리페놀 함량은 발효군 및 무발효군 중 SC 발효군(106.30±0.58 GAE mg/g)이 유의적으로 가장 높았으며(P<0.05), 그다음으로 무발효군(90.57±0.58 GAE mg/g), BS 발효군(82.04±0.29 GAE mg/g), LP 발효군(66.48±0.77 GAE mg/g), LB 발효군(61.46±0.29 GAE mg/g), LC 발효군(61.12±1.26 GAE mg/g) 순으로 높은 함량을 보였고, 이 중 LB와 LC 발효군 간의 유의적인 차이는 없었다. 총 플라보노이드 함량은 SC 발효군(49.23±0.78 CE mg/g)이 유의적으로 가장 높았으며(P<0.05), 그다음으로 무발효군(37.56±0.57 CE mg/g), BS 발효군(36.18±0.38 CE mg/g), LP 발효군(35.93±0.43 CE mg/g), LB 발효군(31.41±0.22 CE mg/g), LC 발효군(26.77±0.75 CE mg/g) 순으로 높은 함량을 보였고, 이 중 BS와 LP 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 따라서 눈개승마 발효 시 SC 균주를 이용하였을 때 다른 미생물 발효군에 비해서 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 평균적으로 증가하는 것으로 나타났다. Kang 등(2020)은 구멍갈파래를 여러 유용균주로 발효했을 때 S. cerevisiae strain CHY1011을 이용한 발효물에서 가장 높은 총 페놀 값을 나타냈다고 보고하여 본 연구 결과와 유사한 경향을 보였으며, Yang과 Hong(2016)은 퀴노아를 B. subtilis CBD2로 72시간 발효했을 때 총 폴리페놀 함량이 무발효군보다 약 2.6배 증가하였고 이는 발효에 의해 불용성 폴리페놀 화합물이 고분자 화합물로부터 분리되어 유리 폴리페놀 화합물로 분해된 것에 영향받은 것으로 보고하였다. 또한 Bae 등(2019)의 연구에서는 명월초 발효물의 총 페놀 및 플라보노이드의 함량이 무발효군보다 증가하였으며, 발효 미생물에 의해 유도되는 protease, lipase 등의 가수분해 효소에 의해 페놀 화합물이 생성되어 증가한 것으로 보고되었다. 따라서 본 연구의 SC 발효군이 무발효군에 비해 유의적으로 총 폴리페놀 및 플라보이드 함량이 증가한 이유는 S. cerevisiae에 의해 생성된 β-glucosidase, feruoylesterase 등의 가수분해 효소가 식물 세포벽의 구조적 파괴를 유도하여 페놀 화합물의 추출을 촉진시키고 눈개승마 내 페놀성 glycoside가 가수분해되면서 항산화 활성을 갖는 aglycone으로 전환되어 나타난 결과로 사료된다(Hur 등, 2014). 반면 Choi 등(2018)의 연구에서는 끄라차이담을 발효했을 때 무발효군이 발효군보다 더 높은 플라보노이드 함량을 보였는데, 이는 페놀성 화합물이 다량 함유된 식물체의 세포독성 작용이 추출물의 발효에 의해 경감된 결과와 관련이 있는 것으로 보고하였고, Hur 등(2014)은 발효 시 항산화 활성을 나타내는 화합물의 생성은 미생물의 종류마다 달라질 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서도 발효에 사용한 미생물 종류에 따라 효소작용의 차이가 발생하여 눈개승마에 함유된 생리활성 물질의 증감에 영향을 미친 것으로 판단되고, 이러한 균주의 특성에 따라 각 발효물의 총 페놀 및 플라보노이드의 함량에 차이가 발생한 것으로 사료된다.

Table 4 . Total polyphenol and total flavonoid contents of fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara extracts by various microorganism.

Microorganism1)	Total polyphenol contents (GAE mg/g2))	Total flavonoid contents (CE mg/g3))
Control	90.57±0.58b4)5)	37.56±0.57b
BS	82.04±0.29c	36.18±0.38c
SC	106.30±0.58a	49.23±0.78a
LC	61.12±1.26e	26.77±0.75e
LB	61.46±0.29e	31.41±0.22d
LP	66.48±0.77d	35.93±0.43c

¹⁾Control: non-fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara, BS: B. subtilis, SC: S. cerevisiae, LC: L. casei, LB: L. brevis, LP: L. plantarum..

²⁾GAE: gallic acid equivalents mg/g..

³⁾CE: catechin equivalents mg/g..

⁴⁾Mean±SD (n=3)..

⁵⁾Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..

라디칼 소거 활성

눈개승마 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 50%의 라디칼 소거 활성을 나타내는 시료 농도인 IC₅₀값으로 Table 5에 나타내었다. SC 발효군의 IC₅₀값은 0.22±0.03 mg/mL로 가장 높은 라디칼 소거 활성을 보였고 다음으로 BS 발효군(0.26±0.00 mg/mL), 무발효군(0.29±0.01 mg/mL), LC 발효군(0.41±0.01 mg/mL), LP 발효군(0.44±0.01 mg/ mL), LB 발효군(0.53±0.02 mg/mL) 순으로 높은 라디칼 소거 활성을 보였으며 모든 발효군 및 무발효군에서 유의적인 차이가 확인되었다(P<0.05). Kim 등(2013b)은 인삼꽃을 발효했을 때 B. subtilis와 S. cerevisiae strain ZP 541 발효군에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 높게 나타났다고 보고하여 본 연구 결과와 유사한 경향을 보였다. 또한 Um 등(2017)의 연구에서는 황련해독탕을 발효했을 때 항산화 효능을 갖는 berberine 함량이 약 3배가량 증가하였고 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성 또한 무발효군에 비해 약 2배 이상 증가하여 발효 후 항산화 효능이 증진됨을 확인하였다. 본 연구에서도 눈개승마를 SC와 BS 균주를 이용하여 발효했을 때 DPPH 라디칼 소거 활성이 높은 대사산물의 생성이 증가한 것으로 판단되며, BS 균주에 비해 SC 균주의 활성이 더 우수한 것으로 확인되었다. BS 발효군의 경우 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 무발효군보다 낮게 나타난 반면 DPPH 라디칼 소거 활성은 무발효군보다 높은 활성을 보여 서로 다른 경향을 보였는데, Lee 등(2012)의 연구에 따르면 과일 껍질의 항산화능과 항산화 성분 간 상관관계를 분석한 결과 DPPH 라디칼 소거능은 비타민 C 함량에서만 양의 상관관계를 보였고 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과는 상관관계가 성립하지 않았다고 보고하였다. 또한 Park 등(2018)은 아로니아의 숙도 단계가 진행될수록 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 감소하고 DPPH 라디칼 소거 활성은 증가하였다고 보고하였는데, DPPH 라디칼 소거 활성이 폴리페놀 화합물로부터 비롯되었다기보다 아로니아에 포함된 다른 항산화 물질과 더욱 밀접한 관련성이 있는 것으로 판단되며, DPPH 라디칼 소거 활성이 반드시 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 정비례하는 것은 아니라고 보고하였다. 따라서 본 연구에서도 BS 발효군의 DPPH 라디칼 소거 활성이 폴리페놀 화합물에 기인하기보다 발효를 통해 생성된 항산화 물질의 작용이 더욱 큰 영향을 미친 것으로 사료된다. 반면 LC, LB, LP 발효군은 무발효군에 비해 DPPH 라디칼 소거 활성이 감소하였는데(P<0.05), Kim 등(2012)의 연구에 따르면 포도박 발효군의 경우 무발효군에 비해 낮은 항산화 활성을 나타내었고 이는 포도박이 발효 중 산화가 진행되어 항산화 화합물 등이 감소한 것으로 여겨진다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서도 LC, LB, LP 발효군의 경우 발효 중 비타민 E, 비타민 C, 카테킨류 등의 항산화 화합물들이 산화되면서 라디칼 소거 활성 물질이 감소한 것으로 사료된다(Park 등, 2009).

Table 5 . DPPH and ABTS radical scavenging activity and ferric reducing antioxidant power (FRAP) value of fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara extracts by various microorganism.

Microorganism1)	DPPH radical scavenging activity IC50(mg/mL)2)	ABTS radical scavenging activity IC50(mg/mL)	FRAP value (M/g)
Ascorbic acid	0.02±0.00g3)4)	0.12±0.00g	－
Control	0.29±0.01d	3.13±0.02e	1.14±0.01b
BS	0.26±0.00e	3.22±0.03d	1.16±0.01b
SC	0.22±0.03f	2.83±0.05f	1.37±0.01a
LC	0.41±0.01c	4.76±0.06a	0.93±0.02e
LB	0.53±0.02a	4.23±0.07b	1.00±0.01d
LP	0.44±0.01b	4.08±0.03c	1.03±0.01c

¹⁾Control: non-fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara, BS: B. subtilis, SC: S. cerevisiae, LC: L. casei, LB: L. brevis, LP: L. plantarum..

²⁾Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by interpolation of concentration inhibition curve..

³⁾Mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..

눈개승마 발효물의 ABTS 라디칼 소거 활성은 IC₅₀값으로 Table 5에 나타내었다. SC 발효군의 IC₅₀값은 2.83± 0.05 mg/mL로 무발효군(3.13±0.02 mg/mL)보다 높은 라디칼 소거 활성을 보였고, BS 발효군(3.22±0.03 mg/mL), LP 발효군(4.08±0.03 mg/mL), LB 발효군(4.23±0.07 mg/ mL), LC 발효군(4.76±0.06 mg/mL) 순으로 높은 라디칼 소거 활성을 보였으며 모든 발효군 및 무발효군에서 유의적인 차이가 확인되었다(P<0.05). Jang 등(2015)은 삼채뿌리 열수추출물을 여러 균주로 발효했을 때 S. cerevisiae MG 111 발효군에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성이 가장 높은 활성을 나타냈다고 보고하여 본 연구 결과와 일치하였다. 반면 BS 발효물의 경우 DPPH 라디칼 소거 활성과는 달리 ABTS 라디칼 소거 활성에서 무발효군보다 낮은 활성을 보였는데, ABTS 라디칼은 상대적으로 빠른 반응 속도를 가지는 반면 DPPH 라디칼의 반응 속도는 화합물에 따라서 차이가 발생한다고 알려져 있고 ABTS 라디칼과 반응성이 큰 항산화 물질이 DPPH 라디칼과는 전혀 반응하지 않을 수도 있다고 보고되어 있다(Kim 등, 2010). 따라서 눈개승마를 B. subtilis 균주로 발효할 때 amylase, hydrolases, levansucrase, peptidase, cellulases 등의 미생물 효소가 활성화되면서 생성된 항산화 물질이 ABTS 라디칼보다 DPPH 라디칼과의 반응성이 더 높았던 것으로 사료된다(Hur 등, 2014). 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 가장 높았던 SC 발효군은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 또한 가장 높은 활성을 보여 눈개승마 SC 발효군에 존재하는 페놀성 화합물의 함량과 라디칼 소거 활성 간 비례적 상관관계가 있을 것으로 사료된다(Kim 등, 2013b).

FRAP 활성

눈개승마 발효물의 철 환원 능력을 나타내는 FRAP 활성의 측정 결과는 Table 5에 나타내었다. 발효 눈개승마의 FRAP value는 SC 발효군(1.37±0.01 M/g)이 유의적으로 가장 높은 값을 나타내었으며(P<0.05), 다음으로 BS 발효군(1.16±0.01 M/g), 무발효군(1.14±0.01 M/g), LP 발효군(1.03±0.01 M/g), LB 발효군(1.00±0.01 M/g), LC 발효군(0.93±0.02 M/g) 순으로 높은 활성을 보였고, 이 중 BS 발효군과 무발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다. Bae 등(2019)은 명월초를 여러 유용 균주로 발효했을 때 모든 발효군에서 무발효군보다 높은 FRAP value가 나타났으며 이는 발효에 의한 항산화 활성 증가로 확인된다고 보고하였다. 본 연구 결과 또한 앞에서의 라디칼 소거 활성, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 결과와 마찬가지로 눈개승마를 SC 균주로 발효할 시 alcohol dehydrogenase, amylase, proteases, maltase, β-glucosidase 등의 효소가 활성화되면서 생성되는 항산화 물질에 의해 환원력이 증가한 것으로 판단된다(Hur 등, 2014). 반면 Choi 등(2018)의 연구에서 끄라차이담을 여러 미생물로 발효했을 때 모든 발효군의 FRAP value가 무발효군에 비해 유의적으로 낮아졌다고 보고하여 본 연구 결과와 다른 경향을 보였는데, 이를 통해 발효에 사용되는 균주뿐만 아니라 천연 식품 또한 항산화 활성을 나타내는 화합물 생성에 큰 영향을 미치는 것으로 판단된다(Bae 등, 2019).

항균 활성

눈개승마 발효물의 항균 활성 측정 결과는 Table 6에 나타내었다. 무발효군은 5 mg/disc의 농도 중 P. aeruginosa(8.75±0.50 mm)를 제외한 모든 균에서 항균 활성을 보이지 않았으나 P. aeruginosa에서는 유의적으로 가장 높은 활성을 보였다(P<0.05). 10 mg/disc의 농도에서 LC, LB, LP 발효군의 경우 실험에 사용된 모든 균에 대해 항균 활성을 보였으며, BS 발효군은 P. aeruginosa(7.25±1.26 mm), SC 발효군은 B. subtilis(1.38±0.25 mm), E. coli(0.50± 0.00 mm), S. Typhimurium(0.95±0.10 mm), P. aeruginosa(12.00±1.41 mm)에 대한 항균 활성을 나타내었다. Kim 등(2012)은 포도 가공 부산물을 여러 유용균주로 발효한 후 항균 활성을 측정한 결과 L. casei 발효군에서 가장 높은 항균 활성을 나타냈다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였으며, L. casei가 포도 가공 부산물을 발효시키면서 항균 활성을 갖는 대사산물을 생산하는 것으로 판단된다고 보고하였다. 본 연구에서 눈개승마를 유산균으로 발효했을 때 항균 활성이 크게 증가하였는데, 중성 또는 알칼리성에서 최적 생육조건을 가진 미생물의 경우 유산균이 생산하는 acetic acid 등의 유기산이 미생물에 bactericidal 작용을 하여 강한 항균 활성을 나타내며, 유산균 발효제품의 향미 성분 중 하나인 diacetyl(2,3-butanedione)은 pH와 상호작용을 통해 효모 및 병원성균 등에 대하여 강한 항균 활성을 나타낸다고 알려져 있다(Ryu 등, 2011). 또한 Kim 등(2009)은 자작나무 수액에 Lactobacillus spp.를 접종하여 발효했을 때 비교적 많은 유기산 생성으로 인해 pH가 4.41 이하로 떨어져 잡균의 오염을 방지할 수 있다고 보고하였으며, 본 연구에서도 눈개승마 유산균 발효물의 pH가 3.55~3.62로 비교적 낮은 수치를 보임으로써 유기산이 생성된 것으로 판단되고 이에 따라 균주에 대한 bactericidal 작용이 증가한 것으로 사료된다. 반면 SC 발효군의 pH는 4.10으로 유산균 발효물에 비해 pH의 감소폭이 적었음에도 불구하고 B. subtilis, E. coli, S. Typhimurium에 대한 항균 활성이 무발효군에 비해 증가하였는데, 이를 통해 눈개승마를 발효함에 따라 salicylaldehyde 등의 항균 및 항진균 활성을 가지는 화합물 증진에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 여겨진다(Felton과 Brewer, 1947).

Table 6 . Antibacterial activities with fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara extracts by various microorganism.

Microorganism	Size of clear zone (mm)
	Sample1)	Fraction conc. (mg/disc)
		5.0	10.0
B. cereus	Control	－2)	－
	BS	－	－
	SC	－	－
	LC	1.00±0.00a3)4)	2.00±0.00a
	LB	1.00±0.00a	2.00±0.00a
	LP	0.50±0.00b	1.75±0.29b
B. subtilis	Control	－	2.00±0.00c
	BS	－	－
	SC	－	1.38±0.25d
	LC	2.00±0.00a	3.00±0.00b
	LB	1.50±0.00b	3.00±0.00b
	LP	1.00±0.00c	3.63±0.25a
S. aureus	Control	－	－
	BS	－	－
	SC	－	－
	LC	0.85±0.24a	1.88±0.25a
	LB	0.48±0.05b	1.38±0.48b
	LP	0.50±0.00b	1.00±0.00c
E. coli	Control	－	－
	BS	－	－
	SC	－	0.50±0.00c
	LC	1.13±0.25a	2.90±0.12a
	LB	0.88±0.25ab	2.25±0.29b
	LP	0.70±0.24b	3.00±0.00a
E. cloacae	Control	－	－
	BS	－	－
	SC	－	－
	LC	－	0.95±0.10NS5)
	LB	－	0.78±0.21
	LP	－	0.78±0.21
S.Typhimurium	Control	－	－
	BS	－	－
	SC	－	0.95±0.10d
	LC	1.20±0.14a	2.88±0.25b
	LB	0.95±0.10b	2.30±0.24c
	LP	0.78±0.21c	3.63±0.25a
P. aeruginosa	Control	8.75±0.50a	19.50±1.73a
	BS	3.50±0.58d	7.25±1.26d
	SC	6.13±0.63b	12.00±1.41b
	LC	6.88±0.85b	13.50±1.00b
	LB	4.38±0.48cd	9.00±0.82cd
	LP	5.13±0.63c	9.75±0.50c

¹⁾Control: non-fermented Aruncus dioicus var. kamtschaticus Hara, BS: B. subtilis, SC: S. cerevisiae, LC: L. casei, LB: L. brevis, LP: L. plantarum..

²⁾Not detected..

³⁾Mean±SD (n=4)..

⁴⁾Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..

⁵⁾NS: not significant..

본 연구에서는 다양한 생리활성성분을 함유한 눈개승마를 여러 유용 미생물을 통해 발효시킨 후 각 발효물의 품질과 항산화, 항균 활성을 분석하여 새로운 기능성 식품 등의 산업원료 소재로서 이용 가능성을 탐색하고자 하였다. 눈개승마 발효물의 pH는 3.55~4.96으로 무발효군(5.40±0.01)에 비해 전체적으로 감소하는 것을 확인하였고, 미생물 생장에 의한 혼탁도 측정 결과 LP 발효군(0.90±0.00)이 유의적으로 가장 높은 값으로 나타났다(P<0.05). 눈개승마 발효물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과 SC 발효군(106.30±0.58 GAE mg/g)이 가장 높은 함량을 보였고, 플라보노이드 함량 또한 SC 발효군(49.23±0.78 CE mg/g)에서 유의적으로 가장 높은 값을 보였다(P<0.05). 따라서 눈개승마 발효 시 SC 균주를 이용하였을 때 다른 미생물 발효군에 비해서 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 평균적으로 증가하는 것으로 판단된다. 눈개승마 발효물의 DPPH 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과 SC 발효군이 유의적으로 가장 높은 활성을 보였다(P<0.05). 따라서 SC 균주를 이용하여 눈개승마를 발효할 시 라디칼 소거 활성이 높은 대사산물의 생성이 증가하는 것으로 사료된다. 눈개승마 발효물의 FRAP 측정 결과 SC 발효군이 1.37±0.01 M/g으로 유의적으로 가장 높은 활성을 나타내었고(P<0.05), 눈개승마를 SC 균주로 발효하면서 활성화되는 alcohol dehydrogenase, amylase 등의 효소들에 의해 항산화물질이 대사산물로 생성되면서 환원력이 증가한 것으로 판단된다. 항균 활성 측정 결과 5 mg/disc 농도에서 P. aeruginosa 균주를 제외한 모든 균주에서 눈개승마 발효물의 항균 활성이 무발효군보다 더 우수하게 나타났다(P<0.05). 특히 유산균 발효물의 경우 10 mg/disc 농도에서 모든 균주에 대한 항균 활성을 보였는데, 이를 통해 유산균을 이용한 눈개승마 발효 시 유기산 생성량 증가에 영향을 미치고 이에 따라 균주에 대한 bactericidal 작용이 증가하는 것으로 사료된다. 이상의 연구 결과를 종합해 볼 때, 눈개승마를 SC 균주로 발효할 경우 우수한 항산화 효과를 나타낼 수 있고 유산균을 이용하여 발효할 경우 항균 활성과 같은 기능성 및 보존력 향상에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료되며, 눈개승마 발효물이 기능성 식품의 천연 원료로써 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 그리고 눈개승마 발효 추출물 간 생리활성 효능 차이에 대한 근거를 추가적으로 확보하기 위해서 향후 눈개승마 발효 추출물의 주요한 생리활성 물질을 분리 및 정제하여 발효과정 중 유효성분의 변화량을 정량적으로 비교･분석함으로써 항산화 및 항균 활성을 검증하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.