사람의 피부는 피하지방조직 위에 상주하는 표피(epidermis)와 진피(dermis) 두 층으로 구성되어 있다(Quan과 Fisher, 2015). 표피는 약 95%의 각질세포(keratinocyte)로 구성되어 있으며, 이는 외부의 감염과 외상으로부터 신체를 보호하는 물리적 장벽역할을 한다. 피부의 가장 바깥쪽 층인 각질층은 피부가 수분을 유지하는 능력과 연관이 있으며, 각질층에 10% 이상의 수분이 공급되어야 피부의 탄력성과 유연성 제공, 장벽 기능 최적화 및 가수분해 효소 활성화로 인한 피부 박리 과정, 손상으로부터 보호할 수 있다(Lee 등, 2021; Verdier-Sévrain과 Bonté, 2007). HaCaT 세포는 인간 각질 세포의 자연적인 변화로부터 분리되어 정상 각질세포와 매우 유사하고, 일반 각질세포와 유사한 방식으로 신호 조절에 반응하며 광범위한 표피 분화 마커를 발현하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 이유로 인간 표피세포의 증식 및 분화와 건선 치료의 약리학적 활성을 연구하는 데 유용한 모델로 활용돼 왔다(Breitkreutz 등, 1998; Gu 등, 2022; Jiang 등, 2020). 진피는 피부 부피의 대부분을 차지하고 표피와 상호작용을 통해 피부의 재생을 돕는다. 진피의 결체 조직은 elastin, collagen, dermal matrix 등의 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)로 구성되는데, 이는 모두 섬유아세포(fibroblast)에 의해 합성된다(Thulabandu 등, 2018; Yoo, 2011; Yoon 등, 2012). 섬유아세포는 피부 구조와 완전성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 피부뿐만 아니라 각종 장기에 존재하여 외부 자극에 의한 상처 치유에 중요한 역할을 한다(Thangapazham 등, 2014; Thulabandu 등, 2018). 피부 섬유아세포의 기능 장애 및 피부 ECM의 변화는 주름형성과 같은 외부적으로 노화된 피부 표현 변화와 관련이 있다(Tigges 등, 2014). HS27 세포는 인간섬유아세포로서 피부 주름 개선 및 상처 치유 연구를 위한 세포주로 활용돼 왔다(Kim 등, 2016; Zhang 등, 2012).

피부의 노화 현상은 시간이 지남에 따라 자연스럽게 신체의 기능이 저하되어 나타나는 내인성 노화(intrinsic aging)와 외부적 환경에 의하여 노화가 가속되는 외인성 노화(extrinsic aging)로 나뉜다(Chung, 2003; Koehler 등, 2006). 외인성 노화 중 광노화(photoaging)는 태양 자외선(UV)에 의한 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS) 생성을 통해 발생한다. UV에 노출 후 생성된 ROS는 단백질, 지질 및 당류와 세포의 항산화 효소에 손상을 입히고, 그로 인해 DNA 손상으로 이어져 깊은 주름, 색소 침착, 피부 건조증, 탄력 감소, 피부암 등의 증상을 유발시킨다(Helfrich 등, 2008; Pillai 등, 2005; Svobodova 등, 2006). 게다가 ROS는 collagenase를 활성화하고 collagen 합성 억제를 통해 주름 생성을 촉진시킨다(Park 등, 2010). 또한 UV에 의해 과도하게 생성된 산화적 스트레스는 각질세포에서 비정상적으로 많은 cytokines 분비를 유발할 뿐만 아니라 진피층의 섬유아세포에도 영향을 미쳐 피부 손상을 일으킬 수 있다(Pasparakis 등, 2002; Proksch 등, 2006). 이와 같이 자외선으로부터 발생하는 피부 손상을 감소시켜 피부 노화를 예방하기 위해 천연 원료 추출물의 보습과 주름 개선 등의 기능성 연구가 활발히 이루어지고 있다.

태반(placenta)은 태아의 정상적인 성장과 발달을 위한 임신 기관으로, 태아와 모체의 사이에서 영양분과 노폐물의 교환이 최대한 효율적으로 작용하도록 하는 역할을 한다(Gude 등, 2004). Lee 등(2012)에 따르면 태반은 각종 cytokine, glycosaminoglycan, 호르몬, 단백질, 지질, 아미노산, 효소, 비타민 및 미네랄 등 생체활성물질을 보유하고 있는 것으로 나타났다. 태반 추출물은 전통적으로 상처 치료와 항염증제로 사용되어 왔으며(Liu 등, 2019), 인체 태반 추출물은 항산화(Togashi 등, 2002), 항염증, 항통각(Lee 등, 2011), 갱년기 증상 완화(Lee 등, 2009), 피부의 노화 예방, 미백(Chang 등, 2022; Pal 등, 2002) 등 다양한 생리활성 기능에 효과가 있다고 연구되었다. 그러나 인체 태반 사용에 대한 윤리적 문제로 유사한 기능을 가진 양, 돼지, 소 및 쥐 등 가축의 태반으로 대체하여 기능성 원료가 개발되고 있다(Liu 등, 2019). 양태반 추출물은 전통적인 의학에서 널리 사용되며 상처치유, 항산화, 항염증과 같은 생리학적 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Chou 등, 2022). Chou 등(2022)은 양태반 추출물이 노화 촉진 동물 모델(senescence-accelerated mouse)의 피부 광택, 척추 경련, 척추측만증 등의 노화지수를 낮추고, 뇌 조직에서 산화적 스트레스를 낮추어 효과적인 노화 방지 치료제로 활용이 가능함을 나타냈다. 또한 Liu 등(2019)은 concanavalin A로 간 손상을 유도한 동물 모델에 대하여 양태반 추출물이 간의 항산화 능력을 회복시키고, 혈청 내 염증성 cytokine 분비를 감소시키며 면역학적 간 손상 치료 효과가 있음을 보고하였다.

본 연구에서 사용된 양태반 펩타이드 분말은 기존의 양태반 분말에 미세 분쇄 공정을 추가 제조하여 총 유리아미노산 함량이 277.9 mg/100 g으로 나타났으며, 기존의 양태반 분말 대비 1.4배로 함량이 증가함을 확인하였다(Lee 등, 2023). 유리아미노산은 피부 각질층에서 피부의 탄력 및 유연성을 유지하는 천연보습인자의 성분 중 40%를 차지하고, 그 함량의 감소는 아토피 피부염 등의 피부질환이나 피부 건조증이 발생할 수 있다고 보고된 바 있다(Seguchi 등, 1996; Verdier-Sévrain과 Bonté, 2007). 이에 따라 미세 분쇄 공정을 통해 유리아미노산 함량을 증가시킨 양태반 펩타이드 분말의 효과적인 피부 보습 및 주름 개선 기능성을 기대해 볼 수 있다.

본 연구에서는 UVB 조사에 의해 손상된 각질세포(HaCaT), 인간섬유아세포(HS27) 및 SKH-1 hairless mice의 피부조직에서 양태반 펩타이드 분말이 보습과 주름 개선에 미치는 영향을 평가하여 피부 건강 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인하고자 하였다.

시료 추출 및 제조

실험에 사용된 양태반 펩타이드 분말은 Lee 등(2023)에서 제조한 것과 동일한 방법으로 제조되었다. 먼저 동결된 상태의 양태반을 파편으로 잘게 절단하고 가염과 가온 후 발생한 액체층을 제거한 후 고형물만을 110°C, 3시간 동안 건조한 뒤, 조분쇄, 유동성 개선제(말토덱스트린) 첨가, 미세 분쇄 및 살균공정을 거쳐 양태반 분말을 제조하였다. 제조된 양태반 분말에 글리세린, Tween 80 및 정제수를 혼합하여 350~450 rpm으로 추가 미세 분쇄를 진행하였다. 그 후 100 mesh 필터 여과 및 분무건조를 통해 양태반 펩타이드 분말을 제조하였으며 시료는 (주)프롬바이오 익산공장을 통해 공급받았다. 양성대조군은 L-ascorbic acid와 arbutin을 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다.

세포 배양

본 실험에서는 HaCaT와 HS27 세포를 사용하였다. 배양에 사용된 High-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium, fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin, L-glutamine, sodium pyruvate 및 penicillin- streptomycin은 Hyclone Laboratories에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양은 10% FBS, 2 mmol/L L-glutamine 및 100 mg/L penicillin-streptomycin을 포함하였으며 37 °C, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다.

세포독성 평가

세포독성평가(MTT assay)는 Berridge와 Tan(1992)의 방법을 참고하여 수행하였다. HaCaT와 HS27 세포를 96- well plate에 1×10⁴ cells/well씩 분주하고 overnight 하여 안정화한 후 각 well에 시료를 농도별로 투여하였다. 24시간 뒤, 5 mg/mL 농도의 MTT solution을 20 µL 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 배지 제거 후 DMSO를 100 µL/well씩 분주하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

HaCaT 세포의 hyaluronan(hyaluronic acid, HA) 분비량 측정

HaCaT 세포를 배양하여 96-well plate에 1×10⁴ cells/ well 분주하고 overnight 하여 안정시킨 뒤, DPBS로 세척하고 UVB lamp(5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co.)를 이용하여 50 mJ/cm² 조사한 후 양성대조군인 L-ascorbic acid를 100 µg/mL 농도와 양태반 펩타이드 분말을 50, 100, 200 µg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 배양한 뒤, 상층액을 분리하고 HA ELISA kit(Biovision Inc.)을 이용하여 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories Inc.)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

HaCaT 세포의 sphingomyelin 함량 측정

배양된 HaCaT 세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/ well 분주하고 overnight 하여 안정시킨 뒤, DPBS로 세척하고 UVB lamp를 이용하여 50 mJ/cm² 조사하였다. 이후 양성대조군 L-ascorbic acid를 100 µg/mL의 농도로, 양태반 펩타이드 분말을 50, 100, 200 µg/mL 농도로 처리하였다. 세포를 homogenizing(1% Triton X-100 in chloroform) 하여 원심분리(13,000×g, 10 min) 후, 상층액을 수집하고 50°C에서 chloroform을 제거하였다. 남은 pellet은 assay buffer로 녹이고 sphingomyelin assay kit(Abcam)을 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

HS27 세포의 pro-inflammatory cytokines(TNF-α, IL-1β, IL-6) 분비량 측정

HS27 세포를 배양하여 96-well plate에 1×10⁴ cells/ well 분주하고 overnight 하여 안정화한 뒤, DPBS로 세척하고 UVB를 50 mJ/cm² 조사하였다. 그 후 양성대조군을 L-ascorbic acid 100 µg/mL 농도로, 양태반 펩타이드 분말을 50, 100, 200 µg/mL 농도로 24시간 처리한 뒤 duoset ELISA kit(R&D system)을 사용하여 상층액의 IL-1β, IL- 6 및 TNF-α 분비량을 655 nm의 흡광도로 측정하였다.

세포의 RNA 추출 및 실시간 정량 PCR

세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well씩 분주하고 overnight 하여 안정시킨 뒤 DPBS로 세척하고 UVB lamp를 이용하여 50 mJ/cm² 조사하였다. 양성대조군인 L-ascorbic acid는 100 µg/mL의 농도로, 양태반 펩타이드 분말은 50, 100, 200 µg/mL 농도로 처리한 후 24시간 배양하였다. 배양된 세포를 0.25% trypsin-EDTA로 수집하고 RNasy mini kit(QIAGEN)을 이용하여 RNA를 추출한 후 iScript^TM cDNA synthesis kit(Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용하여 cDNA로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 CFX Connect real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories Inc.)을 사용하였다. 유전자 증폭 반응에 사용할 HaCaT와 HS27 세포 각각의 primer 염기서열은 Table 1과 Table 2에 나타내었다. 95°C에서 10분 동안 hot start 한 후 95°C에서 15초, 57°C에서 15초, 72°C에서 30초 간 40 cycling으로 PCR 분석을 시행하였다. 모든 cycle이 완료된 후, primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 하였다. 결과는 BioRad에서 제공하는 CFX maestro^TM analysis software(Bio-Rad Laboratories Inc.)로 분석하였다.

Table 1 . Primer sequences used for RT-PCR quantification of the mRNA of genes related to moisturizing in UVB-irradiated HaCaT cell.

Gene1)	Primer sequences
UGTrel7 (H)	F 5′-TCCTGATCGTGGTGGTGAATAA-3′
	R 5′-ACACATAGTGAGGAGGGAAATCTGT-3′
GlcNAc (H)	F 5′-GAGGCAGTTCGCTTGTATCGT-3′
	R 5′-AATGGGCAGCAGCAAACTCT-3′
LCB1(SPT) (H)	F 5′-CCATGGAGTGGCCTGAAAGA-3′
	R 5′-CTGACACCATTTGGTAACAATCCTA-3′
DEGS1 (H)	F 5′-GCTGATGGCGTCGATGTAGA-3′
	R 5′-TGAAAGCGGTACAGAAGAACCA-3′
Elastin (H)	F 5′-GTC GGA GTC GGA GGT ATC-3′
	R 5′-TGA GAA GAG CAA ACT GGG-3′
GAPDH (H)	F 5′-CCC CAC ACA CAT GCA CTT ACC-3′
	R 5′-TTG CCA AGT TGC CTG TCC TT-3′

¹⁾UGTrel7: UDP-glucuronic acid, GlcNAc: UDP-N-acetylglucosamine, LCB1 (SPT): long chain base 1 (Serine palmitoyltransferase), DEGS1: dihydroceramide sturase, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase..

Table 2 . Primer sequences used in RT-PCR quantification of mRNA of genes related to collagen synthesis in UVB-irradiated HS27 cell.

Gene1)	Primer sequences
TGF-βR1 (H)	5′-CATCCTGATGGCAAGAGCTACA-3′
	5′-TAGTGGATGCGGACGTAACCA-3′
Procollagen (H)	F 5′-TTA CGT GGC AAG TGA GGG TTT-3′
	R 5′-TGT CCA GAT GCA CTT CTT GTT TG-3′
Collagen typeⅠ(H)	F 5′-GAC CGT TCT ATT CCT CAG TGC AA-3′
	R 5′-CCC GGT GAC ACA CAA AGA CA-3′
GAPDH (H)	F 5′-CCC CAC ACA CAT GCA CTT ACC-3′
	R 5′-TTG CCA AGT TGC CTG TCC TT-3′

¹⁾TGF-βR1: Transforming growth factor beta-receptor 1, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase..

세포의 western blot

세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well씩 분주하고 overnight 하여 안정화한 뒤 DPBS로 세척하고 UVB lamp를 이용하여 50 mJ/cm² 조사하였다. 양성대조군인 L-ascorbic acid는 100 µg/mL의 농도로, 양태반 펩타이드 분말은 50, 100, 200 µg/mL 농도로 처리한 후 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 protease inhibitor가 첨가된 lysis buffer를 넣어 균질화한 뒤 ice에 두어 일정 시간 유지하고 원심분리(12,000×g, 20 min, 4°C)하여 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 BSA와 biorad protein assay dye reagent concentrate(Bio-Rad Laboratories Inc.)를 이용하여 Bradford 법으로 정량하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE, 10%)을 이용하여 각 샘플당 20 μL씩 loading 하여 전기영동으로 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이하고, TBST buffer에 용해한 5% skim milk(TBS containing 0.5% Tween 20)로 1시간 동안 blocking을 하였다. 그 후 1차 항체 HAS2, CerS4(LASS4), beta-actin, MAPK8(JNK), c-Fos, c-Jun, MMPs(MMP-1, 3, 9) 및 Smad3(Cell signaling Technology)를 상온에서 3시간 반응시킨 뒤 membrane을 HRP가 중합된 2차 항체(Cell Signaling Technology)에 60분 간 반응시키고, enhanced chemiluminescent (ECL, Amershampharmacia Biotech)를 이용해 발색한 후 imagequant 기기(Amercham ImageQuant 800, Cytiva)를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 western blot band 이미지들은 Image J software(NIH)를 사용하여 band의 밀도를 측정하였다.

실험동물 처리 및 식이 제작

본 연구에 사용된 실험동물은 (주)새론바이오에서 20 g 내외의 5주령 male SKH-Ⅰ hairless mice를 공급받아 사용하였으며, 동물 사육실의 온도는 23±2°C, 명암은 12시간(light/dark cycle), 습도는 50±5°C로 일정한 조건하에 일주일 동안 안정시킨 후 실험하였다. 적응 기간에 체중을 측정하여 무작위 법으로 평균 체중에 가까운 8마리씩 군을 나누었다(n=8). 정해진 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 연구는 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(KHGASP-20-327). 식이는 AIN-93G를 기본으로 하여 각 군당 시료를 첨가하여 제공하였다. 양태반 펩타이드 분말은 식이의 0.05%, 0.1%, 0.2%로 첨가하였으며, 양성대조군 L-ascorbic acid 및 arbutin은 각각 식이의 0.15%로 첨가하여 섭취시켰다(Table 3).

Table 3 . Experimental design animals (n=8/group).

Groups1)	UVB	Dietary administration
NC	－	AIN 93G diet
C	＋	AIN 93G diet
PC 1	＋	AIN 93G diet＋L-ascorbic acid 0.15% of diet
PC 2	＋	AIN 93G diet＋Arbutin 0.15% of diet
LPP 0.05%	＋	AIN 93G diet＋lamb placenta peptide powder 0.05% of diet
LPP 0.1%	＋	AIN 93G diet＋lamb placenta peptide powder 0.1% of diet
LPP 0.2%	＋	AIN 93G diet＋lamb placenta peptide powder 0.2% of diet

¹⁾NC: normal control, C: control, PC: positive control, LPP: lamb placenta peptide powder..

마우스 자외선 조사에 의한 보습저하 및 주름생성 유도

자외선 조사는 UVB lamp를 이용하여 최소 홍반량(minimal erythromal dose, MED)을 150 mJ/cm²로 하여 1주일에 3회씩 마우스의 등 부위에 조사하였으며, 1주는 1MED (150 mJ/cm²), 2주는 2MED(300 mJ/cm²), 3주는 3MED (450 mJ/cm²), 4주부터 8주까지 4MED(600 mJ/cm²)로 조사하여 보습저하와 주름생성을 유도하였다. 8주의 시험 종료 후 각 군의 실험동물을 희생시켜 혈액과 피부 조직을 얻었다.

자외선 조사에 의한 마우스 피부조직으로부터 mRNA 추출 및 실시간 정량 PCR

실험동물 희생 후 분리한 피부조직을 수집하여 1 mL trizol(QIAGEN)에 보관하고 homogenizing 한 뒤, 200 μL chloroform을 넣어 상층액을 수거해 RNasy mini kit으로 RNA를 추출하였다. 그 후 iScript™ cDNA synthesis kit을 이용하여 cDNA로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR green을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 CFX connect^TM real-time PCR detection system을 사용하였다. 유전자 증폭 반응에 사용할 각각의 primer 염기서열은 Table 4와 Table 5에 나타내었다. 95 °C에서 10분 동안 hot start 한 후 95°C에서 15초, 57°C에서 15초, 72°C에서 30초 간 40 cycling으로 PCR 분석하였다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석하였다. 결과의 분석은 BioRad에서 제공하는 CFX maestro™ analysis software로 분석하였다.

Table 4 . Primer sequences used in RT-PCR quantification of mRNA of genes related to moisturizing in UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice skin.

Gene1)	Primer sequences
UGTrel8 (M)	5′-TTCCTCATCGTGCTGGTCAA-3′
	5′-TTGGTGAGGGAAAACCGTATG-3′
GlcNAc (M)	5′-GCTCAGTGATGGCCGATTG-3′
	5′-CATAAGGTGTGAAGTAGGGTGATTCC-3′
LCB1(SPT) (M)	5′-AGCGCCTGGCAAAGTTTATG-3′
	5′-GTGGAGAAGCCGTACGTGTAAAT-3′
DEGS1 (M)	5′-CCGGCGCAAGGAGATCT-3′
	5′-TGTGGTCAGGTTTCATCAAGGA-3′
Fibrillin-1 (M)	F 5′-ACA ATT GTT CAC CGA GTC GAT CT-3′
	R 5′-ACT GTA CCT GGG TGT TGC CAT T-3′
GAPDH (M)	F 5′-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3′
	R 5′-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3′

¹⁾UGTrel8: UDP-glucuronic acid, GlcNAc: UDP-N-acetylglucosamine, LCB1 (SPT): long chain base 1 (Serine palmitoyltransferase), DEGS1: dihydroceramide sturase, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase..

Table 5 . Primer sequences used in RT-PCR quantification of mRNA of genes related to collagen synthesis in UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice skin.

Gene1)	Primer sequences
TGF-βR1 (M)	5′-CATCCTGATGGCAAGAGCTACA-3′
	5′-TAGTGGATGCGGACGTAACCA-3′
Procollagen (M)	F 5′-TTA CGT GGC AAG TGA GGG TTT-3′
	R 5′-TGT CCA GAT GCA CTT CTT GTT TG-3′
Collagen typeⅠ(M)	F 5′-GAC CGT TCT ATT CCT CAG TGC AA-3′
	R 5′-CCC GGT GAC ACA CAA AGA CA-3′
GAPDH (M)	F 5′-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3′
	R 5′-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3′

¹⁾TGF-βR1: transforming growth factor beta-receptor 1, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase..

마우스 피부조직의 western blot

실험동물 희생 후 분리한 피부 조직을 수집하여 protease inhibitor 첨가된 lysis buffer를 넣어 homogenizing 하고 ice에 두어 일정 시간 유지 후 원심분리(12,000×g, 20 min, 4°C)하는 과정을 통해 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 BSA와 bio-rad protein assay dye reagent를 이용하여 Bradford 법으로 정량하였다. Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel(10%)을 이용하여 각 샘플당 20 µL씩 loading 하여 전기영동으로 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이하고, TBST buffer에 용해한 5% skim milk로 1시간 동안 blocking을 하였다. 그 후 1차 항체 HAS2, beta-actin, MAPK8(JNK), c-Fos, c-Jun, MMPs (MMP-1, 3, 9) 및 Smad3을 상온에서 3시간 반응시킨 뒤 membrane을 HRP가 중합된 2차 항체에 60분 간 반응시키고, ECL을 이용해 발색한 후 imagequant 기기를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 western blot band 이미지들은 Image J software를 사용하여 band의 밀도를 측정하였다.

마우스 피부조직의 항산화 효소 활성 측정

실험동물 희생 후 분리한 피부조직을 수집하여 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT) 및 glutathione peroxidase(GPx) 활성을 각각 SOD assay kit, CAT assay kit, GPx activity assay kit(BioVison Inc.)을 통해 ELISA reader로 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.

자외선 조사에 의한 마우스 피부의 경표피 수분 함량 측정

마우스 피부의 보습 능력을 판정하기 위해 수분측정기(howskin, Innoinsight Inc.)의 전자단자를 마우스 등 부분에 접합하여 본 실험 8주 차에 피부 경표피 수분 함량을 측정하였다.

자외선 조사에 의한 마우스 피부조직의 형태학적 관찰

형태학적 관찰은 Wu 등(2017)의 연구 방법에서 주름 사진 촬영 방법을 참고하였다. 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 디지털카메라로 mice의 등 부위를 근접 촬영하였다.

통계처리

본 실험 결과의 분석은 통계프로그램 SPSS(Statistical package for social science, version 23.0, SPSS Inc.)를 사용하였으며, 각 실험 항목의 측정 결과를 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다. 그룹 간 평균 차이는 one-way ANOVA로 확인하였고 통계적 유의성은 Duncan’s test를 실시하여 P<0.05 수준에서 검정하였다.

양태반 펩타이드 분말 처리에 대한 HaCaT 세포의 보습 효과

자외선은 UVA(320~400 nm), UVB(280~320 nm) 및 UVC(200~280 nm)로 나뉘며 UVA와 UVB는 지표면에 도달할 수 있어 피부에 영향을 미친다(Matsumura와 Ananthaswamy, 2004). 피부의 자외선 노출은 피부 내 과다한 ROS를 생성시키고, 이러한 ROS는 항산화 효소 활성 감소 및 산화적 스트레스 증가로 피부 세포 및 구성 성분들의 손상을 유발한다. HA는 glycosaminoglycan 계열의 ECM 구성 성분으로 염증, 세포 이동 및 상처 치유에 중요한 역할을 하는데, 자외선은 HA를 생성하는 섬유아세포의 능력을 감소시켜 피부 결합조직에 심각한 손상을 발생시킨다(Jeon 등, 2014; Yoo, 2011). 각질층의 각질 세포 간 주요 지질성분은 표피의 층판소체에서 유래된 ceramide, cholesterol, 유리 지방산이 있으며, 이는 각질세포 지질의 전구체 형태인 phospholipid, sphingomyelin, cholesterol sulfate, glucosylceramide 및 acylglucosylceramide 등에서 유래된다(Kim, 2014). 그중 sphingomyelin은 세포 외 환경 장벽을 제공하여 구조적 역할 뿐만 아니라 세포 손상 신호 전달에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다(Kolesnick, 1991; Reynolds 등, 2004). 따라서 자외선 조사한 HaCaT 세포에서 양태반 펩타이드 분말의 처리가 HA와 sphingomyelin 분비량에 미치는 영향을 측정하였다.

본 연구에 앞서 양태반 펩타이드 분말의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다(자료미제시). HaCaT 세포는 양태반 펩타이드 분말 700 µg/mL 이상의 농도에서 세포 생존율이 감소하는 경향을 보여, 대조군(추출물 무처리군)과 유의적인 차이를 보이지 않은 안전범위의 농도 내에서 실험을 진행하였다. 그 결과(Fig. 1), 자외선 조사군(C)은 HA(Fig. 1A)와 sphingomyelin(Fig. 1B) 분비량을 정상대조군(NC) 대비 유의적으로 감소시키는 경향을 보이며 세포의 보습에 영향을 미친 것으로 나타났다(P<0.05). 양태반 펩타이드 분말을 100 µg/mL와 200 µg/mL의 농도로 처리한 시험군(각각 LPP 100과 LPP 200)의 HA 분비량은 자외선 조사군에 비해 유의적으로 각각 18.5%와 28.2%의 증가율을 보였으며(P<0.05), sphingomyelin 분비량은 양태반 펩타이드 분말로 처리한 모든 시험군(LPP 50, LPP 100, LPP 200)에서 농도 의존적으로 각각 35.0%, 67.4%, 71.4 %의 증가율을 나타내었다(P<0.05).

Fig 1. Effect of lamb placenta peptide powder (LPP) on hyaluronic acid and sphingomyelin levels in UVB-irradiated HaCaT cell. (A) hyaluronic acid and (B) sphingomyelin. The cells were treated with UVB (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 µg/mL of L-ascorbic acid (PC) and various concentrations (50, 100, 200 µg/mL) of LPP. Hyaluronic acid and sphingomyelin levels was analyzed by ELISA. The results were expressed in mean±SD values from three independent experiments. Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

자외선 조사한 HS27 세포의 염증성 cytokine 형성 억제 효과

자외선 조사는 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호 경로를 조절하여 피부의 matrix metalloproteinases(MMPs)를 증가시키고 ECM 단백질 분해를 초래한다. 또한 MMPs의 전사인자인 nuclear factor kappa B (NF-κB)는 광손상에 의해 핵으로의 전위가 발생하게 되며, 전위된 NF-κB는 tumor necrosis factor alpha(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), IL-6과 같은 염증성 cytokine을 증가시켜 피부 손상에 기여한다(Han 등, 2022; Yamamoto와 Gaynor, 2004). 따라서 양태반 펩타이드 추출물의 HS27 세포에서 염증성 cytokine 분비율에 미치는 영향을 평가하고자 하였다.

본 연구에 앞서 양태반 펩타이드 분말 처리에 따른 HS27 세포 독성을 평가한 결과(자료미제시), 800~1,000 µg/mL의 농도에서 세포 생존율이 80% 이하로 감소하였으며, 700 µg/mL의 농도까지 안전범위로 생각되어 이 범위 내에서 실험 농도를 설정하였다. 자외선 조사한 HS27에 양태반 펩타이드 분말 처리가 염증성 cytokine(TNF-α, IL-1β 및 IL- 6) 분비량에 미치는 영향을 측정한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. TNF-α, IL-1β 및 IL-6에 대하여 자외선 조사군은 정상대조군에 비해 유의적으로 증가하여 cytokine 분비가 유도된 것을 확인하였다. 양성대조군(PC)과 양태반 펩타이드 분말 처리군은 전 농도에서 자외선 조사군에 비해 유의적으로 감소한 결과를 보였다(P<0.05). 시험군 중 LPP 200에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6에 대해 각각 39.5%, 36.1% 및 34.7% 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 양성대조군과 유사한 활성을 나타내어 염증 반응 조절에 유효성이 있을 것으로 판단되었다.

Fig 2. Effect of lamb placenta peptide powder (LPP) on pro-inflammatory cytokines in UVB-irradiated HS27 cell. (A) TNF-α, (B) IL-1β and (C) IL-6. The cells were treated with UVB (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 µg/mL of L-ascorbic acid (PC) and various concentrations (50, 100, 200 µg/mL) of LPP. IL-1β, IL-6, and TNF-α was analyzed by ELISA. The results were expressed in mean±SD values from three independent experiments. Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

자외선 조사한 HaCaT와 HS27 세포의 피부보습 및 주름 관련인자 유전자 발현 효과

자외선에 의해 피부에 생성된 ROS는 피부 진피층의 collagen과 elastin 절단 및 비정상적인 교차결합을 발생시키며 ECM 구성 성분들의 함량을 감소시켜 피부 손상을 유발한다(Jeon 등, 2014). HA는 UDP-glucuronic acid(UGTrel)와 UDP-N-acetylglucosamine(GlcNAc)을 기질로 사용하여 혈장막에서 세 가지의 hyaluronic acid synthase(HAS)에 의해 합성된 ECM으로, 피부의 보습을 담당하는 인자 중 하나이며, 표피의 수분 증발 저해 및 피부 탄력 유지의 역할을 한다(Dai 등, 2007; Liao 등, 2005; Yang 등, 2021). Elastin은 탄성 섬유의 핵심 단백질로 진피층 ECM의 중요한 구성요소이며 피부, 대동맥, 인대, 폐와 같은 조직의 탄력성과 복원력을 부여한다(Matwiejuk 등, 2022; Shiratsuchi 등, 2016). 자외선에 의한 elastin의 합성 감소, 탄성 섬유의 분해와 파괴의 증가로 elastin 네트워크가 파괴되고, 이는 결국 주름을 생성하게 된다(Weihermann 등, 2017). 표피의 각질층은 각질 세포와 ceramide, cholesterol, 유리 지방산과 같은 세포 간 지질로 구성되며 피부 장벽 구조로 작용한다. 특히 ceramide는 지질의 50%를 차지하여 수분 증발을 방지하고 피부 장벽기능 강화 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이와 관련하여 아토피 피부염과 건선 환자들의 각질층에서 ceramide 함량이 피험자들에 비해 낮은 것으로 밝혀졌다(Kwon 등, 2005; Ohta 등, 2021). Ceramide는 de novo 생합성과 sphingomyelin과 glycosphingolipid의 가수분해에 의해 합성된다. 그중 de novo 경로는 serine palmitoyl transferase(SPT; LCB1)에 의해 촉매 되고 그 대사산물이 ceramide synthase(CerS4)와 dihydroceramide desaturase(DEGS1) 각각의 효소 활성을 거쳐 합성이 이루어진다(Castro 등, 2014).

Transforming growth factor β(TGF-β)는 세포외 결합 조직의 세포 성장, 분화 및 생합성을 조절하는 데 중요하며, 각질형성세포의 성장 억제제이자 피부 섬유아세포의 성장촉진제 역할을 한다(Ke와 Wang, 2021; Massague, 1998). 활성 TGF-β는 TGF-β receptor type 1(TGF-βR1)과 TGF-βR2에 결합하여 인산화하고, 활성화된 TGF-βR1은 small molecules against decapentaplegic homolog 2 (Smad2)와 Smad3를 인산화하여 Smad4와 복합체 형성 후 핵으로 이동한다. 이러한 Smad 복합체는 TGF-β/Smad 경로의 다양한 효과를 초래한다(Chung 등, 2021). TGF-β/ Smad 경로는 피부 섬유아세포에 collagen type Ⅰ과 Ⅲ을 포함한 ECM의 여러 구성요소를 합성하는 주요 과정으로, 자외선 노출에 의해 신호 전달 구성요소의 기능상실 및 돌연변이가 발생하면 MMP-1의 활성화로 collagen type 1의 분해가 증가하고, procollagen type Ⅰ과 Ⅲ의 합성이 감소하여 광노화가 진행된다(Ke와 Wang, 2021; Kim 등, 2021; Quan 등, 2002).

본 연구에서 HaCaT 세포에서 피부보습 관련 인자 5종(UGTrel7, GlcNAc, elastin, LCB1, DEGS1)과 HS27 세포에서 주름개선(콜라겐 합성) 관련 인자 3종(TGF-βR1, procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ)에 대한 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 3, Fig. 4), 정상 대조군에 비해 자외선 조사군이 각각의 관련 인자의 발현을 유의적으로 억제하여 자외선에 의해 손상을 입은 것으로 확인되었다. 양성 대조군과 양태반 펩타이드 분말 전 농도 처리군은 자외선 조사군 대비 유의적으로 향상시키며 자외선에 의한 피부보습 및 주름개선 인자의 mRNA 발현의 감소 보호 효과를 확인하였다(P< 0.05). 또한 LPP 200은 피부보습 인자 UGTrel7, GlcNAc, elastin, LCB1, DEGS1에 대하여 각각 245.3%, 144.2%, 217.3%, 156.7%, 107.8%의 증가를, 주름개선 인자 TGF- βR1, procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ에 대해서 각각 100.4%, 115.9%, 130.0%의 증가로 양성대조군과 유사한 발현량을 보였다.

Fig 3. Effect of lamb placenta peptide powder (LPP) on mRNA expression of genes related to moisturizing in UVB-irradiated HaCaT cell. (A) UDP-glucuronic acid (UGTrel7), (B) UDP-N- acetylglucosamine (GlcNAc), (C) Elastin, (D) Long chain base 1 (Serine palmitoyltransferase; LCB1(SPT)) and (E) Dihydroceramide sturase (DEGS1). The cells were treated with UVB (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 µg/mL of L-ascorbic acid (PC) and various concentrations (50, 100, 200 µg/mL) of LPP. mRNA expression of UGTrel7, GlcNAc, Elastin, LCB1 (SPT) and DEGS1 was analyzed by real-time PCR. The results were expressed in mean±SD values from three independent experiments. Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

Fig 4. Effect of lamb placenta peptide powder (LPP) on mRNA expression of genes related to collagen synthesis in UVB-irradiated HS27 cell. (A) Transforming growth factor beta-receptor 1 (TGF-βR1), (B) procollagen typeⅠ, and (C) collagen typeⅠ. The cells were treated with UVB (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 µg/mL of L-ascorbic acid (PC) and various concentrations (50, 100, 200 µg/mL) of LPP. mRNA expression of TGF-βR1, procollagen typeⅠ, and collagen typeⅠ was analyzed by real-time PCR. The results were expressed in mean±SD values from three independent experiments. Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

자외선 조사한 HaCaT와 HS27 세포의 피부보습 및 주름 관련 인자 단백질 발현 효과

HA는 HAS에 의해 세포 외 공간에서 합성되며, 촉매 활성이나 세포의 유형이 다른 세 가지 효소로 HAS1, HAS2 및 HAS3가 있다. 그중 HAS2는 정상적인 각질 세포에서 가장 잘 발현되며 노화된 피부에서 하향 조절되는 효소이다. 따라서 각질세포에서의 HAS2 발현 조절은 HA 합성을 조절함으로써 피부 수분과 향상성을 유지할 수 있음을 의미한다(Lee 등, 2019).

피부가 자외선에 노출되면 MAPK 신호경로가 활성화되고 extracellular signal-regulated kinase(ERK), p38, c- jun N-terminal kinase(MAPK8; JNK)의 인산화를 유도하여 세포 분화를 촉진하게 된다(Wäster 등, 2014). MAPK 경로의 활성은 c-Jun과 c-Fos의 발현을 증가시켜 activating protein-1(AP-1)을 활성화한다(Neves 등, 2020; Xu 등, 2014). 또한 AP-1의 활성화는 MMPs의 활성을 증가시키는데 이 효소는 ECM으로부터

collagen과 elastin 섬유를 분해하여 손상을 가속한다(Neves 등, 2020). MMPs 중 MMP-1, MMP-3, MMP-9가 collagen을 분해하는데, MMP- 1은 collagen type Ⅰ을 1차 분해하고 MMP-9는 MMP-1에 의해 분해된 collagen 조각을 가수분해하여 피부노화에 중요한 역할을 한다(Chauhan과 Shakya, 2009; Jang과 Lee, 2018). MMP 매개 collagen 분해는 TGF-βR1의 하향 조절에 의한 Smad3의 인산화 억제로 TGF-β/Smad 신호 손상을 통해 발생하기도 하며, 이는 MMP-1의 활성화로 collagen type Ⅰ의 분해를 증가시켜 노화를 촉진한다(Ke와 Wang, 2021; Kim 등, 2021).

본 연구에서는 자외선 조사로 손상된 HaCaT 세포에서 양태반 펩타이드 분말 처리에 대한 피부 보습 관련 인자(HAS2)와 HS27 세포에서 주름생성 관련 인자(MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun, MMP-1, MMP-3, MMP-9 및 Smad3)의 단백질 발현량을 측정하였다. HaCaT 세포에서 피부보습 관련 인자인 HAS2의 단백질 발현량 측정 결과(Fig. 5), 양태반 펩타이드 분말을 처리한 전 농도의 시험군에서 자외선 조사군에 비해 유의하게 증가하였고(P<0.05), 고농도로 처리한 LPP 200에서 114.2%의 증가율로 양성대조군과 유의적인 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다. HS27 세포에서 주름생성 관련 단백질 발현량 측정 결과(Fig. 6, Fig. 7), 양태반 펩타이드 분말을 처리한 모든 시험군에 대하여 MAPK8(JNK), c-Fos, c-Jun, MMP-1, MMP-3 및 MMP-9의 단백질 발현은 자외선 조사군 대비 유의하게 감소한 것을 확인하였고, Smad3의 단백질 발현은 자외선 조사군과 비교 시 유의적인 증가를 나타냈다(P<0.05). 그중 LPP 200은 MMP-9를 정상대조군과 유의한 수준으로 감소시켰으며, Smad3는 양성대조군보다 높은 단백질 발현을 보였다.

Fig 5. Effect of lamb placenta peptide powder (LPP) on protein expression of HAS2 in UVB-irradiated HaCaT cell. The cells were treated with UVB (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 µg/mL of L-ascorbic acid (PC) and various concentrations (50, 100, 200 µg/mL) of LPP. Protein expression of HAS2 was analyzed by western blot. The results were expressed in mean±SD values from three independent experiments. Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

Fig 6. Effect of lamb placenta peptide powder (LPP) on protein expression of MAPK8 (JNK), c-Fos and c-Jun in UVB-irradiated HS27 cell. (A) MAPK8 (JNK), (B) c-Fos, and (C) c-Jun. The cells were treated with UVB (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 µg/mL of L-ascorbic acid (PC) and various concentrations (50, 100, 200 µg/mL) of LPP. Protein expression of MAPK8 (JNK), c-Fos and c-Jun was analyzed by western blot. The results were expressed in mean±SD values from three independent experiments. Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

Fig 7. Effect of lamb placenta peptide powder (LPP) on protein expression of MMP’s (1, 3, 9), and Smad3 in UVB-irradiated HS27 cell. (A) MMP-1, (B) MMP-3, (C) MMP-9, and (D) Smad3. The cells were treated with UVB (50 mJ/cm²) except NC and incubate for 24 h with 100 µg/mL of L-ascorbic acid (PC) and various concentrations (50, 100, 200 µg/mL) of LPP. Protein expression of MMP’s (1, 3, 9), and Smad3 was analyzed by western blot. The results were expressed in mean±SD values from three independent experiments. Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

자외선 조사한 실험동물 피부조직의 피부보습 및 주름 관련 인자 유전자 발현 효과

HaCaT와 HS27 세포에서 관찰된 양태반 펩타이드 추출물의 피부 보습 및 주름개선 관련 인자의 유전자 발현 조절이 실험동물인 hairless mice 피부조직에서도 영향이 있을지 평가를 진행하였다. Fibrillin 미세섬유는 elastin과 함께 구성된 탄성 섬유로 조직의 탄력성을 부여하는 ECM의 중요한 구성요소이며 다양한 기관에 존재한다(Eckersley 등, 2018). Fibrillin-1은 procollagen, tropoelastin과 같은 ECM의 단백질로 노화된 피부에서 발현이 감소하는 것으로 나타났다(Kim 등, 2006).

본 연구에 앞서 8주의 실험 기간에 양태반 펩타이드 분말을 투여한 후 동물의 체중변화, 식이 섭취량, 식이효율 및 장기무게에 미치는 영향을 측정한 결과(Table 6), 모든 실험적 지표에서 정상대조군, 자외선 조사군, 양성대조군 1(PC 1; L-ascorbic acid), 양성대조군 2(PC 2; arbutin) 및 양태반 펩타이드 분말 전체 섭취군은 모든 군 간의 유의적인 차이를 보이지 않았다(P<0.05). 이러한 결과를 통해 양태반 펩타이드 분말은 실험동물의 식이 섭취나 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

Table 6 . Body weight gain, food consumption, FER, and organ weight.

Group1)	Weight gain (g)2)	Food intake (g/day)	FER3)	Liver (g)	Kidney (g)	Spleen (g)
NC	4.0±1.0NS	2.2±1.4NS	100±29.3NS	4.2±0.2NS	1.3±0.1NS	0.4±0.0NS
C	3.8±1.1	2.4±1.3	100±31.0	4.4±0.1	1.3±0.1	0.5±0.0
PC 1	4.9±0.5	2.6±1.1	100±16.0	4.3±0.2	1.2±0.2	0.4±0.0
PC 2	4.0±0.8	2.8±1.1	100±22.7	4.4±0.1	1.3±0.1	0.4±0.0
LPP 0.05%	3.7±1.1	2.5±0.9	100±34.4	4.3±0.2	1.3±0.1	0.4±0.1
LPP 0.1%	4.0±0.8	2.8±0.9	100±20.1	4.2±0.3	1.3±0.1	0.4±0.1
LPP 0.2%	4.0±2.0	2.7±1.1	100±49.2	4.2±0.0	1.3±0.1	0.4±0.0

¹⁾NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet..

²⁾Weight gain (g/8 weeks)＝final body weight (g)－initial body weight (g)..

³⁾Food efficiency rate (FER)＝{weight (g)/ food intake (g)}×100..

Values are presented as means±SD (n=8). Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05..

NS: Not significant..

자외선을 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 피부보습 관련 인자 UGTrel8, GlcNAc, fibrillin-1, LCB1(SPT) 및 DEGS1과 콜라겐 합성 인자 TGF-βR1, procollagen type Ⅰ 및 collagen type Ⅰ의 유전자 발현을 측정하였다. 피부보습 관련 인자의 유전자 발현 측정 결과(Fig. 8), 5종의 인자에 대하여 양태반 펩타이드 분말을 식이의 0.1%와 0.2%로 섭취한 시험군(각각 LPP 0.1%와 LPP 0.2%)에서 자외선 조사군(C)에 비해 유의적으로 발현이 향상되는 것을 확인하였다(P<0.05). 그중 LPP 0.2%에서 UGTrel8, GlcNAc,

Fig 8. Box-whisker plot of lamb placenta peptide powder (LPP) on mRNA expression of genes related to moisturizing in UVB- irradiated SKH-Ⅰ hairless mice. (A) UDP-glucuronic acid (UGTrel8), (B) UDP-N-acetylglucosamine (GlcNAc), (C) Fibrillin-1, (D) Long chain base 1 (Serin palmitoytransferase; LCB1 (SPT)), and (E) Dihydroceramide sturase (DEGS1). NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet. The results were expressed in mean±SD values (n=8). Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

fibrillin-1, LCB1(SPT) 및 DEGS1에 대하여 각각 105.0%, 159.7%, 79.0%, 173.2% 및 157.1%로 높은 유전자 발현량을 보이며 피부 보습에 도움이 될 수 있음을 확인했다. 주름개선 관련 인자의 유전자 발현 측정 결과(Fig. 9), TGF-βR1과 collagen type Ⅰ은 양태반 펩타이드 분말을 섭취한 LPP 0.1%와 LPP 0.2%에서 자외선 조사군 대비 유의적으로 증가하였으며(P<0.05), procollagen type Ⅰ의 유전자 발현은 양태반 펩타이드 분말 전 섭취군에서 자외선 조사군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(P<0.05). 그중 가장 고농도로 섭취한 LPP 0.2%에서 TGF-βR1, procollagen type Ⅰ및 collagen type Ⅰ에 대하여 각각 218.9%, 166.1% 및 153.7%의 증가율을 나타냈다.

Fig 9. Box-whisker plot of lamb placenta peptide powder (LPP) on mRNA expression of genes related to collagen synthesis in UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice skin. (A) Transforming growth factor beta-receptor 1 (TGF-βR1), (B) procollagen type Ⅰ and (C) collagen type Ⅰ. NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2 % of diet. The results were expressed in mean±SD values (n= 8). Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

자외선 조사한 실험동물 피부 조직의 피부보습 및 주름 관련 인자 단백질 발현 효과

피부보습 및 주름 관련 인자의 mRNA 발현을 조절하는 데 효과가 있는 양태반 펩타이드 분말의 섭취에 대한 실험동물 등 피부조직의 피부보습 관련 인자(HAS2)와 주름개선 관련 인자(MAPK8(JNK), c-Fos, c-Jun, MMP-1, MMP-3, MMP-9, Smad3)의 단백질 발현을 측정하였다. 피부조직의 피부보습 관련 인자의 단백질 발현 측정 결과(Fig. 10), HAS2는 양태반 펩타이드 분말을 섭취한 모든 시험군에서 유의적으로 증가하는 추세를 보였으며, LPP 0.2%는 자외선 대조군에 비해 251.5%의 증가율을 나타냈고 정상대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았다(P<0.05).

Fig 10. Box-whisker plot of lamb placenta peptide powder (LPP) on protein expression of HAS2 in UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice. NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet. The results were expressed in mean±SD values (n=8). Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

주름개선 관련 인자의 단백질 발현을 평가한 결과(Fig. 11, Fig. 12), MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun, MMP-1, MMP-3 및 MMP-9의 인자에서 양태반 펩타이드 분말을 섭취한 모든 시험군에서 자외선 조사군 대비 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며(P<0.05), LPP 0.2%에서 각각 39.5%, 53.0%, 48.8%, 39.5%, 56.9% 및 45.8%의 감소율을 보였다. Smad3에서는 양태반 펩타이드 분말 섭취군 모두 유의적으로 증가하였으며(P<0.05), 그중 LPP 0.2%에서 117.3%의 증가로 양성대조군인 PC 1과 PC 2보다 더 많은 발현량을 보이며 뛰어난 주름개선 효과를 나타내었다.

Fig 11. Box-whisker plot of lamb placenta peptide powder (LPP) on protein expression of MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun, MMP’s (1, 3, 9), and Smad3 in UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice skin. (A) MAPK8 (JNK), (B) c-Fos, and (C) c-Jun. NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet. The results were expressed in mean±SD values (n=8). Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

Fig 12. Box-whisker plot of lamb placenta peptide powder (LPP) on protein expression of MMP’s (1, 3, 9), and Smad3 in UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice skin. (A) MMP-1, (B) MMP-3, (C) MMP-9, and (D) Smad3. NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet. The results were expressed in mean±SD values (n=8). Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

자외선 조사한 실험동물 피부조직의 항산화 효소 활성화

자외선에 의해 생성된 ROS는 피부 세포 내 신호전달 체계에 영향을 주어 DNA와 유전자 발현을 손상시키고 진피층을 구성하는 collagen 성분을 분해하여 피부 주름 생성을 초래한다(Bowden, 2004). ROS는 singlet oxygen(¹O₂), superoxide(O₂^·-), hydrogen peroxide(H₂O₂) 그리고 hydroxyl radical(^•OH)이 있으며(Nakai와 Tsuruta, 2021), 이러한 활성산소를 제거하는 효소에 의한 방어 시스템에는 SOD, CAT, GPx 등이 있다(Hong, 2009). SOD는 표피 각질세포, 섬유아세포에 존재하며 자외선과 가시광선에 의해 생성된 O₂^·-를 H₂O₂로 환원시키는 촉매 작용을 통해 ROS를 제거하는 효소이다(Abreu와 Cabelli, 2010). 세 가지의 SOD가 생체 내에 존재하는데, 이는 미토콘드리아에 있는 manganese SOD(Mn-SOD), 세포질에 있는 copper/zinc SOD(Cu/Zn SOD) 및 세포 외 SOD가 있다(Abreu와 Cabelli, 2010; Hong, 2009). CAT와 GPx는 세포 내 H₂O₂를 물로 분해하여 산화 스트레스를 강하게 완화하는 중요한 항산화 효소이다(Nakai와 Tsuruta, 2021).

본 연구에서는 UVB 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 항산화 효소인 SOD, CAT, GPx 활성을 측정하였으며 결과는 Fig. 13에 나타내었다. SOD 활성 측정 결과, 양태반 펩타이드 분말 섭취군 중 LPP 0.2%는 PC 2와 유사한 수치를 나타내며 SOD 활성을 증가시키는 경향을 보였다. CAT와 GPx 활성은 LPP 0.1%와 LPP 0.2%에서 자외선 조사군에 비해 유의적으로 증가하였으며(P<0.05), 이 중 LPP 0.2%는 자외선 조사군 대비 각각 50.3%와 45.9%의 활성 증가를 보이며 PC 2보다 높은 효소 활성과 PC 1과 유사한 값을 나타내었다. 이에 따라 양태반 펩타이드 분말이 피부 건강 관련 항산화 효소를 활성화시켜 ROS로 인한 보습 및 주름 개선 인자들의 손상을 보호하여 피부 건강에 효과적인 것으로 사료되었다.

Fig 13. Box-whisker plot of lamb placenta peptide powder (LPP) on SOD, CAT, and GPx activity in UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice skin. (A) SOD, (B) CAT, and (C) GPx activity. NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet. The results were expressed in mean±SD values (n=8). Significance were indicated using Duncan’s test at P<0.05.

자외선 조사한 실험동물 표피의 보습 효과

피부는 표피, 진피 및 피하지방으로 이루어져 있으며, 이 중 가장 외각에 존재하는 표피의 각질층은 피부의 탄력 및 유연성을 유지하는 천연보습인자와 HA를 함유하여 피부장벽 역할을 수행한다(Kwon 등 2013; Verdier-Sévrain과 Bonté, 2007). 그러나 자외선은 이러한 단백질들의 발현에 영향을 미쳐 표피 각질층의 수분 함량을 저하시키고 피부장벽기능 이상으로 외부로의 수분 손실량이 증가하게 된다. 이로 인해 결국 피부 건조증이 발생되며 노화가 가속화된다(Kwon 등 2013; Pyun 등, 2012; Yang 등, 2021). 따라서 양태반 펩타이드 분말 섭취에 따라 자외선 조사된 실험동물 등 피부 조직의 수분 손실 정도를 측정하여 피부 보습 효과를 연구하였다.

자외선을 조사한 실험동물 등 피부조직의 경표피 수분함량을 측정한 결과(Fig. 14), 자외선 조사군은 정상대조군에 비해 수분함량이 유의적으로 감소하여 피부보습 기능이 저하됨을 확인하였다. LPP 0.1%와 LPP 0.2%는 자외선 조사군에 비해 각각 20.5%와 36.9%로 표피의 수분이 증가한 것을 확인할 수 있었다(P<0.05). 그중 가장 고농도로 섭취한 LPP 0.2%군은 PC 1과 PC 2와 유사한 수분함량을 보이며 우수한 수분 손실 보호 효과를 나타냈다.

Fig 14. Box-whisker plot of lamb placenta peptide powder (LPP) on skin hydration in back skin from UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice. NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet. The results were expressed in mean±SD values (n=8). Significance were indicated using Duncan’s test at P< 0.05.

자외선 조사한 실험동물의 표피 주름 생성 억제 효과

자외선은 피부 손상의 주요 요인으로 피부의 면역체계에 영향을 미쳐 광노화, 염증, 각질 세포 증식, 표피 과형성 등을 발생시킨다. 광노화로 인해 유발되는 주름 형성은 피부의 collagen, elastin, HA 등 구조 단백질 생성 능력이 감소하고, collagenase의 생합성 증가로 이어져 MMPs의 발현이 증가하면 진피 내 탄력 섬유와 같은 단백질의 분해가 유도되어 발생한다(Kim 등 2015; Lee 등, 2015; Lee 등, 2016). 또한 자외선으로 인해 피부 표피의 두께가 증가하면 주름이 형성되고(Urikura 등, 2011), 이는 일반적인 홍반의 발생을 동반하는 명증 현상의 일부로 현재 활발한 연구 대상으로 알려져 있다(Lopez 등, 2004).

본 연구에서는 hairless mice의 피부에 자외선을 조사한 뒤 등 조직을 디지털카메라에 의한 형태학적 관찰 및 H&E 염색방법을 통한 조직병리학적 관찰을 통해 주름 생성 정도를 평가하였다. 실험동물 등 피부 조직을 형태학적으로 관찰한 결과(Fig. 15), 자외선 조사 후 4주 차부터 주름 형성이 눈에 띄게 증가하기 시작하였으며 광노화로 인한 건조함으로 각질형성과 탄력 저하도 증가하여 8주 후 자외선 조사군은 정상대조군에 비해 깊은 주름이 형성된 것을 확인할 수 있었다. PC 1, PC 2와 양태반 펩타이드 분말 섭취군(LPP 0.05%, 0.1%, 0.2%)은 자외선 조사군에 비해 주름의 형성이 감소하였으며, 그중 LPP 0.2%는 육안으로 구별이 가능할 정도로 주름과 각질 형성이 상당이 억제된 것을 확인하였다. 자외선 조사한 실험동물의 등 피부 조직에 H&E 염색을 하여 조직병리학적 변화를 관찰하였으며 그 결과를 Fig. 16에 나타내었다. 양태반 펩타이드 분말 섭취군은 자외선 조사군에 비해 표피의 두께가 증가하여 자외선의 영향을 받은 것으로 나타났으며, 양태반 펩타이드 분말을 섭취한 모든 시험군에서 자외선 조사군에 비해 표피의 두께가 농도 의존적으로 감소한 것으로 나타났다. 특히 LPP 0.2%는 PC 1, PC 2와 같이 두께가 상당히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

Fig 15. Image of lamb placenta peptide powder (LPP) on wrinkle in back skin from UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice. NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet. Each image is representative of at least eight animals.

Fig 16. Image of lamb placenta peptide powder (LPP) on skin thickening in back skin from UVB-irradiated SKH-Ⅰ hairless mice. NC: AIN93G, C: UVB irradiation＋AIN93G, PC 1: UVB irradiation＋AIN93G＋L-ascorbic acid 0.15% of diet, PC 2: UVB irradiation＋AIN93G＋Arbutin 0.15% of diet, LPP 0.05%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.05% of diet, LPP 0.1%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.1% of diet, LPP 0.2%: UVB irradiation＋AIN93G＋LPP 0.2% of diet. Each image is representative of at least eight animals.

본 연구를 바탕으로 피부 자외선 노출에 대하여 양태반 펩타이드 분말이 보습 및 주름 개선에 효과가 있음을 나타냈다. 양태반 펩타이드 분말은 항산화 효소 활성(SOD, CAT, GPx)을 조절하여 자외선에 의해 생성되는 ROS를 제거하고, 피부 세포 내 유전자 및 단백질 발현 그리고 신호전달 체계를 조절하여 피부 건강에 도움을 주는 것으로 나타났다. 양태반 펩타이드 분말은 자외선으로 인한 피부 진피층의 ECM 구성 성분(HA, elastin, fibrillin-1) 감소를 방지하는 데 효과가 있었다. 양태반 펩타이드 분말에 의해 UGTrel과 GlcNAc의 유전자 발현이 증가하고, 활성화된 HAS를 통해 결합하여 HA의 함량을 증가시켰으며, 탄성 섬유 핵심 단백질인 elastin과 fibrillin-1의 손상 억제를 통해 보습력과 탄력성 유지에 효과가 있음을 나타냈다. 또한 sphingomyelin과 de novo 경로(LCB1, DEGS1)의 효소 활성 증가를 통해

각질층의 ceramide 합성을 유지하여 피부 보호에 도움을 주었다(Fig. 17A). 양태반 펩타이드 분말은 MAPK 신호경로(JNK)를 차단하여 AP-1(c-Jun, c-Fos)의 활성을 억제하고 MMPs(MMP-1, 3, 9)의 활성을 감소시켜 collagen 분해를 막는다. 또한 TGF-β/Smad 신호 경로 구성 요소(TGF-βR1, Smad3) 손상을 감소시켜 MMP-1 매개 collagen type Ⅰ의 분해로부터 보호하고, procollagen type Ⅰ의 합성을 증가시키는 데 효과가 있다. 추가로 광손상으로부터 NF-κB 신호경로를 통해 발생하는 염증성 cytokine (TNF-α, IL-6, IL-1β) 분비량을 감소시켜 피부 염증 반응으로부터 예방이 가능한 것으로 나타났다(Fig. 17B). 이상의 메커니즘으로 장기간 경구 섭취 시 피부 건조 및 주름 개선에 효과가 있음을 동물모델 연구를 통해 확인하였으며, 양태반 펩타이드 분말의 피부 건강 건강기능식품의 기능성 원료로의 활용 가능성이 높음을 알 수 있다.

Fig 17. Lamb placenta peptide powder (LPP) mechanism for skin moisturizing and anti-wrinkle. (A) Mechanism on skin moisturizing effect. (B) Mechanism on skin anti-wrinkle effect.

본 연구에서는 양태반 펩타이드 분말의 피부 보습과 주름 형성에 미치는 영향을 연구하기 위해 시험관 실험과 동물 실험을 하였다. HaCaT 세포에서의 보습력을 측정한 결과, hyaluronic acid와 sphingomyelin은 자외선 조사군에 비하여 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 자외선 조사에 의한 HaCaT의 피부보습인자(UGTrel7, GlcNAc, Elastin, LCB1 (SPT), DEGS1)와 HS27 세포의 주름개선 인자(TGF-βR1, procollagen type Ⅰ, Collagen type Ⅰ)의 유전자 발현을 측정한 결과, 전 농도에서 유의적으로 증가하며 mRNA 발현 감소를 억제하였다. 또한 양태반 펩타이드 분말은 피부보습 관련 인자인 HAS2와 주름생성 관련 인자인 Smad3의 단백질 발현을 유의적으로 증가시켰으며, MAPK8(JNK), c-Fos, c-Jun, MMPs(MMP-1, 3, 9)의 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰다. 자외선에 노출된 실험동물의 등 피부조직의 피부보습인자(UGTrel8, GlcNAc, fibrillin-1, LCB1(SPT), DEGS1)와 HS27 세포의 주름개선 인자(TGF-βR1, procollagen type Ⅰ, Collagen type Ⅰ)의 유전자 발현을 측정하였을 때 양태반 펩타이드 분말에 의해 유의적으로 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 단백질 발현량을 측정한 결과, 피부 보습인자(HAS2)는 유의적으로 증가하였으며, 주름개선인자(MAPK8(JNK), c-Fos, c-Jun, MMPs(MMP- 1, 3, 9), Smad3) 중 Smad3은 유의적으로 증가하였고 이외의 인자들은 감소하여 뛰어난 피부보습 및 주름개선 효과를 나타내었다. 양태반 펩타이드 분말 섭취에 따른 피부 조직의 SOD, CAT, GPx 활성을 측정한 결과, 자외선 조사군 대비 유의적으로 증가하여 항산화 효소 활성 조절을 통해 피부 구성 인자 보호 효과가 있음을 확인하였다. 마지막으로 실험동물의 표피 수분함량을 측정한 결과, 양태반 펩타이드를 식이의 0.2%로 섭취한 군에서 자외선 조사군에 비해 36.9%로 증가하여 효과적인 수분 손실 억제를 보였으며, 표피 주름과 각질형성 그리고 두께가 양성대조군과 유의한 수준으로 감소한 것으로 나타났다. 따라서 본 연구 결과를 통해 양태반 펩타이드 분말은 항산화 효소활성을 증가시켜 자외선으로부터의 ROS를 제거하며 피부 보습 및 주름 개선 신호 경로 및 주요 구성인자 활성을 조절하여 피부 건강에 도움이 되는 것으로 나타났으며, 이는 피부 건강 기능성 소재로써 활용 가능성을 기대할 수 있다.