국민 소득의 증가와 의학 기술의 발달로 인해 사람의 기대수명이 상승함에 따라 건강에 관한 관심이 높아지고 있으나, 서구화된 식습관과 신체활동의 감소 등으로 인한 열량 과잉 섭취는 비만 인구의 증가로 이어지고 있다(Song, 2022). 비만은 대사성 질환의 일종으로 제2형 당뇨병, 심혈관계 질환, 고지혈증, 암, 고혈압 등과 같은 만성질환의 위험인자이므로 세계보건기구(WHO)는 인류에게 위협이 되는 주요 보건문제로 비만을 인식하고 적극적인 대처를 권고하고 있다(Mohammed 등, 2018). 비만은 에너지 섭취와 소비 간의 불균형으로 지방세포의 생성과 크기가 커지는 비대(hypertrophy)와 지방세포의 수가 증가하는 분화(hyperplasia)를 통한 체내 지방조직의 과잉 축적이 주된 원인이다(Jeong, 2021). 지방전구세포인 3T3-L1은 여러 전사인자 및 유전자 발현으로 지방세포로 분화되면서 세포 내 지방을 축적하며, 이때 활성화되는 주요 전사인자는 CCATT/enhancer- binding protein α(C/EBPα)와 peroxisome proliferator- activated receptor γ(PPARγ)가 있다(Park 등, 2020). C/EBPα는 지방세포 분화 유전자의 발현을 직접적으로 유도하고 PPARγ는 ligand 활성 수용체 인자로 지방 생성 과정 동안 높은 수준을 유지함과 동시에 지방생성 및 분화와 관련된 유전자의 활성을 촉진한다(Jeong, 2016). 이들은 sterol regulatory element-binding protein(SREBP), fatty acid synthase(FAS) 등과 같은 adipose-specific 유전자 발현을 활성화하여 지방산 합성 및 분화를 촉진함에 따라 지질 축적에 관여한다(Ho 등, 2013).

비만인 경우 체내 많은 양의 유리지방산에 의한 활성산소종 및 초과산화물의 생산 증가는 인슐린 신호전달을 억제하며, 또한 생성된 과산화물은 2차 전령인자로 작용하여 세포와 조직에 독성을 일으켜 질병을 유발한다(Park, 2005). 이와 같이 체내 지질 축적 증가는 비만을 유발할 뿐만 아니라 항산화 방어계에 영향을 미쳐 다양한 질병을 초래하므로 지방세포 분화과정에 관여하는 전사인자 및 유전자의 활성을 억제하는 것이 중요하다(Park, 2014).

유자(Citrus junos)는 시트러스 계열 중에서 비타민 C 함량이 레몬의 약 3배에 달해 항산화 활성이 높은 소재로 각광받고 있으며 비타민 A, 유기산, 무기질 등이 풍부하다(Lee 등, 2012). 유자는 다양한 생리활성 효능을 가지는 나린진과 헤스페리딘의 함량이 높으며 비타민, 식이섬유와 리모넨, 테르피넨 등을 주요 성분으로 하는 독특한 향기성분을 지닌다(Kim, 2022). 특히, 유자는 과육을 위주로 이용하는 다른 과일과 달리 과육과 과피를 모두 이용하므로 과피에 함유된 유효성분을 쉽게 섭취할 수 있는 장점이 있다(Lee, 2013). 유자 과피는 펙틴과 같은 식이섬유로 인해 생분해성이 높아 의약소재 및 화장품으로 다수 활용되고 있으며, 과육보다 영양적으로 가치 있고 더 많은 생리활성성분을 함유하고 있다(Park 등, 2001). 최근에는 숙성이 완료된 완숙과보다 미숙과일 때 폴리페놀과 헤스페리딘, 나린진, 루틴 등의 항산화 물질의 함량이 높다는 연구가 발표되면서 풋귤, 풋여주 등과 같은 미숙과 연구가 활발히 이루어지고 있다(Ryu 등, 2021). 유자 역시 미성숙 유자가 완숙 유자에 비해 식이섬유 함량이 높으며, 그중에서도 수용성 식이섬유인 펙틴 함량이 높다고 보고하였다(Nam 등, 2021). 그러나 성숙 유자에 관한 연구에 비해 미성숙 유자에 관한 연구는 매우 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 미숙유자의 항산화 활성 및 지방분화억제 효과를 확인하기 위하여 총 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, 라디칼 소거능, 환원 활성 등을 분석하고 3T3-L1 세포를 이용해 지방분화에 미치는 영향을 비교･분석하였다.

유자 과피 열수추출물 제조

유자는 전라남도 고흥군 두원면 용반리에서 재배된 19년생 탱자접목묘에서 수확하여 사용하였으며 2021년 10월에는 미숙유자, 11월에는 성숙유자를 각각 수확하여 정수로 수회 세척 후 반으로 썰어 과육과 과피를 분리하였다. 분리한 과피는 잘게 썰어 열풍건조기(Daihan Scientific)에 37°C로 8시간 건조하여 수분을 제거하고 분쇄기(BL682KR, Ninja)로 분말화하였다. 각 분말 시료는 무게 10배(w/v)의 증류수를 첨가하여 80°C에서 3시간 동안 추출기(Mtops)로 추출한 후 여과지(No 2. Whatman)로 여과한 다음 회전진공증발장치(EYELA rotary evaporator, Rikakikai Co.)로 농축한 뒤 동결건조기(Operon Co.)로 건조한 후 사용하였다.

총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량

총 폴리페놀 함량은 Ryu(2020)의 방법을 응용하여 측정하였다. 시료 용액 160 μL에 Folin-Ciocalteu’s phenol 시약(Sigma-Aldrich Co.) 160 μL를 첨가하여 3분간 반응시킨 후 10% sodium carbonate(Duksan Pure Chemicals Co.) 160 μL를 가하여 암소에서 1시간 동안 방치한 뒤 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용한 표준곡선에 대입하여 g당 mg gallic acid equivalents(GAE)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량은 Herald 등(2012)의 방법을 수정･보완하여 측정하였다. 시료 용액 40 μL에 10% aluminium nitrate(Sigma-Aldrich Co.) 16 μL와 1 M potassium acetate(Sigma-Aldrich Co.) 16 μL를 첨가하고 메탄올(Daejung Chemicals & Metals Co.) 328 μL를 혼합하여 암실에서 40분간 반응시킨 후 microplate reader(Versamax, Molecular Devices)를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 rutin(Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 g당 mg rutin equivalents(RE)로 나타내었다.

나린진 및 헤스페리딘 함량

유자에 다량 함유되어 있다고 알려진 생리활성물질인 나린진과 헤스페리딘을 분석하기 위하여 분말 시료 1 g에 메탄올(Mallinckrodt Baker Inc.) 50 mL를 넣고 20분간 sonication 한 후 0.45 μm syringe filter로 여과한 것을 시험용액으로 사용하였다. 나린진과 헤스페리딘은 high performance liquid chromatography(1260B, Agilent)를 사용하여 측정하였으며 컬럼은 Zorbax Eclipse XDB C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 µm)을 사용하였고 이동상은 acetonitrile:water:formic acid(21:78.8:0.2)로 사용하였다. 이동상 유속은 1 mL/min으로 하였고 시료 주입량은 20 μL를 사용하였다. 나린진과 헤스페리딘의 표준품은 Sigma- Aldrich 제품을 사용하였다.

항산화 활성 측정

α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma Chemical Co.) 라디칼에 대한 각 시료의 환원력을 측정하기 위해 시료 용액 100 µL와 0.2 mM DPPH 100 µL를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Ryu, 2020). DPPH 라디칼 소거능(%)은 (1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100으로 산출하였다. ABTS 라디칼 소거능 측정은 Biglari 등(2008)의 방법을 수정･보완하여 측정하였다. 24.5 mM potassium persulfate(Sigma- Aldrich Co.) 0.5 mL에 70 mM 2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt(ABTS, Sigma-Aldrich Co.) 0.5 mL와 증류수 4 mL를 혼합하여 용액을 제조한 뒤 암소에서 12시간 동안 방치하였다. 그 후 ABTS 용액은 734 nm에서 흡광도 0.70±0.05 값이 나올 때까지 50% 에탄올에 희석하였으며 제조한 ABTS 용액 100 μL에 유자 시료 용액 50 μL를 혼합하여 암실에서 반응한 뒤 734 nm에서 흡광도를 측정하고 (1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100 식에 대입하여 산출하였다.

SOD 활성은 측정용 kit(DG-SOD200, Dogenbio)을 활용하였다. 희석 용액에 희석된 샘플 20 μL와 WST solution 200 μL, Xanthine oxidase 20 μL를 넣은 혼합액을 만들어 37°C에서 20분 동안 반응시킨 후 microplate reader (Versamax)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 값은 (1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)× 100으로 산출하였다. Ferric reducing antioxidant power (FRAP)는 Benzie와 Strain(1996) 방법을 일부 변형하여 acetate buffer(300 mM, pH 3.6) 10 mL에 10 mM 2,4,6- tris(2-pyridyl)-s-triazine(Sigma-Aldrich Co.) 1 mL와 20 mM ferric chloride hexahydrate(FeCl₃･6H₂O)(Sigma-Aldrich Co.) 1 mL를 가하여 혼합한 뒤 항온수조(Daewon Scientific)를 이용하여 37°C에서 30분간 반응 후 FRAP reagent를 제조하였다. 유자 시료 용액 50 μL에 FRAP reagent 150 μL를 첨가하여 37°C에 30분간 반응 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 배양 및 지방세포 분화 유도

3T3-L1 지방전구세포는 American Type Culture Collection(CL-173)에서 구입하여 10% newborn calf serum (Gibco)과 1% anti-biotic-antimycotic(Gibco)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Gibco)을 이용하여 confluent 상태가 될 때까지 37°C에서 CO₂ 5% 상태로 배양하였다. 세포가 confluent 한 상태가 되면 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco), 10 μg/mL insulin(Sigma-Aldrich Co.), 0.25 μM dexamethasone(Sigma-Aldrich Co.), 0.5 mM 3-isobutyl-1-meth-yl-xanthine (Sigma-Aldrich Co.)이 포함된 DMEM으로 교환하여 2일 동안 배양하였다. 2일 후에 10% FBS와 10 μg/mL insulin이 포함된 배지로 교체한 후, 4~8일까지는 10% FBS를 포함한 배지를 처리하여 지방세포로 분화시켰다. 세포 생존율은 MTT 시약(Duchefa Biochemie)을 이용하여 측정하였으며 3T3-L1 지방전구세포는 96-well plate에 3×10³ cells/well로 분주하고 2일간 배양하여 부착시킨 후, 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후에 배양액을 제거하고 제조한 2 mg/mL의 MTT 시약을 분주한 뒤 37°C에서 1시간 동안 반응하였다. 시약을 제거한 후 DMSO(Sigma-Aldrich Co.)를 well당 100 μL씩 처리하여 발색을 유도한 뒤 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율이 90%가 넘는 100 μg/mL 농도에서 실험을 진행하였다.

Oil-Red O 및 중성지질 함량

분화된 지방세포는 배양액을 제거하고 Dulbecco’s phosphate-buffered saline(D-PBS, Welgene)으로 3회 세척한 뒤 10% formalin(Daejung)을 분주하여 1시간 동안 세포를 고정하였다. 고정액 제거 후 D-PBS(Welgene)로 3회 추가 세척한 뒤 0.5% Oil Red O(Sigma-Aldrich Co.) 염색시약을 분주하여 20분간 염색하였다. 이후 증류수로 3회 세척하고 표면이 마르지 않도록 D-PBS(Welgene)를 1 mL 분주하여 현미경(Olympus)으로 분화된 세포의 사진을 촬영하였다. 촬영이 끝난 뒤 정량적 분석을 위하여 증류수를 제거한 후 완전히 건조하고 isopropyl alcohol(Daejung)로 Oil Red O 염색된 지방구를 용출시켜 microplate reader(Versamax)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시간 유전자 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR) 분석

Total RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)으로 추출하여 정제하였으며, 추출된 RNA는 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 정량하였다. 이후 superiorscript Ⅲ cDNA synthesis kit(Enzynomics)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하였고 mRNA 발현은 SYBR green PCR kit(Enzynomics)을 이용하여 PCR 분석을 하였다. 각각의 유전자 발현은 동일한 시료의 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 발현을 측정하여 보정하였으며, Ct값을 이용하여 2^-∆∆CT 방법으로 계산하였다(Livak와 Schmittgen, 2001). 유전자별 cDNA RT-PCR primer는 Bioneer에서 제작 주문하여 사용하였으며 primer 염기서열은 Table 1에 제시하였다.

Table 1 . Primer sequences for real-time PCR.

Gene	Full name	Forward/Reverse (5’-3’)
C/EBPα	CCAAT/enhancer-binding protein α	F: CCTTGACCAAGGAGCTCTCA
		R: GCCGAGATAAAGCCAAACA
DGAT2	Diacylglycerol O-acyltransferase 2	F: CTGGCTGATAGCTGTGCTCTACTTC
		R: TGCGATCTCCTGCCACCTTTC
FAS	Fatty acid synthase	F: TTGGAGCTAAGGCATGGTGG
		R: GCAGTTGTCCTCTGGATGCT
GAPDH	Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	F: AAGGTCATCCCAGAGCTGAA
		R: CTGCTTCACCACCTTCTTGA
PPARγ	Peroxisome proliferator-activated receptor γ	F: TCGCTGATGCACTGCCTATG
		R: GAGAGGTCCACAGAGCTGAT
SCD1	Stearoyl-coenzyme A desaturase 1	F: TTCTTCATCGACTGCATGGC
		R: ACTCAGAAGCCCAAAGCTCAG
SREBP1	Sterol regulatory element-binding protein	F: AACCTCATCCGCCACCTG
		R: TGGTAGACAACAGCCGCATC

통계처리

모든 실험은 3회 반복 실험하여 결과를 도출하여 평균±표준오차로 표시하였다. SPSS package 프로그램(version 27.0, SPSS Inc.)을 이용하여 통계적 유의성 검정은 P<0.05 수준에서 Student’s t-test를 이용하여 검정하였다.

총 폴리페놀, 플라보노이드, 나린진 및 헤스페리딘 함량

식물이나 과일에 많이 함유된 2차 대사산물인 폴리페놀 화합물은 유자, 귤, 레몬 등과 같은 시트러스 계열 과일에 풍부하다(Kim, 2022). 폴리페놀 화합물은 한 분자 내 2개 이상의 하이드록실기를 가지는 방향족 화합물로서 효소 단백질 또는 다른 화합물과 수소를 공유하면서 결합하는 특성으로 유리라디칼을 제거하기 때문에 식품 내 항산화 효과를 결정하는 데 매우 중요한 요소로 작용한다(Perron과 Brumaghim, 2009). 미숙유자 과피 열수추출물 폴리페놀 함량을 살펴보면 성숙유자에 비해 1.2배 유의적(P<0.001)으로 높았으며, 총 플라보노이드 함량 역시 성숙유자에 비해 유의적(P<0.01)으로 높았다(Fig. 1).

Fig 1. Contents of total polyphenols, flavonoids, naringin, and hesperidin in hot- water extract of mature and immature yuzu peel. Values are expressed as mean±SE (n=3). Values are significantly different between groups according to Student’s t- test: ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001, versus MYP. MYP: mature yuzu peel, IYP: immature yuzu peel.

Park 등(2020)은 시트러스 계열 과일인 감귤의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 성숙과에 비해 미숙과인 청귤에서 높다고 보고하였다. Hwang 등(2014)은 수확 시기별 유자 품질 연구에서 8~11월 중 수확시기가 늦어질수록 플라보노이드 함량은 낮아진다고 보고하였다. 유자 과육의 플라보노이드는 1.95~3.93 mg%인데 반해 과피는 9.67~11.87 mg%로 과육보다는 과피에 3배 이상의 플라보노이드가 많이 함유된 것으로 보고되었다(Shin 등, 2009).

플라보노이드 배당체인 나린진과 헤스페리딘은 유자에 풍부하게 함유된 쓴맛을 내는 성분으로 항암, 항염증, 고혈압 등의 다양한 생리활성을 지닌다(Chen 등, 2016; de Oliveira 등, 2020). 따라서 본 연구에서 미숙유자의 나린진과 헤스페리딘의 함량을 성숙유자와 비교하였다. 나린진 함량은 성숙유자에 비해 미숙유자 과피 열수추출물에서 각각 1.6배(P<0.01)와 1.2배(P<0.05) 유의적으로 높았다(Fig. 1). Moon 등(2015)의 연구에서도 유자 미숙과 추출물이 성숙과 추출물에 비해 기능성 플라보노이드 성분인 나린진과 헤스페리딘의 함량이 높다고 보고하여 본 결과와 유사하였다. 특히 Shin(2012)의 연구에서 시트러스 계열 과일인 감귤, 레몬, 오렌지, 유자 과피의 헤스페리딘 함량을 비교한 결과 유자가 124 mg/100 g으로 가장 풍부하였으며 레몬, 오렌지, 감귤 순이었다.

항산화 활성

미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물의 항산화 활성을 측정하기 위하여 ABTS 라디칼 소거 활성, DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP 환원력과 SOD 유사활성능을 측정하였다. ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성은 비교적 짧은 시간 내에 항산화능을 측정할 수 있어 다양한 천연소재로부터 항산화 물질을 탐색하기 위해 많이 이용되고 있다(Que 등, 2006). ABTS 라디칼 소거 활성은 미숙유자가 성숙유자에 비해 유의적으로 높은 활성을 보였으나 DPPH 라디칼 소거 활성은 미숙유자는 75%, 성숙유자는 67%로 미숙유자가 다소 높았으나 유의적인 차이를 보이지 않았다(Fig. 2). ABTS법은 과황산칼륨과의 반응에 의해 생성된 ABTS 라디칼이 항산화 물질에 의해 제거되면서 탈색되는 원리를 이용하는 방법이다(Li 등, 2007). FRAP 환원력은 항산화 활성을 보유하는 식품 또는 천연물의 3가 철이온(Fe³⁺)을 2가 철이온(Fe²⁺)의 형태로 환원시켜 청색의 복합체를 형성하는 원리를 이용한 측정으로, 전자공여능을 측정하는 ABTS, DPPH 라디칼 소거 활성 방법에 비해 재현성이 높다고 알려져 있다(Hong, 2012). 본 실험에서 FRAP 환원력을 측정한 결과, 미숙유자는 414.4 μM이고 성숙유자는 394.8 μM로 미숙유자가 성숙유자에 비해 환원력 활성이 유의적으로 높았다(Fig. 2). 그러나 superoxide의 라디칼을

Fig 2. Effects of hot-water extract of mature and immature yuzu peel on antioxidant activities. Values are expressed as mean±SE (n=3). Values are significantly different between groups according to Student’s t-test: ^*P<0.05, versus MYP. MYP: mature yuzu peel, IYP: immature yuzu peel.

소거하는 SOD 유사활성능은 미숙유자는 68.8%고 성숙유자는 61.8% 활성을 보여 군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았다(Fig. 2). Seo 등(2008)의 보고에 의하면 항산화 활성은 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 양의 상관관계가 있다고 보고하였으며 우리의 결과에서도 총 폴리페놀 함량은 ABTS 라디칼 소거 활성(R²= 0.666, P<0.05), FRAP 환원력(R²=0.713, P<0.01)과 양의 상관관계를 보였다. 또한 ABTS 라디칼 소거 활성이 높을수록 FRAP 환원력(R²=0.683, P<0.05)이 높았다.

이와 같이 ABTS 라디칼 소거 활성 및 FRAP 환원력은 미숙유자 과피 열수추출물이 성숙유자 과피 추출물에 비해 유의적(P<0.05)으로 높은 것은 미숙유자가 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드, 나린진과 헤스페리딘과 같은 항산화 물질을 많이 함유함에 기인하는 것으로 사료된다.

지방 세포 분화 및 지질 축적 억제 효과

미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물의 항비만 효과를 확인하기에 앞서 3T3-L1 지방전구세포에 대한 시료의 세포 독성을 MTT assay를 통해 확인한 결과, 100 μg/mL 농도까지 세포독성이 나타나지 않았다(자료미제시). 유자 과피 추출물이 3T3-L1 지방전구세포의 지방분화 미치는 영향을 알아보기 위하여 지방전구세포의 분화를 유도한 뒤 지방구만 특이적으로 염색하는 Oil red O 실험을 하였다. 염색 결과 과피 추출물 모두 지방 분화 세포가 확연히 억제되었다. 이를 정량화하였을 때 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물에서 대조군에 비해 각각 30%(P<0.001), 27%(P<0.001) 감소하여 모두 유의적으로 지방세포 분화가 억제되었으며, 미숙유자와 성숙유자 간의 차이는 없었다(Fig. 3). 미숙유자 과피 열수추출물이 중성지질 함량에 미치는 영향 측정 결과, 대조군에 비해 미숙유자는 42%(P<0.01), 성숙유자는 33% (P<0.001) 감소하여 유의적인 차이를 보였으나 유자 추출물 간의 차이는 없었다(Fig. 3). Lim 등(2014)은 한라봉 진피 추출물 연구에서 시트러스 계열 과실이 지방전구세포의 분화를 억제하여 중성지질의 축적을 낮춘다고 보고하였다. 본 실험에서 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물은 효과적으로 지방분화를 억제하고 중성지방 함량을 유의적으로 낮추었으나 숙성 정도에 따른 통계적 차이는 없었다.

Fig 3. Effects of hot-water extract of mature and immature yuzu peel on adipocyte differentiation and triglyceride level in 3T3-L1 cells. Quantitative analysis of Oil Red O staining and microscopic observation of lipid droplets stained with Oil Red O (×200). Values are expressed as mean±SE (n=3). Values are significantly different between groups according to Student’s t-test: ^#P<0.05, ^##P<0.01, and ^###P<0.001, versus control. MYP: mature yuzu peel, IYP: immature yuzu peel.

지방 분화 및 중성지질 합성 관련 유전자 발현 억제 효과

Adipogenesis는 지방전구세포가 분화와 증식되는 과정을 거쳐 지방세포가 만들어지는 과정으로 지방 축적, 관련 전사인자 등의 발현, 아디포카인 및 다양한 호르몬 분비량 변화 등이 나타난다(Choi 등, 2013). 그중 PPARγ와 C/EBPα는 지방세포 형성 및 분화를 유도하는 대표적인 전사인자로 알려져 있다(Morrison과 Farmer, 2000). 따라서 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물의 지방세포 억제 기전을 규명하기 위하여 지방세포 분화 및 축적 관련 유전자 발현을 측정한 뒤 Fig. 4에 제시하였다.

Fig 4. Effects of hot-water extract of mature and immature yuzu peel on adipogenesis and lipogenesis-related genes expression in 3T3-L1 adipocytes. Values are expressed as mean±SE (n=3). Values are significantly different between groups according to Student’s t-test: ^#P<0.05, ^##P<0.01, and ^###P<0.001, versus control. ^*P<0.05, versus MYP. MYP: mature yuzu peel, IYP: immature yuzu peel.

C/EBPα는 지방전구세포의 말단 분화과정을 촉진하는 전사인자로 PPARγ와 상호 상승작용을 하여 서로의 발현을 촉진하는 역할을 한다(Rosen과 MacDougald, 2006). 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물은 지방세포의 C/EBPα의 발현을 대조군에 비해 각각 49%(P<0.001)와 38%(P<0.01) 유의적으로 낮추었다. C/EBPα와 상호 상승작용을 하는 PPARγ는 adipogenesis를 활성화하여 지방전구세포가 분화와 증식되는 과정을 총괄적으로 조절하는 역할을 하며, adipocyte로 분화된 상태를 유지하는 데 필수적인 인자이다(Madsen 등, 2014).

미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물 모두 지방분화군에 비해 PPARγ의 발현을 유의적으로 낮추었으며(P<0.01, P<0.05), 특히 미숙유자는 58% 감소율을 보였다. 비만은 adipogenesis 이외에도 중성지방을 축적하는 과정인 lipogenesis와 밀접한 관련이 있다(Park, 2014). FAS는 대표적인 lipogenesis 관련 유전자로, 잉여 칼로리 존재 시 acetyl-CoA와 malonyl-CoA의 축합에 의한 지방산 생합성에 관여하며, 간에서 합성된 지방산은 중성지방으로 전환되어 VLDL의 형태로 혈장을 순환하면서 지방조직에 중성지방을 전달한다고 알려져 있다(Kim, 2018). 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물은 FAS의 유전자 발현을 유의적으로 낮추었으며(P<0.01), 미숙유자와 성숙유자 간의 차이는 없었다. 또 다른 lipogenesis 유전자인 SREBP와 stearoyl-Coenzyme A desaturase 1(SCD1)은 유자에 의한 차이를 보이지 않았다.

중성지질 합성과 관련한 주요 유전자 Diacylglycerol O- acyltransferase 2(DGAT2)는 간과 지방조직에서 주로 발현되며 중성지방 합성 중 말단의 과정을 촉진하는 역할을 한다(Man 등, 2006). 미숙유자 과피 열수추출물 처리 시 DGAT2 유전자 발현을 50% 낮추어 유의적인 차이(P<0.05)를 보였으나, 성숙유자의 경우 대조군과 차이가 없었다. 특히 미숙유자는 성숙유자에 비해 유의적인 차이(P<0.05)를 보여 미숙유자가 DGAT2 유전자 발현 감소에 더 효과적이었다. 이는 유의적이지는 않았으나 미숙유자의 TG 함량이 성숙유자에 비해 낮은 것과 관련성이 있을 것으로 사료된다. Mosqueda-Solis 등(2017)의 연구에서 나린진과 헤스페리딘이 adipocyte specific genes의 유전자 발현을 낮추어 지방 분화를 억제하는 것으로 보고하였으며, Kim 등(2013)은 유자 과피 추출물을 HEK293 cells에 처리하였을 때 PPARγ를 조절하여 지방분화를 낮춘다고 보고하였다. 이와 같이 미숙유자와 성숙유자 추출물은 adipogenesis에 관여하는 전사인자인 C/EBPα와 PPARγ와 lipogenesis 관련 FAS의 유전자 발현을 낮추어 지방 분화 및 축적을 억제한 것을 확인하였으며, 특히 미숙유자 과피 열수추출물은 추가로 중성지방 합성에 주요인자인 DGAT2 유전자 발현을 유의적으로 낮추어 지방분화 및 지질 생성을 낮추는 효과를 제시한다.

본 연구에서는 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물의 항산화력과 3T3-L1 지방세포 분화 억제 효과를 평가하였다. 미숙유자 과피 열수추출물은 성숙유자에 비해 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드, 나린진과 헤스페리딘 함량이 유의적으로 높았으며 ABTS 라디칼 소거 활성과 FRAP 환원력과 같은 항산화 활성 역시 미숙유자 추출물에서 높았다. 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물은 지방세포에서 adipogenesis 관련 대표 유전자인 C/EBPα와 PPARγ 발현을 낮추어 지방세포 분화를 억제하였으며, lipogenesis 관련 유전자인 FAS의 발현을 억제하여 세포 내 중성지방 함량을 유의적으로 낮추었고 지방분화 억제 효능은 성숙유자 역시 효과적이었으나 DGAT2 발현의 감소는 미숙유자에서만 유의적으로 나타났다. 본 연구는 미숙유자와 성숙유자 과피 열수추출물의 항산화력 및 지방세포 분화 억제 기전을 비교하여 제시하였으며, 미숙유자와 성숙유자 모두 지방세포 분화억제에 관여하나 항산화력은 미숙유자가 성숙유자에 비해 더욱 높았다. 이와 같이 수확시기가 짧은 미숙유자의 항산화 활성 및 항비만 효과를 검증함으로써 기능성 식품소재로의 이용 가능성을 제시한다.

이 논문은 2021년 국립순천대학교 학술연구비(과제번호: 2021-0255) 공모과제로 연구되었다.