최근 식습관의 변화, 운동량 감소 등으로 인해 당뇨병과 같은 만성대사질환의 발병률이 높아지고 있다. 국민건강영양조사에 따르면 2020년 기준 국내 30세 이상 성인의 당뇨병 유병률은 16.7%이며, 65세 이상 노인의 경우 30.1%로 보고되었다(KOSIS, 2022). 전체 당뇨병 환자의 90% 이상이 제2형 당뇨병에 해당하며, 이는 췌장 베타 세포의 인슐린 분비 저하 또는 말초조직에서의 인슐린 저항성 증가로 인해 유발된다(Artasensi 등, 2020). 인슐린 분비가 늦어지거나 부족하면 간, 근육, 지방 등의 조직에서 혈당 이용률이 감소하고 간에서 포도당 생성이 줄어들지 못해 인슐린 저항성이 나타나며, 당대사 및 지질대사 이상이 발생하게 된다(Guillausseau 등, 2008). 만성적인 고혈당은 활성산소종 생성에 따른 산화적 세포손상을 통해 심근경색이나 뇌졸중 등의 당뇨 합병증을 유발할 수 있기 때문에 효과적인 혈당 조절이 필요하다(Oguntibeju, 2019). 따라서 체내 산화스트레스를 조절하는 것이 합병증의 예후에도 중요한 영향을 줄 수 있기 때문에 포도당 흡수율을 증가시키고 활성산소를 제거하는 기능성 소재의 발굴이 중요하다.

수수(Sorghum bicolor L. Moench)는 세계에서 5번째로 많이 재배되는 작물로, 글루텐이 없는 주요 곡물이다(Punia 등, 2021). Benzoic acid, cinnamic acid 등의 페놀 화합물과 tannins, anthocyanins 등의 플라보노이드 유도체, phytosterols, policosanols과 같은 생리활성물질을 다량 함유하고 있으며, 곡물 중 가장 많은 페놀 함량과 3-deoxyanthocyanidins의 유일한 식이 공급원으로 알려져 있다(Waniska 등, 1989; Luo 등, 2020). 특히 수수의 tannin 성분은 단순 페놀보다 peroxyl 라디칼을 15~30배 더 효과적으로 제거할 수 있어 강한 항산화 활성을 나타낸다(Chung 등, 2011). 수수 추출물의 생리활성으로는 혈중 콜레스테롤 감소, 항고혈압, 항염증, 항암 및 항당뇨 효과 등이 있으며 α-amylase와 α-glucosidase와 같은 소화 효소를 억제하여 혈당 수치를 감소시키는 것으로 보고되었다(Ofosu 등, 2021). 또한 수수의 섭취는 혈청 인슐린 농도를 증가시키고 인슐린 저항성을 완화할 수 있기 때문에 당뇨병 예방 및 치료에 도움이 될 수 있다(Xiong 등, 2019).

Metformin은 제2형 당뇨병 치료 가이드라인에 따라 제1요법으로 추천되고 있으며, 단독요법으로 혈당 조절이 어려울 경우 병용요법이 권장된다(American Diabetes Association Professional Practice Committee, 2022). Metformin의 대표적인 항당뇨 작용기전은 AMP-activated protein kinase(AMPK)의 활성화를 통해 간에서 당 신생작용을 억제하고 지방산 산화를 억제하여 혈당을 강하시키는 것으로 보고되었다(Scarpello와 Howlett, 2008). 혈당 강하 작용 외에도 세포 산화 반응을 감소시키는 항산화 효과와 항암 효과가 알려져 있다(Lv와 Guo, 2020). 그러나 구토, 설사, 소화 불량과 같은 부작용이 보고되어 있으며, 드물게 젖산증도 발생할 수 있으므로 과민반응(hypersensitivity) 또는 신장 질환이 있는 환자는 metformin의 사용이 금지된다(Jones 등, 2003). 성인 기준 metformin의 초기 일일복용량은 850~1,000 mg이고 최대 2,550 mg까지 사용이 가능하며, 위장 증상을 감소시키기 위해서는 용량을 낮추고 점진적으로 증량하는 것이 권장된다(Badr 등, 2013). 따라서 metformin의 효능을 방해하지 않으면서 다른 제재와의 병용을 통해 용량을 낮추어 부작용을 줄이는 것이 지속적인 당뇨 관리에 도움을 줄 수 있는 방법이다.

당뇨병의 치료는 약물 복용과 함께 식단 조절이 필수적이며, glycemic index(GI)가 낮은 식품이 권장된다. 낮은 GI의 식품은 탄수화물의 흡수 속도를 낮추어 급격한 혈당 증가를 억제하는데, 수수는 전분 및 단백질 소화율이 낮아 당뇨병 식단에 함유될 수 있다(Lemlioglu-Austin 등, 2012). 간은 포도당 및 지질 대사에서 중요한 역할을 수행하는 기관이다. 따라서 본 연구에서는 수수의 에탄올 추출물과 metformin을 HepG2 세포에 병용 처리하여 포도당 흡수율에 대한 상승효과를 확인하고, 당뇨병과 관련된 산화스트레스 지표를 측정함으로써 상승효과를 검증하고자 하였다.

실험재료 및 시약

본 연구에 사용된 수수(Sorghum bicolor L., Sodamchal)는 농촌진흥청으로부터 제공받아 사용하였다. 추출물 제조를 위해 10 g을 취하여 250 mL의 에탄올을 첨가한 뒤 shaking incubator(VS-8480, Vision Scientific, Daejeon, Korea)를 이용하여 24시간 동안 실온에서 추출하였다. Filter paper(Whatman International, Kent, UK)를 이용하여 여과한 후 추출물을 40°C 이하에서 감압 농축하였다. 농축액을 1 mL의 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 재용해하고 0.22 µm 멸균 필터로 여과하여 분석 전까지 -20°C에서 보관하였다. Metformin은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 상승효과의 측정을 위한 병용시험은 수수 추출물과 metformin을 일정 비율로 혼합 조제하여 사용하였다.

세포배양 및 독성 측정

본 연구에 사용된 인간 간암 세포주인 HepG2 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Fetal bovine serum(FBS, 10% heat-inactivated), penicillin(100 unit/mL), streptomycin(100 µg/mL)을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지를 사용하여 배양기(SANYO Electric Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 37°C, 5% CO₂ 및 95% humid air 조건으로 배양하였다. HepG2 세포를 96-well plate에 1×105 cells/well 농도로 분주한 후 80% confluence에 도달하였을 때 bovine serum albumin(BSA, 0.2% fatty acid-free)을 함유하는 RPMI1640(Gibco, Grand Island, NY, USA)에 시료를 희석하여 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 시료 처리 시에는 DMSO의 최종 농도가 0.1%(v/v) 미만이 되도록 시료를 배지로 희석하여 사용하였다. 이후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, 1.25 mg/mL) 용액 20 µL를 각 well에 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고 생존 세포에서 생성된 청색 결정을 DMSO로 가용화시켜 microplate reader(Epoch, BioTek Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Glucose consumption 측정

HepG2 세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주하였다. Glucose consumption 측정 시 seeding 후 80% confluence에 도달하면 시료를 처리하며, RPMI 1640에 희석한 시료를 24시간 동안 배양하였다. 배지에 남아있는 glucose 함량은 glucose colorimetric assay kit Ⅱ(BioVision, Inc., San Francisco, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 세포로 흡수된 glucose의 양은 배양 전 배지의 glucose 함량에서 세포배양 후 배지의 glucose 양을 제거해줌으로써 계산하였다.

활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성량 측정

ROS 생성량은 dichloro-dihydro-fluorescein diacetate(DCFH-DA)를 이용한 방법을 응용하여 측정하였다(Wang과 Joseph, 1999). HepG2 세포를 96-well black plate에 1×105 cells/well 농도로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 수수 에탄올 추출물(sorghum ethanol extract, SEE) 10 µg/mL, Met 100 µM, SEE-Met 4:6 조합의 시료들을 FBS가 없는 DMEM 배지를 이용하여 농도별로 희석하여 처리하였다. 24시간 배양 후 0.5 mM t-BHP를 처리하여 1시간 동안 산화적 스트레스를 유도한 후, phosphate buffered saline(PBS)을 이용하여 세척하였다. 25 µM의 DCFH-DA를 분주하여 염색하고 1시간 후에 fluorescent spectrophotometer(LS-55, Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, USA)를 이용하여 여기파장(excitation wavelength) 485 nm와 발광파장(emission wavelength) 530 nm에서 1시간 동안 fluorescent intensity를 측정하였다.

Malondialdehyde(MDA) 함량 측정

HepG2 세포 내 MDA 생성량은 thiobarbituric acid(TBA)법으로 측정하였다(Buege와 Aust, 1978). HepG2 세포를 6-well plate에 1×10⁶ cells/well 농도로 분주하고 24시간 배양한 후 SEE 10 µg/mL, Met 100 µM, SEE-Met 4:6 조합의 시료들을 FBS가 없는 DMEM 배지를 이용하여 농도별로 희석하여 처리하였다. 24시간 배양 후 0.5 mM t-BHP를 처리하여 4시간 동안 산화적 스트레스를 유도하였다. PBS로 세척한 세포를 모아 Vibra-Cell VCX 750 sonicator(Sonic&Materials, Inc., Newtown, CT, USA)를 사용하여 sonication 시킨 뒤 세포용해물을 4°C, 10,000 rpm(9,800×g) 조건에서 5분간 원심분리하였다. 상등액 200 µL에 TBA solution(0.375% TBA, 15% trichloroacetic acid, 0.25 N HCl) 200 µL를 첨가한 후 100°C 수욕상에서 15분간 가열하여 반응시켜주었다. 그 후 4°C, 13,000 rpm(16,600×g)에서 5분간 원심분리하고 535 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Glutathione(GSH) 함량 측정

GSH 함량 측정은 Baker 등(1990)의 방법을 응용하여 측정하였다. HepG2 세포를 6-well plate에 1×10⁶ cells/well 농도로 분주하고 24시간 동안 배양 후, SEE 10 µg/mL, Met 100 µM, SEE-Met 4:6 조합의 시료들을 FBS가 없는 DMEM 배지를 이용하여 농도별로 희석하여 처리하였다. 24시간 배양 후 0.5 mM의 t-BHP로 4시간 동안 산화적 스트레스를 유도하였다. PBS로 세척한 세포를 모아 Vibra-Cell VCX 750 sonicator(Sonic&Materials, Inc.)를 사용하여 sonication 해준 뒤 세포용해물을 4°C, 10,000 rpm(9,800×g)에서 5분간 원심분리하였다. 상등액 180 µL에 5% sulfosalicylic acid 20 µL를 혼합한 후 4°C, 10,000 rpm(9,800×g)에서 원심분리하였다. 상등액 20 µL에 0.1 M potassium phosphate buffer, 400 units/mL glutathione reductase(GR), 3 mM 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)가 포함된 enzyme mixture를 150 µL 첨가하여 37 °C에서 10분 동안 반응시켜 주었다. 그 후 2.5 mM NADPH를 50 µL 첨가하여 micro plate reader를 사용하여 412 nm에서 10분 동안 20초 간격으로 흡광도를 측정하였다.

상승효과의 판정 및 통계처리

병용처리 결과의 상승효과는 Chou와 Talalay(1984)의 combination index(CI) method에 따라 분석 및 판정하였다. CI value의 계산은 CompuSyn 소프트웨어(ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, USA)를 이용하여 수행하였으며 isobologram을 통해 나타내었다. CI value가 1보다 작으면 상승효과, 1이면 상가효과, 1보다 크면 길항효과로 판정한다. 통계분석은 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 이용하여 실시하였다. 데이터 간의 유의적인 차이는 one-way ANOVA의 Tukey-Kramer method를 통해 P<0.05 수준에서 검증하였다.

수수 추출물과 metformin의 항당뇨 효과

항당뇨의 대표 기전은 포도당 흡수의 증가를 통한 인슐린 저항성 증가이다. 인슐린은 말초 조직으로의 포도당 흡수를 촉진하고 간에서 포도당 생성을 억제하여 혈당 수치를 낮추는 역할을 수행한다. 포도당의 흡수를 촉진하는 경로는 인슐린 수용체 기질의 인산화에 의해 PI3K와 Akt가 활성화되어 포도당 수송체인 GLUT4의 세포막 표면으로의 전위를 자극하는 인슐린 의존성 경로와 AMPK의 활성화를 통해 GLUT4의 전위를 증가시키는 인슐린 비의존성 경로가 있다(Viollet 등, 2009). 이때 간은 포도당을 이용하는 주요 기관으로 식후 포도당 소비의 30~60%를 담당한다(Adeva-Andany 등, 2016). 간에서의 항당뇨 활성을 확인하기 위해 HepG2 세포주에서 MTT assay를 이용하여 세포독성을 측정하였다. 수수 추출물을 2.5, 5, 10 µg/mL 농도로 처리하여 세포 생존율을 측정하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 1A). 항당뇨 효과로 간세포 내 포도당 흡수율은 수수 추출물 처리 시 농도 의존적으로 증가하였으며, 대조군보다 7~32% 정도의 높은 포도당 흡수율을 나타내었다(Fig. 1B). 수수 추출물이 당뇨 유발 동물모델에서 인슐린 감수성을 개선하여 항당뇨 효과를 나타낸다는 보고를 비롯하여, 간에서의 AMPK 발현 증가를 통한 혈당과 혈중 콜레스테롤 농도 감소 효과에 대해 보고된 바 있다(Park 등, 2012; Kim과 Park, 2012). 또한 Lee 등(2021)은 수수의 생리활성 성분인 taxifolin이 miR-195의 발현과 AMPK 경로의 활성화를 통해 인슐린 저항성을 감소시킬 수 있다고 보고하였다. 따라서 수수 추출물이 여러 경로를 통해 간세포로의 포도당 흡수를 증가시켜 항당뇨 효과를 낼 수 있음을 확인하였다.

Fig 1. Effects of the SEE and Met on glucose consumption. Cytotoxicity (A) and glucose consumption (B) of the SEE. Cytotoxicity (C) and glucose consumption (D) of the Met. The percentage of glucose consumption was calculated as compare with control group. Data were presented as the mean±standard error of the mean (n=3). *P<0.05 versus control group by ANOVA and the Tukey-Kramer method. CON, untreated cells; SEE, sorghum ethanol extract; Met, metformin.

Metformin은 간에서의 포도당 생성을 억제하는 당뇨병 치료제로서 positive control로 흔히 사용된다(Viollet 등, 2009). HepG2 세포에 metformin을 25, 50, 100 µM로 처리하였을 때 세포독성이 발견되지 않았다(Fig. 1C). 항당뇨 활성을 측정한 결과 포도당 흡수율이 농도 의존적으로 증가하였으며, metformin 100 µM 농도에서 포도당 흡수율이 약 48% 수준까지 유의적으로 증가하였다(Fig. 1D). 이는 Garber 등(1997)이 보고한 시험에서 metformin의 항당뇨 활성이 농도 의존적으로 나타난 결과와 유사하였다. 또한 여러 연구에서 간에서의 포도당 생합성을 억제하기 위해 임상적으로 확인된 metformin의 농도가 50~100 µM임을 고려할 때, 본 연구에서 사용된 농도와 유사하며 해당 범위에서 포도당 흡수율이 증가할 수 있음을 확인하였다(LaMoia와 Shulman, 2021).

수수 추출물과 metformin 조합의 최적 비율 선정

수수 추출물과 metformin 조합의 최적 비율을 선정하기 위해 수수 추출물(10 µg/mL)과 metformin(100 µM)을 각각 10:0부터 8:2, 6:4, …, 2:8, 0:10의 비율(v/v)로 혼합하여 HepG2 세포에서의 포도당 흡수율을 측정하였다(Fig. 2). 수수 추출물 및 metformin 조합을 처리하였을 때 수수 단독처리군을 제외한 모든 실험군에서 포도당 흡수율이 유의적으로 증가하였다. Metformin 100 µM 농도는 간세포 실험에서 positive control로 흔히 사용된다. Metformin 단독 처리군과 수수 추출물 및 metformin 조합을 비교했을 때도 포도당 흡수율이 병용처리군에서 유의적으로 증가하였으며, 4:6과 2:8 비율에서 높은 포도당 흡수율을 나타내었다. 특히 수수 추출물 및 metformin 조합 4:6 비율에서 control 대비 약 77% 수준으로 가장 높은 포도당 흡수율을 나타내었다. 이에 따라 이후 연구에서는 수수 추출물과 metformin의 조합 비율을 4:6으로 고정하여 사용하였다.

Fig 2. The glucose consumption of SEE-Met in different ratios (10:0, 8:2, …, 2:8, 0:10). The percentage of glucose consumption was calculated as compare with control group. Data were presented as the mean±standard error of the mean (n=3). **P< 0.01 and ***P<0.001 versus control group by ANOVA and the Tukey-Kramer method. CON, untreated cells; SEE, sorghum ethanol extract; Met, metformin.

수수 추출물 및 metformin 4:6 조합의 상승효과

당뇨병은 다양하고 복잡한 병인에 의해 발생하므로 여러 제제의 병용요법이 효과적인 전략이 될 수 있다(Shikov 등, 2018). 특히 식물유래 화합물과 약물의 조합은 약물의 효능을 높이고 치료에 필요한 약의 용량을 낮추어 부작용을 줄일 수 있는 방법이다(Pezzani 등, 2019). 수수는 다량의 페놀 화합물들을 함유하고 있으며, 수수 플라보노이드의 주요 생리활성 성분인 3-deoxyanthocyanidins은 높은 항산화력과 단백질 당화 억제를 통한 항당뇨 효과를 나타낸다고 보고되었다(de Morais Cardoso 등, 2017). 따라서 수수 추출물과 당뇨병 치료제인 metformin의 병용이 항당뇨 효과를 증가시킬 수 있을 것으로 예상하여 수수 추출물과 metformin의 최적 비율 조합에 대한 포도당 흡수율을 측정하였다. 수수 추출물과 metformin 4:6 조합에서의 포도당 흡수율은 약 77% 수준까지 유의적으로 증가하였다(Fig. 3). 이에 대한 상승효과를 판단하기 위해 CI model을 이용하여 계산하였다. 단독처리 및 병용처리를 통해 얻은 dose-effect curve는 Fig. 4A에 나타내었다. 이를 수수 추출물과 metformin 4:6 조합의 포도당 흡수율에 대한 effective value(Fa)를 이용하여 log[concentration]에 대해 log[Fa/(1－Fa)]의 값을 구하여 median-effect plot으로 나타낸 그래프는 Fig. 4B와 같다. CompuSyn 소프트웨어를 통해 median-effect plot의 m(기울기), Dm(median-effective dose, ED50)값을 얻어 CI값을 계산하였으며 CI<1, CI=1, CI>1 각각을 상승, 유지, 길항 효과로 판단하였다. 수수 추출물과 metformin 4:6 조합의 병용시험에서 나타난 Fa 0.49~0.77에 해당하는 CI값이 0.21~0.35로 1보다 작은 값을 나타내었기에 상승효과가 있음을 확인하였다(Fig. 4C). Isobologram에서 수수 추출물과 metformin의 4:6 조합이 모든 Fa값에서 상승효과를 나타내었으며(Fig. 4D), Fa값 0.9에 해당하는 수수 추출물과 metformin의 용량은 약 89 µg/mL, 485 µM로 계산되었다. 수수 에탄올 추출물은 IRS1, PI3K, Akt 및 AMPK의 인산화를 통해 간에서의 포도당 흡수율을 증가시킨다고 보고되었다(Lee 등, 2021). Metformin은 AMPK complex의 γ-subunit에 결합하거나 세포 내 AMP/ATP 비율의 증가를 통해 직간접적으로 AMPK의 인산화와 활성화를 촉진하여 포도당 흡수를 자극한다(Zhang 등, 2012). 본 연구에서 수수 추출물과 metformin을 낮은 농도로 병용처리 시 포도당 흡수율을 증가시켜 단독처리 시보다 뛰어난 항당뇨 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 이는 수수 추출물과 metformin이 인슐린 비의존성 경로와 관련된 AMPK 활성화에 대해 서로 다른 메커니즘을 통해 상승적인 효과를 일으킨 것으로 사료된다.

Fig 3. Effects of the SEE-Met 4:6 combinations on glucose consumption. Cytotoxicity (A) and glucose consumption (B) of the SEE-Met 4:6 combinations. The percentage of glucose consumption was calculated as compare with control group. Data were presented as the mean±standard error of the mean (n=3). *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 versus control group by ANOVA and the Tukey- Kramer method. SEE, sorghum ethanol extract; Met, metformin; SEE-Met, combined extract of SEE and Met.

Fig 4. Combination index (CI) model of SEE-Met combinations. Dose-effect curves (A) and medium-effect plot (B) of SEE, Met, and SEE-Met 4:6 combinations. Combination index (CI) values (C) were plotted as a function of fractional of glucose consumption (Fa) by CompuSyn software. (D) Isobologram curves of SEE, Met, and SEE-Met 4:6 combinations. SEE, sorghum ethanol extract; Met, metformin; SEE-Met, combined extract of SEE and Met.

병용처리 시 ROS 생성 억제 효과

산화 스트레스는 당뇨병 합병증 발병의 주요 원인이다. 당뇨병이 진행됨에 따라 ROS가 과다 생산되면 산화 스트레스가 발생하여 지질, 단백질, DNA를 포함한 다양한 세포에 손상을 유도하고 인슐린 분비 및 신호 전달 장애를 유발한다(Kang 등, 2020). 산화 스트레스에 대한 수수 추출물과 metformin 4:6 조합의 ROS 생성 억제 효과를 알아보기 위해 HepG2 세포에서 시간에 따른 ROS 생성량을 측정하였다(Fig. 5). 간세포에 t-BHP를 처리하여 산화스트레스를 유도한 결과 ROS 생성이 증가하였으나, 수수 추출물과 metformin 단독처리 시 ROS 생성량이 유의적으로 감소하였으며 병용처리 시 대조군과 유사한 수준으로 ROS 생성이 억제되었다. 수수 추출물은 다양한 폴리페놀을 함유하고 있으며, 특히 apigeninidin, luteolinidin, 3-deoxyanthocyanidin 등의 안토시아닌은 높은 항산화 활성을 갖는다고 보고되었다(Awika 등, 2005). Metformin은 ROS를 공급하는 미토콘드리아에 영향을 주어 ROS 생성을 억제할 수 있다고 보고되었다(Nasri와 Rafieian-Kopaei, 2014). 따라서 낮은 농도의 수수 추출물과 metformin 조합이 간세포에서 ROS 생성을 유의적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

Fig 5. Effects of the SEE, Met, SEE-Met 4:6 combinations on time course of reactive oxygen species (ROS) generation (A) and ROS production at 60 min (B). Data were presented as the mean±standard error of the mean (n=3). Different letters indicate significant (P<0.05) differences based on Duncan’s multiple range test. SEE, sorghum ethanol extract; Met, metformin; SEE-Met, combined extract of SEE and Met.

MDA 함량 측정

당뇨병 발생 시 산화적 스트레스의 증가와 체내 활성산소의 생성으로 인해 조직 내의 과산화지질이 증가한다. MDA는 지질과산화물의 대표적인 성분 중 하나로 간에서 MDA 양은 세포의 손상 정도를 간접적으로 알 수 있는 지질산화의 지표이다(Bilanda 등, 2020). 지질과산화를 유도하기 위해 HepG2 세포에 500 µM 농도의 t-BHP를 4시간 동안 처리하여 세포 내 자유라디칼을 형성하였다. 시료 무처리 세포의 MDA 함량은 0.04 nmol/mg protein이었으며, t-BHP 처리에 의해 0.06 nmol/mg protein 수준으로 증가하였다. 수수 추출물과 metformin 단독처리 시 t-BHP에 의해 증가한 MDA 농도가 유의적으로 감소하였으며, 수수 추출물 및 metformin 4:6 조합 처리 시 MDA가 대조군과 유사한 수준으로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 6A). Zhu 등(2017)은 수수 밀기울에 풍부한 procyanidin이 높은 자유라디칼 소거 활성을 갖는다고 보고하였으며, Wu 등(2011)은 수수의 procyanidin이 간세포에서 자유라디칼을 제거하여 지질과산화물의 축적을 억제하였다고 보고하였다. Abdulkadir와 Thanoon(2012)은 metformin이 제2형 당뇨병 환자의 혈청 MDA 수준을 유의적으로 감소시킨다고 보고하였다. 따라서 수수 추출물과 metformin의 항산화 활성에 의해 HepG2 세포 내 MDA 생성이 억제된 것으로 생각된다.

Fig 6. Effects of the SEE, Met, SEE-Met 4:6 combinations on MDA production (A) and GSH depletion (B). Data were presented as the mean±standard error of the mean (n=3). Different letters indicate significant (P<0.05) differences based on Duncan’s multiple range test. SEE, sorghum ethanol extract; Met, metformin; SEE-Met, combined extract of SEE and Met; MDA, malondialdehyde; GSH, glutathione.

GSH 함량 측정

GSH는 간에서 만들어지는 아미노산의 일종으로 H2O2와 지질과산화를 대사시키는 GSH-Px, GST의 전자공여체로서 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는데 중추적인 역할을 수행한다(Zhang 등, 2009). 수수 추출물 및 metformin의 항당뇨 활성과 관련된 항산화 기전을 명확히 하기 위해 세포 내 GSH 변화를 측정하였다(Fig. 6B). HepG2 세포에 500 µM 농도의 t-BHP를 4시간 동안 처리하여 산화 스트레스를 유도한 결과 GSH 농도는 12.5 nmol/mg protein으로 대조군 23.3 nmol/mg protein에 비해 유의적으로 감소하였다. 이는 세포 내 환원형태로 존재하던 GSH가 t-BHP에 의해 유도된 산화 스트레스로 인해 산화형태인 GSSG로 전환되면서 GSH의 농도가 감소한 것으로 생각된다. 그러나 수수 추출물과 metformin 단독 처리에 의해 GSH 농도가 증가하는 경향을 보였으며, 특히 수수 추출물 및 metformin 4:6 조합에서 유의적인 증가를 나타내었다. Ajiboye 등(2013)은 수수 추출물이 간에서 높은 GSH:GSSG 수준을 유지할 수 있다고 보고하였으며, Xu 등(2021)은 3-deoxyanthocyanidins이 풍부한 수수의 페놀 추출물이 항산화 효소의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스와 세포 손상을 완화시킨다고 보고하였다. Correia 등(2008)은 당뇨병 동물 모델에서 metformin이 GSH 수준을 증가시켜 당뇨병 관련 산화 스트레스를 완화할 수 있다고 보고하였다. 따라서 수수 추출물과 metformin의 조합이 세포 방어체계에 중요한 역할을 하는 GSH 작용에 영향을 미쳐 간세포에서의 항산화 활성에 도움을 주는 것으로 생각된다. 또한 병용처리 시 GSH가 산화 스트레스로 인해 GSSG로 전환되는 것을 억제하여 GSH 농도가 증가한 것으로 판단된다.

본 연구에서는 HepG2 세포에서 수수 추출물과 metformin의 포도당 흡수 조절을 통한 항당뇨 활성에 대해 알아보고, 두 제제의 병용처리 시 나타나는 상승효과에 대해 평가하고자 하였다. 그 결과 HepG2 세포에 수수 추출물과 metformin을 단독처리했을 때 대조군 대비 포도당 흡수율이 각각 약 32%, 48% 수준까지 증가하였다. 이후 최적화된 비율의 수수 추출물과 metformin 조합을 이용하여 병용처리한 결과, 4:6 조합에서 포도당 흡수율이 약 77%까지 증가하였다. CI 값의 계산을 통해 수수 추출물과 metformin 4:6 조합의 상승작용을 측정한 결과, 모든 농도에서 1보다 작은 값을 나타내어 유의적인 상승효과가 있음을 확인하였다. 항당뇨 활성과 관련된 항산화 활성으로 ROS 생성, MDA 및 GSH 함량을 측정한 결과에서도 당뇨병의 수수 추출물과 metformin 4:6 조합이 가장 높은 보호 효과를 나타내었다. 따라서 수수 추출물과 metformin의 조합은 당뇨병 치료 시 효능을 증대시키고 약물의 용량을 낮추어 부작용을 줄일 수 있는 효과적인 방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 농촌진흥청 연구비 지원(과제번호 PJ01415004)에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.