콤부차(Kombucha)란 녹차, 홍차, 수크로오스(sucrose)를 symbiotic culture of bacteria and yeasts(SCOBY)로 발효시켜 제조하는 음료로, 현재 건강기능 식품군에서 소비자들에게 각광받고 있다. 콤부차는 뛰어난 항산화 작용, 소화 증진, 피부 미용, 항균 작용, 항암 효과가 있다고 밝혀졌다(Villarreal-Soto 등, 2020). 미국, 캐나다에서는 이미 콤부차가 대중화되어 마트에서 제품 형태로 쉽게 구입할 수 있고, 국내에서는 시장에서의 입지를 점차 높여가고 있다. 건강 기능식품 시장이 빠르게 성장하며 콤부차 시장도 점차 성장하고 있으며, 콤부차는 제조와 복용의 편리함, 뛰어난 효과와 맛, 적극적인 마케팅으로 식품과 헬스케어 분야에서 소비자에게 각광받고 있다.

콤부차의 제작 과정은 1차 발효와 2차 발효로 나뉜다. 1차 발효는 콤부차 원액을 획득하고 스코비(SCOBY) 미생물을 증식하기 위해 진행하는 발효 단계이다. 일반적으로 1차 발효 시에는 설탕이나 과당, 포도당을 홍차나 녹차와 함께 발효시키는 방법으로 제작된다. 2차 발효는 1차 발효 결과 얻어진 용액에 과일 등의 2차 발효 첨가물을 첨가하여 개인의 취향에 맞는 콤부차를 획득하는 과정이다. 이 단계는 1차 발효액에서 스코비를 제거하여 용액만 따로 옮겨 담고, 이에 과일 등을 적당량 첨가하여 2~7일간 상온에서 밀폐한 상태로 보관하는 과정으로 이루어진다.

콤부차는 발효 음료이기 때문에 정형화된 제조 방법이 없으며 환경과 취향에 따라 발효 시간을 달리하거나 당원 및 찻물을 달리하는 등 다양한 변화를 줄 수 있다. 1차 발효 시에는 설탕 등의 당원을 홍차, 녹차와 같은 대중적인 차와 함께 발효시키는 방법으로 정형화되어 있지만, 2차 발효의 방법 및 재료는 더욱 다양하다. 2차 발효의 재료로는 석류, 자몽, 사과, 포도, 파인애플, 키위 등이 있으며 이 외에도 인삼, 오미자, 커피, 로즈메리를 발효한 콤부차도 존재한다. 이 중에서 석류, 사과, 당근, 포도, 자두를 이용한 콤부차가 대중적으로 큰 인기를 끌고 있으며, 자몽과 인삼, 오미자를 이용한 콤부차는 다이어트 및 우수한 건강관리 음료로 이용되고 있다(Akbarirad 등, 2017).

콤부차 내에는 acetic acid bacteria(AAB, 초산균), lactic acid bacteria(LAB, 유산균) 그리고 Saccharomyces 속의 yeast가 다양하게 존재한다(Mukadam 등, 2016; Tran 등, 2020). 이들의 존재 및 대사체로 인해 콤부차가 우수한 항균 작용과 항산화능을 갖는다(Villarreal-Soto 등, 2020). 한편 콤부차는 발효 환경에 따라 증식하는 미생물종이 다르고 아직 콤부차 내 모든 미생물이 규명되지 않았다. 또한 콤부차의 효능 및 시장성에 관한 연구는 활발히 진행된 반면 제조 방법에 관한 연구는 미흡하며, 특히 2차 발효의 경우 정형화된 프로토콜이 존재하지 않아 많은 소비자가 콤부차 제조에 시행착오를 겪고 있다. 콤부차의 잠재 가치는 2차 발효를 통한 개인의 맞춤형 콤부차 제작에 달려있다는 점에서, 2차 발효에 관한 미흡한 연구는 콤부차에 대한 소비자의 유입을 막는 요인으로 작용하고 있다.

따라서 본 연구에서는 국내에서 판매되는 콤부차 스타터를 사용해 콤부차의 발효 조건을 달리하여 실험을 진행하였다. 우선, 본 연구에 사용한 스코비에 포함된 미생물 조성을 확인하기 위하여 스코비에 존재하는 미생물들을 분리·동정하여 미생물 조성을 확인하였다. 그리고 콤부차의 유리당과 유기산, 에탄올 농도를 측정하여 제작한 콤부차의 2차 발효 첨가물에 따른 일반적인 발효 특성들을 확인하였다. 추가로 콤부차의 생리활성 기능 및 콤부차를 지속해서 음용할 경우 얻을 수 있는 건강증진 기능을 알아보기 위해 항산화능과 항염증 효과에 대한 분석을 진행하였고 2차 발효 첨가물에 따른 콤부차의 기능성을 비교하였다.

콤부차 준비

본 실험에서 콤부차 발효에 사용된 스타터는 Wonderaw(Seoul, Korea)에서 제조한 종균을 구입하였다. 먼저 홍차 잎(Taylors of Harrogate, Harrogate, England) 6 g을 끓는 물 1 L에 넣고 15분간 우려냈다. 홍차 잎은 커피 필터를 사용해 걸러낸 후 설탕(CJ Cheiljedang, Seoul, Korea) 65 g을 추가하였다. 이후 구매한 콤부차 원액(Wonderaw) 200 mL와 스코비 덩어리를 추가로 넣고 25°C 조건으로 14일간 1차 발효를 진행하였다. 그다음 1차 발효가 끝난 콤부차 300 mL에 이마트에서 구매한 고흥산 석류(pomegranate), 금산산 건삼(ginseng), 영동산 블루베리(blueberry), 미국 캘리포니아산 자몽(Zamboa), 문경산 오미자(Omija) 80 g을 각각 첨가한 다음 공기가 통하지 않도록 밀폐한 후 25°C에서 7일간 2차 발효를 진행하였다.

미생물 분리 동정

콤부차에 존재하는 미생물에 대한 분리･동정은 Mukadam 등(2016)과 Gaggía 등(2019)의 실험을 일부 수정하여 수행하였다. 1차 발효가 끝난 콤부차 용액을 0.85% NaCl로 단계 희석하여 사용하였으며 AAB를 분리하기 위해 WL agar, LAB 분리에는 bromocresol purple(BCP)을 첨가한 MRS agar, 효모 분리에는 PDA agar를 각각 사용하였다. 배지에 도말 후 WL agar는 28°C에서 5일 동안 배양하였고 BCP-MRS는 37°C에서 48시간, PDA agar는 25°C에서 7일간 각각 배양하였다. 배양 후 콜로니가 나타났을 때 콜로니의 형태 및 배양 특성을 바탕으로 콜로니를 무작위로 추출하여 순수분리하였다. 분리된 균주는 PureHelix^TM Genomic DNA Prep kit(Nanohelix, Daejeon, Korea)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 세균은 universal primer set 27F-1492R을 사용하여 16S rRNA sequencing 방법으로 동정하였고 효모는 ITS1과 ITS4 primer set을 사용하여 ITS region sequencing 방법으로 동정하였다(Torán-Pereg 등, 2021). 염기서열 분석은 Macrogen(Seoul, Korea)에 의뢰하였고, 분석된 염기서열을 기반으로 NCBI(National Center for Biotechnology Information) BLAST 검색을 통하여 동정하였고, 결과는 Table 1과 같이 나왔다.

Table 1 . List of acetic acid bacteria and yeast isolated from primary fermented kombucha.

Species-identification	Identity (%)	GenBank accession No.
Acetobacter senegalensis	99	LN606600.1
Acetobacter tropicalis	99	KX424639.1
Dekkera bruxellensis	98	AM850055.1
Schizosaccharomyces pombe	99	NG_042649.1
Brettanomyces bruxellensis	98	KY103322.1

콤부차 발효 특성 분석

콤부차의 유리당과 유기산 함량을 알아보기 위해 high-performance liquid chromatography(UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 분석을 진행하였고 Choi 등(2016)의 실험을 일부 수정하여 수행하였다. 콤부차 1차 발효를 시작하고 나서 0일, 7일, 14일 차의 시료를 수집하였고 2차 발효 시작 후 7일 차에 마지막 시료를 수집하였다. 채취한 각 시료를 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하는 과정을 진행한 후 0.45 μm membrane filter로 여과하여 분석하였다. 유리당 분석은 Sugar-pak column(300×6.5 mm, Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였으며, detector는 Shodex RI-101(Shodex, Tokyo, Japan)을 사용하였다. 분석 용매는 3차 증류수를 이동상으로 하여 유속은 0.5 mL/min의 속도로 흘려 주었다. 유기산 분석은 Aminex 87H column(300×10 mm, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하였으며, detector는 RI(ERC, Refracto MAX520, Tokyo, Japan)를 사용하여 UV 210 nm 파장에서 분석하였다. 이동상은 0.01 N H2SO4로 0.5 mL/min의 속도로 흘려 주었다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거 활성은 Villarreal-Soto 등(2019)의 방법을 참고하였다. 시료 1 mL를 원심분리(7,000 rpm, 15 min) 후 상층액 0.02 mL와 0.2 mM DPPH 용액 0.18 mL를 섞고 25°C에서 30분간 암실에서 반응시킨 후 SpectraMax ABS Plus microplate reader(Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. DPPH 소거 활성은 다음과 같은 식에 의해 계산되었다.

% inhibition＝100×(A_(blank)－A_(sample))/ A_(blank)

세포 생존율 측정

콤부차에 대한 세포 독성을 측정하기 위해 RAW 264.7 세포(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)를 사용해 MTT assay를 실시하였다. 세포 배양에는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Invitrogen, San Diego, CA, USA)을 사용하였고 동결건조를 완료한 콤부차 추출물을 DMEM broth에 녹여 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL의 농도로 준비하였다. 먼저 96-well plate에 세포를 1×10⁵ cells/well 농도로 주입하여 37°C, 5% 조건으로 CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 96-well plate에 콤부차 추출물을 농도별로 0.2 mL씩 주입하였다. 처리된 세포는 24시간 동안 배양한 후 phosphate buffered saline을 사용하여 2회 세척 후 Promega’s Cell Titer 96^® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit(Promega, Madison, WI, USA)을 매뉴얼대로 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. SpectraMax ABS Plus microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 시료의 평균 OD 값을 사용해 세포 생존율을 측정하였다.

Nitric oxide(NO) 생성 억제능 측정

NO 생성 억제능을 측정하기 위해 MTT assay 결과를 바탕으로 콤부차 추출물을 100 μg/mL 농도로 세포에 노출하였다. RAW 264.7 세포를 1×10⁵ cells/well로 96-well plate에 분주하고 5% CO₂, 37°C incubator에서 배양한 후, 배양 배지에 lipopolysaccharide(LPS) 1 μg/mL와 콤부차 추출물 100 μg/mL를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 시료를 처리한 배양 상층액을 NO Plus Detection kit(21023, iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 이용해 NO의 양을 측정하였다. Kit을 사용한 상등액을 ELISA를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며 Nitrite Standard (2 mM)를 사용하여 표준곡선을 그린 후 각 샘플의 NO 값을 도출하였다. 콤부차 추출물을 처리하지 않은 대조군보다 시료 값이 낮으면 항염증 효과가 있는 것으로 해석하였다.

통계 분석

통계 분석은 GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 소프트웨어를 사용하여 평균과 표준편차를 산출하였다. 각 시료 간의 유의적 차이는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하여 분석한 후 해당하는 경우 Tukey’s method로 사후 검증을 수행하였다. 유의성은 P<0.05, P<0.01, P<0.001 수준에서 검증하였다.

미생물의 분리･동정

미생물 분리･동정 결과, 세균은 대부분 Acetobacter genus로 나타났다. 그중에서는 Acetobacter senegalensis와 Acetobcater tropicalis의 동정률이 99%로 높은 유사도를 보였다. 효모의 경우에는 Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Dekkera genera가 나타났다. 콤부차에는 Acetobacter, Gluconacetobacter, Gluconobacter 3개의 genus가 주로 분포하는 것으로 알려져 있다. 본 실험의 콤부차에서는 2가지 AAB 종이 확인되었다. A. senengalensis는 설탕을 이용해 cellulose를 생산하는 것으로 알려져 있는데 식물에서 발견되는 cellulose는 hemicellulose, lignin, pectin 등 다른 polymer와 동반되는 것에 반해, Acetobacter genus에 속하는 세균에서는 순수한 cellulose를 생산하는 것으로 알려져 있다. 따라서 Acetobacter가 생산하는 cellulose는 최근 식물성 cellulose의 대체재로 주목받고 있다.

콤부차에는 AAB 이외에도 여러 효모가 포함된다(Coton 등, 2017). 콤부차의 원료인 설탕(sucrose)이 glucose와 fructose로 분해되고 생성된 glucose는 콤부차를 이루는 AAB에 의해 cellulose를 합성하거나 gluconic acid로 산화되며, fructose는 효모 발효에 의해 에탄올과 CO₂로 분해되고 여기서 나오는 에탄올을 AAB가 acetic acid로 분해하는 것으로 알려져 있다. 앞선 결과들을 토대로 본 실험에 사용된 콤부차에서도 콤부차의 특징적인 발효를 위한 AAB와 yeast가 다양하게 존재함을 확인할 수 있다.

콤부차의 발효 특성

먼저 1차 발효과정 중의 유리당은 sucrose, glucose, fructose를 분석하였으며 유기산은 lactic acid, acetic acid를 분석하였다. 추가로 에탄올의 함량도 분석하였다(Fig. 1). 유리당의 함량을 분석한 결과 시간이 지남에 따라 sucrose의 양은 계속해서 감소하였고 glucose의 양은 발효과정 중에 조금씩 감소하였으나 큰 변화 없이 일정한 경향을 보였다. Fructose의 경우에는 발효가 진행될수록 양이 조금씩 증가하는 것으로 나타났다. 콤부차의 1차 발효과정 중에는 당원으로 사용한 sucrose가 glucose와 fructose로 분해되며 이렇게 분해된 당류 단당체는 더 발효가 진행됨에 따라 에탄올과 CO2로 분해되는 과정을 거치는 것으로 알려져 있다(May 등, 2019). 본래 sucrose가 분해되면서 glucose와 fructose가 증가해야 하지만 본 실험에서는 발효과정 중 glucose의 함량 변화가 크지 않았다. 이는 콤부차 내에 존재하는 Acetobacter가 glucose를 이용해 cellulose를 합성한다는 기존 연구 결과(Nguyen 등, 2008)처럼 새로 생성된 glucose가 Acetobacter의 대사에 활용되었음을 알 수 있다. 또한 실험 결과 에탄올의 함량이 증가한 것으로 나타났는데, 이는 fructose가 에탄올로 환원된다는 이전 연구처럼(Sievers 등, 1995) 다양한 양상이 나타날 수 있음을 알 수 있다. 유기산의 함량은 기존 연구 결과(Kumar와 Joshi, 2016)와 일치하게 acetic acid와 lactic acid 둘 다 발효가 진행됨에 따라 증가하는 경향을 보였다.

Fig 1. Changes in free sugar, organic acid, and EtOH contents in primary fermented kombucha. Results shown are mean±SD (n=3).

다음으로 1차 발효가 끝난 콤부차를 활용하여 자몽, 블루베리, 건삼, 오미자, 석류를 첨가해 2차 발효를 진행하였고 마찬가지로 유리당과 유기산의 함량을 분석하였다(Fig. 2). 2차 발효를 시작하고 7일 후에 앞선 1차 발효 용액과 마찬가지로 유리당은 sucrose, fructose, glucose를 분석하였으며 유기산인 lactic acid, acetic acid 그리고 에탄올의 함량을 분석하였다. 2차 발효 후 콤부차의 특성을 확인한 결과 2차 발효 첨가물에 따른 유리당, 유기산, 에탄올의 함량에 다양한 차이를 보였다. 특히, 자몽으로 2차 발효한 콤부차의 경우 glucose의 함량이 다른 2차 발효 첨가물에 비해 매우 적게 나타났고 fructose의 함량은 2차 발효 첨가물에 따라 다양한 수치를 보였다. 유리산의 함량도 2차 발효 첨가물에 따른 차이를 보였는데 lactic acid의 경우에 다른 2차 발효 첨가물들과 비교했을 때 유독 자몽에서만 약 5,327 mg/L의 높은 수치를 보였다. Acetic acid와 에탄올의 함량 또한 2차 발효 첨가물별로 다양한 수치를 보였는데, 건삼에서 acetic acid와 에탄올의 함량이 가장 높았고 나머지도 2차 발효 첨가물에 따른 함량 차이를 확인할 수 있었다.

Fig 2. Changes in free sugar, organic acid, and EtOH contents in various secondary fermented kombucha. Results shown are mean±SD(n=3).

콤부차의 2차 발효란 1차 발효에서 줄어든 sugar 등의 carbohydrate를 보충하고 풍미를 증진하기 위해 추가적인 carbonation을 하는 것을 말한다. 2차 발효 첨가물에 따라 달라지는 유리당, 유기산, 에탄올 함량의 변화는 스코비에 존재하는 yeast와 AAB의 활성에 따른 생물학적 변환에 기인할 수 있다. 2차 발효 첨가물로 자몽을 사용했을 때 sucrose의 분해는 활발하지 않았지만 acetic acid와 에탄올의 양은 증가하는 것으로 나타났다. Sucrose의 분해는 스코비 yeast가 분비하는 invertase에 의해 이루어지는데, Cvetnić과 Vladimir-Knezević(2004)에 따르면 자몽 씨앗 추출물이 yeast에 대해 antifungal effect를 보이는 것으로 나타났다. 또한 자몽의 antifungal effect는 yeast에 강한 저해 작용을 하는 것으로 알려진 phenolic and hydroxycinnamic acids의 영향으로 볼 수 있다. 이를 통해 본 실험의 2차 발효과정에서 스코비에 존재하는 yeast가 자몽의 antifungal effect에 영향을 받아 sucrose 분해를 저해 받았음을 추정할 수 있다. 2차 발효에 사용한 5가지 2차 발효 첨가물 중 건삼을 제외한 4종의 과일들은 모두 대표적인 vinegar-producing fruit이며, vinegar는 AAB가 sugar, 에탄올을 aerobic condition에서 발효시킬 때 생성되는 부산물로 알려져 있다(Chang 등, 2005). 이전 연구에서 블루베리와 자몽에 다수의 AAB가 존재하는 것이 밝혀졌고(Gerard 등, 2020), 콤부차의 발효과정에서 본래 과일 내에 존재하는 AAB와 스코비 자체에 포함된 AAB의 상승작용에 의해 acetic acid가 상당량 존재하는 것으로 확인된다. 이러한 결과들을 통해 우리는 2차 발효에 이용한 첨가물의 종류에 따른 유기산, 유리당, 에탄올 함량의 차이가 2차 발효 첨가물 각각의 특성과 스코비에 존재하는 yeast와 AAB의 활성 조절에 기인함을 확인했지만, 첨가물과 스코비 미생물 간의 상호작용 그리고 생리적인 변화와의 연관성에 대한 부분은 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

DPPH 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 1차 발효가 끝난 콤부차(primary)의 경우 소거능이 74.14%로 측정되었다(Fig. 3). 2차 발효의 경우 1차 발효 후 건삼으로 2차 발효를 진행한 콤부차가 87.56%로 가장 높은 것으로 나타났다. 반면 오미자로 발효한 콤부차는 50.84% 수준으로 나타나 1차 발효 콤부차와 비교했을 때 소거능보다 유의적으로 낮은 값을 나타내어 오미자를 이용한 콤부차의 자유 라디칼 소거능이 상대적으로 가장 떨어진다는 것을 알 수 있었다.

Fig 3. Effects of various secondary fermented kombucha on DPPH radical scavenging activities. DPPH radical scavenging ability was quantified, expressed as a percentage of DPPH radical scavenging ability, and shown as the mean±SD (n=3). One-way ANOVA was performed for the data analysis, followed by Tukey’s post-hoc test. *P<0.05 and ***P<0.001, compared to that of the primary.

항산화능을 측정하는 DPPH assay의 결과를 보면, 가장 먼저 2차 발효까지 진행한 건삼 콤부차의 항산화능이 가장 뛰어난 것으로 나타났지만 일반적으로 1차 발효 콤부차와 비교했을 때 2차 발효 콤부차의 항산화능이 서로 비슷하거나 더 낮은 수치를 나타냈다. 이러한 항산화 기능성 실험 결과를 통해 과일과 같은 2차 발효 첨가물의 첨가에 의한 2차 발효가 항산화 기능성 증가에 있어서는 큰 효과가 없음을 확인할 수 있었다. 그러나 DPPH assay의 경우 시료 분자 크기가 크면 DPPH의 자유 라디칼이 소거되지 않을 수 있으며, pH의 변화에도 영향을 받을 수 있다고 알려져 있다(Sharma와 Bhat, 2009). 따라서 이러한 DPPH assay가 가진 한계점을 고려했을 때 본 실험 결과만으로 2차 발효물에서 항산화능이 감소했다고 단정 지을 수는 없으며, 이를 보완하기 위해 다른 방식의 항산화능 측정 연구가 필요할 것으로 사료된다.

MTT assay에 의한 세포 독성

RAW 264.7 세포에 콤부차 추출물을 처리하여 NO 소거 활성을 측정하기 전, 콤부차 추출물이 RAW 264.7 세포의 생존에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고 NO assay에 사용하기 적절한 농도를 설정하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. MTT assay는 세포의 미토콘드리아 활성 정도를 측정하여 시료 내 세포의 생존율을 검증하는 방법으로, MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]가 미토콘드리아의 환원제에 의해 환원되어 510~570 nm 파장의 빛을 흡수하는 formazan을 형성하는 원리를 이용하였다. 실험 결과(Fig. 4A), 1차 발효 콤부차는 모든 농도에서 cell viability가 감소하지 않았고 이를 통해 콤부차 추출물의 세포 독성은 2차 발효 첨가물에 의해 나타남을 확인할 수 있었다. 50 μg/mL에서는 모든 시료에서 cell viability 감소가 나타나지 않았으며, 100 μg/mL 농도에서는 모든 시료에서 cell viability가 80% 이상으로 나타나 세포 독성이 없는 것으로 판별되었다. 200 μg/mL의 농도에서는 1차 발효 콤부차와 자몽을 제외한 나머지 시료에서 80% 미만의 cell viability를 나타냈다는 점을 감안해 NO assay의 콤부차 추출물 처리 농도를 100 μg/mL로 설정하여 이후의 실험을 진행하였다.

Fig 4. Cytotoxicity profile and NO inhibitory effects of various secondary fermented kombucha on RAW 264.7 cells. Cell viability and NO inhibitor activity was quantified, expressed as a percentage of cell viability and NO inhibitor activity, and shown as the mean±SD (n=3). One-way ANOVA was performed for the data analysis, followed by Tukey’s post-hoc test. *P<0.05, compared to that of the primary.

NO 생성 저해 효과

본 실험에서는 콤부차가 갖는 항염증성을 알아보기 위하여 NO assay를 진행하였다. NO assay는 대식세포가 방출하는 NO의 농도를 측정하여 염증 반응의 활성을 알아보는 실험 방법이다. NO는 사이토카인에 의해 활성화된 면역 세포가 분비하는 물질 중 하나로, 추가적인 염증 반응을 활성화하는 핵심적인 매개체로 작용한다(Bogdan, 2002). 본 실험에서는 RAW 264.7 세포를 LPS로 자극하여 NO 생산을 유발하고 콤부차 추출물이 이를 억제하는 정도를 측정하여 항염증성을 측정했다. 콤부차 추출물 100 μg/mL와 LPS를 함께 RAW 264.7 세포에 처리하여 24시간 배양했을 때 나타나는 NO 생산은 Fig. 4B와 같다.

첨가한 2차 발효 첨가물에 따른 콤부차 추출물의 항염증성을 분석한 결과, 자몽, 블루베리, 석류, 건삼에서 1차 발효 콤부차보다 낮은 NO production이 나타났다. 오미자의 경우 1차 발효 콤부차보다 높은 수준의 NO production이 나타났다. 1차 발효 콤부차와 비교했을 때 특히 자몽과 건삼을 추가하여 2차 발효를 진행한 콤부차의 경우 다른 시료와 비교했을 때 유의적으로 가장 뛰어난 항염증 효과를 보였고, 블루베리와 석류를 첨가한 콤부차는 유의적이진 않았지만 수치적으로 NO production이 감소한 것으로 나타났다. 이전 연구(Laureys 등, 2020; Villarreal‐Soto 등, 2018; Yang 등, 2022)에 따르면 콤부차 내에 존재하는 미생물과 미생물의 대사체가 콤부차의 발효과정에 상당한 영향을 주는 것으로 나타나 있다. 따라서 본 실험에서 나타난 결과는 콤부차 내에 존재하는 미생물과 미생물의 대사체에 의한 효과로 보이며, 2차 발효 첨가물에 따라 콤부차 내 존재하는 미생물의 조성 변화로 인한 콤부차 특성 변화에도 영향을 줄 수 있음을 시사한다.

본 연구의 실험군은 2차 첨가물 자체가 다르다는 특징과 그에 따른 성분의 차이가 크기 때문에 NO assay에 영향을 주는 요인도 첨가물마다 차이가 나타날 수 있다(Hunter 등, 2013). 따라서 본 실험의 NO assay 결과는 콤부차의 항염증성을 온전히 대변하기에는 한계가 존재할 수 있다. 본 연구에서 NO assay 전처리 과정으로 콤부차 발효액의 동결건조 과정을 진행하여 첨가물에 따른 성분의 종류와 농도 차이를 최소화하였고, 또한 콤부차 1차 발효액 및 2차 발효 시 사용한 원료 모두 항염증성을 갖는다는 연구(Jeong 등, 2010; García‐Martínez 등, 2018; Baek 등, 2016; Colombo 등, 2013)를 고려할 때 본 연구 결과는 콤부차의 항염증능을 정성적으로 대변할 수 있다. 그러나 좀 더 명확한 콤부차의 항염증성을 입증하기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료되며, 본 연구는 후속 연구 진행을 위한 가이드라인을 제시했다는 점에 의의가 있다.

콤부차는 녹차나 홍차를 스코비(SCOBY)와 함께 발효시켜 만든 음료이며, 높은 항산화 활성, 소화율, 피부미용 능력, 비만 예방 효과를 가지고 있는 것으로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 기본적으로 설탕을 당원으로 발효한 콤부차에 2차 발효를 위한 5가지 2차 발효 첨가물(블루베리, 석류, 자몽, 건조 인삼, 오미자)을 첨가하여 실험을 진행하였다. 먼저 스코비에 존재하는 미생물들을 확인하고 여러 종류의 유리당, 유기산 및 에탄올의 농도를 측정했다. 또한, DPPH assay를 통해 항산화 활성을 측정하였고, RAW 264.7 세포를 이용한 NO assay를 통해 항염증 활성을 측정하였다. 스코비 미생물 동정 결과 초산균에 속하는 Acetobacter senegalensis와 Acetobacter tropicalis가 발견되었으며, Dekkera bruxellensis, Schizosaccharomyces pombe, Bruxellensis spp. 같은 효모들도 존재함을 확인하였다. 1차 발효 후 콤부차의 발효 특성을 분석한 결과 sucrose는 감소하였고 acetic acid는 증가하는 것으로 나타났으며, 2차 발효 시 2차 발효 첨가물에 따른 콤부차의 발효 특성 변화도 확인하였다. DPPH 분석 결과, 1차 발효 콤부차와 건삼 콤부차가 가장 높은 항산화 활성을 보였고 NO 분석 결과에서는 자몽과 인삼을 추가하여 발효한 콤부차에서 뛰어난 항염증 활성을 보였다. 따라서 본 연구를 통해 일반적인 콤부차의 발효 특성을 비롯하여 다양한 2차 발효 첨가물을 첨가한 2차 발효 콤부차의 발효 특성과 항산화 및 항염 효과 결과를 확인하였으며, 앞으로 콤부차의 건강 기능성과 관련된 연구에 도움이 될 것으로 사료된다.

이 논문은 2021년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단－중견연구사업(NRF-2021R1A2C3011051)과 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ015865)의 지원을 받아 수행된 연구임.