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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(8): 780-788

Published online August 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.8.780

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Effect of Cudrania tricuspidata Water Extract on TNF-α-Induced Endoplasmic Reticulum Stress and Changes in Insulin Signaling and Lipid Metabolism in HepG2 Cells

Ok-Kyung Kim

Division of Food and Nutrition, Chonnam National University

Correspondence to:Ok-Kyung Kim, Division of Food and Nutrition, Chonnam National University, 77, Yongbong-ro, Buk-gu, Gwangju 61186, Korea, E-mail: 20woskxm@jnu.ac.kr
Author information: Ok-Kyung Kim (Professor)

Received: April 13, 2022; Revised: May 18, 2022; Accepted: May 30, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Hepatic inflammation and endoplasmic reticulum (ER) stress are associated with several metabolic conditions, including obesity and hyperglycemia. We evaluated the effects of the water extract of Cudrania tricuspidata leaves (CTL) in the tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)-treated HepG2 cells to examine its protective effects in TNF-α triggered ER stress, insulin resistance, and lipogenesis in hepatic cells. The TNF-α-stimulated control group showed a marked increase in the inflammatory cytokines [TNF-α, interleukin (IL)-1β, and IL-6] and ER stress-related factors (IRE1α, eIF2α, ATF4, CHOP, XBP-1, and GRP78). Additionally, TNF-α suppressed the insulin signaling IRS/Akt pathway and increased the mRNA expression of SREBP-1 and FAS. The CTL treatment, however, caused the interruption of TNF-α-induced inflammation and ER stress in the HepG2 cells. Moreover, the treatment with CTL resulted in the activation of insulin signaling and inhibition of gluconeogenic gene expression and lipogenesis. In conclusion, these results suggest that CTL can protect against inflammation as well as ER stress, insulin resistance, and lipogenesis in the liver and that it may be a useful agent in the treatment of hyperglycemia.

Keywords: TNF-α, ER stress, insulin resistance, inflammation, Cudrania tricuspidata

Tumor necrosis factor(TNF)-α는 다양한 유형의 세포에 의해 생성되는 전염증성 사이토카인이다. 증가한 TNF-α 수준은 interleukin(IL)-1β 및 IL-6를 포함한 다른 전염증성 사이토카인의 발현 및 분비와 함께 염증을 유도한다(Treede 등, 2009; Luo, 2018). 이전 연구에서는 비만 실험 모델에서 증가한 TNF-α가 염증 및 인슐린 저항성의 발달과 관련이 있음을 보고하였다(Ye, 2013). 비만에 의한 인슐린 저항성 유발의 분자적 기전은 불분명하지만, 지방세포 내 과도한 지방축적은 TNF-α 분비를 증가시키고, 분비된 TNF-α는 간조직에서 소포체 스트레스[endoplasmic reticulum(ER) stress]와 인슐린 저항성을 유발하여 당뇨병의 진행을 가속할 수 있다고 보고되었다(Denis 등, 2010; Xue 등, 2005; Masharani 등, 2011).

간세포는 크고 잘 발달한 소포체가 필요하며 소포체 항상성의 변화에 ​​민감하다. 소포체는 진핵 세포에서 가장 큰 세포소기관 중 하나로 칼슘 저장, 지질 합성 및 단백질 접힘(folding) 등의 중요한 기능을 한다. 모든 단백질은 소포체를 통해 분비 경로로 들어가고 접힘에 의해 가공된다. 소포체에 펼쳐진 단백질(unfolded proteins)이 축적되면 단백질 접힘을 위해 세 가지 ER 막관통 단백질[PKR-like endoplasmic reticulum kinase(PERK), activating transcription factor(ATF) 6, inositol-requiring enzyme 1(IRE1)]이 활성화된다. 이러한 반응을 펼쳐진 단백질 반응(unfolded protein response, UPR)이라고 하며 단백질의 분해와 단백질 접힘을 돕는 샤페론의 발현을 유도한다. 하지만 UPR이 펼쳐진 단백질의 축적을 억제할 수 없는 경우 소포체 스트레스가 유발된다(Lee와 Glimcher, 2009; Achard와 Laybutt, 2012).

이전 연구 결과에서 TNF-α에 대한 노출이 소포체 스트레스를 유도하여 nuclear factor kappa B(NF-κB) 및 c-Jun N-terminal kinase(JNK) 경로를 통해 insulin receptor substrate-1(IRS-1) 세린 잔기 인산화를 유도하였음을 보고하였다(Masharani 등, 2011; Feng 등, 2020). 소포체 스트레스 상태에서 IRE1에 의해 매개되는 JNK 경로의 활성화와 PERK에 의해 매개되는 eukaryotic initiation factor-2α(eIF2α) 인산화 경로의 활성화는 당신생합성 관여 효소인 phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)와 glucose 6-phosphatase(G6Pase) 유전자의 발현을 자극하여 인슐린 저항성을 악화시킬 수 있다. 또한 TNF-α는 지방생합성을 촉진하여 에너지 항상성에 불균형을 유발할 수 있으며, 간조직의 비정상적인 지방축적 또한 인슐린 저항성을 유도할 수 있다(Ozcan 등, 2004; Cnop 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 간세포에서 TNF-α를 염증 매개체로 사용하여 염증에 의한 소포체 스트레스, 인슐린 저항성 및 지방생합성을 유도하였다.

꾸지뽕나무는 뽕나무과(Molaceae)에 속하는 낙엽활엽교목으로 동아시아나 우리나라 전라도, 경상도, 충청남도 등에 분포하고 10월경 붉은 열매를 맺는 특징이 있다(Lee 등, 2007). 사전 연구에 따르면 꾸지뽕(Cudrania tricuspidata)은 항산화, 항비만, 항염, 항고혈당 등의 효과가 있음이 밝혀졌다(Yang 등, 2012; Park 등, 2012). 이전 연구에서 꾸지뽕의 잎, 줄기, 열매 일부의 총 폴리페놀 함량과 항산화 효과를 비교한 결과 잎에서 가장 높았음을 확인하였고, 당뇨 유발 동물 모델에서 꾸지뽕 잎 물추출물(CTL)의 투여가 항당뇨 효능을 보였을 뿐만 아니라(Kim 등, 2012), 간조직에서 염증과 소포체 스트레스 발생을 억제시켰음을 확인하였다(Kim 등, 2016). 하지만 꾸지뽕의 항비만, 항당뇨, 항염 효능의 분자학적 기전은 명확하지 않으며, 이러한 복합적인 효능이 서로 연관성이 있는지에 대해서는 기전이 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 이러한 효능의 기전을 확인하기 위하여 비만에서 일반적으로 증가하는 TNF-α를 간세포에 노출하고 CTL의 처리가 염증, 소포체 스트레스, 인슐린 저항성 및 지방생합성에 미치는 영향을 관찰하였다.

꾸지뽕 잎 물추출물 준비

본 연구에 사용된 꾸지뽕나무 잎은 영농법인 고성 꾸지뽕에서 제공받았으며, 이물질을 제거한 후 동결건조기로 건조하여 분말화하였다. 분말 시료 50 g에 1 L의 증류수를 가하여 250°C에서 3시간 동안 reflux 하여 추출하였다. 추출물을 여과한 후 회전진공농축기로 감압 농축하여 동결 건조한 다음 -20°C에 보관하며 본 실험에 사용하였다.

세포배양 및 처리

본 실험에 사용된 인간 간암세포주 HepG2는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구매하였으며, 10% FBS와 penicillin streptomycin(100 units/mL), L-glutamine(200 mM), HEPES(1 M), gentamicin reagent(1 mg/mL)가 함유된 high-glucose DMEM 배지를 사용하였고, 37°C, 5% CO2, 95% humid air로 조절된 배양기(Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였다. HepG2 세포를 6-well plate에 분주하고 24시간 동안 증식시킨 후, 1 ng/mL 또는 10 ng/mL TNF-α(R&D System, Minneapolis, MN, USA)와 CTL을 300 μg/mL 또는 500 μg/mL 처리하여 24시간 배양하였다.

Western blot을 통한 단백질 발현 확인

HepG2 세포를 protease inhibitor가 첨가된 lysis buffer(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 세포를 균질화한 다음 ice에 두어 일정 시간 유지한 후 원심분리(12,000 rpm, 20 min, 4°C)하여 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 BSA와 Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 Bradford법(1976)으로 정량하였다. NuPAGE® LDS sample buffer 4X(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 동일한 단백질량이 포함된 샘플을 준비하였다. Sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE, 10%)을 이용하여 전기영동으로 샘플을 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이하였다. 그 후 blocking solution(5% skim milk in TBS containing 0.5% Tween 20)으로 1시간 동안 blocking을 하였고, 1차 항체 JNK, p-JNK, NF-κB, p-NF-κB, IRE1α, p-eIF2α, eIF2α, p-eIF2α, IRS-1, p-IRS-1(ser), Akt, p-Akt, ACC, p-ACC, β-actin(1:1,000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)을 12시간 4°C에서 반응시켰다. Membrane을 HRP가 중합된 2차 항체(1:5,000, antirabbit IgG HRP-linked antibody, Cell Signaling Technology)에 60분간 반응시켰고, enhanced chemiluminescent(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chiffon, UK)를 이용해 발색한 후 Easy photo를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 western blot band 이미지들은 Image J Software(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 band의 밀도를 측정하였다.

RNA 추출 및 실시간 정량 PCR

HepG2 세포의 RNA는 RNeasy Mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 추출하였고, iScript cDNA Synthesis kit(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위해 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 real-time PCR(Applied Bio systems, Foster City, CA, USA)을 수행하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR primer의 염기서열은 Table 1과 같다. Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 10 μL의 2X SYBR mix, 2 μL cDNA, forward 및 reverse primer 1 μL씩 각각 100 pmol/μL를 첨가하였고 나머지 볼륨은 nuclease free water로 채워주었다. 모든 유전자에 대한 PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 cycle은 40 cycle을 실시하였다. Hot start를 위해 95°C에서 10분, denaturation을 95°C에서 15초, annealing을 52°C에서 30초, extension을 72°C에서 30초간 반복하며 각 cycle의 extension 후에 값이 기록되었다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과는 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.1로 분석하였으며 mRNA의 상대적인 함량은 TNF-α 처리를 하지 않은 군에 대한 상대적인 양으로 나타냈다.

Table 1 . Primer sets used for real-time PCR

GeneSequence
GAPDH (H)F5′-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3′
R5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3′
TNF-α (H)F5′-CCA CTT CGA AAC CTG GGA TTC-3′
R5′-TTA GTG GTT GCC AGC ACT TCA-3′
IL-1β (H)F5′-TTA AAG CCC GCC TGA CAG A-3′
R5′-GCG AAT GAC AGA GGG TTT CTT AG-3′
IL-6 (H)F5′-AGG GCT CTT CGG CAA ATG TA-3′
R5′-GAA GGA ATG CCC ATT AAC AAC AA-3′
ATF4 (H)F5′-GAG GTG GCC AAG CAC TTC AA-3′
R5′-GCC CGC CTT AGC CTT GTC-3′
CHOP (H)F5′-CTC TGA TTG ACC GAA TGG TGA A-3′
R5′-GGG ACT GAT GCT CCC AAT TG-3′
XBP-1 (H)F5′-CCT GAG CCC CGA GGA GAA-3′
R5′-GGC AGT CTG AGC TGC TAC TCT GT-3′
GRP78 (H)F5′-TGG CGG AAC CTT CGA TGT-3′
R5′-GCC ACA ACT TCG AAG ACA CCA T-3′
G6Pase (H)F5′-GAG TGG AGT GGC ACG ATC TTG-3′
R5′-GAC ATG AGA ATC GCT TGA ACC A-3′
PEPCK (H)F5′-TGG GCT CGC CTC TGT CA-3′
R5′-CCA CCA CGT AGG GTG AAT CC-3′
SREBP-1 (H)F5′-CGG AAC CAT CTT GGC AAC A-3′
R5′-GCC GGT TGA TAG GCA GCT T-3′
FAS (H)F5′-CAG CCA TGG AGG AGG TGG TGA TT-3′
R5′-GGG ACA TGC CTA ACA CCT ACG TCT A-3′
ACC (H)F5′-TGC AGA TCT TAG CGG ACC AA-3′
R5′-GCC TGC GTT GTA CAG AGC AAA-3′


세포 내 중성지질 측정

HepG2 세포의 중성지질을 측정하기 위해 Colorimetric/Fluorometric Triglyceride Assay kit(Biomax, Seoul, Korea)을 사용하여 제공된 방법으로 수행하였다.

통계처리

본 실험은 SPSS(Statistical Package for Social Science, version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 사용하였다. 각 실험군의 측정 항목 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였으며, 실험군 간 평균 차이를 one-way ANOVA로 확인한 후 그룹 간의 통계적 유의성은 Duncan’s multiple range test를 실시하였다. 실험군 간에 유의성을 P<0.05 수준에서 검정하였다.

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물의 염증 억제 효능

TNF-α는 세포 표면의 TNF-α 수용체에 결합하여 JNK 인산화를 통한 신호전달 활성화와 NF-κB 인산화를 통한 전사 인자 활성화에 의해 염증 물질 합성을 증가시킨다(Gupta 등, 2007). 본 연구에서는 JNK 및 NF-κB 인산화(Fig. 1A~C)뿐만 아니라 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 mRNAs 발현(Fig. 1D~F)이 정상 HepG2 세포에 비해 TNF-α로 자극된 HepG2 세포에서 유의적으로(P<0.05) 증가했음을 보여주었다. 이는 HepG2 세포에서 TNF-α 처리가 정상적으로 염증을 유발했음을 나타낸다. TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때, JNK 및 NF-κB 인산화(Fig. 1A~C)는 감소하였고 전염증성 사이토카인의 mRNAs 발현(Fig. 1D~F)이 Control 그룹과 비교하여 유의적으로(P<0.05) 감소하였다.

Fig. 1. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on inflammation in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of JNK (B) and NF-κB (C) in TNF-α-induced HepG2 cells. mRNA expression of pro-inflammatory cytokines (D, TNF-α; E, IL-1β; F, IL-6) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

Jeong 등(2009)의 연구에서 꾸지뽕으로부터 추출된 Cudratricusxanthone A가 염증을 유발한 대식세포에서 cyclooxygenase-2, nitric oxide synthase, prostaglandin E2의 발생을 감소시켜 항염 효능이 있음을 입증하였다. 또한 Joo와 Lim(2009)의 연구 결과에서는 CCl4 처리를 통해 간 손상을 유발한 마우스에서 꾸지뽕 투여가 간조직의 NF-κB 경로를 억제해 간 보호 효능을 나타냈다. 이러한 사전 연구 결과와 본 연구의 결과에 의해 꾸지뽕의 항염 효능을 확인할 수 있었다.

대부분의 비만 환자에서 백색지방 조직은 전염증성 사이토카인의 분비 증가를 특징으로 하며(Cottam 등, 2004), 증가한 전염증성 사이토카인이 간조직에서 염증 ​​및 소포체 스트레스를 통해 인슐린 신호전달에 부정적인 영향을 미친다고 알려져 있다(Denis 등, 2010; Xue 등, 2005). 따라서 본 연구에서는 TNF-α가 처리된 간세포에서 소포체 스트레스 및 인슐린 저항성이 유발되었는지 확인하고, CTL의 처리에 의한 변화를 관찰하였다.

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물의 소포체 스트레스 억제 효능

소포체 스트레스의 첫 반응은 소포체 막관통 단백질 중 하나인 PERK 활성화 매개 eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit α(eIF2α)의 인산화로, 이는 mRNA에서 단백질로 번역(translation)이 되는 과정을 감소시킨다. 번역 감소를 통해 새롭게 펼쳐진 단백질합성을 감소시켜 소포체의 부담이 감소하도록 조절된다. 또 다른 소포체 막관통 단백질 ATF6는 소포체 스트레스가 발생하면 소포체에서 골지체로의 이동 후 절단되어 N-말단 ATF6가 핵에서 전사 인자로 작용한다. 세 번째 소포체 막관통 단백질 IRE1α는 소포체 스트레스에 의해 인산화되어 XBP-1의 splicing을 유도한다. 이러한 N-말단 ATF6와 IRE1α/XBP-1의 경로에 의해 단백질 접힘에 중요한 효소와 샤페론 단백질의 발현이 유도되고 펼쳐진 단백질제거가 일어난다(Ozcan 등, 2004; Schröder, 2008).

하지만 이러한 소포체 스트레스 반응이 일어나는 동안 eIF2α의 인산화는 ATF4를 통해 proapoptotic transcription factor인 C/EBP homologous protein(CHOP) 발현을 유도하여 염증 및 세포사멸(apoptosis)을 유발할 수 있다. 또한 IRE1α 인산화를 통한 JNK 경로 활성화와 N-말단 ATF6도 CHOP 발현을 증가시킬 수 있다(Ozcan 등, 2004; Schröder, 2008). Denis 등(2010)은 TNF-α 수용체 신호가 소포체 스트레스의 유도로 이어지는 경로에 관여할 수 있다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 TNF-α로 자극된 HepG2 세포에서 소포체 스트레스가 유발되었는지 확인하기 위해 IRE1α와 eIF2α의 인산화 유무, ATF4, CHOP, XBP-1, 78 kDa glucose-regulated protein(GRP78)의 mRNA 발현을 확인하였다.

HepG2 세포에 TNF-α를 처리했을 때 eIF2α/ATF4/CHOP(Fig. 2A ,B,D,E) 경로, IRE1α/XBP-1(Fig. 2A,C,F) 경로, IRE1α/JNK/CHOP(Fig. 2C, Fig. 1B, Fig. 2E) 경로가 모두 활성화되었으며, 샤페론 단백질인 GRP78의 mRNA 발현(Fig. 2G)이 유의적(P<0.05)으로 증가하였음을 확인하였다. TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때 eIF2α/ATF4/CHOP(Fig. 2A,B,D,E) 경로, IRE1α/XBP-1(Fig. 2A,C,F) 경로, IRE1α/JNK/CHOP(Fig. 2A,C, Fig. 1B, Fig. 2E) 경로의 활성화와 GRP78의 mRNA 발현(Fig. 2G)이 Control 그룹과 비교하여 모두 유의적으로(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다. 이러한 연구 결과에 의해 CTL은 간세포에서 염증에 의한 소포체 스트레스 유발을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

Fig. 2. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on endoplasmic reticulum stress in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of eIF2α (B) and IRE1α (C) in TNF-α- induced HepG2 cells. mRNA expression of ATF4 (D), CHOP (E), XBP-1 (F), and GRP78 (G) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.


TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물의 인슐린 저항성 억제 효능

비만은 간 인슐린 저항성 발달의 주요 요인이지만 비만과 간 인슐린 저항성 사이의 관계에 대한 분자 메커니즘은 여전히 명백하게 밝혀지지 않았다. 비만과 간 인슐린 저항성을 연결하는 분자 메커니즘은 불분명하지만, 이전 연구에서 전염증성 사이토카인에 의해 유도된 염증 및 소포체 스트레스가 간 인슐린 저항성의 발달로 이어진다고 보고되었다(Feng 등, 2020; Ozcan 등, 2004).

Cai 등(2005) 연구의 고지방 식이를 섭취한 마우스의 간에서 전염증성 사이토카인의 생성과 지질 축적이 NF-κB 활성화를 유발하였으며, 이러한 염증 상태가 인슐린 저항성을 유발했다고 밝혔다. 인슐린 신호전달은 인슐린수용체에 인슐린이 결합했을 때 IRS의 타이로신 잔기 인산화에 의해 시작된다. IRS의 타이로신 잔기 인산화에 의해 phosphoinositide 3-kinase가 Akt 등 단백질 활성화에 의해 세포 내 인슐린에 대한 반응을 촉진한다. Gupta 등(2007)의 연구 결과에서는 TNF-α가 처리된 세포에서 IRS-1 세린 잔기의 과인산화가 유발되었음을 보여주었다. 또 다른 연구에 따르면 소포체 스트레스 유발과 소포체 스트레스 매개 염증 유발은 IRS의 세린 인산화를 통해 인슐린 저항성의 발달로 이어진다고 보고되었다(Hirosumi 등, 2002). 결론적으로 TNF-α의 노출은 세포에서 인슐린 저항성 유발의 역할을 할 수 있다.

소포체 스트레스에 의한 IRE1α/JNK 경로 활성화는 인슐린 신호전달을 방해하고, eIF2α의 인산화는 C/EBP의 활성화에 의해 G6Pase 또는 PEPCK와 같은 당신생 관여 효소의 유전자 발현을 초래한다. 따라서 간조직에서 염증 및 소포체 스트레스는 인슐린 신호전달 방해 및 포도당신생합성의 활성화를 통해 간 인슐린 저항성 및 대사 조절 장애에 영향을 줄 수 있다(Choudhury 등, 2011; Schwabe와 Brenner, 2006). 본 연구에서는 HepG2 세포에서 TNF-α를 처리했을 때 염증과 소포체 스트레스뿐만 아니라 인슐린 저항성을 유발할 수 있다고 추측하였다.

HepG2 세포에 TNF-α를 처리한 후 인슐린 신호전달을 관찰한 결과, TNF-α가 IRS-1 세린 잔기(Ser636/639) 인산화(Fig. 3A,B)를 유도하고 Akt(protein kinase B)의 인산화(Fig. 3A,C)가 감소하였음을 확인하여 인슐린 저항성이 유도되었음을 확인하였다. 또한 G6Pase(Fig. 3D)와 PEPCK(Fig. 3E)의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과, TNF-α 처리가 처리하지 않은 그룹과 비교하여 유의적으로(P<0.05) 증가하였음을 확인하였다. TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때, IRS-1 세린 잔기 인산화(Fig. 3A,B), G6Pase(Fig. 3D)와 PEPCK(Fig. 3E)의 mRNA 발현은 유의적으로(P<0.05) 감소하였고 Akt의 인산화(Fig. 3A,C)는 유의적으로(P<0.05) 증가하였음을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 간세포에서 TNF-α가 인슐린 저항성을 유발할 수 있으나, CTL 처리가 이러한 반응을 억제할 수 있음을 보여주었다.

Fig. 3. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on insulin signaling in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of IRS-1 (B) and Akt (C) in TNF-α-induced HepG2 cells. mRNA expression of G6Pase (D), and PEPCK (E) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물의 지방생합성 억제 효능

Wandrer 등(2020)의 연구에서는 TNF-α 매개 간 손상이 TNF 수용체 신호전달에 의해 일어났음을 보여주었고, 고지방식이 섭취 마우스에 anti-TNFR1-antibody를 처리했을 때 간조직의 지방축적 감소와 SREBP1의 발현이 감소하였음을 보여주었다. SREBP1은 지질 생성에서 중요한 전사 조절인자로, 소포체로부터 골지체로 이동되어 프로세스 된 후 핵으로 이동하여 콜레스테롤 및 지방산 합성에 관여하는 유전자 발현을 유도한다(Kim과 Spiegelman, 1996). 따라서 TNF-α의 처리는 간세포에서 비정상적인 지방생합성을 유도할 수 있으므로 본 연구에서는 TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리하여 지방생합성 관련 인자의 변화를 관찰하였다. 앞 실험에서 사용한 TNF-α 1 ng/mL의 처리는 HepG2 세포에서 지방대사 변화가 미미하게 나타나 CTL의 효능을 관찰하기 어려웠다. TNF-α 10 ng/mL를 처리했을 때 HepG2 세포에서 지방대사 변화가 관찰되어 본 실험에서는 TNF-α 10 ng/mL를 처리한 후 CTL의 효능을 관찰하였다.

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 SREBP1의 mRNA 발현을 확인한 결과(Fig. 4A), TNF-α 처리가 SREBP1의 발현을 유의적으로(P<0.05) 증가시켰음을 확인하였다. 하지만 CTL 처리는 TNF-α 처리에 의해 증가한 SREBP1의 발현을 유의적으로(P<0.05) 감소시켰음을 확인하였다.

Fig. 4. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on lipogenesis in TNF-α (10 ng/mL)-induced HepG2 cells. mRNA expression of SREBP-1 (A), FAS (B), and ACC (C) and total protein and phosphorylation of ACC (bands, D; E) in TNF-α-induced HepG2 cells. The level of intracellular triglyceride (F) in TNF-α-induced HepG2 cells. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

Acetyl CoA carboxylase(ACC)는 지방산 생합성의 개시 기전에 관여하는 효소로, 인산화에 의해 활성이 억제되어 지방산 합성이 억제된다(Imamura 등, 2020). TNF-α가 처리된 간세포에서 ACC의 mRNA 발현(Fig. 4C)을 확인한 결과 그룹 간에 ACC mRNA 발현에는 큰 차이가 없었지만, ACC 인산화(Fig. 4D,E)를 측정한 결과에서 정상군과 비교해 TNF-α를 처리한 세포가 ACC 인산화를 유의적으로(P<0.05) 감소시켰음을 확인하였다. TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때, ACC 인산화가 Control과 비교하여 유의적으로(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다. 지방산 합성을 촉매하는 다중 효소 단백질인 fatty acid synthase(FAS)의 발현(Imamura 등, 2020)을 확인한 결과(Fig. 4B), TNF-α가 처리된 HepG2 세포 FAS의 mRNA 발현이 유의적으로(P<0.05) 증가하였음을 확인하였다. 반면, TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때는 FAS의 mRNA 발현이 Control과 비교하여 유의적으로(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다. 또한 세포 내 지방축적을 확인한 결과(Fig. 4F), TNF-α를 처리했을 때는 중성지질 함량이 증가하였지만, CTL을 처리했을 때는 유의적으로(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다. 이러한 결과는 TNF-α 처리로 간세포에서 지방생합성을 유도할 수 있으며, CTL 처리는 TNF-α에 의한 지방생합성을 억제해 비정상적인 지방합성을 억제할 수 있음을 시사한다(Fig. 5).

Fig. 5. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves on TNF-α-induced inflammation, ER stress, and insulin resistance in HepG2 cells.

사전 연구를 통해 당뇨 유발 동물 모델에서 CTL의 투여가 항당뇨 효능을 보였을 뿐만 아니라 간조직에서 염증과 소포체 스트레스 발생은 억제했음을 확인하여, 본 연구에서는 이러한 CTL 효능의 기전을 밝히는 실험을 수행하였다. 본 연구에서는 TNF-α를 이용하여 염증을 유발한 HepG2 세포에서 소포체 스트레스, 인슐린 저항성, 지방생합성의 변화를 관찰하고, CTL의 처리에 의한 효과를 관찰하였다. TNF-α를 HepG2 세포에 처리했을 때 염증뿐만 아니라 소포체 스트레스, 인슐린 저항성, 지방생합성이 유도되었음을 확인하였다. 하지만 TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때는 염증이 억제되었을 뿐만 아니라, 소포체 스트레스, 인슐린 저항성, 지방생합성 또한 억제되었음을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과 CTL이 간에서의 염증, 소포체 스트레스, 인슐린 저항성, 지방생합성의 발생으로부터 보호할 수 있고 고혈당증 치료에 유용한 약제가 될 수 있음을 보여주었다.

이 논문은 전남대학교 학술연구비(과제번호: 2021-2448) 지원에 의하여 연구되었다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(8): 780-788

Published online August 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.8.780

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물 처리가 소포체 스트레스, 인슐린 신호전달과 지방대사 변화에 미치는 영향

김 옥 경

전남대학교 식품영양과학부

Received: April 13, 2022; Revised: May 18, 2022; Accepted: May 30, 2022

Effect of Cudrania tricuspidata Water Extract on TNF-α-Induced Endoplasmic Reticulum Stress and Changes in Insulin Signaling and Lipid Metabolism in HepG2 Cells

Ok-Kyung Kim

Division of Food and Nutrition, Chonnam National University

Correspondence to:Ok-Kyung Kim, Division of Food and Nutrition, Chonnam National University, 77, Yongbong-ro, Buk-gu, Gwangju 61186, Korea, E-mail: 20woskxm@jnu.ac.kr
Author information: Ok-Kyung Kim (Professor)

Received: April 13, 2022; Revised: May 18, 2022; Accepted: May 30, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Hepatic inflammation and endoplasmic reticulum (ER) stress are associated with several metabolic conditions, including obesity and hyperglycemia. We evaluated the effects of the water extract of Cudrania tricuspidata leaves (CTL) in the tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)-treated HepG2 cells to examine its protective effects in TNF-α triggered ER stress, insulin resistance, and lipogenesis in hepatic cells. The TNF-α-stimulated control group showed a marked increase in the inflammatory cytokines [TNF-α, interleukin (IL)-1β, and IL-6] and ER stress-related factors (IRE1α, eIF2α, ATF4, CHOP, XBP-1, and GRP78). Additionally, TNF-α suppressed the insulin signaling IRS/Akt pathway and increased the mRNA expression of SREBP-1 and FAS. The CTL treatment, however, caused the interruption of TNF-α-induced inflammation and ER stress in the HepG2 cells. Moreover, the treatment with CTL resulted in the activation of insulin signaling and inhibition of gluconeogenic gene expression and lipogenesis. In conclusion, these results suggest that CTL can protect against inflammation as well as ER stress, insulin resistance, and lipogenesis in the liver and that it may be a useful agent in the treatment of hyperglycemia.

Keywords: TNF-α, ER stress, insulin resistance, inflammation, Cudrania tricuspidata

서 론

Tumor necrosis factor(TNF)-α는 다양한 유형의 세포에 의해 생성되는 전염증성 사이토카인이다. 증가한 TNF-α 수준은 interleukin(IL)-1β 및 IL-6를 포함한 다른 전염증성 사이토카인의 발현 및 분비와 함께 염증을 유도한다(Treede 등, 2009; Luo, 2018). 이전 연구에서는 비만 실험 모델에서 증가한 TNF-α가 염증 및 인슐린 저항성의 발달과 관련이 있음을 보고하였다(Ye, 2013). 비만에 의한 인슐린 저항성 유발의 분자적 기전은 불분명하지만, 지방세포 내 과도한 지방축적은 TNF-α 분비를 증가시키고, 분비된 TNF-α는 간조직에서 소포체 스트레스[endoplasmic reticulum(ER) stress]와 인슐린 저항성을 유발하여 당뇨병의 진행을 가속할 수 있다고 보고되었다(Denis 등, 2010; Xue 등, 2005; Masharani 등, 2011).

간세포는 크고 잘 발달한 소포체가 필요하며 소포체 항상성의 변화에 ​​민감하다. 소포체는 진핵 세포에서 가장 큰 세포소기관 중 하나로 칼슘 저장, 지질 합성 및 단백질 접힘(folding) 등의 중요한 기능을 한다. 모든 단백질은 소포체를 통해 분비 경로로 들어가고 접힘에 의해 가공된다. 소포체에 펼쳐진 단백질(unfolded proteins)이 축적되면 단백질 접힘을 위해 세 가지 ER 막관통 단백질[PKR-like endoplasmic reticulum kinase(PERK), activating transcription factor(ATF) 6, inositol-requiring enzyme 1(IRE1)]이 활성화된다. 이러한 반응을 펼쳐진 단백질 반응(unfolded protein response, UPR)이라고 하며 단백질의 분해와 단백질 접힘을 돕는 샤페론의 발현을 유도한다. 하지만 UPR이 펼쳐진 단백질의 축적을 억제할 수 없는 경우 소포체 스트레스가 유발된다(Lee와 Glimcher, 2009; Achard와 Laybutt, 2012).

이전 연구 결과에서 TNF-α에 대한 노출이 소포체 스트레스를 유도하여 nuclear factor kappa B(NF-κB) 및 c-Jun N-terminal kinase(JNK) 경로를 통해 insulin receptor substrate-1(IRS-1) 세린 잔기 인산화를 유도하였음을 보고하였다(Masharani 등, 2011; Feng 등, 2020). 소포체 스트레스 상태에서 IRE1에 의해 매개되는 JNK 경로의 활성화와 PERK에 의해 매개되는 eukaryotic initiation factor-2α(eIF2α) 인산화 경로의 활성화는 당신생합성 관여 효소인 phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)와 glucose 6-phosphatase(G6Pase) 유전자의 발현을 자극하여 인슐린 저항성을 악화시킬 수 있다. 또한 TNF-α는 지방생합성을 촉진하여 에너지 항상성에 불균형을 유발할 수 있으며, 간조직의 비정상적인 지방축적 또한 인슐린 저항성을 유도할 수 있다(Ozcan 등, 2004; Cnop 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 간세포에서 TNF-α를 염증 매개체로 사용하여 염증에 의한 소포체 스트레스, 인슐린 저항성 및 지방생합성을 유도하였다.

꾸지뽕나무는 뽕나무과(Molaceae)에 속하는 낙엽활엽교목으로 동아시아나 우리나라 전라도, 경상도, 충청남도 등에 분포하고 10월경 붉은 열매를 맺는 특징이 있다(Lee 등, 2007). 사전 연구에 따르면 꾸지뽕(Cudrania tricuspidata)은 항산화, 항비만, 항염, 항고혈당 등의 효과가 있음이 밝혀졌다(Yang 등, 2012; Park 등, 2012). 이전 연구에서 꾸지뽕의 잎, 줄기, 열매 일부의 총 폴리페놀 함량과 항산화 효과를 비교한 결과 잎에서 가장 높았음을 확인하였고, 당뇨 유발 동물 모델에서 꾸지뽕 잎 물추출물(CTL)의 투여가 항당뇨 효능을 보였을 뿐만 아니라(Kim 등, 2012), 간조직에서 염증과 소포체 스트레스 발생을 억제시켰음을 확인하였다(Kim 등, 2016). 하지만 꾸지뽕의 항비만, 항당뇨, 항염 효능의 분자학적 기전은 명확하지 않으며, 이러한 복합적인 효능이 서로 연관성이 있는지에 대해서는 기전이 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 이러한 효능의 기전을 확인하기 위하여 비만에서 일반적으로 증가하는 TNF-α를 간세포에 노출하고 CTL의 처리가 염증, 소포체 스트레스, 인슐린 저항성 및 지방생합성에 미치는 영향을 관찰하였다.

재료 및 방법

꾸지뽕 잎 물추출물 준비

본 연구에 사용된 꾸지뽕나무 잎은 영농법인 고성 꾸지뽕에서 제공받았으며, 이물질을 제거한 후 동결건조기로 건조하여 분말화하였다. 분말 시료 50 g에 1 L의 증류수를 가하여 250°C에서 3시간 동안 reflux 하여 추출하였다. 추출물을 여과한 후 회전진공농축기로 감압 농축하여 동결 건조한 다음 -20°C에 보관하며 본 실험에 사용하였다.

세포배양 및 처리

본 실험에 사용된 인간 간암세포주 HepG2는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구매하였으며, 10% FBS와 penicillin streptomycin(100 units/mL), L-glutamine(200 mM), HEPES(1 M), gentamicin reagent(1 mg/mL)가 함유된 high-glucose DMEM 배지를 사용하였고, 37°C, 5% CO2, 95% humid air로 조절된 배양기(Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였다. HepG2 세포를 6-well plate에 분주하고 24시간 동안 증식시킨 후, 1 ng/mL 또는 10 ng/mL TNF-α(R&D System, Minneapolis, MN, USA)와 CTL을 300 μg/mL 또는 500 μg/mL 처리하여 24시간 배양하였다.

Western blot을 통한 단백질 발현 확인

HepG2 세포를 protease inhibitor가 첨가된 lysis buffer(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 세포를 균질화한 다음 ice에 두어 일정 시간 유지한 후 원심분리(12,000 rpm, 20 min, 4°C)하여 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 BSA와 Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 Bradford법(1976)으로 정량하였다. NuPAGE® LDS sample buffer 4X(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 동일한 단백질량이 포함된 샘플을 준비하였다. Sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE, 10%)을 이용하여 전기영동으로 샘플을 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이하였다. 그 후 blocking solution(5% skim milk in TBS containing 0.5% Tween 20)으로 1시간 동안 blocking을 하였고, 1차 항체 JNK, p-JNK, NF-κB, p-NF-κB, IRE1α, p-eIF2α, eIF2α, p-eIF2α, IRS-1, p-IRS-1(ser), Akt, p-Akt, ACC, p-ACC, β-actin(1:1,000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)을 12시간 4°C에서 반응시켰다. Membrane을 HRP가 중합된 2차 항체(1:5,000, antirabbit IgG HRP-linked antibody, Cell Signaling Technology)에 60분간 반응시켰고, enhanced chemiluminescent(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chiffon, UK)를 이용해 발색한 후 Easy photo를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 western blot band 이미지들은 Image J Software(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 band의 밀도를 측정하였다.

RNA 추출 및 실시간 정량 PCR

HepG2 세포의 RNA는 RNeasy Mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 추출하였고, iScript cDNA Synthesis kit(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위해 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 real-time PCR(Applied Bio systems, Foster City, CA, USA)을 수행하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR primer의 염기서열은 Table 1과 같다. Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 10 μL의 2X SYBR mix, 2 μL cDNA, forward 및 reverse primer 1 μL씩 각각 100 pmol/μL를 첨가하였고 나머지 볼륨은 nuclease free water로 채워주었다. 모든 유전자에 대한 PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 cycle은 40 cycle을 실시하였다. Hot start를 위해 95°C에서 10분, denaturation을 95°C에서 15초, annealing을 52°C에서 30초, extension을 72°C에서 30초간 반복하며 각 cycle의 extension 후에 값이 기록되었다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과는 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.1로 분석하였으며 mRNA의 상대적인 함량은 TNF-α 처리를 하지 않은 군에 대한 상대적인 양으로 나타냈다.

Table 1 . Primer sets used for real-time PCR.

GeneSequence
GAPDH (H)F5′-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3′
R5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3′
TNF-α (H)F5′-CCA CTT CGA AAC CTG GGA TTC-3′
R5′-TTA GTG GTT GCC AGC ACT TCA-3′
IL-1β (H)F5′-TTA AAG CCC GCC TGA CAG A-3′
R5′-GCG AAT GAC AGA GGG TTT CTT AG-3′
IL-6 (H)F5′-AGG GCT CTT CGG CAA ATG TA-3′
R5′-GAA GGA ATG CCC ATT AAC AAC AA-3′
ATF4 (H)F5′-GAG GTG GCC AAG CAC TTC AA-3′
R5′-GCC CGC CTT AGC CTT GTC-3′
CHOP (H)F5′-CTC TGA TTG ACC GAA TGG TGA A-3′
R5′-GGG ACT GAT GCT CCC AAT TG-3′
XBP-1 (H)F5′-CCT GAG CCC CGA GGA GAA-3′
R5′-GGC AGT CTG AGC TGC TAC TCT GT-3′
GRP78 (H)F5′-TGG CGG AAC CTT CGA TGT-3′
R5′-GCC ACA ACT TCG AAG ACA CCA T-3′
G6Pase (H)F5′-GAG TGG AGT GGC ACG ATC TTG-3′
R5′-GAC ATG AGA ATC GCT TGA ACC A-3′
PEPCK (H)F5′-TGG GCT CGC CTC TGT CA-3′
R5′-CCA CCA CGT AGG GTG AAT CC-3′
SREBP-1 (H)F5′-CGG AAC CAT CTT GGC AAC A-3′
R5′-GCC GGT TGA TAG GCA GCT T-3′
FAS (H)F5′-CAG CCA TGG AGG AGG TGG TGA TT-3′
R5′-GGG ACA TGC CTA ACA CCT ACG TCT A-3′
ACC (H)F5′-TGC AGA TCT TAG CGG ACC AA-3′
R5′-GCC TGC GTT GTA CAG AGC AAA-3′


세포 내 중성지질 측정

HepG2 세포의 중성지질을 측정하기 위해 Colorimetric/Fluorometric Triglyceride Assay kit(Biomax, Seoul, Korea)을 사용하여 제공된 방법으로 수행하였다.

통계처리

본 실험은 SPSS(Statistical Package for Social Science, version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 사용하였다. 각 실험군의 측정 항목 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였으며, 실험군 간 평균 차이를 one-way ANOVA로 확인한 후 그룹 간의 통계적 유의성은 Duncan’s multiple range test를 실시하였다. 실험군 간에 유의성을 P<0.05 수준에서 검정하였다.

결과 및 고찰

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물의 염증 억제 효능

TNF-α는 세포 표면의 TNF-α 수용체에 결합하여 JNK 인산화를 통한 신호전달 활성화와 NF-κB 인산화를 통한 전사 인자 활성화에 의해 염증 물질 합성을 증가시킨다(Gupta 등, 2007). 본 연구에서는 JNK 및 NF-κB 인산화(Fig. 1A~C)뿐만 아니라 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 mRNAs 발현(Fig. 1D~F)이 정상 HepG2 세포에 비해 TNF-α로 자극된 HepG2 세포에서 유의적으로(P<0.05) 증가했음을 보여주었다. 이는 HepG2 세포에서 TNF-α 처리가 정상적으로 염증을 유발했음을 나타낸다. TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때, JNK 및 NF-κB 인산화(Fig. 1A~C)는 감소하였고 전염증성 사이토카인의 mRNAs 발현(Fig. 1D~F)이 Control 그룹과 비교하여 유의적으로(P<0.05) 감소하였다.

Fig 1. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on inflammation in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of JNK (B) and NF-κB (C) in TNF-α-induced HepG2 cells. mRNA expression of pro-inflammatory cytokines (D, TNF-α; E, IL-1β; F, IL-6) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

Jeong 등(2009)의 연구에서 꾸지뽕으로부터 추출된 Cudratricusxanthone A가 염증을 유발한 대식세포에서 cyclooxygenase-2, nitric oxide synthase, prostaglandin E2의 발생을 감소시켜 항염 효능이 있음을 입증하였다. 또한 Joo와 Lim(2009)의 연구 결과에서는 CCl4 처리를 통해 간 손상을 유발한 마우스에서 꾸지뽕 투여가 간조직의 NF-κB 경로를 억제해 간 보호 효능을 나타냈다. 이러한 사전 연구 결과와 본 연구의 결과에 의해 꾸지뽕의 항염 효능을 확인할 수 있었다.

대부분의 비만 환자에서 백색지방 조직은 전염증성 사이토카인의 분비 증가를 특징으로 하며(Cottam 등, 2004), 증가한 전염증성 사이토카인이 간조직에서 염증 ​​및 소포체 스트레스를 통해 인슐린 신호전달에 부정적인 영향을 미친다고 알려져 있다(Denis 등, 2010; Xue 등, 2005). 따라서 본 연구에서는 TNF-α가 처리된 간세포에서 소포체 스트레스 및 인슐린 저항성이 유발되었는지 확인하고, CTL의 처리에 의한 변화를 관찰하였다.

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물의 소포체 스트레스 억제 효능

소포체 스트레스의 첫 반응은 소포체 막관통 단백질 중 하나인 PERK 활성화 매개 eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit α(eIF2α)의 인산화로, 이는 mRNA에서 단백질로 번역(translation)이 되는 과정을 감소시킨다. 번역 감소를 통해 새롭게 펼쳐진 단백질합성을 감소시켜 소포체의 부담이 감소하도록 조절된다. 또 다른 소포체 막관통 단백질 ATF6는 소포체 스트레스가 발생하면 소포체에서 골지체로의 이동 후 절단되어 N-말단 ATF6가 핵에서 전사 인자로 작용한다. 세 번째 소포체 막관통 단백질 IRE1α는 소포체 스트레스에 의해 인산화되어 XBP-1의 splicing을 유도한다. 이러한 N-말단 ATF6와 IRE1α/XBP-1의 경로에 의해 단백질 접힘에 중요한 효소와 샤페론 단백질의 발현이 유도되고 펼쳐진 단백질제거가 일어난다(Ozcan 등, 2004; Schröder, 2008).

하지만 이러한 소포체 스트레스 반응이 일어나는 동안 eIF2α의 인산화는 ATF4를 통해 proapoptotic transcription factor인 C/EBP homologous protein(CHOP) 발현을 유도하여 염증 및 세포사멸(apoptosis)을 유발할 수 있다. 또한 IRE1α 인산화를 통한 JNK 경로 활성화와 N-말단 ATF6도 CHOP 발현을 증가시킬 수 있다(Ozcan 등, 2004; Schröder, 2008). Denis 등(2010)은 TNF-α 수용체 신호가 소포체 스트레스의 유도로 이어지는 경로에 관여할 수 있다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 TNF-α로 자극된 HepG2 세포에서 소포체 스트레스가 유발되었는지 확인하기 위해 IRE1α와 eIF2α의 인산화 유무, ATF4, CHOP, XBP-1, 78 kDa glucose-regulated protein(GRP78)의 mRNA 발현을 확인하였다.

HepG2 세포에 TNF-α를 처리했을 때 eIF2α/ATF4/CHOP(Fig. 2A ,B,D,E) 경로, IRE1α/XBP-1(Fig. 2A,C,F) 경로, IRE1α/JNK/CHOP(Fig. 2C, Fig. 1B, Fig. 2E) 경로가 모두 활성화되었으며, 샤페론 단백질인 GRP78의 mRNA 발현(Fig. 2G)이 유의적(P<0.05)으로 증가하였음을 확인하였다. TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때 eIF2α/ATF4/CHOP(Fig. 2A,B,D,E) 경로, IRE1α/XBP-1(Fig. 2A,C,F) 경로, IRE1α/JNK/CHOP(Fig. 2A,C, Fig. 1B, Fig. 2E) 경로의 활성화와 GRP78의 mRNA 발현(Fig. 2G)이 Control 그룹과 비교하여 모두 유의적으로(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다. 이러한 연구 결과에 의해 CTL은 간세포에서 염증에 의한 소포체 스트레스 유발을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

Fig 2. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on endoplasmic reticulum stress in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of eIF2α (B) and IRE1α (C) in TNF-α- induced HepG2 cells. mRNA expression of ATF4 (D), CHOP (E), XBP-1 (F), and GRP78 (G) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.


TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물의 인슐린 저항성 억제 효능

비만은 간 인슐린 저항성 발달의 주요 요인이지만 비만과 간 인슐린 저항성 사이의 관계에 대한 분자 메커니즘은 여전히 명백하게 밝혀지지 않았다. 비만과 간 인슐린 저항성을 연결하는 분자 메커니즘은 불분명하지만, 이전 연구에서 전염증성 사이토카인에 의해 유도된 염증 및 소포체 스트레스가 간 인슐린 저항성의 발달로 이어진다고 보고되었다(Feng 등, 2020; Ozcan 등, 2004).

Cai 등(2005) 연구의 고지방 식이를 섭취한 마우스의 간에서 전염증성 사이토카인의 생성과 지질 축적이 NF-κB 활성화를 유발하였으며, 이러한 염증 상태가 인슐린 저항성을 유발했다고 밝혔다. 인슐린 신호전달은 인슐린수용체에 인슐린이 결합했을 때 IRS의 타이로신 잔기 인산화에 의해 시작된다. IRS의 타이로신 잔기 인산화에 의해 phosphoinositide 3-kinase가 Akt 등 단백질 활성화에 의해 세포 내 인슐린에 대한 반응을 촉진한다. Gupta 등(2007)의 연구 결과에서는 TNF-α가 처리된 세포에서 IRS-1 세린 잔기의 과인산화가 유발되었음을 보여주었다. 또 다른 연구에 따르면 소포체 스트레스 유발과 소포체 스트레스 매개 염증 유발은 IRS의 세린 인산화를 통해 인슐린 저항성의 발달로 이어진다고 보고되었다(Hirosumi 등, 2002). 결론적으로 TNF-α의 노출은 세포에서 인슐린 저항성 유발의 역할을 할 수 있다.

소포체 스트레스에 의한 IRE1α/JNK 경로 활성화는 인슐린 신호전달을 방해하고, eIF2α의 인산화는 C/EBP의 활성화에 의해 G6Pase 또는 PEPCK와 같은 당신생 관여 효소의 유전자 발현을 초래한다. 따라서 간조직에서 염증 및 소포체 스트레스는 인슐린 신호전달 방해 및 포도당신생합성의 활성화를 통해 간 인슐린 저항성 및 대사 조절 장애에 영향을 줄 수 있다(Choudhury 등, 2011; Schwabe와 Brenner, 2006). 본 연구에서는 HepG2 세포에서 TNF-α를 처리했을 때 염증과 소포체 스트레스뿐만 아니라 인슐린 저항성을 유발할 수 있다고 추측하였다.

HepG2 세포에 TNF-α를 처리한 후 인슐린 신호전달을 관찰한 결과, TNF-α가 IRS-1 세린 잔기(Ser636/639) 인산화(Fig. 3A,B)를 유도하고 Akt(protein kinase B)의 인산화(Fig. 3A,C)가 감소하였음을 확인하여 인슐린 저항성이 유도되었음을 확인하였다. 또한 G6Pase(Fig. 3D)와 PEPCK(Fig. 3E)의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과, TNF-α 처리가 처리하지 않은 그룹과 비교하여 유의적으로(P<0.05) 증가하였음을 확인하였다. TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때, IRS-1 세린 잔기 인산화(Fig. 3A,B), G6Pase(Fig. 3D)와 PEPCK(Fig. 3E)의 mRNA 발현은 유의적으로(P<0.05) 감소하였고 Akt의 인산화(Fig. 3A,C)는 유의적으로(P<0.05) 증가하였음을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 간세포에서 TNF-α가 인슐린 저항성을 유발할 수 있으나, CTL 처리가 이러한 반응을 억제할 수 있음을 보여주었다.

Fig 3. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on insulin signaling in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of IRS-1 (B) and Akt (C) in TNF-α-induced HepG2 cells. mRNA expression of G6Pase (D), and PEPCK (E) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 꾸지뽕 잎 물추출물의 지방생합성 억제 효능

Wandrer 등(2020)의 연구에서는 TNF-α 매개 간 손상이 TNF 수용체 신호전달에 의해 일어났음을 보여주었고, 고지방식이 섭취 마우스에 anti-TNFR1-antibody를 처리했을 때 간조직의 지방축적 감소와 SREBP1의 발현이 감소하였음을 보여주었다. SREBP1은 지질 생성에서 중요한 전사 조절인자로, 소포체로부터 골지체로 이동되어 프로세스 된 후 핵으로 이동하여 콜레스테롤 및 지방산 합성에 관여하는 유전자 발현을 유도한다(Kim과 Spiegelman, 1996). 따라서 TNF-α의 처리는 간세포에서 비정상적인 지방생합성을 유도할 수 있으므로 본 연구에서는 TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리하여 지방생합성 관련 인자의 변화를 관찰하였다. 앞 실험에서 사용한 TNF-α 1 ng/mL의 처리는 HepG2 세포에서 지방대사 변화가 미미하게 나타나 CTL의 효능을 관찰하기 어려웠다. TNF-α 10 ng/mL를 처리했을 때 HepG2 세포에서 지방대사 변화가 관찰되어 본 실험에서는 TNF-α 10 ng/mL를 처리한 후 CTL의 효능을 관찰하였다.

TNF-α가 처리된 HepG2 세포에서 SREBP1의 mRNA 발현을 확인한 결과(Fig. 4A), TNF-α 처리가 SREBP1의 발현을 유의적으로(P<0.05) 증가시켰음을 확인하였다. 하지만 CTL 처리는 TNF-α 처리에 의해 증가한 SREBP1의 발현을 유의적으로(P<0.05) 감소시켰음을 확인하였다.

Fig 4. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on lipogenesis in TNF-α (10 ng/mL)-induced HepG2 cells. mRNA expression of SREBP-1 (A), FAS (B), and ACC (C) and total protein and phosphorylation of ACC (bands, D; E) in TNF-α-induced HepG2 cells. The level of intracellular triglyceride (F) in TNF-α-induced HepG2 cells. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.

Acetyl CoA carboxylase(ACC)는 지방산 생합성의 개시 기전에 관여하는 효소로, 인산화에 의해 활성이 억제되어 지방산 합성이 억제된다(Imamura 등, 2020). TNF-α가 처리된 간세포에서 ACC의 mRNA 발현(Fig. 4C)을 확인한 결과 그룹 간에 ACC mRNA 발현에는 큰 차이가 없었지만, ACC 인산화(Fig. 4D,E)를 측정한 결과에서 정상군과 비교해 TNF-α를 처리한 세포가 ACC 인산화를 유의적으로(P<0.05) 감소시켰음을 확인하였다. TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때, ACC 인산화가 Control과 비교하여 유의적으로(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다. 지방산 합성을 촉매하는 다중 효소 단백질인 fatty acid synthase(FAS)의 발현(Imamura 등, 2020)을 확인한 결과(Fig. 4B), TNF-α가 처리된 HepG2 세포 FAS의 mRNA 발현이 유의적으로(P<0.05) 증가하였음을 확인하였다. 반면, TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때는 FAS의 mRNA 발현이 Control과 비교하여 유의적으로(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다. 또한 세포 내 지방축적을 확인한 결과(Fig. 4F), TNF-α를 처리했을 때는 중성지질 함량이 증가하였지만, CTL을 처리했을 때는 유의적으로(P<0.05) 감소하였음을 확인하였다. 이러한 결과는 TNF-α 처리로 간세포에서 지방생합성을 유도할 수 있으며, CTL 처리는 TNF-α에 의한 지방생합성을 억제해 비정상적인 지방합성을 억제할 수 있음을 시사한다(Fig. 5).

Fig 5. Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves on TNF-α-induced inflammation, ER stress, and insulin resistance in HepG2 cells.

요 약

사전 연구를 통해 당뇨 유발 동물 모델에서 CTL의 투여가 항당뇨 효능을 보였을 뿐만 아니라 간조직에서 염증과 소포체 스트레스 발생은 억제했음을 확인하여, 본 연구에서는 이러한 CTL 효능의 기전을 밝히는 실험을 수행하였다. 본 연구에서는 TNF-α를 이용하여 염증을 유발한 HepG2 세포에서 소포체 스트레스, 인슐린 저항성, 지방생합성의 변화를 관찰하고, CTL의 처리에 의한 효과를 관찰하였다. TNF-α를 HepG2 세포에 처리했을 때 염증뿐만 아니라 소포체 스트레스, 인슐린 저항성, 지방생합성이 유도되었음을 확인하였다. 하지만 TNF-α가 처리된 HepG2 세포에 CTL을 처리했을 때는 염증이 억제되었을 뿐만 아니라, 소포체 스트레스, 인슐린 저항성, 지방생합성 또한 억제되었음을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과 CTL이 간에서의 염증, 소포체 스트레스, 인슐린 저항성, 지방생합성의 발생으로부터 보호할 수 있고 고혈당증 치료에 유용한 약제가 될 수 있음을 보여주었다.

감사의 글

이 논문은 전남대학교 학술연구비(과제번호: 2021-2448) 지원에 의하여 연구되었다.

Fig 1.

Fig 1.Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on inflammation in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of JNK (B) and NF-κB (C) in TNF-α-induced HepG2 cells. mRNA expression of pro-inflammatory cytokines (D, TNF-α; E, IL-1β; F, IL-6) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 780-788https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.8.780

Fig 2.

Fig 2.Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on endoplasmic reticulum stress in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of eIF2α (B) and IRE1α (C) in TNF-α- induced HepG2 cells. mRNA expression of ATF4 (D), CHOP (E), XBP-1 (F), and GRP78 (G) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 780-788https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.8.780

Fig 3.

Fig 3.Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on insulin signaling in TNF-α (1 ng/mL)-induced HepG2 cells. Representative western blots (bands; A) for total protein and phosphorylation of IRS-1 (B) and Akt (C) in TNF-α-induced HepG2 cells. mRNA expression of G6Pase (D), and PEPCK (E) in TNF-α-induced HepG2 cell. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 780-788https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.8.780

Fig 4.

Fig 4.Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves (CTL) on lipogenesis in TNF-α (10 ng/mL)-induced HepG2 cells. mRNA expression of SREBP-1 (A), FAS (B), and ACC (C) and total protein and phosphorylation of ACC (bands, D; E) in TNF-α-induced HepG2 cells. The level of intracellular triglyceride (F) in TNF-α-induced HepG2 cells. The data are expressed as the mean±standard deviation (n=3). The different letters show a significant difference at P<0.05 as determined by Duncan’s multiple range test.
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Fig 5.

Fig 5.Effect of water extract from Cudrania tricuspidata leaves on TNF-α-induced inflammation, ER stress, and insulin resistance in HepG2 cells.
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Table 1 . Primer sets used for real-time PCR.

GeneSequence
GAPDH (H)F5′-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3′
R5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3′
TNF-α (H)F5′-CCA CTT CGA AAC CTG GGA TTC-3′
R5′-TTA GTG GTT GCC AGC ACT TCA-3′
IL-1β (H)F5′-TTA AAG CCC GCC TGA CAG A-3′
R5′-GCG AAT GAC AGA GGG TTT CTT AG-3′
IL-6 (H)F5′-AGG GCT CTT CGG CAA ATG TA-3′
R5′-GAA GGA ATG CCC ATT AAC AAC AA-3′
ATF4 (H)F5′-GAG GTG GCC AAG CAC TTC AA-3′
R5′-GCC CGC CTT AGC CTT GTC-3′
CHOP (H)F5′-CTC TGA TTG ACC GAA TGG TGA A-3′
R5′-GGG ACT GAT GCT CCC AAT TG-3′
XBP-1 (H)F5′-CCT GAG CCC CGA GGA GAA-3′
R5′-GGC AGT CTG AGC TGC TAC TCT GT-3′
GRP78 (H)F5′-TGG CGG AAC CTT CGA TGT-3′
R5′-GCC ACA ACT TCG AAG ACA CCA T-3′
G6Pase (H)F5′-GAG TGG AGT GGC ACG ATC TTG-3′
R5′-GAC ATG AGA ATC GCT TGA ACC A-3′
PEPCK (H)F5′-TGG GCT CGC CTC TGT CA-3′
R5′-CCA CCA CGT AGG GTG AAT CC-3′
SREBP-1 (H)F5′-CGG AAC CAT CTT GGC AAC A-3′
R5′-GCC GGT TGA TAG GCA GCT T-3′
FAS (H)F5′-CAG CCA TGG AGG AGG TGG TGA TT-3′
R5′-GGG ACA TGC CTA ACA CCT ACG TCT A-3′
ACC (H)F5′-TGC AGA TCT TAG CGG ACC AA-3′
R5′-GCC TGC GTT GTA CAG AGC AAA-3′

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