치주 질환은 대표적인 만성 염증 질환으로(Williams, 1990), 치은염과 함께 치조골의 소실이 일어나는 것으로 알려져 있으며(Samejima 등, 1990), 다양한 세균의 증식과 이와 관련된 염증이 강력한 병인으로 부각되고 있다(Listgarten, 1987). 최근 들어서는 산화질소(nitric oxide; NO)의 산화스트레스가 발병에 기인하는 것으로 알려지며(Lohinai 등, 1998), 항염, 항산화 및 골다공증 치료제들이 치주 질환의 예방 및 치료에 비교적 양호한 결과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Kim 등, 2012; Lee 등, 2014; Park 등, 2016).

치주염 및 치조골 손상 개선을 위한 천연물 복합 기능성 식품 개발의 일환으로 본 연구자 등은 15종의 천연물 추출물의 치주염 및 치조골 소실에 대한 약효를 치아 경부 결찰 experimental periodontitis diseases(EPD) rat 모델을 이용하여 탐색한 결과, 치주염 및 치조골 소실에 대한 억제 효과를 동시에 나타낸 모링가와 두충을 후보물질로 선정하였다.

모링가[Moringa oleifera Lam.(M. oleifera); MF]는 식용식물로 인도 고대 의서인 아유르베다(Ayurveda)에 충치 치료 등 다양한 치료용 약물로 기록되어 있으며(Saini 등, 2011), 건조한 잎에는 비타민 C가 오렌지의 7배, 비타민 A는 당근의 10배, 칼슘은 우유의 17배, 단백질은 요구르트보다 9배나 더 들어있으며, 칼륨은 바나나의 15배, 철 성분은 시금치의 25배에 이를 만큼 영양학적 이용 가치가 매우 높은 것으로 알려져 있다(Fahey, 2005). 특히 모링가 잎은 β-카로틴, 단백질, 비타민 C, 칼슘 등이 풍부해 항산화제로 이용되고 간 기능 보호 효과, 암세포의 세포자살과 증식 억제 효과 등이 보고되었으며(Gopalakrishnan 등, 2016), 최근 연구에 따르면 면역조절, 통증 감소, 방사선으로부터 보호 효능, 치매 유발 모델에서의 신경 보호 및 항경련, 뇌 허혈로 인한 뇌 기능 장애, 백내장의 효능에 대하여 보고된 바 있다(Xiao 등, 2020; Khongrum 등, 2012; Bin-Meferij와 El-Kott, 2015; Kirisattayakul 등, 2013; Sasikala 등, 2010).

두충(Eucommia ulmoides Oliver; EC)은 두충나무의 줄기 껍질로 주피를 제거한 것을 말한다. 주요성분으로는 pinoresinol, epipinoresinol, pinoresinol diglucoside, aucubin, geniposide 등과 같은 리그닌(lignin)류로 항염증, 항스트레스, 항균, 항고혈압, 관절염 및 골다공증 개선 효과 등 다양한 생리활성이 보고되었으며, 두충은 과거부터 현재까지 고혈압, 바이러스 감염증, 신장 질환 및 간 질환에 사용되어 온 대표적인 한약재로 알려져 있다(Hsieh와 Yen, 2000; Kwan 등, 2003; Zhao 등, 2008).

모링가와 두충은 항염증, 항산화 효과가 보고된 대표적인 약용 천연물로(Cheenpracha 등, 2010), 본 연구자 등은 치아 경부 결찰 EPD rat 모델을 이용한 선행연구를 통해 모링가:두충 2:1(w/w) 복합 비율을 최적의 복합 조성물로 선택하였다. 따라서 본 연구에서는 모링가:두충 2:1(w/w) 복합 조성물의 투여 용량 의존적인 치주염 및 치조골 손실 개선 효과를 치아 경부 결찰 EPD rat 모델을 이용하여 모링가와 두충 단독 조성물 200 mg/kg 투여군, NSAIDs 계열의 항염제인 IND 5 mg/kg 경구투여군(Ku 등, 2011; Kim 등, 2012; Park 등, 2016)과 각각 비교하여 확인하고자 하였다.

실험동물

본 연구를 위해 6주령의 수컷 Sprague-Dawley(SD) rats(170~200 g) 총 100마리를 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)로부터 구매하여 8일간 순화 후, 체중이 일정한 실험동물을 선별하여 군당 8마리씩 9개 군으로 구분하여 사용하였다. 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회의 사전 승인하에 실시하였다(Approval No. DHU2017-025, March 06, 2017). 모링가(MF):두충(EC) 2:1(w/w) 복합 조성물의 투여 용량 의존적인 치주염 및 치조골 손실 개선 효과를 확인하기 위한 실험군은 정상군, 대조군, IND 투여 양성대조군, MF 및 EC 단독 조성물 투여군(200 mg/kg), MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 투여군(25, 50, 100, 200 mg/kg)으로 나누어 실험을 진행하였다(Table 1).

Table 1 . Experimental designs used in this study.

Groups		EPD	Dose (mg/kg/d) of treatment drug
Controls	Intact	No ligature	Oral administration of distilled water (5 mL/kg)
	EPD	Incisior ligature	Oral administration of distilled water (5 mL/kg)
Reference	IND	Incisior ligature	Oral administration of IND 5 mg/kg
Single formula	MF	Incisior ligature	Oral administration of MF single formula, 200 mg/kg
	EC	Incisior ligature	Oral administration of EC single formula, 200 mg/kg
MF:EC 2:1 (w/w)	200 mg/kg	Incisior ligature	Oral treatment of 2:1 (w/w) mixed formula totalized 200 mg/kg
mixed formula	100 mg/kg	Incisior ligature	Oral treatment of 2:1 (w/w) mixed formula totalized 100 mg/kg
(totalized)	50 mg/kg	Incisior ligature	Oral treatment of 2:1 (w/w) mixed formula totalized 50 mg/kg
	25 mg/kg	Incisior ligature	Oral treatment of 2:1 (w/w) mixed formula totalized 25 mg/kg

EPD, experimental periodontitis diseases; IND, indomethacin; MF, Moringa Folium (leaf parts of drumstick-tree; Moringa oleifera Lam.); EC, Eucommiae Cortex (stem bark parts of Eucommia ulmoides Oliver)..

치주 질환 유발

실험동물을 8일간 실험실 환경에 순응시킨 다음, 설치류용 흡입마취기(Surgivet, Waukesha, WI, USA)와 환기 장치(Model 687, Harvard Apparatus, Cambridge, UK)를 이용하여 2~3% isoflurane(Hana Pharm Co., Ltd., Hwaseong, Korea)과 70% N₂O 및 28.5% O₂ 혼합가스로 전신 흡입마취하고, 1~1.5% isoflurane으로 마취를 유지하면서 왼쪽 절치의 치아 경부에 3-0 나일론 봉합사를 이용하여 결찰을 실시하여 치주염 및 치은 질환을 유발하였다. 한편 정상 대조군에서는 절치의 치아 경부 부분만 확인한 후 결찰하지 않았다.

시험물질의 조제 및 투여

모링가잎 추출 분말(MF)과 두충 추출 분말(EC)은 (주)에이치엘사이언스(Uiwang, Korea)에서 공급받아 사용하였으며, 적정량의 MF 또는 EC를 멸균 증류수에 직접 용해시키고, 5 mL/kg의 용량으로 치아 경부 결찰 24시간 후부터 매일 1회씩 10일간 경구투여하였다. 즉, MF 및 EC 단독 조성물에서는 각각 40 mg/mL의 농도로 멸균 증류수에 용해시켜 5 mL/kg(200 mg/kg)의 용량으로 경구투여하였으며, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 투여군에서는 5 mL의 증류수에 MF 및 EC 각각을 133:67, 67:33, 33:17 및 17:8 mg:mg씩 용해시켜 역시 5 mL/kg(총량 200, 100, 50 및 25 mg/kg)의 용량으로 각각 경구투여하였다. IND 역시 1 mg/mL의 농도로 멸균 증류수에 용해시켜 5 mL/kg의 용량(5 mg/kg)으로 치아 경부 결찰 24시간 후부터 매일 1회씩 10일간 경구투여하였으며, 정상 대조군 및 EPD 대조군에서는 동일한 투여 스트레스를 가하기 위해 천연물 추출물 또는 IND 대신 멸균 증류수만을 동일한 용량 및 빈도로 경구투여하였다.

체중의 변화

체중 변화는 자동 전자저울(Precisa Instrument, Dietikon, Switzerland)을 사용하여 모든 실험 기간에 걸쳐 치아 경부 결찰 1일 전부터 하루에 한 번 측정하였다. 개인차를 줄이기 위해 투여 10일 후의 체중 증가량을 아래 식과 같이 계산하였다.

시험물질 처리 10일 동안의 체중 증가(g)＝희생 시 체중－치료 시작 시 체중(치아 경부 결찰 후 24시간)

치조골 소실 측정

경구투여 10일 후 11일째에 실험동물은 희생되었고, Crawford 등의 방법(1978)과 Samejima 등의 방법(1990)을 이용하여 상악골이 결찰된 위치(제2 어금니)를 절제한 후, 치조골에서 끝 사이의 거리인 수평 치조골 소실을 왼쪽 위 앞니의 뿌리 축 기준으로 electronic digital caliper(CD-15CPX, Mytutoyo, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.

미생물 분석

왼쪽 위 앞니를 둘러싸고 있는 치은 조직을 제거하고 brain heart infusion broth(Becton, Dickinson and Company, Cockeysville, MD, USA) 0.3 mL에 넣은 후, bead beater(Model TacoTMPre, GeneResearch Biotechnology Corp., Taichung, Taiwan)와 ultrasonic cell disruptor (Model KS-750, Madell Technology Corp., Ontario, CA, USA)로 균질화하여 blood agar(brain heart infusion agar supplemented with 5% defibrinated sheep blood and henin/menadione 10 μg/mL; Becton, Dickinson and Company)에 1:100, 1:1,000으로 희석하고, 37°C, 5% CO₂ 호기성 조건에서 48시간 배양하였다. 48시간 배양 후 구강 협부 조직 내 호기성 생균 수는 ×10⁵ CFU/g tissues로 계산되었다.

Myeloperoxidase(MPO) 활성 측정

호중구 침윤의 측정치로 MPO 활성을 측정하기 위해 EPD 유도 후 11일 이후 치은 조직이 수집되었다. 초저온 냉각기(MDF-1156, Sanyo, Tokyo, Japan)를 이용하여 -150°C에서 보관된 왼쪽 앞니의 치은 조직을 pH 6.0의 50 mM potassium phosphate buffer에 0.5% hexadecyltrimethyl-ammonium bromide(Gibco, Carlsbad, CA, USA)를 넣어 MPO를 용출하고, ice bath에서 15초 균질화한 후 샘플을 2회 동결 및 해동하였다. 12분 동안 조직 15 mg당 400 μL의 buffer를 추가하고 12분 동안 1,000×g 원심분리한 후, 0.1 mL의 상등액을 0.167 mg/mL o-dianisidine dihydrochloride(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 함유된 phosphate buffer(50 mM, pH 6.0) 2 mL에 첨가하고 증류수와 0.0005% 과산화수소를 넣어 튜브당 2.1 mL가 되게 하였다. 흡광도는 분광광도계(460 nm; UV/visible spectrometer, OPTIZEN POP, Mecasys, Daejeon, Korea)로 측정하였으며, 1 unit(U)은 25°C에서 1분당 1 μM의 과산화물을 분해하는 것을 나타낸다.

항염증 지표(PGE2, MMP-8, IL-1β, TNF-α) 측정

치은 조직의 항염증 지표는 prostaglandin E2(PGE2)(Cat No. KGE004, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), Rat Matrix metalloproteinase-8(MMP-8) enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit(Cat No. MBS 721664, MyBioSource, San Diego, CA, USA), interleukin-1β(IL-1β) Rat ELISA kit(Cat No. ab100768, Abcam, Cambridge, UK), tumor necrosis factor-α(TNF-α) Rat ELISA kit(Cat No. ab46070, Abcam)을 사용하여 측정하였다. 흡광도는 microplate reader(Tecan, Mänedorf, Switzerland)를 사용하여 450 nm 파장에서 측정하였다.

Inducible nitric oxide synsthase(iNOS) 활성 측정

iNOS 활성 측정은 L-[3H]-arginine에서 L-[3H]-citrulline으로의 전환을 이용한 방법을 통해 시행하였다. L-[3H]-arginine(10 mM, 5 kBq/tube), NADPH(1 mM), calmodulin(30 nM), tetrahydrobiopterin(5 mM), calcium(2 mM)을 22°C에서 30분간 배양하고, EGTA(2 mM), EDTA(2 mM)가 포함된 0.5 mL의 ice-cold HEPES buffer(pH 5.5)로 반응을 종료하였다. NADPH가 없이 수행된 실험은 특정 NOS 활성과 무관하게 L-[3H]-citrulline 형성 정도를 결정하였으며, 칼슘 없이 NADH와 EGTA(5 mM) 조건에서는 독립적인 NOS 활성이 확인되었다. 반응 혼합물을 Dowex 50W(Na/form) column에 적용하고, 용출된 L-[3H]-citrulline을 liquid scintillation counter(Wallac 1450 MicroBeta TriLux, Wallac, Annapoli, MD, USA)로 측정하였다. 결과는 fM/mg/min으로 표시되며, iNOS 활성 측정에 이용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였다.

혈액 생화학적 분석

10일간의 경구투여 24시간 후, 설치류 흡입마취기와 인공호흡기를 사용하여 70%의 N2O와 28.5% O₂ 혼합물에 2~3% isoflurane을 포함하는 마취상태에서 23 gauge needle syringe를 사용하여 혈액 검체를 채취하였다. 실험동물은 채혈 전 18시간 동안 절식하였으며, 혈청을 얻기 위하여 separation tube에 담긴 혈액을 2,000×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 모든 혈청은 사용 전까지 ultra deep freezer를 사용하여 -150°C에 보관하였으며, autoanalyzer(Dri-Chem NX500i, Fuji Medical System Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.

RANKL, OPG mRNA 분석(realtime RT-PCR)

치은 조직의 receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand(RANKL) 및 osteoprotegerin(OPG) mRNA 발현은 이전의 방법에 따라(Liu 등, 2016) realtime RT-PCR을 사용하여 검출하였다. RNA는 Trizol reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 추출하였으며 RNA 농도와 품질은 CFX96TM Real-Time system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 측정하고, 오염된 DNA를 제거하기 위해 검체를 recombinant DNase Ⅰ(DNA-free; Ambion, Austin, TX, USA)으로 처리하였다. RNA는 high-capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 역전사되었다. 즉, 총 RNA에서 cDNA 가닥을 합성한 뒤 프라이머와 cDNA 생성물의 혼합물이 95°C에서 15초간, 50°C 30초간, 72°C 30초 동안 PCR에 의해 증폭되었다. 이때 사용된 PCR oligonucleotide primers의 sequences는 다음과 같다. RANKL: 5′-GCAGCATCGCTCTGTTCCTGTA-3′와 5′-GCATGAGTCAGGTAGTGCTTCTGTG-3′. OPG: 5′-ACAATGAACAAGTGGCTGTGCTG-3′와 5′-CGGTTTCTGGGTCATAATGCAAG-3′. β-actin: 5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′와 5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′. 각 샘플은 β-actin mRNA에 대한 표준화를 시행하고, ABI Step One Plus Sequence Detection System(Applied Biosystems)을 사용하여 분석을 수행하였다. 치은 조직의 RANKL/OPG mRNA 발현(relative to control/β-actin mRNA expressions) 또한 이전 연구에 따라 계산하였다(Shen 등, 2012; Takahashi 등, 2014).

조직병리학적 변화

EPD 유도 후 11일째에 결찰 주위의 상악골 영역을 10% neutral buffered formalin으로 고정 후 24.4% formic acid와 0.5 N sodium hydroxide를 포함한 decalcifying solution을 사용하여 5일 동안 석회질을 제거했으며, 이때 decalcifying solution은 하루에 한 번 교환하였다. 그 후 왼쪽과 오른쪽 절치가 포함되도록 세로 방향으로 잘라내고 파라핀으로 포매 후 3~4 μm로 절편하여 Hematoxyin & Eosin(H&E)으로 염색하였다. 치은 조직과 치조골의 조직학적 프로파일은 대조군과 비교하여 관찰했으며, 염증세포 침윤을 고려해 광학현미경(Eclipse 80i, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 0~3점으로 구분하였다. 이때 사용한 조직학적 점수는 다음과 같다(Menezes 등, 2005; Park 등, 2016). 0, 없음 또는 별개의 세포 침윤(염증성 세포 침윤이 드물고, 치은 조직 주변부에 국한됨), 보존된 치조골 및 시멘트질; 1, 중간적인 세포 침윤(염증성 세포 침윤이 모든 치은 조직에서 나타남), 소수의 치조골 재흡수 및 정상적인 시멘트질; 2, 두드러진 세포 침윤(염증성 세포 침윤이 치은조직과 치근막에서 나타남), 치조골의 두드러진 분해 및 시멘트질의 부분적 파괴; 3, 두드러진 세포 침윤, 치조골의 완전한 재흡수 및 시멘트질의 심각한 파괴.

또한, 이미지 분석 프로그램인 iSolution FL ver 9.1(IMT i-solution Inc., Vancouver, Canada)을 사용하여 제조한 세로 절단 시료에서 조직 형태 분석으로 제1 및 제2 어금니 사이의 침윤된 염증성 세포(수/치은 조직의 mm²) 및 콜라겐 차지 영역(%/치은 조직의 mm²), 더 나아가 치조골 부피(%/치조골 영역의 mm²), 조골세포 수(수/치조골 표면의 mm²) 및 이들이 차지하는 퍼센트(%/치조골 표면의 mm²), 파골세포 수(수/치조골 표면의 mm²) 및 이들이 차지하는 퍼센트(%/치조골 표면의 mm²)를 측정하였으며, 조직병리학자들에게는 그룹 분배에 대한 정보를 제공하지 않았다.

통계처리

모든 데이터는 8마리 랫트의 평균±표준편차(SD)로 표현되었다. 복용량이 다른 그룹을 위한 다중비교 검사를 수행했으며, 변이 균질성(variance homogeneity)은 Levene test(1981)를 사용하여 조사하였다. Levene test가 변이 균질성으로부터 유의성 없는 편차를 도출한 경우, 그룹 비교 쌍이 유의하게 다른지 확인하기 위해 one way ANOVA test 후 least-significant differences(LSD) multi-comparison test에 의해 분석하였다. Levene test에서 변이 균질성으로부터 유의성 있는 편차가 관찰될 경우에는 non-parametric comparison test 및 Kruskal-Wallis H test를 수행하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의성 있는 차이가 관찰될 경우, 다른 특정 그룹 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U(MW) test를 수행하였다. 통계학적 분석은 SPSS(Release 14.0K, IBM SPSS Inc., Armonk, NY, USA)(Ludbrook, 1997)를 사용하여 수행하였다. 또한, 본 연구에서 혈액 생화학적 분석을 제외한 모든 항목에서 결찰에 의해 유발된 EPD의 심각도를 확인하기 위하여 정상 대조군과 EPD 대조군 사이의 변화율을 계산하였고, 시험물질의 효능을 이해하는 데 도움이 되도록 EPD 대조군과 시험물질을 처리한 랫트와 비교한 변화율을 계산하였다. 해당 수학식은 다음과 같다.

정상 대조군과 비교한 변화율(%)＝[(EPD 대조군 데이터－정상 대조군 데이터)/ 정상 대조군 데이터]×100

EPD 대조군과 비교한 변화율(%)＝[(시험물질 데이터－EPD 대조군 데이터)/ EPD 대조군 데이터]×100

체중의 변화

치주염 및 치조골의 손상은 저작 곤란으로 직결되고, 이 결과 현저한 체중 감소가 초래된다(Botelho 등, 2007). 따라서 이러한 체중 감소의 억제는 치주염 및 치조골 손상에 대한 예방 또는 치료 효과를 간접적으로 나타내주는 것으로 생각된다. 본 실험에 사용한 정상 대조군의 랫트는 동일한 연령의 정상 랫트의 체중 증가 범주(Fox 등, 1984) 내에서 체중 변화를 나타내었으나, EPD 대조군의 경우 정상 대조군에 비해 체중 및 증체량이 유의하게 감소하였다. 반면 모든 MF와 EC 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 체중 및 증체량이 유의하게 증가하였다. 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해 체중 및 증체량이 유의하게 증가하였다. 한편 IND 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 체중 및 증체량의 유의적인 변화가 확인되지 않았다(Table 2). 투여 기간인 10일 동안의 증체량은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 -60.74%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -8.97, 66.37, 63.23, 137.67, 123.77, 109.42 및 67.26%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 치아 경부 결찰로 유발되는 치주 질환 관련 체중 감소 개선 효과가 현저히 증가하는 직접적인 증거로 판단된다.

Table 2 . Body weight gains after 10 days of continuous oral treatment of test substances in intact or EPD rats.

Groups		Body weights (g)		Body weight gains (B－A)
		At initiation of test article treatment (A)	At sacrifice (B)
Controls	Intact	261.63±8.33	332.63±15.41	71.00±8.40
	EPD	262.13±13.50	290.00±9.55a	27.88±10.32a
Reference	IND 5 mg/kg	266.00±9.43	291.38±12.51a	25.38±7.57a
Single formula	MF 200 mg/kg	264.00±5.04	310.38±8.40ac	45.38±6.61ac
	EC 200 mg/kg	262.88±3.94	308.38±12.16ac	45.50±10.57ac
MF:EC 2:1 (w/w)	200 mg/kg	266.38±5.58	332.63±7.48cdf	66.25±2.87cdf
mixed formula	100 mg/kg	264.38±8.37	326.75±12.98cdf	62.38±7.01bcdf
(totalized)	50 mg/kg	265.88±8.32	324.25±12.23cef	58.38±7.58acdf
	25 mg/kg	264.88±6.94	311.50±10.38ac	46.63±6.70ac

Abbreviations are the same as Table 1..

Values are expressed mean±SD of eight rats..

^aP<0.01 and ^bP<0.05 as compared with intact control by LSD test. ^cP<0.01 as compared with EPD control by LSD test..

^dP<0.01 and ^eP<0.05 as compared with MF single formula by LSD test. ^fP<0.01 as compared with EC single formula by LSD test..

치조골 손실률의 변화

치조골 손실률(alveolar bone loss score)은 치조골 질환에서 염증반응에 의한 치조골 손실을 평가하는 가장 기본적인 육안기준으로, score가 높을수록 치조골의 손실이 큰 것으로 알려져 있다(Botelho 등, 2007). 본 실험의 결과, EPD 대조군의 경우 정상 대조군에 비해 치조골 손실률이 유의적으로 증가하였으나, 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 치조골 손실률이 유의적으로 감소하였다. 특히, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해 치조골 손실률이 투여 용량 의존적으로 유의하게 감소하였다. 또한 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 50 mg/kg은 IND 5 mg/kg과 비교할 만한 치조골 손실률의 개선 효과를 나타내었다(Fig. 1, 2). 치조골 손실률은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 119.50%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -28.33, -17.82, -19.39, -36.37, -30.55, -25.95 및 -16.63%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 치아 경부 결찰로 유발된 치조골 손실에 대한 개선 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 직접적인 증거로 판단된다.

Fig 1. Representative gross images, taken from intact or EPD rats around upper left incisor teeth after 10 days of continuous oral treatment of test substances. (A) Intact vehicle control, Non-ligated and distilled water orally administered rats; (B) EPD control, Ligated EPD induced and distilled water orally administered rats; (C) Ligated EPD induced and indomethacin 5 mg/kg orally administered rats; (D) Ligated EPD induced and MF single formula 200 mg/kg orally administered rats; (E) Ligated EPD induced and EC single formula 200 mg/kg orally administered rats; (F) Ligated EPD induced and MF:EC 2:1 (w/w) mixed formula 200 mg/kg orally administered rats; (G) Ligated EPD induced and MF:EC 2:1 (w/w) mixed formula 100 mg/kg orally administered rats; (H) Ligated EPD induced and MF:EC 2:1 (w/w) mixed formula 50 mg/kg orally administered rats; (I) Ligated EPD induced and MF:EC 2:1 (w/w) mixed formula 25 mg/kg orally administered rats. Scale bars=3.1 mm.

Fig 2. Alveolar bone loss scores after 10 days of continuous oral treatment of test substances in intact or EPD rats. Values are expressed mean±SD of eight rats. ^aP<0.01 as compared with intact control by LSD test. ^bP<0.01 as compared with EPD control by LSD test. ^cP<0.01 as compared with MF single formula by LSD test. ^dP<0.01 as compared with EC single formula by LSD test.

구강 협부 총 호기성 생균 수의 변화

세균 역시 치주 질환의 중요한 원인으로 알려져 있으며, 병리학적으로 치주 질환 시 세균의 증식에 의해 염증반응이 시작되고(Botelho 등, 2007) 현저한 치조골의 소실이 야기된다(Samejima 등, 1990; Menezes 등, 2005). 치아 경부 결찰로 유발되는 치주 질환 시에도 결찰 주변 치은 조직 내 생균 수, 특히 호기성 그람 음성 간균의 현저한 증가가 초래되는 것으로 알려져 있으며(Menezes 등, 2005; Botelho 등, 2007), 본 실험에서도 IND 5 mg/kg 투여군을 제외한 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 구강 협부 조직 내 생균 수가 각각 유의하게 감소하였고, 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 투여군에 비해 구강 협부 조직 내 총 호기성 생균 수가 투여 용량 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 3). 구강 협부 총 호기성 생균 수는 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 670.05%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -1.91, -40.63, -32.99, -59.55, -58.16, -54.69 및 -30.21%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 치아 경부 결찰로 유발되는 치주 질환 관련 세균증식 억제 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 직접적인 증거로 판단된다.

Fig 3. Buccal gingival total aerobic bacterial counts after 10 days of continuous oral treatment of test substances in intact or EPD rats. Values are expressed mean±SD of eight rats. ^aP<0.01 as compared with intact control by MW test. ^bP<0.01 as compared with EPD control by MW test. ^cP<0.01 as compared with MF single formula by MW test. ^dP<0.01 as compared with EC single formula by MW test.

치은 조직 내 MPO 활성의 변화

치주염 발생 시 중성호성 백혈구의 현저한 침윤이 일어나며(Menezes 등, 2005), 이들 중성호성 백혈구는 염증반응 시 원인이 되는 이물질 치료에 필수적인 역할을 하지만, 독성 활성 산소를 생산하여 주변 조직을 파괴하는 것으로 알려져 있다(Sullivan 등, 2000). MPO는 중성호성 백혈구에서 생산되는 대표적인 세포독성 효소로(Işeri 등, 2005), 치주 질환 시에도 치주 조직 내에서 현저한 상승이 초래된다(Ku 등, 2011; Kim 등, 2012; Park 등, 2016). EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 치은 조직 내 MPO의 활성이 유의적으로 증가하였으나, 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 MPO 활성이 유의하게 감소하였다. 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해 치은 조직 내 MPO 활성이 투여 용량 의존적으로 유의하게 감소하였다. 또한 적어도 본 실험의 조건하에서 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 50 mg/kg은 IND 5 mg/kg과 비교할 만한 치은 조직 내 MPO 활성 감소 효과를 나타내었다(Table 3). 치은 조직 내 MPO 활성은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 573.14%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -60.60, -44.95, -40.21, -67.51, -63.08, -59.00 및 -39.30%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 EPD에 대한 항염 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 직접적인 증거로 판단된다.

Table 3 . Maxillary gingival MPO activities, PGE2, MMP-8, IL-1β, and TNF-α contents after 10 days of continuous oral treatment of test substances in intact or EPD rats.

Groups		In maxillary gingival tissues
		MPO activities (U/mg of tissue)	PGE 2 contents (pg/mg tissue)	MMP-8 contents (ng/mL)	IL-1β levels (pg/mL)	TNF-α levels (pg/mL)
Controls	Intact	15.49±5.67	165.63±23.19	11.45±0.90	15.34±6.16	187.50±49.59
	EPD	104.27±25.52f	434.63±71.83f	19.87±1.30a	79.97±11.00a	945.75±229.89f
Reference	IND 5 mg/kg	41.09±11.72fh	234.13±43.26gh	13.67±1.30ac	31.45±13.03ac	338.38±100.09fh
Single formula	MF 200 mg/kg	57.40±11.55fh	327.63±31.96fh	17.00±0.59ac	46.58±10.39ac	509.25±122.12fh
	EC 200 mg/kg	62.35±10.80fh	337.38±40.97fh	17.41±0.95ac	54.33±10.97ac	565.75±136.73fh
MF:EC 2:1 (w/w)	200 mg/kg	33.88±11.78fhjl	196.75±21.87ghjl	12.73±0.93bcde	26.71±5.63bcde	286.75±62.46fhjl
mixed formula	100 mg/kg	38.50±11.04fhjl	214.00±23.59fhjl	13.11±0.92acde	30.91±8.54acde	318.75±40.81fhjl
(totalized)	50 mg/kg	42.76±10.66fhkl	245.63±9.59fhjl	14.25±1.09acde	32.42±5.48acde	347.38±72.28fhjl
	25 mg/kg	63.29±14.74fh	340.88±44.29fi	17.59±1.16ac	55.72±12.16ac	567.50±108.79fh

Abbreviations are the same as Table 1..

Values are expressed mean±SD of eight rats..

^aP<0.01 and ^bP<0.05 as compared with intact control by LSD test. ^cP<0.01 as compared with EPD control by LSD test. ^dP<0.01 as compared with MF single formula by LSD test. ^eP<0.01 as compared with EC single formula by LSD test. ^fP<0.01 and ^gP<0.05 as compared with intact control by MW test. ^hP<0.01 and ⁱP<0.05 as compared with EPD control by MW test. ^jP<0.01 and ^kP<0.05 as compared with MF single formula by MW test. ^lP<0.01 as compared with EC single formula by MW test..

치은 조직 내 PGE2 함량의 변화

PGE2는 염증반응 시 cyclooxygenase-2에 의해 형성되는 염증성 산물로 염증의 진행을 촉진하고 통증을 유발하며, 조골세포를 자극하여 파골세포의 골 흡수 기능을 증가시키는 역할을 담당하는 것으로 알려져 있고(Cho 등, 2015), 다양한 치주 질환 시 염증반응 및 파골세포의 활성에 따른 치조골 소실과 동반된 PGE2 함량의 현저한 증가가 이미 잘 알려져 있다(Kats 등, 2016). 본 실험에서도 EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 치은 조직 내 PGE2 함량이 유의적으로 증가하였으나, MF 단독 조성물 200 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 PGE2 함량이 유의하게 감소하였고, 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해 치은 조직 내 PGE2 함량이 투여 용량 의존적으로 유의하게 감소하였다. 또한 적어도 본 실험의 조건에서 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 50 mg/kg은 IND 5 mg/kg과 비교할 만한 치은 조직 내 PGE2 함량 증가 억제 효과를 나타내었다(Table 3). 치은 조직 내 PGE2 함량은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 162.42%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -46.13, -24.62, -22.38, -54.73, -50.76, -43.49 및 -21.57%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 EPD에 대한 항염 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 직접적인 증거로 판단된다.

치은 조직 내 MMP-8 함량의 변화

MMP는 세포외 기질 중 단백질성 물질들의 분해 및 신호전달 체계에서 단백질의 절단을 담당하는 metal 의존성 단백질 분해 효소 계통이고(Nagase와 Woessner, 1999), 다양한 생리(상처 치유, 혈관 신생 또는 apoptosis 등) 및 병인(심혈관계 질환, 관절염, 악성 종양 또는 치주 질환)에 관여하는 것으로 알려져 있으며(Nagase와 Woessner, 1999; Balli 등, 2016), 특히 치주 질환 시 초래되는 염증 인자와 세균에 의해 MMP의 발현 및 활성이 증가한다(Tüter 등, 2002; Kubota 등, 2008; Balli 등, 2016). 이들 중 MMP-8은 대표적인 콜라겐 분해 효소에 속한 MMP 계열 효소로 조직의 간질에서 가장 높은 활성을 나타내어 치주 질환 시 세포외 기질의 분해를 유발하는 가장 중요한 MMP 중 하나로 주목받아 왔다(Tüter 등, 2002). 다양한 염증성 치주 질환 시 치은 조직 내 MMP-8의 발현 및 함량의 증가가 관찰되며, 치주 질환이 치료됨에 따라 이들 MMP-8의 발현, 활성 및 함량이 현저히 감소하는 것으로 알려져 있다(Tüter 등, 2002; Balli 등, 2016). 본 실험의 결과에서도 EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 치은 조직 내 MMP-8 함량이 유의적으로 증가하였으나, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 MMP-8 함량이 유의적으로 감소하였고, 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 치은 조직 내 MMP-8 함량이 투여 용량 의존적으로 유의하게 감소하였다(Table 3). 치은 조직 내 MMP-8 함량은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 73.59%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -31.22, -14.47, -12.39, -35.93, -34.03, -28.28 및 -11.49%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 EPD에 대한 항염 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 신뢰할 만한 증거로 판단된다.

치은 조직 내 IL-1β 및 TNF-α 함량의 변화

치주 질환에서 염증성 사이토카인, 특히 TNF-α와 IL-1β의 중요성은 이미 잘 알려져 있다(De Lima 등, 2000). TNF-α는 비장세포를 포함한 여러 종류의 세포에서 생산되는 대표적인 사이토카인의 일종으로 T-임파구의 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Samira 등, 2004). TNF-α는 일반적으로 세포성 면역을 활성화하며, 항체 생산을 촉진하는 것으로 알려진 IL-2의 기능을 증가시킨다(Isaacs, 1995). IL-1은 대식세포, 수지상 세포, 임파구, 내피세포, 섬유세포 및 각질세포 등 다양한 세포에서 분비되는 또 다른 사이토카인으로 세포의 분비 형태인 IL-1β와 막 부착형인 IL-1α의 두 종류가 존재하며, 면역반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Unanue, 1995). 치주 질환에서 TNF는 eicosanoids 및 다른 사이토카인 즉, TNF-α와 IL-1을 유리시켜 치주염을 악화시키고, IL-1은 중성호성 백혈구와 대식세포를 활성화해 활성 산소와 NO의 유리를 촉진해 결과적으로 주변 조직의 손상을 유래한다(Assuma 등, 1998). 따라서 이들 TNF-α와 IL-1β의 억제는 치주염 및 이와 관련된 치조골 손실을 억제할 수 있다(Botelho 등, 2007; Ku 등, 2011; Kim 등, 2012; Park 등, 2016). 본 연구 결과 EPD 대조군의 경우 정상 대조군에 비해 치은 조직 내 IL-1β 및 TNF-α 함량이 유의적으로 증가하였으나, 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 IL-1β 및 TNF-α 함량이 유의적으로 감소하였고, 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 치은 조직 내 IL-1β 및 TNF-α 함량이 유의하게 감소하였다. 또한 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 50 mg/kg은 IND 5 mg/kg과 비교할 만한 치은 조직 내 IL-1β 및 TNF-α 함량 증가 억제 효과를 나타내었다(Table 3). 치은 조직 내 IL-1β 함량은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 421.47%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -60.67, -41.76, -32.06, -66.60, -61.35, -59.47 및 -30.33%의 변화를 나타내었다. 치은 조직 내 TNF-α 함량은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 404.40%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -64.22, -46.15, -40.18, -69.68, -66.30, -63.27 및 -39.99%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 다시 한번 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 EPD에 대한 항염 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 믿을만한 증거로 판단된다.

치은 조직 내 iNOS 활성 및 Malondialdehyde(MDA) 함량의 변화

iNOS는 bacterial lipopolysaccharide, IL-1β, TNF-α 및 interferon-γ 등의 염증 유발물질에 의해 다양한 세포에서 유도되며, iNOS의 작용에 의한 L-arginine의 산화에 의해 형성되는 NO는 생체에 다양한 종류의 생리학적 및 생리 병리학적 변화를 일으켜 shock과 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다(Szabó, 1995). 치주 질환에서도 NO의 상승이 초래되며, 이로 인한 주변 조직 특히 치조골의 손실이 일어나는 것으로 알려져 있다(Lohinai 등, 1998; Di Paola 등, 2004; Park 등, 2016). 또한 MDA는 일반적으로 사용된 지질 과산화(lipid peroxidation) 마커로 치주 질환에서도 현저한 상승이 초래되는 것으로 알려져 있다(Di Paola 등, 2004). 본 연구에서도 EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 치은 조직 내 iNOS의 활성 및 MDA 함량이 유의적으로 증가하였으나, 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 iNOS의 활성 및 MDA 함량이 유의적으로 감소하였고, 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해 치은 조직 내 iNOS의 활성 및 MDA 함량이 투여 용량 의존적으로 유의하게 감소하였다. 한편 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 25 mg/kg은 IND 5 mg/kg보다 비교적 우수한 치은 조직 내 iNOS의 활성 및 MDA 증가 억제 효과를 나타내었다(Table 4).

Table 4 . Maxillary gingival MDA levels, iNOS activities, RANKL and OPG mRNA Expressions, and RANKL/OPG mRNA expressions after 10 days of continuous oral treatment of test substances in intact or EPD rats.

Groups		In maxillary gingival tissues
		MDA contents (μM/mg of tissue)	iNOS activities (fM/mg/min)	mRNA expressions (relative to control/β-actin)
				RANKL	OPG	RANKL/OPG
Controls	Intact	1.51±0.65	26.64±11.41	1.00±0.12	1.00±0.10	1.01±0.15
	EPD	9.54±1.48g	234.25±70.23g	6.53±0.83g	1.30±0.22a	5.16±1.13g
Reference	IND 5 mg/kg	6.15±1.13gh	127.72±26.78gh	3.21±1.13gh	1.26±0.19b	2.63±1.12gh
Single formula	MF 200 mg/kg	4.04±0.48gh	77.24±14.79gh	5.12±0.57gh	1.59±0.24ac	3.29±0.62gh
	EC 200 mg/kg	4.46±0.77gh	82.55±16.65gh	4.68±0.81gh	1.68±0.19ac	2.83±0.59gh
MF:EC 2:1 (w/w)	200 mg/kg	3.08±0.47ghik	47.78±13.19ghik	2.38±0.66ghik	2.36±0.33acde	1.03±0.35hik
mixed formula	100 mg/kg	3.21±0.47ghik	54.13±12.50ghik	2.60±0.58ghik	2.10±0.17acde	1.25±0.30hik
(totalized)	50 mg/kg	3.49±0.41ghjk	60.07±10.51ghjl	3.42±0.70ghil	1.92±0.21acdf	1.80±0.39ghik
	25 mg/kg	4.66±1.22gh	83.89±18.64gh	5.13±0.95gh	1.59±0.17ac	3.25±0.62gh

Abbreviations are the same as Table 1..

Values are expressed mean±SD of eight rats..

^aP<0.01 and ^bP<0.05 as compared with intact control by LSD test. ^cP<0.01 as compared with EPD control by LSD test. ^dP<0.01 as compared with MF single formula by LSD test. ^eP<0.01 and ^fP<0.05 as compared with EC single formula by LSD test. ^gP<0.01 as compared with intact control by MW test. ^hP<0.01 as compared with EPD control by MW test. ⁱP<0.01 and ^jP<0.05 as compared with MF single formula by MW test. ^kP<0.01 and ^lP<0.05 as compared with EC single formula by MW test..

치은 조직 내 iNOS 활성은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 779.45%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -45.48, -67.03, -64.76, -79.60, -76.89, -74.36 및 -64.19%의 변화를 나타내었다. 또한 치은 조직 내 MDA 함량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 530.31%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -35.54, -57.62, -53.29, -67.73, -66.41, -63.47 및 -51.16%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 EPD에 대한 항산화 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 확실한 증거로 판단된다.

치은 조직 내 RANKL 및 OPG mRNA 발현의 변화

치주 질환의 발생 및 진행은 환자의 염증 및 이와 관련된 골 재흡수 등 방어 시스템과 직접 연관되어 있으며(Takahashi 등, 2014), 치주 질환 시 염증성 골 흡수는 조골세포에서 생산되는 RANKL이 파골세포의 표면에 존재하는 RANK에 결합하여 활성화된 파골세포에 의해 주로 초래된다(Takahashi 등, 2014). RANKL은 파골세포 분화 촉진 인자로 활성 비타민 D3, PGE2, IL-1, IL-6, TNF-α 및 IL-17과 같은 염증 인자와 사이토카인에 의해 활성화되어 조골세포의 표면에 발현된다(Tyagi 등, 2012). RANKL은 파골세포 전구세포의 표면에 존재하는 수용체인 RANK와 결합하여 파골세포의 분화, 성숙 및 활성을 유도한다(Lacey 등, 1998). 조골세포에 의해 생산 및 분비되는 또 다른 신호분자인 OPG는 RANKL의 RANK 결합을 경쟁적으로 차단하여 파골세포의 골 흡수 기능을 강력히 억제한다(Lee 등, 2010; Takahashi 등, 2014). 치주염 및 이와 관련된 치조골 소실 시 RANKL의 발현 증가 및 이와 관련된 RANKL/OPG 발현 비율의 증가가 관찰되어 왔다(Shen 등, 2012; Takahashi 등, 2014). 본 실험에서도 EPD 대조군의 경우 정상 대조군에 비해 치은 조직 내 RANKL 및 OPG mRNA 발현과 RANKL/OPG mRNA 발현 비율이 유의적으로 증가하였으나, 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 유의적으로 RANKL mRNA 발현 감소, OPG mRNA 발현 증가 및 RANKL/OPG mRNA 발현 비율의 감소가 각각 확인되었고, 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 치은 조직 내 RANKL mRNA 발현 감소, OPG mRNA 발현 증가 및 RANKL/OPG mRNA 발현 비율이 각각 투여 용량 의존적으로 유의하게 감소하였다. 한편 IND 5 mg /kg 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 유의적으로 RANKL mRNA 발현 및 RANKL/OPG mRNA 발현 비율의 감소가 각각 확인되었으나, OPG mRNA 발현의 변화는 유의적인 차이가 확인되지 않았다(Table 4).

치은 조직 내 RANKL mRNA 발현은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 553.94%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -50.85, -21.57, -28.33, -63.52, -60.27, -47.60 및 -21.47%의 변화를 나타내었다. 치은 조직 내 OPG mRNA 발현은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 29.84%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -2.88, 22.21, 28.85, 81.44, 61.63, 47.69 및 22.12%의 변화를 나타내었다. 또한 치은 조직 내 RANKL/OPG mRNA 발현 비율은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 413.37%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -49.00, -36.31, -45.29, -80.00, -75.89, -65.23 및 -37.12%의 변화를 나타내었다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건으로 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 EPD rat에서 MF 및 EC의 RANKL/OPG mRNA 발현 조절을 통한 치조골 소실 억제 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 명확한 증거로 판단된다.

혈액 생화학적 변화

20항목인 AST, ALT, ALP, BUN, CRE, GLU, CHO, PRO, CPK, BIL, ALB, globulin, A/G, TG, LDH, Ca, IP, Na, K 및 Cl에 대한 혈액 생화학적 검사 결과, 정상군 및 EPD 대조군을 포함한 모든 rat은 동일한 연령의 정상 rat의 혈액 생화학적 범위(Wolford 등, 1986) 내에서 변화를 나타내었고, 정상 대조군에 비해 EPD 대조군에서 유의적인 차이가 확인되지 않았으며, EPD 대조군에 비해 혈액 생화학적 변화 역시 MF 단독 조성물 200 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서 유의적인 차이가 없었다. 또한 MF와 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여 혈액 생화학적 변화 역시 4가지 모든 용량의 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 투여군에서 각각 유의적인 차이가 확인되지 않았다(Table 5). 따라서 MF 및 EC 단독 조성물, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200 mg/kg의 10일간에 걸친 경구투여는 적어도 본 실험의 조건에서 심각한 독성을 유발하지 않는 것으로 판단된다.

Table 5 . Serum Biochemistrical Analysis after 10 Days of Continuous Oral Treatment of Test Substances in Intact or EPD Rat.

Groups		AST(IU/L)	ALT(IU/L)	ALP(IU/L)	BUN(mg/dL)	CRE(mg/dL)	GLU(mg/dL)	CHO(mg/dL)
Sham control		101.75±14.95	42.63±11.55	174.88±30.60	10.16±0.47	0.44±0.13	121.50±17.56	57.38±6.59
EPD control		104.63±15.80	41.75±11.00	174.75±30.03	10.15±0.71	0.43±0.13	114.75±12.26	55.88±6.58
IND 5 mg/kg		104.50±17.37	42.88±10.62	177.63±20.89	10.20±0.67	0.45±0.18	117.88±24.23	58.50±10.70
Single formula	MF 200 mg/kg	102.25±14.42	39.63±9.02	178.75±26.41	10.20±1.36	0.43±0.12	121.88±17.18	55.50±19.62
	EC 200 mg/kg	103.00±22.69	41.50±6.44	178.00±32.30	10.14±0.72	0.41±0.16	114.63±12.85	57.88±14.65
MF:EC 2:1 (g/g) mixed formula (Totalized)	200 mg/kg	104.13±16.79	42.25±6.14	179.75±30.10	9.90±0.80	0.41±0.15	115.50±12.73	56.00±15.27
	100 mg/kg	103.50±19.84	42.38±14.08	178.00±31.80	10.14±0.63	0.40±0.12	120.00±9.13	55.82±12.72
	50 mg/kg	106.75±20.15	43.13±7.26	176.75±15.94	10.20±0.48	0.43±0.10	120.25±18.40	55.88±14.28
	25 mg/kg	104.75±18.09	44.13±8.89	175.00±29.39	10.10±0.70	0.45±0.11	119.13±11.37	57.00±12.21
		PRO(g/dL)	CPK(IU/L)	BIL(mg/dL)	ALB(g/dL)	Globulin(g/dL)	A/G(Ratio)	TG(mg/dL)
Sham control		6.34±0.82	813.25±180.31	0.15±0.08	4.09±0.14	2.25±0.82	2.08±0.95	47.38±16.01
EPD control		6.35±0.58	803.25±169.54	0.16±0.07	4.05±0.42	2.30±0.75	1.97±0.77	49.00±21.69
IND 5 mg/kg		6.41±0.39	853.75±219.58	0.16±0.07	4.06±0.14	2.35±0.45	1.79±0.35	50.00±14.08
Single formula	MF 200 mg/kg	6.41±0.56	846.50±186.71	0.16±0.07	4.05±0.19	2.36±0.53	1.78±0.39	51.38±18.61
	EC 200 mg/kg	6.23±0.44	778.75±223.33	0.18±0.09	4.06±0.26	2.16±0.49	2.00±0.64	46.38±17.68
MF:EC 2:1 (g/g) mixed formula (Totalized)	200 mg/kg	6.83±0.52	846.13±182.22	0.16±0.07	4.10±0.21	2.28±0.59	1.93±0.57	46.75±13.63
	100 mg/kg	6.31±0.41	838.38±178.90	0.15±0.08	4.05±0.42	2.26±0.52	1.90±0.54	43.95±14.51
	50 mg/kg	6.29±0.60	854.13±169.94	0.14±0.07	4.08±0.30	2.21±0.61	1.95±0.45	47.00±19.26
	25 mg/kg	6.39±0.50	829.88±321.07	0.15±0.08	4.03±0.34	2.36±0.73	1.87±0.63	47.88±17.59
		LDH(x102)(IU/L)	Ca(mg/dL)	IP(mg/dL)	Na(mmol/L)	K(mmol/L)	Cl(mmol/L)
Sham control		14.53±5.67	11.94±0.33	11.65±0.44	141.50±1.20	4.06±0.16	102.50±1.93
EPD control		13.80±5.64	11.91±0.15	11.59±0.24	141.63±1.30	4.05±0.16	102.75±2.12
IND 5 mg/kg		13.59±6.20	11.93±0.36	11.63±0.42	141.13±1.36	4.13±0.37	102.88±1.89
Single formula	MF 200 mg/kg	12.74±4.88	11.93±0.27	11.56±0.37	141.50±1.60	4.10±0.12	103.63±2.72
	EC 200 mg/kg	14.62±6.54	11.91±0.37	11.59±0.41	141.63±1.92	4.05±0.16	103.38±3.93
MF:EC 2:1 (g/g) mixed formula (Totalized)	200 mg/kg	13.88±5.92	11.95±0.40	11.55±0.41	141.50±1.60	4.08±0.22	103.13±1.81
	100 mg/kg	12.69±6.15	11.91±0.39	11.65±0.45	141.38±1.51	4.09±0.19	103.13±2.80
	50 mg/kg	10.96±5.50	11.94±0.41	11.61±0.47	141.63±1.69	4.09±0.19	102.88±2.36
	25 mg/kg	14.56±5.87	11.93±0.38	11.65±0.40	141.38±1.06	4.08±0.13	103.25±2.82

Abbreviations are the same as Table 1..

Values are expressed mean ± S.D. of eight rats.

조직병리학적 변화

본 연구에서도 이전의 연구들과 유사하게(Ku 등, 2011; Kim 등, 2012; Park 등, 2016) 조직병리학적으로 치은 결찰부 주위에 현저한 염증세포 침윤과 함께 부종 현상을 특징으로 하는 치은염이 유발되었으며, 조골세포의 활성 억제와 파골세포의 활성화에 의한 치주량의 현저한 감소가 확인되었다. 즉, 염증세포의 침윤 정도와 치조골 소실을 바탕으로 한 histological score의 증가, 중성호성 백혈구를 포함한 침윤 염증세포의 수적 증가, 부종에 따른 콜라겐 섬유가 차지하는 비율의 감소, 조골세포 수 및 비율의 감소, 파골세포 수 및 비율의 증가, 치조골량의 감소가 EPD 대조군에서 각각 유의적으로 확인되었으나, 모든 실험물질 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 유의적으로 치은염 및 치조골 소실에 대한 조직병리학적 소견의 억제 효과가 확인되었다. 특히 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 현저한 치은염 및 치조골 소실에 대한 조직병리학적 소견의 억제 효과가 투여 용량 의존적으로 확인되었다. 또한 적어도 본 실험의 조건에서 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 25 mg/kg은 IND 5 mg/kg과 비교할 만한 치은염 및 치조골 소실에 대한 조직병리학적 소견의 억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성에 의해 MF 및 EC의 EPD에 의한 치은염 및 치조골 소실에 대한 조직병리학적 소견의 억제 효과가 적어도 4배 이상 현저히 증가하는 직접적인 증거로 판단된다(Table 6 및 7, Fig. 4).

Table 6 . Histological scores and histomorphometrical analysis of maxillary regions around ligation placement-gingival tissues after 10 days of continuous oral treatment of test substances in intact or EPD rats.

Groups		In maxillary gingival tissues
		Histological scores (Max=3)	Inflammatory cells (cells/mm2)	Collagen fibers (%/mm2)
Controls	Intact	0.25±0.46	20.63±10.25	65.14±11.71
	EPD	2.88±0.35a	1,408.13±345.86h	17.57±6.28h
Reference	IND 5 mg/kg	1.63±0.52ac	159.25±27.85hj	37.95±5.26ij
Single formula	MF 200 mg/kg	2.00±0.76ac	523.75±170.77hj	30.24±4.16hj
	EC 200 mg/kg	2.13±0.64ad	597.00±115.58hj	28.91±5.78hj
MF:EC 2:1 (w/w)	200 mg/kg	0.88±0.64bceg	47.88±17.58hjkl	51.33±6.65ijkl
mixed formula	100 mg/kg	1.00±0.76bceg	69.75±17.84hjkl	41.89±5.57hjkl
(totalized)	50 mg/kg	1.25±0.46acfg	174.38±32.36hjkl	37.70±3.81hjkl
	25 mg/kg	2.25±0.46ad	602.63±163.48hj	28.73±3.74hj

Abbreviations are the same as Table 1..

Values are expressed mean±SD of eight rats..

^aP<0.01 and ^bP<0.05 as compared with intact control by LSD test. ^cP<0.01 and ^dP<0.05 as compared with EPD control by LSD test. ^eP<0.01 and ^fP<0.05 as compared with MF single formula by LSD test. ^gP<0.01 as compared with EC single formula by LSD test. ^hP<0.01 and ⁱP<0.05 as compared with intact control by MW test. ^jP<0.01 as compared with EPD control by MW test..

^kP<0.01 as compared with MF single formula by MW test. ^lP<0.01 and ^kP<0.05 as compared with EC single formula by MW test..

Fig 4. Representative histological images of gingival tissues and alveolar bone areas between upper incisor teeth, taken from intact or EPD rats around upper left incisor teeth after 10 days of continuous oral treatment of test substances. (A) Intact vehicle control, Non-ligated and distilled water orally administered rats; (B) EPD control, Ligated EPD induced and distilled water orally administered rats; (C) Ligated EPD induced and indomethacin 5 mg/kg orally administered rats; (D) Ligated EPD induced and MF single formula 200 mg/kg orally administered rats; (E) Ligated EPD induced and EC single formula 200 mg/kg orally administered rats; (F) Ligated EPD induced and MF:EC 2:1 (w/w) mixed formula 200 mg/kg orally administered rats; (G) Ligated EPD induced and MF:EC 2:1 (w/w) mixed formula 100 mg/kg orally administered rats; (H) Ligated EPD induced and MF:EC 2:1 (w/w) mixed formula 50 mg/kg orally administered rats; (I) Ligated EPD induced and MF:EC 2:1 (w/w) mixed formula 25 mg/kg orally administered rats. All Hematoxylin-eosin stain. Scale bars=60 µm.

조직병리학적 score는 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 1,050.0%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -43.48, -30.43, -26.09, -69.57, -65.22, -56.52 및 -21.74%의 변화를 나타내었다. 치은 조직 내 침윤 염증세포의 수는 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 6727.27%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -88.69, -62.81, -57.60, -96.60, -95.05, -87.62 및 -57.20%의 변화를 나타내었다. 치은 조직 내 콜라겐 섬유가 차지하는 비율은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 -73.04%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 116.08, 72.13, 64.57, 192.23, 138.46, 114.63 및 63.57%의 변화를 나타내었다.

치조골량은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 -68.55 %의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 92.96, 60.04, 79.40, 189.47, 142.46, 113.76 및 59.32%의 변화를 나타내었다. 조골세포의 수 및 치조골 표면당 조골세포가 차지하는 비율은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -81.20 및 -88.60%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 148.30, 64.20, 79.55, 238.07, 193.75, 133.52 및 61.36%의 조골세포 수의 변화를 각각 나타내었고, 425.53, 191.70, 261.77, 611.48, 579.73, 403.48 및 187.52%의 치조골 표면당 조골세포가 차지하는 비율의 변화를 각각 나타내었다. 파골세포의 수 및 치조골 표면당 파골세포가 차지하는 비율은 EPD 대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 1,368.42 및 1,710.72%의 변화를 나타내었으나, IND 5 mg/kg, MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg, MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -65.23, -42.29, -51.25, -86.02, -78.49, -62.37 및 -40.50%의 파골세포의 수의 변화를 나타내었고, -73.42, -41.23, -50.41, -86.99, -80.45, -72.24 및 -38.86%의 치조골 표면당 파골세포가 차지하는 비율의 변화를 각각 나타내었다.

치주염 및 치조골 손상 개선을 위한 천연물 복합 기능성 식품 개발의 일환으로 이전의 상악 절치 경부 결찰 EPD rat 모델을 이용한 약효 탐색 실험 및 최적 조성비 실험에서 가장 우수한 항염 및 치조골 손실 억제 효과를 나타낸 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물의 투여 용량 의존적 치은염 및 치조골 손실 개선 효과를 역시 치아 경부 결찰 EPD rat 모델을 이용하여 확인한 결과, 치아 경부 결찰로 유발된 치은염 및 관련 치조골 소실, 체중 및 증체량의 감소, 치조골 손실률, 구강 협부 총 호기성 세균수, 치은 조직 내 MPO 및 iNOS 활성, PGE2, MMP-8, IL-1β, TNF-α 및 MDA 함량, RANKL/OPG mRNA 발현 비율의 현저한 증가가 4개 용량의 모든 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100, 50 및 25 mg/kg의 10일에 걸친 연속 투여에 의해 투여 용량 의존적으로 현저히 억제되었고, 특히 본 실험의 조건에서 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 치은염 및 관련 치조골 소실 개선 효과가 투여 용량 의존적으로 유의하게 증가하였다. 한편 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 25 mg/kg 투여군에서는 각각의 MF 및 EC 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해 치은염 및 관련 치조골 소실 개선 효과의 유의적인 변화는 확인되지 않았다. MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물 50 mg/kg은 전체적으로 IND 5 mg/kg과 비교할 만한 항염 및 치조골 손실 억제 효과를 나타내었다. 따라서 MF:EC 2:1(w/w) 복합 조성물은 항염, 항산화, MMP-8 억제, RANKL/OPG mRNA 발현 조절 효과의 증가를 통해 MF 및 EC의 치은염 및 관련 치조골 소실 개선 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 것으로 관찰되어, 향후 안전하고 효과적인 치은염 및 관련 치조골 소실 개선물질로의 개발 가능성이 매우 높을 것으로 기대된다.

본 연구에서는 모링가 및 두충 2:1 복합물이 치은염 및 치조골 파괴 억제에 효능이 있는지 확인하고자 하였다. 6주령 SD rats의 치아 경부에 3-0 나일론 봉합사를 이용하여 결찰을 실시한 후, 모링가:두충 2:1(w/w) 복합물을 25, 50, 100 및 200 mg/kg의 용량으로 10일 동안 경구투여하였다. 10일 후 모링가:두충 2:1(w/w) 복합물을 투여한 군에서 치조골 손실률, 구강 협부 총 호기성 세균수, 치은 조직 내 MPO 및 iNOS 활성, PGE2, MMP-8, IL-1β, TNF-α, MDA 함량, RANKL/OPG mRNA 발현 비율이 투여 용량 의존적으로 억제되어 유의적인 치주염 및 치조골 소실 개선 효과가 확인되었다. 따라서 모링가:두충 2:1(w/w) 복합물은 항염, 항산화, MMP-8 억제, RANKL/OPG mRNA 발현 조절을 통해 치은염 및 치조골 소실 개선 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 것으로, 효과적인 치은염 및 관련 치조골 소실 개선제로의 개발 가능성이 매우 높을 것으로 기대된다.