치매(dementia)는 다양한 요인에 의해 학습과 기억력이 감퇴하는 질환으로 그중 Alzheimer’s disease(AD)는 나이와 연관된 대표적인 퇴행성 뇌질환으로 치매의 가장 흔한 형태로 알려져 있다(Chuong 등, 2014). 이러한 AD는 임상적으로 인지능력 장애, 언어능력과 운동 협응능력 그리고 행동의 변화를 야기하며, 신경 병리학적 특징으로는 세포 외 amyloid-β peptide로 이루어진 extracellular senile plaques, 세포 내로는 neurofibrillary tangle이 동반된 신경세포들 및 시냅스의 광범위한 손실, 신경 전달물질계의 변형 등을 들 수 있다. 특히 전뇌 기저부(basal forebrain)에서의 cholinergic cells의 손실은 acetylcholine(ACh)과 같은 신경전달물질의 소실을 야기하며, 치매의 진행에 있어 결정적인 요인으로 작용한다(Becker 등, 1988; Taraschenko 등, 2005). 근래 들어 이러한 cholinergic 가설을 기본으로 신경 연접 부위에서 ACh의 분해를 담당하는 효소인 acetylcholinesterase(AChE)를 억제하여 치매를 치료하고자 노력하고 있으며, 중추신경계의 콜린성 연접에서 ACh의 이용을 증가시키는 physostigmine, tacrine, donepezil, galanthamine, huperzine A 및 rivastigmine 등과 같은 다양한 AChE inhibitors가 실제 치매 치료에 사용되고 있고, 현재에도 새로운 효과적인 AChE inhibitor가 계속해서 개발되고 있다(Chuong 등, 2014; Becker 등, 1988). 이 중 tacrine(CognexTM, 9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine hydrochloride)은 US Food and Drug Administration에서 가장 먼저 선택되어 사용되는 대표적인 AChE 억제성 치매 치료제(Park 등, 2015)로, 대뇌피질 및 해마에서 콜린성 신경의 소실을 효과적으로 억제하며(Farlow 등, 1992), intracerebral streptozotocin 유발 마우스 치매 모델에서 매우 효과적인 대뇌 항산화 효과도 나타내는 것으로 알려져 있으나(Saxena 등, 2008), 대략 30%의 환자에서 심각한 혈중 alanine aminotransferase 수치의 증가, 즉 간 독성이 유발되는 것으로 알려져 임상에서 사용이 제한되고 있다(Watkins 등, 1994). 따라서 근래에 들어 상대적으로 부작용이 낮은 천연물 유래의 AChE inhibitor를 개발하기 위한 노력이 시도되어 왔으며(Oh 등, 2004; Houghton 등, 2006), 다양한 항산화제들 역시 치매에 대해 비교적 효과적인 기억력 개선 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Hasanein과 Mahtaj, 2015; Palit 등, 2015).

중추신경계의 콜린성 신경은 인지기능 조절에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이들 콜린성 신경의 신경전달물질인 ACh는 choline acetyltransferase(ChAT)에 의해 합성 분비되어(Blusztajn과 Wurtman, 1983) 적절한 타이밍, 학습, 주의력 및 기억력과 같은 다양한 중추성 및 말초성 인지기능 조절을 담당한다(Brandon 등, 2004). 따라서 콜린성 신경원의 손상은 신경 연접에서 ACh의 분비를 감소시켜 학습 및 기억력 장애를 초래하는 것으로 알려져 있다(Mohapel 등, 2005). 또한 이들 ACh의 작용 시간은 ACh의 유리 후 ACh의 분해를 담당하는 효소인 AChE에 의존적이므로(Eichenbaum, 1997; Bartus 등, 1982), AChE 활성의 억제는 AD를 포함한 다양한 치매, 외상성 뇌 손상, 섬망(delirium) 등의 치료제 개발에 중요한 표적으로 이용되고 있으며, 정신분열증(schizophrenia)의 치료에도 매우 유용할 것으로 판단되어 왔다(Giacobini, 2004). ChAT는 ACh의 합성을 담당하므로 중추 및 말초 신경계의 콜린성 신경원의 활성에 AChE와 반대의 측면에서 매우 중요한 지표로 이용되고 있다(Oda, 1999). 즉, ChAT의 활성은 인지 장애와 직접적으로 연관되어 고령 인구에서 현저히 감소한다(Zambrzycka 등, 2002). 이러한 맥락에서 인지기능 개선 효과를 평가하기 위해서는 신경원 자체의 변성이 동반되지 않은 콜린성 신경 기능 이상에 따른 기억력 장애 실험동물 모델이 필요하며(Lee 등, 2014), scopolamine(SCP) 유발 기억력 장애 C57BL/6 마우스 모델은 이러한 목적에 가장 부합되는 실험동물 모델로 이용되고 있다(Lee 등, 2014; Brouillette 등, 2007; Kim 등, 2018; Hu 등, 2019). SCP는 주로 muscarinic acetylcholine receptor M1(M1AChR) 및 M2AChR에 작동하는 비선택적 MAChR 길항제로 설치류과 사람에게 학습 및 단기 기억력 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다(Molchan 등, 1992; Iversen, 1997). 따라서 SCP 유발 기억 상실(건망증) 설치류 모델은 항건망증 약물의 스크리닝에 일반적으로 사용되고 있으며, 특히 C57BL/6 마우스가 가장 흔히 이용되고 있다(Chuong 등, 2014; Bartus 등, 1982; Lee 등, 2014; Hu 등, 2019). 현재 해마 및 전두엽 대뇌피질에 존재하는 신경원이 SCP에 민감한 것으로 알려져 있고(Abe, 1991), SCP는 해마 부위에서 기억력과 관련된 유전자[brain-derived neurotrophic factor(BDNF), phosphoinositide 3-kinase(PI3K), protein kinase B(Akt), extracellular signal-regulated kinase 1,2(ERK1 및 2), cAMP response element-binding protein(CREB), calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅳ(CaMK Ⅳ)]의 발현 역시 현저히 억제하는 것으로 알려져 있다(Chuong 등, 2014; Bartus 등, 1982; Lee 등, 2014; Hu 등, 2019; Win-Shwe 등, 2007).

현재 약용식물, medicinal herb는 신약 개발에 있어 새로운 치료제를 찾기 위한 매우 중요한 소재로 활용되고 있고(Devipriya 등, 2007; Kim 등, 2015), 특히 다양한 질병에 대한 신체의 방어력을 증가시키는 것으로 알려진 항산화제가 풍부하게 존재하며(Noh 등, 2011), 일부 AChE 차단제 역시 천연물의 alkaloid에서 분리, 정제되어 개발되었다(Chuong 등, 2014; Hu 등, 2019; Nam과 Lee, 2014). 강황(Curcuma longa L.)은 인도, 중국 및 일본을 포함한 남아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카에 걸쳐 분포하고 있는 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 다년생 초본(Kim 등, 2016; Song과 Choi, 2016)으로, curcumin의 AD(Kim 등, 2012; Guerra-Araiza 등, 2013) 및 다발성 경화증(von Geldern과 Mowry, 2012; Feng 등, 2014)과 같은 신경 염증성 질환 보호 효과로 잘 알려져 있다. 또한, β-carotene, 비타민 E 및 C보다 더 우수한 항산화 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며(Suresh와 Srinivasan, 2007), 랫트에서 curcumin의 장기 투여는 비교적 우수한 뇌 신경 보호 효과를 나타내는 것으로 알려져 있고(Kulkarni 등, 2008), 5-hydroxyindoleacetic acid, epinephrine, norepinephrine 및 dopamine과 같은 monoaminergic system에 속하는 신경전달물질의 분비 조절을 통해 항우울증 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(He 등, 2016). Curcumin은 염증성 cytokine 분비, 혈소판 응집, cyclooxygenase, lipoxygenase isoenzymes, protein kinase-C, protein tyrosine kinases, calcium-dependent endonuclease 및 apoptosis 조절을 통해서도 다양한 신경 보호 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 있다(Bishnoi 등, 2008; Kumar 등, 2020). 특히 SCP 유발 건망증 마우스 모델에서 발효 강황(Eun 등, 2017) 및 curcuminoid(curcumin, bisdemethoxycurcumin 및 demethoxycurcumin 혼합물)의 항건망 효과가 보고되어 있다(Ahmed와 Gilani, 2009). 따라서 본 연구에서는 인지기능 개선을 위한 천연물 유래 기능성 식품 또는 천연물 신약 소재 개발의 일환으로 아리바이오 에서 개발한 신규 수용성 강황 제형인 강황 추출물(CM-SD)의 SCP 유발 기억력 장애 마우스 모델에서 in vivo 기억력 개선 효과를 평가하기 위해 반수의 실험동물은 수동회피시험 후 해마 부위의 ACh 함량, AChE 활성 및 realtime RT-PCR 검사에 사용했으며, 나머지 반수는 수중미로시험 후 대뇌피질 항산화 방어 시스템의 측정에 활용하였다.

시험물질

실험에 사용된 강황 추출물(CM-SD; curcumin 40%)은 (주)아리바이오(Seongnam, Korea)로부터 시험물질로 제공되었다. CM-SD 제조를 위해 (주)사빈사한국지사(Seoul, Korea)로부터 공급받은 원재료 강황 추출분말(curcumin C3 complex, 95% cucuminoids)을 이용 정제수, 인산, 가티검과 혼합 후 20시간 이상 분산 입도(<1,000 nm) 과정을 통해 나노화하여 여과 후 덱스트린을 첨가, 최종적으로 분무건조(spray dryer) 방법을 이용하여 (주)아리바이오에이치앤비에서 시험물질 ‘강황 추출물’(CM-SD)이 제조되었다. 실험에 사용 전까지 빛과 습기로부터 보호하기 위해 4°C에서 냉장 보관하였다.

실험동물

총 120마리의 6주령 수컷 SPF/VAF Inbred C57BL/6NCrljOri 마우스(OrientBio, Seongnam, Korea)를 7일간 실험실 환경에 순응시킨 후 평균 체중 21.57±1.02 g, 20.10~23.60 g(Table 1) 체중을 기준으로 정상 매체 대조군(매체 경구 및 복강투여 대조군), scopolamine hydrobromide(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 대조군(매체 경구 및 SCP 복강투여 대조군), tacrine 10 mg/kg 경구투여 및 SCP 복강투여 대조 약물군, CM-SD 실험군(각각 20, 40, 80 mg/kg 및 SCP 복강투여 실험군) 총 6군으로 군당 20마리씩으로 구분하여 실험에 사용하였다. 마우스는 20~25°C, 습도 40~45%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 1주일간 예비 사육 후 실험에 사용하였다. 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: DHU 2021-005)을 받아 수행하였다.

Table 1 . In vivo experimental test groups used in this study.

Group	Inducer	Dose (mg/kg/d)	Treatment drug	Animal No.
Control	Saline (vehicle)	10 mL/kg	Vehicle (distilled water)	M01∼M20
	SCP 1 mg/kg	10 mL/kg	Vehicle	M21∼M40
Control drug	SCP 1 mg/kg	10 mg/kg	Tacrine	M41∼M60
Active	SCP 1 mg/kg	80 mg/kg	CM-SD, the highest dosage	M61∼M80
	SCP 1 mg/kg	40 mg/kg	CM-SD, the middle dosage	M81∼M100
	SCP 1 mg/kg	20 mg/kg	CM-SD, the lowest dosage	M101∼M120

SCP: scopolamine, CM-SD: curcumin spray dry powder..

시험물질의 투여

제조한 CM-SD를 10, 20, 40 mg/mL 농도로 멸균 증류수에 용해시켜 10 mg/kg의 용량(20, 40, 80 mg/kg)으로 금속제 존대가 부착된 1 mL 주사기를 이용하여 매일 1회씩 28일간 강제 경구투여하였으며, tacrine hydrochloride(Sigma-Aldrich) 1 mg/mL 농도로 멸균 증류수에 용해시킨 다음 10 mL/kg의 용량(10 mg/kg)으로 강제 경구투여하였다. 정상 SCP 대조군에서는 동일한 투여 및 보정 스트레스를 가하기 위해 실험물질 대신 멸균 증류수만 동일한 방법으로 동일한 기간에 강제 경구투여하였다(Table 1, Fig. 1).

Fig 1. In vivo experimental designs used in this study. Male C57BL/6NCrljOri mice were selected as six groups (20 mice in each groups, total 120 mice). Curcumin spray powder was orally administered to mice whose memory was impaired by scopolamine intraperitoneal treatment (1 mg/kg) once a day at concentrations of 20, 40, and 80 mg/kg for 28 days. In addition, tacrine was also dissolved in distilled water as 1 mg/mL concentrations and also orally administered in a volume of 10 mL/kg, as equivalence to 10 mg/kg, once a day for 28 days.

SCP를 이용한 기억력 장애 유발

이전의 연구에 따라(Lee 등, 2014; Kim 등, 2018; Hu 등, 2019) SCP hydrobromide를 생리식염수에 0.1 mg/mL의 농도로 용해시킨 다음 약물 투여 시작 후 7, 14 및 28일에 약물 투여 1시간 후 각각 10 mL/kg의 용량(1 mg/kg)으로 26 G needle이 부착된 1 mL 주사기를 이용하여 우측 하복부에 복강 주사하여 기억력 장애를 유발하였다. 정상 매체 대조군에는 동일한 투여 및 보정 스트레스를 가하기 위해 SCP 용액 대신 동일한 용량의 멸균 생리식염수만 동일한 방법으로 동일한 기간에 복강 투여하였다.

체중 측정

체중의 변화는 최초 약물 투여 1일 전과 최초로 tacrine hydrochloride 또는 CM-SD 분말을 투여한 후 1, 6, 13, 20, 27 및 28일에 자동전자저울(XB320M, Precisa Instrument, Dietkon, Switzland)을 이용하여 측정하였다. 실험동물의 차이를 줄이기 위해서 28일의 실험 기간에 체중 증가량은 아래의 식으로 계산하였다.

체중 계산식＝28번째 약물 투여로부터 24시간이 지난 후의 몸무게－첫 번째 약물 투여 날의 몸무게

수동회피실험(Passive avoidance task test)

수동회피실험은 실험물질의 학습, 기억력 저장 및 활용의 3단계를 평가하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 신경학적 행동실험 중 하나로 이용되고 있다(Chuong 등, 2014; Hu 등, 2019; LeDoux, 1993). 수동회피실험을 위해 빛/소음 시설과 전기가 들어오는 바닥이 설치된 2개의 분리된 상자로 구성된 실험 장치(Cat NO. 7550, Coulbourn Instruments, Selangor, Malaysia)를 사용하여 실험을 진행하였다. SCP hydrobromide 처리 30분 후 실험을 진행하였으며, 각각의 마우스들을 실험 장치 박스의 빛/소음 시설에 넣는다. 15초 후 빛과 소음이 장치에 적용되고 마우스가 인접한 바닥의 박스를 탈출할 때까지 지속한다. 마우스가 인접한 바닥의 박스로 탈출하면 두 구획 사이의 문이 닫히게 되고 전기자극(3.0 mA, 3 s)이 바닥에 가해진다. 위와 동일한 조건으로 훈련검사(training test) 시행 후 24시간 후에 기억력 검사(retention test)를 시행하였다. 박스 간의 이동 시간은 체류잠복기(step-through latency time)로 기록되었고, 300초를 최대 상한선으로 제한하여 시행하였다.

모리스 수중미로실험(Morris water-maze test)

수중미로실험 역시 인지기능 개선을 평가하기 위해 가장 흔히 이용되는 행동학적 검사 중 하나로(Morris, 1984), 실험동물의 인지 장애 시 물이 채워진 수조에서 탈출 플랫폼을 찾아가는 탈출잠복기(escape latency time)가 현저히 증가하는 점에 착안하여 기억력 개선 효과를 평가하는 행동학적 평가이며, 특히 반복적인 시도에서 인지 장애를 나타내는 실험동물의 탈출잠복기는 더욱 증가하므로 장기 기억력 평가에 주로 이용되고 있다(Roof 등, 2001). 모리스 수중미로실험은 모리스의 방법에 따라 실험하였고, Hung 등(2008)의 방법에 따라 수정하였다. 이 실험은 원형 수조(지름 100 cm, 높이 37 cm)에 수심 27 cm, 온도 22°C의 물을 채워 진행하였다. 탈출 플랫폼(지름 10 cm)은 수조의 사분면 중 하나의 수면 아래 침수시켜 설치하였다. SCP hydrobromide 처리 30분 후 training test를 진행하였다. 각각의 마우스를 물에 빠뜨려서 탈출 플랫폼으로 탈출하는 것을 관찰하였으며, 전체 과정은 비디오 추적시스템(Smart Junior, PanLab, Barcelona, Spain)으로 관찰하였다. 마우스가 탈출 플랫폼에 성공적으로 도달했을 때 10초 동안 플랫폼 위에 머물도록 한다. 그러나 마우스가 150초 내로 플랫폼에 도달하지 못하면 플랫폼 위로 옮겨져서 10초 동안 머물게 한다. Retention test는 training test 시행 24시간 후에 위와 동일한 조건으로 진행하였다. 마우스가 물에서 탈출 플랫폼에 도달하는 데까지 걸리는 시간을 측정했으며, 최대 제한 시간을 300초로 한정하여 기록하였다. 이 실험은 초기 시험물질 투여 29일째 SCP hydrobromide 처리 24시간 후에 진행하였다. 또한 수동회피실험의 동물과는 분리하여 진행하였다.

ACh 및 AChE 활성 측정

수동회피실험을 완료한 마우스를 설치류 인공호흡기(Model 687, Harvard Apparatus, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 흡입마취 후 뇌 조직을 적출하였다. 해마 부위를 분리하고 분석이 끝날 때까지 -150°C(Ultradeep Freezer, MDF-1156, Sanyo, Tokyo, Japan)로 냉동하였다. 분리된 해마의 무게를 측정한 후 차가운 0.01 M HCl(pH 7.4)에 bead beater(TacoTMPre, GeneReserch Biotechnology Corp., Taichung, Taiwan)와 Ultrasonic cell disruptor(KS-750, Madell Technology Corp., Ontario, CA, USA)를 이용하여 균질화했으며, 12,000×g로 15분간 원심분리하였다. ACh 함량과 AChE 활성도를 측정하기 위해 Amplex Red ACh/AChE assay kit(Cat No. A12217, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)을 사용하였다. Working solution으로 2 U/mL horseradish peroxidase와 0.2 U/mL choline oxidase를 함유한 400 μM AmplexRed를 사용하였다. CM-SD가 조직에서 ACh 함량 및 AChE 활성에 미치는 영향을 측정하기 위해 100 U/mL의 AChE와 100 μM의 ACh를 각각 첨가하였다. 반응은 100 μL의 working solution이 microplate wells의 샘플에 가해졌을 때 시작되었다. 각각의 샘플에서 방출된 형광 발광은 VersaMax ELISA microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정했으며, 560 nm의 여기파장(excitation wavelength)과 590 nm의 발광파장(emission wavelength)이 사용되었다. 배경의 형광 발광은 negative control에서 축출한 값을 빼서 제외하였다.

RT-PCR을 이용한 ChAT 및 기억 관련 유전자 mRNA 발현

ChAT는 ACh의 합성을 담당하므로 중추 및 말초 신경계의 콜린성 신경원의 활성에 AChE와 반대의 측면에서 매우 중요한 지표로 이용되고 있다(Oda, 1999). 즉, ChAT의 활성은 인지 장애와 직접 연관되어 고령 인구에서 현저히 감소한다(Zambrzycka 등, 2002). BDNF는 기억의 저장 및 활용에 직접 관련된 영양 인자(neurotrophic factor)로 학습 및 기억력에 관여하는 다양한 세포 내 신호전달 체계를 통해 PI3K/Akt 및 ERK/mitogen-activated protein kinase(MAPK) 경로를 포함한 하위 신호전달 체계의 자극은 해마 부위의 기억력 관련 유전자 CaMK IV와 CREB의 발현을 증가시켜 인지기능을 증가시킨다(Lin 등, 2014; Wu 등, 2008; Callaghan과 Kelly, 2012; Kim 등, 2018; Brouillette 등, 2007; Wattanathorn 등, 2011). SCP는 BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK IV 등의 기억력 관련 유전자들의 발현을 해마 부위에서 현저히 억제하여 기억력 장애를 초래하는 것으로 알려져 있다(Chuong 등, 2014; Bartus 등, 1982; Lee 등, 2014; Hu 등, 2019).

RNA는 수동회피실험 종료 후 마우스로부터 취한 해마 조직에서 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 추출하였다. RNA의 농도 및 품질은 CFX96TM 실시간 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 측정하였으며, 오염된 DNA를 제거하기 위해 시료들은 재조합형 DNase I(DNA-free; Ambion, Austin, TX, USA)으로 처리하였다. RNA는 매뉴얼에 따라 reagent High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)을 이용하여 역전사하였다. ABI Step One Plus Sequence Detection System(Applied Biosystem)을 이용하여 정상 대조군에 대한 발현 수준을 계산하고 분석을 진행하였다. PCR 증폭은 94°C에서 10분, 94°C에서 15초간 35 cycle, 57°C에서 20초, 72°C에서 30초로 시행하였다. ChAT의 발현 수치는 β-actin RNA를 내부 대조군으로 사용하여 정상군과 비교한 수치를 백분율로 계산하였다(Schmittgen과 Livak, 2008). PCR oligonucleotide primer는 Table 2와 같이 나열하였다. 정량적 분석을 위해 대조군으로 정상 대조군의 대동맥 조직을 사용하였고, 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 ChAT, BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK IV의 상대적 발현을 계산하였다(Livak과 Schmittgen, 2001).

Table 2 . Oligonucleotides for realtime RT-PCR used in this study.

Target	5’－3’	Sequence	NCBI accession number
ChAT	Sense	CTTGGATGGTCCAGGCAC	NM_009891
	Antisense	GTCATACCAACGATTCGCTCC
BDNF	Sense	GACAAGGCAACTTGGCCTAC	NM_007540
	Antisense	CTGTCACACACGCTCAGCTC
PI3K	Sense	TCCAAATACCAGCAGGATCA	NM_001024955
	Antisense	ATGCTTCGATAGCCGTTCTT
Akt	Sense	TACTCATTCCAGACCCACGA	NM_009652
	Antisense	GAGGTTCTCCAGCTTCAGGT
ERK1	Sense	TGGCTTTCTGACGGAGTATG	NM_011952
	Antisense	GGTCCAGGTAGTGCTTGC
ERK2	Sense	CCTCAAGCCTTCCAACCTC	NM_011949
	Antisense	GCCCACAGACCAAATATCAATG
CREB	Sense	TACCCAGGGAGGAGCAATAC	NM_009952
	Antisense	GAGGCAGCTTGAACAACAAC
CaMK IV	Sense	AAATCAGCCTGGTCCTTGAG	NM_009793
	Antisense	GAAGCATTTGCGGTGCACGATG
β-Actin	Sense	GCTGAGAGGGAAATCGTGCGT	NM_007393
	Antisense	TCTGGTTTGAGGTCACGATG

대뇌피질의 항산화 방어 시스템

자유라디칼은 외인성 물질의 자극 또는 세포 대사의 결과 생산되는 독성물질로, 연령이 증가함에 따라 생산량이 급격히 증가하는 것으로 알려져 있고(Wattanathorn 등, 2011), 뇌에서 이들 자유라디칼은 다양한 분자들과 반응하여 신경 변성과 기억력 장애를 초래한다(Rao, 2009). 현재 AD의 인지기능 장애 약시 산화스트레스가 매우 중요한 병인으로 부각되고 있다(Ghumatkar 등, 2015). 즉, AD 환자에서 내인성 항산화제, glutathione(GSH), catalase(CAT) 및 superoxidedismutase(SOD)의 감소에 따른 지질과산화, malonidialdehyde(MDA)의 증가는 신경세포 내 당화를 더욱 증가시키고, 신경섬유다발(neurofibrillary tangles) 내 peroxynitrite 및 hemeoxygenase-1과 같은 물질의 축적을 일으켜 최종적으로 노인반(senile plaques)을 형성하는 것으로 알려져 있다(Ghumatkar 등, 2015; Kumar 등, 2012). 특히 뇌 조직은 에너지 요구량이 매우 높은 조직으로 산화스트레스에 더욱 민감하여 다른 조직에 비해 지질과산화, 반응성 산소류(reactive oxygen species; ROS)의 형성, 철 이온의 이화, 항산화제의 고갈이 더욱 쉽게 발생하고(Nunomura 등, 2001), 학습 및 기억력 형성에 중요한 역할을 하는 대뇌 기저핵 및 편도핵이 특히 산화스트레스에 민감한 것으로 알려져 있다(Mattson 등, 1999). 따라서 산화스트레스 및 항산화 방어 시스템의 불균형은 다양한 신경 변성 질환의 직접적인 병인으로 작용한다(Ghumatkar 등, 2015). 이 중 미토콘드리아의 장애는 다양한 ROS를 유리하여 노화 및 신경병성 질환을 발생시키며, 특히 AD와 같은 퇴행성 질환에서 지적장애, 기억력 감퇴를 초래하는 것으로 알려져 있다(Swerdlow, 2011). 또한, SCP 역시 심각한 항산화 방어 시스템의 장애를 초래하여 지질과산화의 증가를 일으키고 AD와 유사한 병증을 야기한다(Hu 등, 2019; Nam과 Lee, 2014; Ghumatkar 등, 2015; Lee 등, 2015). 지질과산화에 의해 형성되는 다양한 독성물질은 주변 조직의 파괴를 수반하고(Comporti, 1985; Mansoorali 등, 2012), 산화스트레스는 뇌 손상을 유발하는 중요한 원인 중 하나로 간주되어 왔다(Rao, 2009; Zhan과 Yang, 2006). GSH는 대표적인 내인성 항산화제로 낮은 농도에서도 과도한 ROS을 제거한다(Odabasoglu 등, 2006). 또한 SOD는 대표적인 내인성 항산화 효소로 뇌 조직에서도 항산화 방어 시스템의 근간을 이루는 중요한 효소(Hu 등, 2019; Zhan과 Yang, 2006; Hu 등, 2012)이며, CAT 역시 과산화물인 H₂O₂를 무해한 H₂O로 분해하는 대표적인 내인성 항산화제의 일종이다(Cheeseman과 Slater, 1993).

모리스 수중미로실험이 끝난 28일째 마우스들은 흡입마취 후 희생되었다. 피질을 제거하고 MDA 및 GSH 함량, CAT 및 SOD 효소 활성도를 각각 측정하여 대뇌 항산화 방어 시스템을 관찰하였다. 분리된 대뇌피질의 무게를 측정한 후, 0.1 M MEDTA(pH 7.4), 10 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl이 들어간 완충용액으로 균질화하였으며, 12,000×g로 15분간 원심분리하였다. 대뇌 지질과산화 농도는 UV/VIS 분광광도계(OPTIZEN POP, Mecasys, Daejeon, Korea)를 이용하여 nM of MDA/g으로 흡광도 525 nm에서 thiobarbituric acid test를 이용하여 측정하였다(Jamall과 Smith, 1985). 총단백질량은 bovine serum albumin(Invitrogen)을 표준물질로 사용하여 이전 방법(Lowry 등, 1951)에 따라 측정하였다. GSH 함량 측정을 위해 준비된 sample을 25% trichloroacetic acid 0.1 mL(Merk, San Francisco, CA, USA)와 혼합한 후 40분 동안 4°C의 온도에서 4,200 rpm으로 원심분리하였다. GSH 함량은 2-nitrobenzoic acid(Sigma-Aldrich)를 사용하여 nM/mg 단백질량으로 흡광도 412 nm에서 측정하였다(Sedlak과 Lindsay, 1968). 과산화수소의 분해는 CAT의 처리하에 240 nm에서 측정하였다(Aebi, 1974). CAT 활성은 25°C 및 pH 7.8에서 분당 1 nM의 과산화수소를 분해하는 데 필요한 효소의 양으로 정의되었다. SOD 활성도 측정은 이전의 방법(Sun 등, 1988)에 따라 진행되었으며, SOD 추정치는 nitrotetrazolium blue와 반응하여 formazan 염료를 형성하는 xanthine과 xanthine oxidase에서 생성되는 superoxide radicals의 형성에 기초하였다. SOD 활성은 이 과정을 방해하는 정도에 따라 560 nm에서 측정되는데 U/mg으로 단백질량을 표현하였다. SOD 효소 활성도의 단위는 초기 nitroblue tetrazolium 흡광도를 1분당 50% 감소시키는 효소의 양과 같다.

통계분석

모든 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 다른 용량의 그룹에 대해서는 다중 비교 테스트를 시행하였다. 분산의 동질성은 Levene test를 이용해 이루어졌다(Levene, 1981). Levene test에서 분산의 동질성에서 유의성이 나타나지 않으면, 데이터는 그룹 간의 유의성을 측정하기 위해 ANOVA test 후 Tukey’s Honest Significant Difference로 검증하였다. Levene test에서 분산의 동질성에 유의한 편향이 있을 경우를 대비하여, 비모수 검증법인 Kruskal-Wallis H test를 시행하였다. Kruskal-Wallis H test를 사용하여 유의성이 관찰되면 Mann-Whitney test로 그룹 간의 유의성을 관찰하였다. 모든 통계처리는 SPSS for Windows(Release 14.0K, IBM SPSS Inc., Armonk, NY, USA)를 이용하여 평가하였다(Ludbrook, 1997).

체중의 변화

정상 매체 대조군에 비해 체중 및 28일간의 투여 기간에 증체량의 변화는 모든 SCP 처리군에서 유의하거나 의미 있는 변화는 없었다. SCP 대조군에 비해 체중 및 증체량의 변화 역시 모든 실험물질인 tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서 실험 전 기간에 걸쳐 유의하거나 의미 있는 변화는 없었다(Table 3, Fig. 2).

Table 3 . Changes on body weight gains in intact or SCP-induced memory impairment mice.

Groups	Body weights (g) after initial test substance treatment			Body weight gains
	1 day before	0 day1) [A]	28 days [B]	[B－A]
Intact vehicle control	21.58±1.03	19.54±0.99	23.83±1.19	4.29±0.52
SCP control	21.57±1.04	19.53±1.12	23.78±1.16	4.25±0.56
Tacrine	21.56±0.98	19.49±1.10	23.50±1.42	4.02±0.71
CM-SD 20 mg/kg	21.55±0.94	19.49±1.00	23.94±0.93	4.45±0.51
CM-SD 40 mg/kg	21.58±1.17	19.60±1.21	24.00±1.37	4.40±0.35
CM-SD 80 mg/kg	21.56±1.11	19.47±1.18	23.80±1.19	4.34±0.30

Values are expressed as mean±SD of 20 mice..

Tacrine was administrated at a dose level of 10 mg/kg..

Day 0 means the day of initial test article administration..

SCP: scopolamine, CM-SD: curcumin spray dry powder..

¹⁾All animals were overnight fasted..

Fig 2. Body weight changes in intact or scopolamine (SCP)-induced memory impairment mice. No significant or meaningful changes on the body weight and gains during 28 days of experimental periods were detected in all SCP treated mice as compared with intact vehicle control mice, and also no noticeable changes on the body weight gains were detected in all three different dosages of curcumin spray dry powder (CM-SD) 20, 40, and 80 mg/kg treated mice as compared to those of SCP control mice, and also in tacrine 10 mg/kg treated mice respectively. Values are expressed as mean±SD of 10 mice. Day 0 means the day of initial test article administration. SCP was intraperitoneally treated at 1 h after the 7, 14, and 28th test substance administration. All animals were overnight fasted before initial test substance administrations.

투여 기간의 증체량은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -0.93%의 변화를 나타내었고, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 -5.53, 2.00, 3.53 및 4.71%의 변화를 나타내었다. 따라서 적어도 본 시험의 조건으로 SCP 및 tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 또는 80 mg/kg 28일 반복 경구투여는 C57BL/6 마우스의 체중 변화에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.

수동회피실험 결과

SCP 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(P<0.01) 밝은 방에서의 체류시간 즉, 체류잠복기의 감소가 인정되었으나, tacrine 10 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 SCP 대조군보다 체류잠복기의 현저한 증가가 각각 인정되었고, 특히 세 용량의 모든 CM-SD 투여군에서는 명확한 투여 용량 의존적인 체류잠복기의 증가가 인정되었으며, CM-SD 40 mg/kg 투여군에서는 tacrine 10 mg/kg과 비교할만한 SCP 유발 체류잠복기 감소 억제 효과를 나타내었다(Fig. 3). 체류잠복기는 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -73.87%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 179.23, 39.52, 179.44 및 226.01%의 변화를 나타내었다.

Fig 3. Changes on the step-through latency times of passive avoidance task test in intact or scopolamine (SCP)-induced memory impairment mice. Significant decreases of the step-through latency times were detected in SCP control mice as compared with intact vehicle control mice. However, dramatic increases of step-through latency times were detected in all test material administered mice including tacrine 10 mg/kg, as compared to those of SCP control mice, respectively. Especially, all three different dosages of curcumin spray dry powder (CM-SD) showed dose-dependent favorable effects on the passive avoidance task test as comparable to those of tacrine 10 mg/kg at an oral dose level of 40 mg/kg, in this behavior test. Values are expressed as mean±SD of 10 mice. ^aP<0.01 and ^bP<0.05 as compared with intact vehicle control by Mann-Whitney (MW) test. ^cP<0.01 as compared with SCP control by MW test.

아밀로이드 베타(amyloid beta) 1-42를 처리한 쥐의 뇌 손상을 일으킨 상태에서 강황 추출물을 처리한 결과, 수동회피실험과 수중미로실험에서 개선된 결과를 보였다는 Lee 등(2015)의 연구와 강황과 강황의 주요 성분인 curcumin과 curcuminoid의 인지기능 개선 효과를 나타낸 연구(Eun 등, 2017; Ahmed와 Gilani, 2009)와 같은 결과를 보이는 것으로 보아, 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건으로 SCP 유발 기억력 장애 C57BL/6 마우스 모델에 대해 CM-SD 40 mg/kg의 투여 용량에서 tacrine 10 mg/kg과 비교할만한 정도의 기억력 개선 효과를 나타내는 확실한 증거 중 하나로 판단된다.

수중미로실험 결과

CM-SD의 기억력 개선 효과를 평가하기 위해 수동회피 실험과 별도로 준비된 실험동물에서 수중미로실험을 수행한 결과, SCP 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는(P<0.01) 탈출 플랫폼을 찾아가는 탈출잠복기의 증가가 있었으나, CM-SD 80 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 유의성 있는(P<0.01) 탈출잠복기의 감소가 각각 있었고, 특히 세 용량의 모든 CM- SD 투여군에서는 명확한 용량 의존적인 탈출잠복기의 감소 효과가 있었으며, CM-SD 40 mg/kg 투여군에서는 tacrine 10 mg/kg과 비교할만한 SCP 유발 탈출잠복기 증가 억제 효과를 나타내었다(Fig. 4). 탈출잠복기는 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 241.98%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 -50.90, -29.89, -50.25 및 -58.99%의 변화를 나타내었다.

Fig 4. Changes on the escape latency times of morris water maze test in intact or scopolamine (SCP)-induced memory impairment mice. Significant increases of the escape latency times were detected in SCP control mice as compared to those of intact vehicle control mice. However, significant decreases of escape latency times were detected in all test substance administered mice including curcumin spray dry powder (CM-SD) 80 mg/kg as compared to those of SCP control mice, respectively. Especially, all three different dosages of CM-SD showed dose-dependent favorable effects on the Morris water maze test as comparable to those of tacrine 10 mg/kg at an oral dose level of 40 mg/kg, in the current behavior test. Values are expressed as mean±SD of 10 mice. ^aP<0.01 as compared with intact vehicle control by Tukey’s honest significant difference (THSD) test. ^bP<0.01 as compared with SCP control by THSD test.

아밀로이드 베타 1-42를 처리한 쥐의 뇌 손상을 일으킨 상태에서 강황 추출물을 처리한 결과, 수동회피실험과 수중미로실험에서 개선된 결과를 보였다는 Zhang 등(2015)의 연구와 강황과 강황의 주요 성분인 curcumin과 curcuminoid의 인지기능 개선 효과를 나타낸 연구(Eun 등, 2017; Ahmed와 Gilani, 2009)와 같은 결과를 보이는 것으로 보아, 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건으로 SCP 유발 기억력 장애 C57BL/6 마우스 모델에 대해 CM-SD 40 mg/kg의 투여 용량에서 tacrine 10 mg/kg과 비교할만한 정도의 기억력 개선 효과를 나타내는 확실한 증거 중 하나로 판단된다.

해마 조직 내 ACh 함량 및 AChE 활성의 변화

SCP 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 해마 조직 내 유의성 있는(P<0.01) ACh 함량의 감소와 AChE 활성의 증가가 각각 있었으나, CM-SD 40 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 해마 조직 내 유의성 있는(P<0.01) ACh 함량의 증가와 AChE 활성의 감소가 각각 있었고 특히 세 용량의 모든 CM-SD 투여군에서는 명확한 투여 용량 의존적인 해마 조직 내 ACh 함량 증가와 AChE 활성 감소가 있었으며, CM-SD 40 mg/kg 투여군에서는 tacrine 10 mg/kg과 비교할만한 SCP 유발 해마 조직 내 ACh 함량 감소 및 AChE 활성 증가 억제 효과를 각각 나타내었다(Fig. 5, 6).

Fig 5. Changes on the hippocampus acetylcholine (ACh) contents in intact or scopolamine (SCP)-induced memory impairment mice. In SCP control mice, significant decreases of hippocampus ACh contents were observed as compared with intact vehicle control mice, however, significant increases of the hippocampus ACh contents were detected in all test substance administered mice including curcumin spray dry powder (CM-SD) 40 mg/kg as compared to those of SCP control mice, respectively. Especially, all three different dosages of CM-SD showed dose- dependent favorable inhibitory effects on the SCP-induced hippocampal ACh content decreases as comparable to those of tacrine 10 mg/kg at an oral dose level of 40 mg/kg, in the present measurement. Values are expressed as mean±SD of 10 mice. ^aP<0.01 as compared with intact vehicle control by Tukey’s honest significant difference (THSD) test. ^bP<0.01 as compared with SCP control by THSD test.

Fig 6. Changes on the hippocampus acetylcholinesterase (AChE) activities in intact or scopolamine (SCP)-induced memory impairment mice. In SCP control mice, significant increases of AChE activities were observed as compared with intact vehicle control mice, however, significant decreases of AChE activities were detected in all test substance administered mice including curcumin spray dry powder (CM-SD) 40 mg/kg as compared to those of SCP control mice, respectively. Especially, all three different dosages of CM-SD showed dose-dependent favorable inhibitory effects on the SCP-induced hippocampal AChE activity increases as comparable to those of tacrine 10 mg/kg at an oral dose level of 40 mg/kg, in the current measurement. Values are expressed as mean±SD of 10 mice. ^aP<0.01 as compared with intact vehicle control by Mann-Whitney (MW) test. ^bP<0.01 as compared with SCP control by MW test.

해마 조직 내 ACh 함량은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -71.72%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 125.18, 83.81, 121.94 및 174.10%의 변화를 나타내었다. 해마 조직 내 AChE 활성은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 158.47%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 -42.56, -31.54, -41.77 및 -53.18%의 변화를 나타내었다. AChE 억제제는 대부분 알칼로이드류에 속하는 천연물에서 유래되는데(Chuong 등, 2014; Nam과 Lee, 2014), 계속해서 부작용이 적은 천연 AChE 억제제를 찾는 연구를 활발히 하고 있다.

뇌 조직 내 콜린계의 활성 감소는 기억력 저하의 중요한 원인 중의 하나로, 뇌 조직 신경세포에서 choline과 acetyl CoA는 ChAT에 의해 ACh로 합성이 된다(Blusztajn과 Wurtman, 1983). Ach는 중추와 말초에서 타이밍, 주의력, 학습력, 기억력을 포함한 복합적인 인지과정에 관여한다(Brandon 등, 2004). 따라서 시냅스 간극으로 분출되어 ACh가 감소하는 콜린성 신경은 학습과 기억장애를 야기한다(Mohapel 등, 2005). 또한, 나이가 들어감에 따라 인지기능 장애가 현저하게 나타나는 변화 중 하나는 뇌의 해마 및 대뇌피질에서 ACh의 감소이다. ACh는 AChE에 의해 acetate와 choline으로 분해되는데, 이 과정에서 계속된 AChE의 작용으로 ACh의 양이 감소하면 기억력 저하가 일어난다(Choi 등, 2004). ChAT는 중추와 말초 신경계에서 콜린성 뉴런 기능의 가장 중요한 특이 지표이다(Oda, 1999). ChAT의 활동은 노화된 뇌에서 강하게 줄어든다. 그리고 감퇴와 비활동성의 정도는 인지기능 손상의 심각도와 관련된다(Zambrzycka 등, 2002).

본 연구에서는 CM-SD가 SCP에 의해 유도된 기억력손상 C57BL/6 마우스에서 ChAT mRNA, ACh와 AChE 활성도가 증가하는 것이 확인되었으며, 특히 40 mg/kg 이상에서는 tacrine 10 mg/kg 경구 투여군보다 증가 효과를 보이는 것을 확인하였다. 이는 해마의 ACh 함량, ChAT mRNA의 감소, AChE 활성도의 상승과 관련이 있었다.

해마 조직 내 ChAT 및 기억력 관련 유전자 발현 변화

SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 해마 조직 내 유의성 있는(P<0.01) ChAT, BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK IV mRNA 발현 감소가 각각 있었으나, CM-SD 20 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 해마 조직 내 ChAT 및 기억력 관련 유전자(BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK Ⅳ) mRNA 발현의 현저한 증가가 각각 있었고, 특히 세 용량의 모든 CM-SD 투여군에서는 해마 조직 내 ChAT, BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK IV mRNA의 용량 의존적인 증가가 있었으며, CM-SD 40 mg/kg 투여군에서는 항상 일관성 있게 tacrine 10 mg/kg과 비교할만한 SCP 유발 해마 조직 내 ChAT, BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK IV mRNA 발현 감소 억제 효과를 각각 나타내었다(Fig. 7).

Fig 7. Change on the hippocampal ChAT and novel memory susceptibility gene mRNA expressions in intact or scopolamine (SCP)-induced memory impairment mice, realtime RT-PCR analysis. Significant and dose-dependent increase of the hippocampus (A) ChAT, (B) BDNF, (C) PI3K, (D) Akt, (E) ERK1, (F) ERK2, (G) CREB, (H) CaMK mRNA expressions were demonstrated in all three different dosages of curcumin spray dry powder (CM-SD) treated mice as compared with SCP control mice, respectively. Tacrine was administrated at a dose level of 10 mg/kg. Values are expressed as mean±SD of mice. ^aP<0.01 as compared with intact vehicle control by THSD test. ^dP<0.01 as compared with intact vehicle control by MW test. ^bP<0.01 and ^cP<0.05 as compared with SCP control by THSD test. ^eP<0.01 as compared with SCP control by MW test. ChAT, choline acetyltransferase; BDNF, brain-derived neurotrophic factor; PI3K, phosphoinositide 3-kinase; Akt, protein kinase B; ERK, extracellular signal-regulated kinase; CREB, cAMP response element-binding protein; CaMK, calcium/calmodulin-dependent protein kinase.

해마 조직 내 ChAT mRNA 발현은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -64.33%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 67.13, 39.33, 65.73 및 100.28%의 변화를 나타내었다. 해마 조직 내 BDNF mRNA 발현은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -68.86%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 90.38, 42.95, 86.22 및 116.67%의 변화를 나타내었다. 해마 조직 내 PI3K mRNA 발현은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -71.27%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 63.76, 37.98, 71.78 및 114.29%의 변화를 나타내었다. 해마 조직 내 Akt mRNA 발현은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -68.28%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 83.91, 36.91, 80.76 및 117.35%의 변화를 나타내었다.

해마 조직 내 ERK1 mRNA 발현은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -72.58%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 89.09, 54.55, 85.09 및 125.82%의 변화를 나타내었다. 해마 조직 내 ERK2 mRNA 발현은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -77.08%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 127.71, 55.41, 126.41 및 181.39%의 변화를 나타내었다. 해마 조직 내 CREB mRNA 발현은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -67.86%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 66.77, 36.65, 63.04 및 101.55 %의 변화를 나타내었다. 해마 조직 내 CaMK IV mRNA 발현은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -72.00%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 79.64, 45.71, 75.36 및 122.14%의 변화를 나타내었다.

BDNF는 기억의 저장 및 활용에 직접적으로 관련된 영양 인자(Kim 등, 2018; Callaghan과 Kelly, 2012)로, 학습 및 기억력에 관여하는 다양한 세포 내 신호전달 체계를 자극한다(Callaghan과 Kelly, 2012). BDNF에 의한 PI3K/Akt 및 ERK/MAPK 경로를 포함한 하위 신호전달 체계의 자극은 CREB의 발현을 증가시켜 인지기능을 증가시킨다(Lin 등, 2014; Wu 등, 2008). 이와 함께 CaMK IV 역시 해마 부위의 기억력 관련 유전자로 활용되고 있다(Brouillette 등, 2007; Wattanathorn 등, 2011).

BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK IV 등의 기억력 관련 유전자들의 발현을 해마 부위에서 현저히 억제하여 기억력 장애를 초래하는 것으로 알려진 SCP(Chuong 등, 2014; Bartus 등, 1982; Lee 등, 2014; Hu 등, 2019)의 처리에 의한 마우스에 CM-SD는 BDNF, PI3K, Akt, ERK1, ERK2, CREB, CaMK 등의 증가를 통한 온전한 신경세포로의 신경회로의 시냅스 후 전기반응성과 세포생존성을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.

대뇌피질 지질과산화 및 내인성 항산화 방어 시스템의 변화

SCP 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 대뇌피질 조직 내 유의성 있는(P<0.01) MDA 함량, 지질과산화의 증가와 내인성 항산화제 GSH, 내인성 항산화 효소 SOD 및 CAT 활성의 감소가 각각 있었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 대뇌피질 조직 내 유의성 있는(P<0.01) MDA 함량의 감소와 GSH 함량, SOD 및 CAT 활성의 증가가 각각 있었고 특히 세 용량의 모든 CM-SD 투여군에서는 대뇌피질 조직 내 명확한 투여 용량 의존적인 MDA 함량의 감소와 GSH 함량, SOD 및 CAT 활성의 증가가 있었으며, CM-SD 40 mg/kg 투여군에서는 tacrine 10 mg/kg과 비교할만한 SCP 유발 대뇌피질 조직 내 MDA 함량 감소, GSH 함량, SOD 및 CAT 활성 증가 효과를 항상 일관성 있게 나타내었다(Table 4).

Table 4 . Changes on cerebral cortex lipid peroxidation and antioxidant defense systems in intact or SCP-induced memory impairment mice.

Groups	Lipid peroxidation	Antioxidant defense systems
Malondialdehyde (nM/mg protein)	Glutathione (nM/mg protein)	Catalase (nM/mg protein)	SOD (U/mg protein)
Intact vehicle control	1.76±0.44	8.20±0.93	55.13±14.03	33.70±10.10
SCP control	4.77±0.64a	1.81±0.49a	7.70±2.48a	4.04±2.15a
Tacrine	3.34±0.60ab	4.32±1.11ab	21.64±6.97ab	15.35±3.19ab
CM-SD 20 mg/kg	3.86±0.26ab	2.92±0.29ab	14.54±2.49ab	10.41±1.62ab
CM-SD 40 mg/kg	3.35±0.52ab	4.29±1.07ab	23.11±5.95ab	15.66±3.46ab
CM-SD 80 mg/kg	2.62±0.40ab	5.56±1.00ab	30.93±11.50ab	20.26±6.96ab

Values are expressed as mean±SD of 10 mice..

Tacrine was administrated at a dose level of 10 mg/kg..

SCP: scopolamine, SOD: superoxide dismutase, CM-SD: curcumin spray dry powder..

^aP<0.01 as compared with intact vehicle control by Mann-Whitney (MW) test..

^bP<0.01 as compared with SCP control by MW test..

대뇌피질 조직 내 MDA 함량은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 171.33%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 -29.90, -19.16, -29.73 및 -44.99%의 변화를 나타내었다. 대뇌피질 조직 내 GSH 함량은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -77.93%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 139.03, 61.36, 137.15 및 207.08%의 변화를 나타내었다. 대뇌피질 조직 내 CAT 활성은 SCP 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -86.03%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 181.03, 88.84, 200.18 및 301.70%의 변화를 나타내었다. 대뇌피질 조직 내 SOD 활성은 SCP 대조군의 경우 정상 매체 대조군에 비해 -88.02%의 변화를 나타내었으나, tacrine 10 mg/kg, CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여군에서는 SCP 대조군에 비해 각각 280.38, 157.80, 288.06 및 401.86%의 변화를 나타내었다.

지질과산화는 지질 이중층 막의 구조를 변형시켜 세포의 기능에 영향을 주는 것으로 알려져 있고(Podloucká 등, 2013), 폴리페놀이 갖는 항산화 성질이 지질과산화 저해능에 작용하는 것으로 보고하였으며, 손상된 뇌 조직 내에서 지질과산화 및 ROS 형성의 억제와 함께 GSH 함량, SOD 및 CAT 활성의 증가는 허혈성 뇌 손상 방지에 이차적인 중요한 치료 수단으로 활용되어 왔다고 알려져 있다(Hu 등, 2019; Mansoorali 등, 2012; Zhan과 Yang, 2006; Hu 등, 2012).

본 실험 결과 SCP에서 높은 수준의 용량 의존적인 대뇌피질 조직 내 MDA 함량의 감소와 GSH 함량, SOD 및 CAT 활성의 증가가 관찰되어 천연 산화방지제로 신경세포 사멸의 원인으로 알려진 활성산소의 억제에 효과가 있을 것으로 판단된다.

AChE 억제제로 알려진 tacrine, donepezil, rivastigmine, galantamine 등은 중앙 콜린성 시냅스에서 ACh의 가용성을 증가시키는 기전으로 다양한 치매를 비롯하여 인지기능 장애의 치료에 활용되고 있으나, 복용한 30% 환자에게서 ALT 수치 상승의 부작용이 발견되었고(Watkins 등, 1994) 구역, 구토, 식욕감소, 장운동의 이상 증가 등 다양한 부작용으로 그 사용이 제한되고 있다. 기존의 실험 논문들에서 대조군인 tacrine보다 뛰어난 효능을 보이며 부작용이 낮은 약재들은 거의 없었다는 점에서 수용성 강황 추출물에 대한 이번 실험이 인지기능 개선에 도움을 주는 물질로 의의가 있다고 할 수 있다.

다양한 항산화제들 역시 AD에 대해 비교적 효과적인 기억력 개선 효과를 나타내는 것으로 알려짐에 따라 계속해서 부작용이 낮은 천연물 유래의 AD 치료제를 찾기 위한 노력이 시도되고 있고, 강황과 강황의 주요 성분인 curcumin과 curcuminoid의 인지기능 개선 효과가 이미 잘 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 인지기능 개선을 위한 천연물 유래 기능성 식품 또는 천연물 신약 소재 개발의 일환으로 아리바이오에서 개발한 신규 수용성 강황 제형인 강황 추출물(CM-SD)의 기억력 개선 효과 및 작용 기전[항산화 활성, 콜린성 신경 조절(ACh 함량 및 AChE 활성, ChAT mRNA 발현), 해마 기억력 관련 유전자(BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK Ⅳ) 발현]을 SCP 유발 기억력 장애 마우스 모델을 이용하여 평가하였다. SCP에 의해 밝은 방에서의 체류시간 즉, 체류잠복기의 현저한 감소가 수동회피실험에서 인정되었으며, 수중미로실험에서도 도피대를 찾아가는 탈출잠복기가 정상 매체 대조군에 비해 현저히 증가하였고, 최종 희생 시 해마 부위 조직 내 ACh 함량 및 ChAT mRNA 발현의 감소가 AChE 활성의 증가와 함께 인정되었으며, 기억력 관련 유전자(BDNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK Ⅳ) mRNA 감소가 일정하게 관찰되었고, 대뇌피질 내 MDA의 증가가 GSH 함량, SOD 및 CAT 활성의 저하와 함께 관찰되었다. 즉, 이전의 연구들과 유사하게 본 실험에서도 SCP에 의해 AChE 활성의 증가와 ChAT mRNA 발현의 감소에 의한 ACh의 함량 감소 및 이와 관련된 기억력 관련 유전자 발현의 감소와 대뇌피질 항산화 방어 시스템의 고갈에 의한 기억력 장애가 유발되었으나, 이러한 SCP에 의한 ACh 감소 및 이와 관련된 기억력 관련 유전자 mRNA 발현 감소와 대뇌피질 항산화 방어 시스템의 고갈에 의한 기억력 장애 소견이 CM-SD 20, 40 및 80 mg/kg 투여에 의해 용량 의존적으로 유의성 있게 현저히 억제되었으며, 특히 CM-SD 40 mg/kg은 항상 일관성 있게 tacrine 10 mg/kg 투여군과 유사한 기억력 개선 효과를 나타내었다. 따라서 적어도 본 실험의 조건하에서 콜린성 신경 활성 및 항산화 효과와 함께 이와 관련된 기억력 관련 유전자(DNF, PI3K, Akt, ERK1 및 2, CREB, CaMK IV) 발현 조절을 통해 SCP 유발 기억력 장애 C57BL/6 마우스 모델의 CM-SD 40 mg/kg에서 tacrine 10 mg/kg과 비교할만한 정도의 기억력 개선 효과를 나타내는 것으로 관찰되어, 금후 치매를 포함한 다양한 기억력 장애에 더욱 효과적인 인지기능 개선용 치료제 또는 기능성 식품 소재로서 개발 가능성이 매우 높을 것으로 기대된다.

본 연구는 2020년도 중소벤처기업부 산학연 collabo R&D 사업화 [2단계] (S2889318)에 의하여 수행된 결과이며 연구비 지원에 감사드립니다.