인간의 수명 증가와 더불어 외모에 관한 관심 증가로 피부노화를 완화하거나 지연시킬 수 있는 성분에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim과 Yoon, 2013; Kim 등, 2007). 이에 따라 단순히 외적 치장의 도구로 여겨지던 화장품은 여성의 고학력화, 사회진출 및 생활패턴 등의 변화와 맞물려 미백 활성 및 주름 개선 등 다양한 기능성이 추가된 화장품의 수요가 폭발적으로 증가하고 있다(Kim 등, 2008b).

마늘(Allium sativum L.)은 대표적인 Allium속에 속하는 다년초 식물로, 전 세계적으로 식재료, 향신료, 건강기능식품 및 의약품 소재로 널리 이용되고 있다(Aslani 등, 2016). 마늘은 다른 채소들과 달리 인, 비타민 B1, B2, 칼륨 및 미네랄 등 다양한 성분이 풍부하고 항암 효과(Yu 등, 2016), 고혈압 예방(Kim 등, 2015), 항균 작용(Choi, 2001) 및 세포의 항돌연변이 효과(Durnev, 2018) 등이 있다고 알려져 있다. 또한 마늘은 강력한 항산화 효과와 더불어 혈액 순환 및 피부의 탄력성을 증진시켜 화장품 소재로서의 가능성에 관해 연구가 이루어지고 있다(Kwon 등, 2003; Lee와 Chang, 2007).

과채류와 같은 천연물 열처리 가공은 식품의 저장성 및 품질을 향상시키기 위해 사용되고 있지만, 영양소가 파괴되거나 활성물질이 손실되는 등 문제가 발생한다. 그러나 몇몇 과채류는 열처리 시 각종 성분의 분해와 합성 등의 변화로 인해 생리활성이 증가한다고 보고되어 있다(Dewanto 등, 2002). 대표적으로 사과, 멜론, 토마토, 참외 및 수박 등 다양한 과채류를 열처리할 시 폴리페놀 및 플라보노이드와 같은 항산화 성분이 증가하며(Kim 등, 2008a), 마늘 또한 고온고압 처리 시 항산화 성분으로 알려진 폴리페놀 함량이 증가하고 이에 따라 항산화 활성이 증가한다고 알려졌지만(Lee 등, 2012), 피부 미백 활성과 주름 개선 효과 등 피부 항노화 활성에 관한 연구는 찾아보기 어려운 실정이다.

따라서 본 연구에서는 고온고압 처리한 마늘의 항산화 성분 및 항산화 활성을 평가하고 tyrosinase 저해 활성과 collagenase 저해 활성 측정을 통해 항노화 활성을 갖는 기능성 소재 개발의 기초자료로 활용하고자 하였다.

재료

본 실험에 사용된 마늘은 2021년 전남 고흥에서 생산된 저장 마늘로 2022년 3월 청주농수산물시장에서 구매하였다. 마늘의 크기가 균일한 시료를 선별하여 세척한 후 고온고압 처리장치 내부 용기에 50 g씩 담아 밀봉한 후 열처리를 진행하였다. 이후 -20°C에 저장하면서 분석 시료로 사용하였다.

고온고압 처리

마늘의 열처리를 위해 사용된 고온고압 처리장치는 20 kg/cm2의 압력을 견딜 수 있도록 제작한(Model HR-8200, Jisico, Seoul, Korea) 것으로 가열에 의해 증기압을 발생시키는 외부 용기, 시료를 넣는 내부 용기, 공기배출구와 안전변 및 압력게이지로 구성되어 있다. 세척한 마늘 50 g을 직접적인 열전달에 의한 시료의 탄화를 방지하기 위하여 내부 용기에 넣고 밀봉한 후 일정량의 물이 첨가된 외부 용기에 넣고 뚜껑을 밀봉하여 130°C에서 2시간 동안 처리하였다.

추출물 제조 및 용매 분획

마늘 추출물 제조는 열처리된 마늘 50 g에 80% 에탄올 1,500 mL를 가하고 상온에서 24시간 동안 추출한 다음 감압 여과하였다. 이후 회전진공농축기(EYELA N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 40°C에서 용매를 제거한 다음 Kulkarni 등(2004)의 방법에 따라 순차적 용매 분획을 실시하였다. 즉, 추출 농축물을 증류수로 현탁시킨 후 용매 극성별로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 수포화 부탄올 순으로 각 용매당 150 mL씩 3회 용매 분획한 다음 회전진공농축기(EYELA N-1000, EYELA)를 사용하여 40°C에서 용매를 제거하고 동결건조(Freeze Dryer, FD5508, Ilshin Lab Co., Ltd., Dongducheon, Korea)한 다음 -80°C에서 저장하면서 시료로 사용하였다. 동결건조한 시료는 항산화 및 효소 실험에서 용매에 의한 영향을 최소화하기 위해 80% 에탄올에 고농도로 재용해한 후 증류수로 희석하여 실험에 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

고온고압 처리 마늘의 총 폴리페놀 함량은 Jo 등(2021)의 방법으로 측정하였다. 즉, 시료에 polyphenol compounds가 존재할 때 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent와 반응하여 환원 시 몰리브덴 청색으로 발색하는 원리를 이용하였다. 즉, 1 mg/mL의 농도로 조절된 추출물 50 µL에 2% Na₂CO₃를 1 mL 가하여 3분간 방치하였다. 이후 50% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 시약 50 µL를 첨가하여 30분간 반응시킨 후 분광광도계(Epoch microplate spectrophotometer, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 750 nm의 흡광도에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 1, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.0625 mg/mL 농도로 희석하여 사용하였다. 이후 검량선을 작성하여 시료의 총 폴리페놀 함량을 추출물 1 g당 mg gallic acid로 표현하였다.

ABTS 및 DPPH에 의한 라디칼 소거 활성 측정

고온고압 처리 마늘의 항산화력 평가를 위해 ABTS[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 라디칼 소거 활성을 Hwang 등(2011)의 방법을 이용하여 측정하였다. 즉 7 mM의 농도로 ABTS(Sigma-Aldrich Co.)를 용해시킨 후, 2.4 mM의 potassium persulfate 용액에 첨가하여 실온의 암소 공간에서 하루 동안 교반하여 ABTS 양이온을 형성하였다. 이후 735 nm에서 1.4~1.5의 흡광도 값이 되도록 증류수를 이용하여 희석하였다. 희석한 ABTS 라디칼 양이온 용액 1 mL에 시료 또는 증류수(blank) 50 μL를 첨가하여 1시간 반응시키고 분광광도계를 이용하여 흡광도 변화를 735 nm에서 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 표준물질로 L-ascorbic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용했으며 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 추출물 1 g당 mg ascorbic acid로 나타내었다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성은 Choi 등(2019)의 방법을 변형하여 측정하였다. 0.2 mM DPPH(Sigma-Aldrich Co.) 용액 0.8 mL에 0.1 mg/mL 농도의 추출물 또는 증류수(blank) 0.2 mL를 가한 후 실온에서 30분간 반응하여 흡광도 변화를 520 nm에서 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 표준물질로 L-ascorbic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용했으며 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 추출물 1 g당 mg ascorbic acid로 나타내었다.

Tyrosinase 저해 활성 측정

고온고압 처리 마늘의 피부 미백 효과를 측정하기 위해 Yagi 등(1987)의 방법을 이용하여 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다. 즉, 0.1 mL의 시료 용액에 0.5 mL의 0.175 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 및 0.2 mL의 10 mM L-DOPA 기질액 0.1 mL를 첨가한 후 110 Unit/mL mushroom tyrosinase를 0.2 mL 첨가하여 25°C에서 2분간 반응시켰다. 반응 후 생성된 DOPA chrome은 분광광도계를 이용하여 475 nm 흡광도에서 측정하였다. Tyrosinase 저해 활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었으며, positive control로 ascorbic acid를 1 mg/ mL의 농도로 사용하였다.

Collagenase 저해 활성 측정

고온고압 처리 마늘의 피부주름 개선 효과를 확인하기 위해 Yang 등(2016)의 방법을 이용하여 collagenase 저해 활성을 측정하였다. 즉, 0.1 M tris-HCI buffer(pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하고 4-phenylazobenzyloxy-carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg(0.3 mg/mL)를 녹인 기질액 0.35 mL에 시료 용액 0.1 mL 및 0.15 mL collagenase(0.2 mg/mL)를 첨가하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 이후 0.5 mL의 6% citric acid를 넣어 반응을 정지시키고 1.5 mL의 ethyl acetate를 첨가하여 교반 후 상등액을 취해 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해 활성은 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율에 따라 나타냈으며, positive control로 epigallocatechin gallate를 1 mg/mL의 농도로 사용하였다.

통계처리

통계분석은 SPSS(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 측정하였다. 모든 측정은 3회 반복 측정하여 평균±표준편차로 표현하였다. 각 분석은 평균 및 표준편차를 산출하여 Duncan’s multiple range test를 통해 유의성을 검정(P<0.05)하였다. 이후 상관관계 분석은 Pearson’s correlation analysis를 사용하여 분석(P<0.01, P<0.05)을 진행하였다.

총 폴리페놀 함량

고온고압 처리 및 용매 분획에 따른 마늘의 총 폴리페놀 함량 측정 결과는 Table 1과 같다. 열처리한 마늘의 총 폴리페놀 함량은 40.52 mg GAE/extract g으로 무처리의 8.11 mg GAE/extract g에 비해 5배가량 증가하였다. 이러한 결과는 Stewart 등(2000)의 연구에서 보고한 토마토에 존재하는 루틴과 같은 배당체 형태의 페놀성 화합물은 가공 공정 중 열에 의해 케르세틴과 같은 비배당체 형태로 저분자화될 수 있다는 결과와 같이 고분자 형태의 페놀성 화합물이 열처리에 의해 저분자로 전환되었거나 새롭게 페놀성 화합물이 생성되어 총 폴리페놀 함량이 증가하기 때문에 나타난 결과라 생각된다. 순차적 용매 분획물의 경우 에틸아세테이트 및 클로로포름 분획물에서 241.55 및 177.85 mg GAE/extract g으로 에틸아세테이트 분획물의 경우 열처리 마늘에 비해 6배 높은 함량을 보였으며, 헥산, 부탄올 및 증류수 분획물의 0.29, 17.67 및 10.49 mg GAE/extract g보다 높은 함량을 나타내었다. 이는 복분자 와인의 저분자 페놀성 화합물 단리, 동정 시 에틸아세테이트 분획물에서 높은 폴리페놀 함량을 보이며(Kim 등, 2008c), 무 열처리 시 총 폴리페놀 함량이 증가하고 용매 분획 시 에틸아세테이트 분획물에서 높은 총 폴리페놀 함량을 보인다는 연구(Lee 등, 2009)와 일치하는 경향이었다.

Table 1 . ABTS and DPPH radical scavenging activity, and total polyphenol content of heated garlic at 130°C and 2 h.

Samples		Total polyphenol (mg GAE/extract g)1)	ABTS radical scavenging (mg AAE/extract g)2)	DPPH radical scavenging (mg AAE/extract g)
	Control	8.11±0.09f3)4)	1.04±0.12f	0.74±0.28f
	Heated garlic	40.52±0.13c	8.02±0.08d	8.95±0.06c
Solvent fraction	Hexane	0.29±0.04g	0.23±0.03g	0.39±0.67g
	Chloroform	177.85±1.42b	56.13±0.18b	31.43±1.04b
	Ethyl acetate	241.55±1.92a	91.43±0.32a	40.59±0.49a
	Butanol	17.67±0.08d	13.59±0.11c	7.69±0.12d
	Water	10.49±0.09e	7.07±0.05e	5.83±0.23e

¹⁾mg gallic acid equivalent (GAE) per 1 g of extracts..

²⁾mg ascorbic acid equivalent (AAE) per 1 g of extracts..

³⁾Values are mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different letters (a-g) in the same item indicate a significant difference by Duncan’s multiple range test (P<0.05) with different sample..

ABTS 및 DPPH에 의한 라디칼 소거 활성

고온고압 처리된 마늘과 추출물의 용매 분획에 따른 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과는 Table 1과 같다. ABTS 라디칼 소거 활성은 열처리하지 않은 마늘에서 1.04 mg AAE/extract g으로 낮았으나 130°C에서 2시간 열처리한 마늘에서는 8.02 mg AAE/extract g으로 8배 정도 증가하였다. DPPH 라디칼 소거능 또한 무처리에서 0.74 mg AAE/extract g으로 낮았지만, 열처리 시 8.95 mg AAE/extract g으로 12배 정도 증가하였다. 이러한 결과는 열처리에 따라 폴리페놀 함량이 증가하였기 때문으로 생각되며, 이는 식물체에 열처리 시 결합형의 폴리페놀 성분이 유리형으로 전환되어 폴리페놀 함량이 증가하고 이에 따라 항산화 활성이 증가한다는 연구(Turkmen 등, 2005; Lee 등, 2009)와 일치하는 경향이었다. 용매 분획물의 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성은 에틸아세테이드 분획물에서 각각 91.43 및 40.59 mg AAE/extract g으로 가장 높은 활성을 나타내었다. 클로로포름 분획물에서도 각각 56.13 및 31.43 mg AAE/extract g으로 높은 활성을 보였으나, 헥산, 수포화 부탄올 및 증류수 분획물에서는 각각 0.23~13.59 및 0.39~7.69 mg AAE/extract g으로 낮게 나타났다. 이러한 결과는 흑마늘을 용매 분획 시 클로로포름 및 에틸아세테이트 추출물에서 항산화 활성이 높다는 연구(Shin 등, 2010)에서도 찾아볼 수 있다.

Tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase는 동식물 및 미생물이 가지고 있는 polyphenol oxidase의 일종으로 멜라닌 합성의 주요한 조절의 역할을 하는 효소이다(Lee와 An, 2010). Tyrosinase는 polyphenol oxidase계에 속하는 구리를 함유한 효소로, 색소 세포에서 L-tyrosine을 L-1,3-dihydroxy-phenylalanine(DOPA)으로 변환하고 효소적 산화반응 단계를 거쳐 DOPA quinone으로 변환시킨다. DOPA quinone은 자발적 반응에 의해 DOPA chrome으로 전환되며 이들은 tyrosinase-related protein-2(DOPA chrome tautomerase)에 의해 촉매 되어 5,6-dihydroxylindole-2-carboxylic acid (DHICA)로 전환된다. 이 DHICA는 tyrosinase-related protein-1(DHICA oxidase)의 촉매 과정에 의해 indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid로 전환되어 최종적으로 멜라닌이 합성된다(Körner와 Pawelek, 1982; Jeong과 Lim, 2004). 이러한 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase에 대한 영향을 확인하고자 고온고압 처리 마늘의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다.

Fig 1. Tyrosinase inhibitory activity of heated garlic at 130°C and 2 h. The concentration of positive control was 1 mg/mL. Data are expressed as mean±SD. Different small letters (a-g) in the same concentration indicate a significant difference among different samples by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

모든 처리구에서 처리농도가 증가함에 따라 tyrosinase 저해 활성은 유의적으로 증가하였다. 무처리 마늘은 1 mg/mL 농도에서 활성이 나타나지 않았지만 2.5 및 5 mg/mL의 농도에서 6.53 및 9.44%의 저해 활성을 나타내었으며, 고온고압 처리 시 농도에 따라 각각 7.26, 11.16 및 19.42%로 증가하는 경향을 나타내었다. 용매 분획 결과 처리농도에 따라 에틸아세테이트 분획물은 44.55, 64.11 및 82.96%의 저해 활성을 보였으며, 클로로포름 분획물은 각각 20.74, 40.31 및 62.40%의 저해 활성을 나타내었다. 그러나 헥산, 부탄올 및 물 분획에서는 낮은 저해 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 총 폴리페놀 및 항산화 활성 결과와 유사한 경향이었으며, 다양한 식물추출물의 용매 분획 시 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 tyrosinase 저해 활성을 보인다는 연구와 유사한 경향이었다(Im과 Lee, 2014; Lee 등, 2011; Kang 등, 2008).

Collagenase 저해 활성

Collagenase는 세포외 기질 단백질을 분해하는 효소로 피부 진피층을 구성하는 extracellular matrix 단백질의 가교결합을 끊어 피부의 주름을 유발한다(Fligiel 등, 2003). 고온고압 처리 마늘의 collagenase 저해능에 대해 측정한 결과는 Fig. 2와 같이 모든 처리구에서 농도 의존적으로 증가하였다. 1, 2.5 및 5 mg/mL 농도에서 무처리구는 각각 7.23, 9.15 및 12.86%였지만 열처리 시 각각 11.71, 18.40 및 26.22%로 약 2배 정도 증가하였다. 용매 분획 결과 총 폴리페놀 및 항산화 활성 결과와 유사하게 클로로포름 및 에틸아세테이트 분획물에서 높은 저해 활성을 나타내었다. 에틸아세테이트 분획물 1, 2.5 및 5 mg/mL 농도에서 각각 36.64, 42.18 및 62.43%의 가장 높은 저해 활성을 나타내었으며, 부탄올 분획물은 1, 2.5, 5 mg/mL 농도에서 각각 10.92, 14.41 및 26.17%, 물 분획물은 7.72, 9.37 및 16.87%로 낮은 저해 활성을 나타내었는데, 이는 collagenase 저해 활성을 갖는 활성물질의 용매 친화력 및 극성 정도에 따른 결과라 판단되며 추후 활성물질의 동정이 필요할 것으로 판단된다.

Fig 2. Collagenase inhibitory activity of heated garlic at 130°C and 2 h. The concentration of positive control was 1 mg/mL. Data are expressed as mean±SD. Different small letters (a-g) in the same concentration indicate a significant difference among different samples by Duncan’s multiple range test (P<0.05). EGCG: epigallocatechin gallate.

상관관계

고온고압 처리 마늘의 총 폴리페놀, 항산화 활성 및 항노화 활성 간의 상관관계 분석 결과는 Table 2와 같다. 총 폴리페놀은 ABTS(r=0.987) 및 DPPH(r=0.992) 라디칼 소거능, tyrosinase(r=0.936) 및 collagenase(r=0.982) 저해 활성과 높은 양의 상관관계를 나타내었으며(P<0.01), 이는 폴리페놀 함량이 높을수록 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능이 높다고 보고한 연구와 일치하는 경향이었다(Shin 등, 2010; Turkmen 등, 2005). 또한 tyrosinase 및 collagenase 저해 활성도 총 폴리페놀 함량과 높은 상관관계를 보여 열처리에 따라 페놀성 화합물의 함량이 증가하였기 때문이라 판단된다.

Table 2 . Correlation coefficients among total polyphenol, antioxidant activity, and anti-skin aging activity with heated gallic at 130°C and 2 h.

Factors	Total polyphenol	ABTS	DPPH	Tyrosinase inhibitory	Collagenase inhibitory
Total polyphenol	1	0.987**	0.992**	0.936**	0.982**
ABTS		1	0.896**	0.942**	0.973**
DPPH			1	0.924**	0.993**
Tyrosinase inhibitory				1	0.931**
Collagenase inhibitory					1

**P<0.01..

본 연구는 고온고압 처리 마늘의 피부 항노화 활성 소재로서의 가능성을 확인하기 위해 ABTS 및 DPPH 항산화 활성과 tyrosinase 및 collagenase 저해 활성을 분석하였다. 총 폴리페놀 함량은 무처리 마늘 8.11 GAE mg/extract g에서 고온고압 처리 시 40.52 GAE mg/extract g으로 약 5배 증가하였으며, ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성 모두 고온고압 처리 시 91.43 및 40.59 mg AAE/extract g으로 높았다. 용매 분획 결과 총 폴리페놀 함량, ABTS 및 DPPH 항산화 활성 모두 에틸아세테이트 분획물에서 각각 241.55 mg/extract g, 91.43 mg AAE/extract g 및 40.59 mg AAE/extract g으로 높았다. Tyrosinase 및 collagenase 저해 활성은 에틸아세테이트 분획물 5 mg/mL 농도에서 각각 82.96% 및 62.43%로 가장 높았다. 상관관계 분석 결과 항산화 및 항노화 활성 모두 페놀성 화합물의 변화 및 함량 증가와 높은 양의 상관성을 보였다. 본 실험 결과 고온고압 처리한 마늘의 항산화 활성 및 피부 항노화 효능을 확인할 수 있었으며 추후 성분에 관한 추가적인 연구를 통해 기능성 화장품 소재 개발이 가능할 것으로 판단된다.

본 연구는 2022년도 교육부 재원으로 한국연구재단의 지원(재단 과제관리번호: 2021RIS-001)을 받아 수행된 지자체-대학 협력기반 지역혁신 사업의 결과입니다. 이에 감사드립니다.