고추(Capsicum annuum L.)는 가지과에 속하는 식물로 원산지는 남아메리카이며, 17세기 초 한국에 전래된(Lim 등, 2012) 이후 한국인의 식생활에서 필수적인 향신료로 자리 잡았다. 국내산 건고추의 경우 과피 65%, 고추씨 25%, 꼭지 7%, 태좌 3%로 이루어져 있어 외국산 고추와 비교하여 씨의 함량이 높지만(Yoon 등, 1983), 고춧가루에 첨가되는 경우를 제외하고는 제대로 활용되지 못하고 있다(Ku 등, 2008). 고추씨는 항돌연변이 및 항산화(Sim과 Han, 2007), 항비만(Jeon 등, 2010) 등의 생리활성 기능이 있으며, superoxide anion 라디칼 소거능 및 superoxide dimutaes (SOD), 높은 농도에서의 ABTS 라디칼 소거능이 고추의 과피보다 높은 것으로 나타났다(Sim과 Han, 2007). 그러나 고추씨는 이와 같은 기능성을 가짐에도 불구하고 활용 방안이 뚜렷하게 없는 실정이다. 현재까지 고추씨를 활용하고자 하는 시도는 지속되어 왔으나 대부분은 기존의 식품에 고추씨를 단순 첨가하는 식품의 개발에 관한 연구(Kim 등, 2013; 2016; Ku 등, 2009; Lee와 Kim, 2018)에 그치고 있다.

고추씨는 과피보다 약 10배 많은 양의 캡사이신을 함유하고 있다(Pandhair와 Sharma, 2008). 캡사이신(8-methyl-N-vanillyl-6-momenamide)은 캡사이시노이드에 속하는 화합물로 매운맛을 유발하는 고추의 성분이다. 방향족 고리, 아마이드 결합, 소수성 사슬 구조로 되어있어 물에 용해되지 않는 특징을 가진다(Cho 등, 2019). Vanilinamine의 아마이드 산과 C9 및 C11에서 분지된 지방산의 길이에 의해 매운맛이 결정되며, phenyl propanoid pathway의 중간 산물인 vanillylamine과 valine pathway의 생성물인 8-methyl-nonenoic acid가 캡사이신 합성 효소에 의해 응축되어 생성된다(Díaz 등, 2004; Bennett과 Kirby, 1968). 캡사이신은 체내 세포 항산화 및 지질 과산화 억제(Luqman과 Rizvi, 2006; Yu 등, 2002), 항염증(Demirbilek 등, 2004), 항비만(Kang 등, 2007) 등의 기능성을 가진다는 연구 결과가 있으나, 돌연변이 유발(Nagabhushan과 Bhide, 1985), 종양 유발(Agrawal 등, 1986) 등의 상반된 연구 결과도 보고되었다. 캡사이신은 섭취 시 구강 내 점막 및 혀에 작열감을 일으키게 되는데 이러한 자극적인 맛은 고추씨를 활용할 때 유용하게 작용하기도 하지만 활용 용도에 따라 오히려 제한점이 되기도 한다. 캡사이신은 Variovorax sp. 및 Ralstonia sp. (Flagan과 Leadbetter, 2006), Bacillus subtilis P3-3(Lee 등, 2010), Actinoplanes utahensis(Romano 등, 2011) 등의 미생물들에 의해 분해될 수 있다.

B. subtilis는 자연계에 널리 분포하는 비병원성 그람양성의 호기성 간균이며, 높은 단백질분해효소 활성을 가지고 있고(Pant 등, 2015) 섬유소 분해효소를 분비하여 in vitro 및 in vivo에서 섬유소혈전을 용해하는 것으로 보고되었다(Yuan 등, 2012). 또한 He 등(2012)의 연구에 따르면 B. subtilis를 이용하여 유채 가루를 발효했을 때 생성된 펩타이드에 풍부한 글루탐산이 존재하는 것으로 확인되었으며, 이는 DPPH 라디칼 소거 및 리놀레산 자동산화 방지 등의 높은 항산화 활성을 가진다고 나타났다.

본 연구에서는 고추씨의 활용범위에 제한점으로 작용하는 매운맛을 저감화하기 위해 B. subtilis를 이용해서 고추씨를 발효시키고, 온도, 가수량, 시간에 따른 고추씨의 최적 발효 조건을 규명하고자 하였다. 또한, 발효된 고추씨의 식품학적 가치를 평가하기 위해 발효 조건에 따른 고추씨의 수분, 회분, 조지방, 조단백 등의 일반성분 및 항산화 활성, 캡사이신 함량의 변화를 분석하였다.

고추씨의 미생물 오염도

온라인 마트에서 국내산 고추씨 17점과 중국산 고추씨 15점을 구입하여 본 실험에 사용하였다. 구매한 고추씨는 실험에 사용하기 전까지 4°C에서 냉장 보관하였다. AOAC(2007) 방법에 따라 조사 대상 미생물의 개체수를 측정하였다. 호기성 일반 세균(total aerobic bacteria, TAB), 대장균군(coliform), 대장균(Escherichia coli), 효모 및 곰팡이(yeast and mold)의 개체수를 분석하기 위해 각각 Petrifilm^TM(3M, St. Paul, MN, USA) aerobic count(AC) plate, E. coli/coliform(EC) count plate, yeast and mold(YM) count plate를 이용하였다. 고추씨 10 g과 멸균된 0.1% 펩톤수 100 mL를 균질기용 샘플백(3M)에 넣어 균질기(Stomacher^® 400 Circulater, Seward, Inc., London, UK)로 260 rpm에서 1분간 균질화한 후 멸균된 0.1% 펩톤수 9 mL를 이용하여 십진 희석하였다. 이후 희석액 1 mL를 각각의 준비된 Petrifilm^TM plate에 분주하여 AC plate는 37°C에서 48시간, EC plate는 37°C에서 24시간, YM plate는 25°C에서 3일간 배양한 후 의심되는 집락을 계수하였다.

Bacillus subtilis

발효 균주로 사용된 Bacillus subtilis KCTC 3014는 tryptic soy broth(BD DifcoTM, Sparks, MD, USA)에 접종하여 30°C에서 24시간 간격으로 3회 계대배양 하였다. 계대배양이 완료된 B. subtilis 배양액을 50 mL conical tube에 옮긴 후 20분간 원심분리(2,000×g)하여 상층액을 제거한 뒤 상층액과 동일한 양의 멸균 증류수를 회수한 세포와 혼합하여 세척하는 과정을 2번 반복하였다. 이러한 방법으로 대략 108 CFU/mL의 농도로 B. subtilis 배양액을 준비하였다.

고추씨의 B. subtilis 접종

고추씨를 블렌더로 분쇄한 후 18 mesh의 채로 거른 후 일정한 굵기로 준비하였다. 준비된 고추씨 100 g에 증류수(50 mL, 75 mL, 100 mL, 125 mL, 150 mL)를 첨가하여 잘 섞어준 후 121°C에서 15분간 고압 멸균하였다. 멸균된 고추씨를 1시간 동안(25±1°C, RH 38±4%) laminar flow hood에서 식힌 후 준비된 B. subtilis 배양액 10 mL를 균일하게 접종하였다.

고추씨의 B. subtilis 개체수 및 pH 측정

B. subtilis를 접종한 고추씨를 25°C, 30°C, 35°C, 40°C에서 7일간 배양하면서 24시간 간격으로 시료를 채취하여 고추씨의 B. subtilis 개체수 및 pH를 측정하였다. 고추씨의 B. subtilis 개체수를 측정하기 위해 시료 25 g과 멸균된 0.1% 펩톤수 250 mL를 균질기용 샘플백(3M)에 넣어 균질기(Stomacher^® 400 Circulater, Seward, Inc.)로 260 rpm에서 1분간 균질화하였다. 균질화된 시료 혼합액 1 mL를 취하여 0.1% 펩톤수(9 mL)로 십진 희석한 후 tryptic soy agar(TSA, BD DifcoTM)에 0.1 mL씩 도말하였다. 시료 혼합액이 도말된 TSA 배지를 30°C에서 24시간 배양한 후 B. subtilis로 의심되는 집락을 계수하였다. 고추씨의 pH는 pH meter(Orion Star A211, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였다.

고추씨의 일반성분 분석

35°C와 40°C에서 발효 기간에 따른 고추씨의 일반성분 변화를 확인하기 위해 발효 고추씨의 수분, 회분, 조지방, 조단백 함량을 AOAC(2007) 방법에 따라 분석하였다. 105°C에서 상압가열건조법을 이용하여 발효된 고추씨의 수분 함량을 측정하였고, 조단백 함량은 Kjeldahl법에 준하여 조단백 자동분석장치로 측정하였다. B. subtilis가 접종된 고추씨를 35°C와 40°C에서 7일간 발효시키는 동안 24시간 간격으로 시료를 채취하여 120시간 동결건조 후 분쇄하여 직접 회화법과 Soxhlet법으로 각각 회분과 조지방을 분석하였다.

고추씨의 캡사이시노이드 함량 분석

35°C와 40°C에서 발효 중인 고추씨를 24시간 간격으로 취하여 캡사이시노이드 함량을 분석하였다. 캡사이시노이드의 함량은 캡사이신과 디하이드로캡사이신의 합으로 나타내었으며, 캡사이시노이드의 분석법은 중앙관세분석소의 캡사이신 분석 방법(Central Customs Laboratory and Scientific Service, 2006)에 따라 고성능액체크로마토그래피(HPLC NANOSPACE SI-2, Osaka Soda, Osaka, Japan)를 이용해 분석하였다. 분쇄하여 발효한 고추씨 시료 1 g을 폴리프로필렌 원심분리관에 넣고 아세톤 30 mL를 첨가하여 습윤시킨 후 5시간 동안 초음파를 이용해 추출하고 아세톤을 50 mL가 되도록 첨가하였다. 추출액 5 mL를 취해 50°C에서 질소로 건조하고 acetonitrile 2 mL를 첨가하여 녹였다. 이후 상등액을 0.45 μm membrane 필터를 사용하여 여과하고 HPLC로 캡사이시노이드를 정량 분석하였다. 분리에 사용된 컬럼은 Capcell Pak^® 5 µm C18 UG 120 Å, LC Column(5 μm, 250 mm×4.6 mm, Shiseido, Tokyo, Japan)이며, UV 검출기를 이용하여 229 nm의 흡광도에서 검출하였다. 이동상은 acetonitrile:water＝65:35를 사용하였고 유속은 1.0 mL/min으로 하여 분리하였다(Table 1). 캡사이신(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 및 디하이드로캡사이신(Sigma-Aldrich Co.)의 표준용액을 조제하기 위해 각각 acetonitrile로 희석하였다. 희석 후 캡사이신 표준용액은 단계적으로 3.125 mg/L, 6.25 mg/L, 12.5 mg/L, 25 mg/L의 농도로 조제하였고, 디하이드로캡사이신 표준용액은 3.25 mg/L, 6.5 mg/L, 13 mg/L, 26 mg/L의 농도로 희석하여 준비하였다. 이에 따라 표준 검량곡선을 작성한 뒤 아래의 식에 측정된 값을 대입하여 산출하였다.

Table 1 . HPLC conditions.

Description	Condition
Instrument	HPLC NANOSPACE SI-2
Mobile phase	Acetonitrile:Water (65:35)
Column	Capcell Pak® 5 µm C18 UG 120 Å, LC Column (5 μm, 250 mm×4.6 mm)
Column temperature	35°C
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	5 μL
Detection	UV 229 nm

$$캡사이신함량\left(mg/kg\right)=\frac{A}{B}\times C\times \frac{D}{E}$$

A: HPLC 검출량(mg/kg)

B: 시료의 무게(g)

C: 질소농축 후 재용해 용매의 부피(mL)

D: 추출 용액의 최종 부피(mL)

E: 질소농축 시 취한 추출 용액의 부피(mL)

고추씨의 총 폴리페놀 함량 분석

발효한 고추씨의 발효 기간별 총 폴리페놀 함량 분석은 Jang 등(2008)의 방법을 이용하여 분석하였다. 35°C와 40°C에서 발효한 고추씨를 7일 동안 24시간 간격으로 채취해 동결건조하여 시료를 준비하였다. 준비된 시료 50 g에 250 mL의 70% 에탄올을 가하여 3시간 동안 교반하여 추출하는 과정을 2회 반복해 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액을 여과지로 여과한 후 감압 농축하여 멸균된 증류수에 1 mg/mL의 농도로 녹여 고추씨 추출물을 준비하였다. 추출물 0.4 mL와 증류수 3 mL를 혼합한 후 2 N Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.) 0.2 mL를 넣고 3분간 정치하였다. 이후 20% Na2CO3(Samchun Pure Chemical Co., Pyeongtaek, Korea) 400 μL를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 분광광도계(UV 1600 PC, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량곡선은 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용했으며, 작성된 표준 검량곡선을 통해 총 폴리페놀 함량으로 환산하였다. 추출물의 총 폴리페놀 함량은 g당 mg gallic acid equivalent(GAE)로 나타내었다.

고추씨의 항산화능 분석

35°C와 40°C에서 발효 중인 고추씨를 7일 동안 24시간 간격으로 채취하여 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH; Sigma-Aldrich Co.)과 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS; Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 고추씨의 DPPH 라디칼 소거능 측정은 Blois(1958)의 방법을 일부 변형하여 적용하였다. 에탄올에 용해시킨 0.1 mM DPPH 라디칼 160 μL에 고추씨 추출물 40 μL를 첨가하여 30분간 암실에서 반응시킨 후 ELISA reader(Versa Max Microplate Reader, Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

고추씨의 ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(1999)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 고추씨 추출물을 1 mg/mL의 농도로 준비하였으며, 암실에서 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate(Samchun Pure Chemical Co.)와 혼합한 후 24시간 동안 방치하여 ABTS 라디칼을 형성시켰다. ABTS 라디칼이 형성된 용액을 760 nm의 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 멸균된 증류수로 희석하였으며, 희석된 용액 180 μL에 고추씨 추출물 20 μL를 혼합하여 ELISA reader(Versa Max Microplate Reader, Molecular Device)를 이용해 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계분석

모든 실험은 3회 반복하여 측정했으며, 실험 결과를 평균값±표준편차로 나타내었다. 실험 결과는 SAS software(ver. 9.4, SAS Institute, Cary, NC, USA)의 일반화 선형 모형을 이용하여 분산분석을 수행했으며, 고추씨의 B. subtilis 개체수, 일반성분, 총 폴리페놀 함량, DPPH와 ABTS 라디칼 소거능은 Fisher’s least significant difference test를 이용하여 P<0.05 수준에서 발효 온도, 가수량 및 발효 기간에 따른 유의성을 검증하였다. 또한, 중국산 및 국내산 고추씨 간의 미생물 오염도 차이 및 35°C와 40°C에서 발효한 고추씨의 총 폴리페놀 함량, DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 차이는 two-sample t-test를 이용하여 분석했으며, P<0.05 수준에서 원산지와 온도에 따른 유의성을 검증하였다.

고추씨의 미생물 오염도

국내산 고추씨 시료 17점과 중국산 시료 15점의 미생물 오염도를 조사한 결과 총 32개 시료의 일반세균과 대장균군, 효모 및 곰팡이의 평균 개체수는 각각 7.03 log CFU/g, 4.02 log CFU/g, 4.37 log CFU/g으로 나타났다(Table 2). 국내산 고추씨와 중국산 고추씨의 일반세균과 대장균군의 개체수를 비교한 결과 원산지 간의 유의적인 차이가 나타나지 않았고(P<0.05), 국내산과 중국산 고추씨 모두에서 대장균은 검출되지 않았다. 효모 및 곰팡이의 개체수는 국내산 고추씨에서 3.89 log CFU/g, 중국산 고추씨에서 4.79 log CFU/g으로 검출되어 원산지 간의 유의적인 차이가 나타났으며(P<0.05), 국내산 고추씨보다 중국산 고추씨의 효모 및 곰팡이의 오염도가 더 높은 것으로 나타났다. 이는 Jeong 등(2018)의 연구에서 고추의 일반세균수 및 대장균군 오염도를 조사한 결과 고추 시료 63점의 일반세균이 5.64 log CFU/g으로 본 연구의 결과에서 더 높은 일반세균 검출량을 나타내었다. Hung 등(2018)의 연구에서는 건고추 생산 농장을 대상으로 고추의 일반세균 및 대장균을 조사한 결과 노지와 시설재배 고추의 세척 후 일반세균수는 각각 6.51 log CFU/g과 6.96 log CFU/g, 대장균군수는 각각 3.99 log CFU/g, 5.00 log CFU/g으로 보고하여 본 연구와 비슷한 미생물 오염도를 나타냈다. 또한 Kim 등(2020)이 농가에서 수확한 고추와 유통 중인 고추의 미생물 오염도를 조사한 결과 수확 직후 고추의 효모 및 곰팡이 개체수는 3.00 log CFU/g, 유통 중인 고추에서는 3.40 log CFU/g을 검출하여 본 연구의 결과와 크게 다르지 않았다.

Table 2 . Populations of total aerobic bacteria (TAB), coliform, E. coli, and yeasts/molds on chili pepper seeds.

Place of origin	Microbial populations (log CFU/g)
	TAB	Coliform	E. coli	Yeasts/Molds
Korea (n=17)1)	7.20±0.692)	3.68±1.89	ND3)	3.89±1.19*
Chinese (n=15)	6.89±0.44	4.32±0.93	ND	4.79±0.77
Mean (n=32)	7.03±0.58	4.02±1.47	ND	4.37±1.08

¹⁾Numbers of samples tested..

²⁾Mean±SD (Detection limit: <10 CFU/g)..

³⁾Not detected (Detection limit: <10 CFU/g)..

*Values in the same column are significantly different (P<0.05)..

고추씨의 발효 중 B. subtilis 개체수 및 pH 변화

Fig. 1은 고추씨 100 g에 첨가한 증류수의 양에 따른 고추씨의 수분 함량 및 수분활성도를 측정한 결과이다. 가수하지 않은 고추씨의 초기 수분활성도는 0.61이었으며, 증류수 20 mL를 첨가했을 때 수분활성도가 0.91로 상승하였다. 이후 증류수 첨가량에 따라 고추씨의 수분활성도는 지속해서 증가했으며, 75 mL 이상의 증류수를 첨가한 경우는 75 mL를 첨가했을 때와 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 또한, 가수하지 않은 고추씨의 수분 함량은 12.50%였으며 증류수를 첨가할수록 유의적으로 증가하는 경향을 나타냈다.

Fig 1. Moisture content (A) and water activity (B) of chili pepper seeds as affected by amount of water added. Bars indicate standard deviations.

발효 기간, 온도 및 가수량에 따른 고추씨의 B. subtilis 개체수 변화는 Table 3에 나타냈다. 증류수 50 mL를 첨가하여 발효한 고추씨의 경우 25°C와 30°C에서는 7일 동안 감소하는 경향을 나타냈으며, 35°C와 40°C에서는 개체수가 유지되었다. 하지만 증류수 75 mL 이상을 첨가한 경우는 모든 온도 조건에서 7일 동안 B. subtilis의 개체수가 7.65~9.52 log CFU/g까지 증가하였다. 가수량에 따라 B. subtilis 개체수를 측정하여 비교한 결과, 모든 온도에서 증류수 75 mL를 첨가하여 발효한 고추씨의 발효 7일차 B. subtilis 개체수가 가장 높게 나타났다. 30°C, 35°C, 40°C에서 발효한 고추씨는 증류수 75 mL 이상을 가한 경우 B. subtilis 개체수가 발효 1일차부터 유의미하게 증가한 것으로 나타났지만, 25°C에서는 2일차부터 Bacillus 개체수의 유의적인 증가가 나타났다. 35°C와 40°C에서 증류수 75 mL를 첨가하여 발효한 고추씨에서는 발효 1일차에 B. subtilis의 개체수가 각각 9.70 log CFU/g과 8.51 log CFU/g으로 급격하게 증가하여 7일차까지 유지하였다. 증류수 75 mL를 가하여 40°C에서 4일간 발효시킨 고추씨에서 10.04 log CFU/g의 B. subtilis 개체수가 검출되어 모든 온도와 가수량의 경우 중에서 가장 높은 개체수 값을 나타냈다.

Table 3 . Populations of B. subtilis in chili pepper seeds as affected by fermentation temperature, time, and amounts of water added.

Temp.	Amounts of water	Population of B. subtilis (log CFU/g)
		Day 0	Day 1	Day 2	Day 3	Day 4	Day 5	Day 6	Day 7
25°C	50 mL	5.92Aa1)	5.90Aa	4.19ABb	3.53Bb	4.61ABb	3.77Bb	4.18ABb	3.97ABb
	75 mL	5.92CDa	5.73Da	7.36BCa	8.32ABa	9.34Aa	9.37Aa	9.32Aa	9.43Aa
	100 mL	5.92Ba	6.54Ba	8.97Aa	9.28Aa	8.91Aa	9.17Aa	8.98Aa	8.95Aa
	125 mL	5.92Ca	6.86Ba	8.80Aa	9.14Aa	8.95Aa	9.07Aa	8.90Aa	8.92Aa
	150 mL	5.92Ca	6.89BCa	8.34ABa	8.90Aa	8.85Aa	8.27ABa	8.03ABa	7.65ABa
30°C	50 mL	5.92Aa	3.63Bc	2.92Bb	2.81Bc	2.37Bb	2.60Bb	1.86Bb	2.07Bb
	75 mL	5.92Ea	7.61Db	8.75Ca	9.89Aa	9.85ABa	9.67ABa	9.14BCa	9.51ABa
	100 mL	5.92Da	8.71Ca	8.91BCa	9.07ABCb	9.34ABCa	9.64Aa	9.55ABa	9.52ABa
	125 mL	5.92Ba	8.92Aa	8.76Aa	9.09Ab	8.94Aa	8.80Aa	9.01Aa	9.09Aa
	150 mL	5.92Ca	8.55ABa	8.04Ba	8.34ABb	8.87Aa	8.86Aa	8.94Aa	8.93Aa
35°C	50 mL	5.92Aa	5.42Ac	5.02Ab	5.44Ab	5.90Ab	6.23Aa	6.51Aa	6.85Aa
	75 mL	5.92Ba	9.70Aa	9.78Aa	9.84Aa	9.82Aa	9.53Aa	9.63Aa	9.50Aa
	100 mL	5.92Ba	9.04Aab	9.35Aa	9.55Aa	9.65Aa	9.47Aa	9.56Aa	9.39Aa
	125 mL	5.94Ba	9.17Aab	9.22Aa	9.34Aa	9.14Aa	8.66Aa	8.70Aa	8.58Aa
	150 mL	5.92Ba	8.72Ab	8.84Aa	9.11Aa	9.08Aa	9.00Aa	8.39Aa	8.01Aa
40°C	50 mL	5.92Aa	6.12Ab	6.53Ab	7.19Aa	7.17Aa	7.49Aa	7.15Aa	6.92Aa
	75 mL	5.92Ca	8.51Ba	9.79Aab	9.98Aa	10.04Aa	9.50ABa	9.50ABa	9.38ABa
	100 mL	5.92Ba	9.16Aa	9.07Aab	8.65Aa	8.79Aa	8.85Aa	8.67Aa	8.98Aa
	125 mL	5.92Ca	9.16Aa	8.61ABab	8.78ABa	8.29Ba	8.30Ba	8.18Ba	8.45ABa
	150 mL	5.92Ca	8.59Aa	8.48Aab	7.73Ba	7.55Ba	7.41Ba	7.72Ba	7.94ABa

¹⁾Mean values that are followed by different uppercase letters are significantly different (P<0.05) in the same row. Within the same temperature and time, values in the same column that are followed by different lowercase letters are significantly different (P<0.05)..

발효 온도와 가수량에 따른 고추씨의 pH를 측정하였다(Table 4). 35°C를 제외한 모든 온도에서 증류수 50 mL를 첨가하여 발효한 경우 발효 시간에 따른 pH의 유의미한 변화는 나타나지 않았으며, 또한 모든 온도에서 증류수 75 mL를 첨가했을 때 발효한 고추씨의 pH가 가장 높게 증가한 것으로 나타났다. 증류수 75 mL를 첨가하여 발효했을 때, 30°C, 35°C, 40°C에서 발효한 고추씨의 경우 발효 1일차에 각각 5.72, 6.44, 6.27로 유의적인 증가를 나타냈고 2일차에는 모두 7.35 이상으로 유의하게 증가했으며, 발효 7일차에는 모두 8.14 이상으로 최댓값을 나타냈다.

Table 4 . pH values of chili pepper seeds as affected by fermentation temperature, time, and amounts of water added.

Temp.	Amounts of water	pH
		Day 0	Day 1	Day 2	Day 3	Day 4	Day 5	Day 6	Day 7
25°C	50 mL	5.20Aa1)	5.25Ab	5.25Ab	5.27Ab	5.27Ac	5.22Ac	5.24Ac	5.24Ad
	75 mL	5.20Ca	5.50Cab	5.88Cab	6.28BCab	7.21ABa	7.53Aa	7.90Aa	8.12Aa
	100 mL	5.20Ca	5.51Cab	6.53Ba	7.38Aa	7.52Aa	7.68Aa	7.67Aa	7.70Aab
	125 mL	5.20Ea	5.62DEa	5.94CDab	6.04CDb	6.36BCb	6.77ABb	6.84ABb	7.14Ab
	150 mL	5.20Ca	5.66BCa	5.88ABab	5.93ABb	5.80ABbc	5.78ABc	5.67Bc	6.16Ac
30°C	50 mL	5.20Aa	5.20Ac	5.20Ac	5.26Ac	5.24Ab	5.26Ac	5.24Ac	5.26Ad
	75 mL	5.20Ea	5.72Db	7.51Ca	7.63BCa	7.92ABCa	8.06ABa	8.15Aa	8.24Aa
	100 mL	5.20Ca	6.45Ba	7.46Aa	7.63Aa	7.79Aa	7.72Aa	7.80Aa	7.77Aab
	125 mL	5.20Ba	6.10ABb	6.46ABb	6.82Ab	6.68ABb	6.46ABbc	6.54ABbc	6.66ABcd
	150 mL	5.20Ba	5.84ABb	5.76ABb	5.75ABb	6.24ABb	6.10ABb	6.97Ab	6.23ABbc
35°C	50 mL	5.20Ba	5.24Bc	5.20Be	5.25Bc	5.72ABb	5.99ABc	6.37ABa	7.11Aab
	75 mL	5.20Ca	6.44Ba	7.77Aa	8.05Aa	8.09Aa	7.88Aab	8.03Aa	8.14Aab
	100 mL	5.20Ea	6.27Da	7.37Cb	7.71BCa	8.03ABa	8.00ABa	8.06ABa	8.06Aa
	125 mL	5.20Ba	6.10ABab	6.46ABc	6.82Ab	6.68ABb	6.46ABbc	6.54ABa	6.66ABab
	150 mL	5.20Ba	5.84ABb	5.76ABd	5.75ABc	6.24ABb	6.10ABc	6.97Aa	6.23ABb
40°C	50 mL	5.20Aa	5.25Ab	5.36Ac	6.45Aabc	7.05Aab	7.30Aab	7.18Aa	7.22Aa
	75 mL	5.20Ca	6.27Ba	7.35Aa	7.85Aa	8.13Aa	8.08ABa	7.96ABa	8.18ABa
	100 mL	5.20Ba	6.73Aa	6.66Aab	7.13Aab	7.33Aab	7.61Aab	7.77Aa	7.85Aa
	125 mL	5.20Ba	6.17ABa	6.09ABbc	6.22ABbc	6.23ABbc	6.13ABbc	6.47Aab	7.13Aa
	150 mL	5.20ABa	5.89Aab	5.43ABc	5.30ABc	4.82Bc	4.81Bc	4.95Bb	5.14ABb

¹⁾Mean values that are followed by different uppercase letters are significantly different (P<0.05) in the same row. Within the same temperature and time, values in the same column that are followed by different lowercase letters are significantly different (P<0.05)..

이러한 고추씨의 pH 변화는 Visessanguan 등(2005)과 Allagheny 등(1996)의 B. subtilis를 이용한 대두 발효 연구 결과와 유사하게 나타났다. 발효 중 고추씨의 pH 상승은 단백질이 아미노산으로 분해되고 탈 아미노화 과정을 통해 생성된 암모니아가 원인인 것으로 판단된다(Ann, 2011). 본 연구에서 발효 조건에 따른 고추씨의 B. subtilis 개체수를 비교한 결과와 고추씨의 pH 변화는 상관관계가 있다고 보인다. B. subtilis의 개체수가 급격히 증가할 때 고추씨의 pH도 가파른 상승을 나타냈다. 예를 들어, 증류수 75 mL를 첨가하여 40°C에서 발효한 고추씨가 발효 4일차에 가장 높은 B. subtilis 개체수를 나타냈고, 이때 고추씨의 pH도 급격하게 상승하였다. 이는 청국장 발효 중 B. subtilis 개체수를 측정한 연구(Kim 등, 2006)에서도 40°C에서 발효한 청국장의 B. subtilis의 개체수가 가장 높아 본 연구의 결과와 유사하게 나타났다.

고추씨의 일반성분 변화

증류수 75 mL를 첨가한 고추씨에 B. subtilis를 접종하고 35°C 또는 40°C에서 발효하여 고추씨의 일반성분 함량을 분석한 결과는 Table 5에 나타냈다. 고추씨의 수분 함량을 비교한 결과, 35°C에서 발효한 고추씨의 수분 함량은 발효 전 49.48%에서 발효 1일차에 50.80%로 유의미하게 증가했으며, 발효 4일차에 52.40%로 가장 높은 수분 함량을 나타냈다. 또한 40°C에서 발효한 고추씨의 수분 함량은 발효 전 49.48%에서 발효 1일차에 50.99%로 상승하였고 발효 6일차에 53.09%로 가장 높은 값을 나타냈다. 35°C와 40°C에서 발효한 고추씨의 수분 함량은 각각 3일차와 6일차에 증가한 값이 7일차까지 유지되었다. 회분 함량 분석 결과 35°C에서 발효한 고추씨의 회분 함량은 발효 전 1.82%에서 발효 7일차에도 1.94%로 유의적인 변화가 나타나지 않았고, 40°C에서 발효한 고추씨는 발효 5일차에 2.02%로 유의한 증가를 나타냈다. 고추씨의 조지방 분석 결과 온도와 발효 기간과 관계없이 조지방 함량은 유지되었다. 발효 전 고추씨의 조단백 함량은 10.97%였으며, 35°C와 40°C에서 발효한 고추씨의 조단백 함량은 발효 기간이 증가할수록 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 변화는 수분 함량 증가에 의한 상대적인 감소로 판단된다. Ku 등(2008)의 고추씨 일반성분 분석 연구 결과와 본 연구의 발효 초기 고추씨의 일반성분 함량 차이가 발생하는 이유는 품종 및 처리 방법의 차이로 추정된다.

Table 5 . Proximate composition of chili pepper seeds fermented at 35°C or 40°C for up to 7 days.

Temp.	Component1)	Proximate composition (%)
		Day 0	Day 1	Day 2	Day 3	Day 4	Day 5	Day 6	Day 7
35°C	Moisture	49.48±0.00D2)	50.80±0.16C	51.32±0.07BC	52.24±0.15A	52.40±0.10A	52.28±0.11A	51.74±0.47AB	52.16±1.09A
	Crude ash	1.82±0.05C	1.86±0.08BC	2.09±0.13A	2.06±0.20AB	1.97±0.03ABC	2.07±0.03A	1.99±0.13ABC	1.94±0.17ABC
	Crude fat	43.30±0.84A	43.21±0.34A	42.14±0.95A	43.12±0.73A	43.15±0.58A	42.63±1.41A	42.81±1.42A	42.06±1.16A
	Crude protein	10.97±0.22A	10.67±0.05B	10.35±0.05C	10.28±0.01C	10.24±0.00CD	10.21±0.02CD	10.18±0.00CD	10.06±0.01D
40°C	Moisture	49.48±0.00D	50.99±0.26C	51.38±0.25C	51.42±0.16C	52.66±0.30AB	52.31±0.36B	53.09±0.21A	52.99±0.36A
	Crude ash	1.82±0.05C	1.89±0.00BC	1.98±0.06AB	1.96±0.03ABC	1.96±0.02ABC	2.02±0.13A	2.01±0.05A	1.99±0.08AB
	Crude fat	43.30±0.84A	42.25±0.61A	42.07±0.42A	42.38±1.06A	41.95±1.77A	42.14±1.77A	41.68±0.17A	41.75±1.47A
	Crude protein	10.97±0.22A	10.97±0.00B	10.43±0.01BC	10.30±0.01BC	10.23±0.00BC	10.19±0.00C	10.13±0.01CD	9.91±0.18D

¹⁾Moisture content: wet basis. crude ash, fat, and protein: dry basis..

²⁾Mean±SD. Values followed by the same uppercase letters are not significantly different (P<0.05) in the same row..

고추씨의 캡사이시노이드 함량 변화

발효 온도와 기간에 따른 고추씨의 캡사이시노이드 함량 변화를 확인하기 위해 증류수 75 mL를 첨가한 고추씨에 B. subtilis를 접종하고 35°C 또는 40°C에서 발효하여 24시간 간격으로 고추씨의 캡사이시노이드 함량을 측정하였다(Fig. 2). 발효 전 고추씨의 캡사이시노이드 함량은 33.77 mg/kg이었으며, 35°C와 40°C에서 발효한 고추씨의 경우 발효 1일차에 각각 30.16 mg/kg과 22.60 mg/kg으로 급격하게 감소하였다. 발효 기간 중 35°C보다 40°C에서 발효한 고추씨에서 캡사이시노이드 함량의 감소가 더 빠르게 나타났다. 온도와 관계없이 발효 기간에 따라 고추씨의 캡사이시노이드 함량은 점차 감소하여 발효 7차에는 40°C에서 3.58 mg/kg, 35°C에서 9.25 mg/kg으로 감소하였다. 최종적으로 40°C에서 발효한 고추씨가 35°C에서 발효한 고추씨에 비해 더 낮은 캡사이시노이드를 함유하고 있었으며, 이는 B. subtilis를 이용한 고추 발효 시 발효 기간이 증가할수록 캡사이신 함량이 감소한 Lee 등(2008)의 연구와 유사한 결과를 보였다.

Fig 2. apsaicinoid (□), capsaicin (○), and dihydrocapsaicin　(△）concentrations of chili pepper seeds fermented with 75 mL of water at 35°C (A) or 40°C (B) for up to 7 days. Bars indicate standard deviations.

고추씨의 총 폴리페놀 함량 변화

증류수 75 mL가 가해진 고추씨에 B. subtilis를 접종하고 35°C와 40°C에서 7일 동안 고추씨의 총 폴리페놀 함량 변화를 Table 6에 나타내었다. 발효 전 고추씨의 총 폴리페놀 함량은 3.95 mg GAE/g으로 나타났으며, 이는 토마토(0.33 mg/g), 사과(0.82 mg/g), 바나나(0.12 mg/g) 등과 같은 과채류에 비해 5~32배 높은 값에 해당된다(Kim 등, 2008). 특히, 항산화 효과가 있다고 알려진 호두(2.06 mg/g)나 해바라기 씨앗(2.02 mg/g)보다도 대략 2배 가까이 높게 나타났다(Zhang 등, 2009). 35°C와 40°C에서 발효한 고추씨 모두 발효 기간이 길어질수록 총 폴리페놀 함량이 발효 전보다 증가하는 경향을 보였다. 35°C에서 발효한 고추씨의 경우 발효 6일차에 5.01 mg GAE/g으로 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타내었으며, 40°C에서 발효한 고추씨는 발효 7일차에 6.07 mg GAE/g으로 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타냈다. 35°C에서 발효한 고추씨와 비교하여 40°C에서 발효한 고추씨가 발효 2일차부터 유의적으로 더 높은 총 폴리페놀 함량을 나타냈다. 식물계에 널리 분포된 2차 대사산물인 페놀성 화합물은 단백질 등의 거대 분자와 쉽게 결합하는 특징을 가지고 있으며, 항산화 등의 다양한 생리활성을 가진다고 알려져 있다(Lee 등, 2005). B. subtilis를 이용하여 발효한 현미 청국장의 총 폴리페놀 함량도 발효 기간이 증가함에 따라 증가하는 것으로 나타났다(Shin 등, 2014).

Table 6 . Total polyphenol content of chili pepper seeds fermented at 35°C or 40°C for up to 7 days.

Temp.	Total polyphenol content (mg GAE1)/g)
	Day 0	Day 1	Day 2	Day 3	Day 4	Day 5	Day 6	Day 7
35°C	3.95±0.06E2)	4.32±0.17D	4.22±0.04D*	4.54±0.07C*	4.66±0.06BC*	4.69±0.14BC*	5.01±0.09A*	4.73±0.12A*
40°C	3.95±0.06E	4.53±0.12E	5.13±0.07D	5.26±0.09D	5.43±0.11C	5.45±0.03C	5.86±0.06B	6.07±0.06A

¹⁾GAE: gallic acid equivalent..

²⁾Mean±SD. Values followed by different uppercase letters are significantly different (P<0.05) in the same row..

*Mean values in the same column are significantly different (P<0.05)..

고추씨의 항산화능 변화

증류수 75 mL를 첨가한 고추씨에 B. subtilis를 접종하여 발효 온도 및 발효 기간에 따른 고추씨의 항산화 활성 변화를 알아보기 위하여 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 분석을 실시하였다(Table 7, Table 8). 35°C에서 발효한 고추씨의 DPPH 라디칼 소거능은 발효 전 20.56%에서 발효 3일차에 26.92%, 40°C에서 발효한 고추씨의 경우 발효 2일차에 30.14%로 유의적인 증가가 나타났다. 35°C에서 발효한 고추씨는 발효 6일차에 31.35%로 가장 높은 소거능을 보였으며, 40°C에서 발효한 고추씨는 발효 7일차에 39.58%로 가장 높은 소거능을 보였다. Ali 등(2017)과 Chen 등(2020)의 연구 결과에서도 대두와 귀리를 B. subtilis로 발효했을 때, 발효 이전보다 발효 이후 DPPH 라디칼 소거능이 증가하여 본 연구와 유사한 결과를 나타냈다. 발효 온도에 따른 고추씨의 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 결과, 35°C보다 40°C에서 발효한 고추씨에서 더 높은 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타났다.

Table 7 . DPPH radical scavenging activity of chili pepper seeds fermented at 35°C or 40°C for up to 7 days.

Temp.	DPPH radical scavenging activity (%)
	Day 0	Day 1	Day 2	Day 3	Day 4	Day 5	Day 6	Day 7
35°C	20.56±0.06C1)	20.40±0.17C	23.20±0.09C*	26.92±0.06B	27.02±0.12B*	29.83±0.14AB*	31.35±0.04A*	30.54±0.07A*
40°C	20.56±0.06C	22.43±0.12C	30.14±0.07B	31.08±0.03B	31.74±0.11B	38.43±0.09A	39.45±0.06A	39.58±0.06A

¹⁾Mean±SD. Values followed by different uppercase letters are significantly different (P<0.05) in the same row..

*Mean values in the same column are significantly different (P<0.05)..

Table 8 . ABTS radical scavenging activity of chili pepper seeds fermented at 35°C or 40°C for up to 7 days.

Temp.	ABTS radical scavenging activity (%)
	Day 0	Day 1	Day 2	Day 3	Day 4	Day 5	Day 6	Day 7
35°C	34.07±0.06D1)	42.60±0.17C	43.11±0.04C*	45.74±0.12BC*	45.25±0.09BC*	46.76±0.14B	50.79±0.07A	47.07±0.06B*
40°C	34.07±0.06G	41.54±0.12F	48.76±0.09E	50.57±0.07DE	52.75±0.11CD	55.33±0.03BC	56.40±0.06AB	59.70±0.06A

¹⁾Mean±SD. Values followed by different uppercase letters are significantly different (P<0.05) in the same row..

*Mean values in the same column are significantly different (P<0.05)..

35°C와 40°C에서 발효한 고추씨의 ABTS 라디칼 소거능은 발효 전 34.07%에서 발효 1일차에 각각 42.60%와 41.54%로 유의적인 증가를 하였다. 35°C에서 발효한 고추씨는 발효 6일차에 50.79%로 최대 소거능을 보였으며, 40°C에서 발효한 고추씨의 경우 발효 7일차에 59.70%로 최대 소거능을 보였다. 35°C와 40°C에서 발효한 고추씨의 항산화능은 발효 기간이 증가할수록 유의적으로 증가하는 경향을 나타냈으며, 40°C에서 발효한 고추씨가 35°C에서 발효한 고추씨보다 유의적으로 더 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타냈다. Shin 등(2014)은 B. subtilis를 이용하여 발효한 현미 청국장의 발효 기간에 따른 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 분석한 결과 발효 기간이 증가할수록 청국장의 항산화능이 증가하는 것으로 보고하여 본 연구의 결과와 유사한 경향을 보였다. 또한, 본 연구의 결과에서 발효한 고추씨의 총 폴리페놀 함량이 증가하였고 이는 총 폴리페놀 함량이 높을수록 항산화 활성이 높게 나타난 다른 연구 결과와도 일치하였다(Boo 등, 2009; Choi 등, 2003). Hur 등(2014)은 미생물의 발효에 의해 효소적 또는 비효소적 항산화 활성이 나타나며, Bacillus는 발효과정에서 생성하는 가수분해 산물인 펩타이드나 아미노산 등에 의하여 라디칼 소거 활성이 증가한다고 보고하였다.

본 연구에서는 B. subtilis를 이용한 최적의 고추씨 발효 조건을 규명하고, 발효 조건(가수량, 온도, 기간)에 따른 고추씨의 발효 정도와 성분 변화를 분석하였다. 가수량(50 mL, 75 mL, 100 mL, 125 mL 및 150 mL), 발효 온도(25°C, 30°C, 35°C 및 40°C), 발효 기간(0~7일)에 따른 고추씨의 발효 정도를 관찰한 결과, 증류수 75 mL를 첨가하여 40°C에서 발효한 고추씨의 B. subtilis 개체수 및 pH가 가장 높은 값을 나타내어 이를 최적 발효 조건으로 선정하였다. 최적 조건으로 발효한 고추씨의 일반성분을 분석한 결과 발효에 의해 고추씨의 수분 함량이 증가했으며, 조회분 및 조지방 함량의 경우 발효로 인한 유의적인 변화는 나타나지 않았다. 고추씨의 캡사이시노이드 함량의 경우 7일간의 발효로 초기값에 비해 90%까지 감소하였다. 고추씨의 총 폴리페놀 함량은 발효 기간이 증가할수록 점차 증가하여 발효 7일차에 최대 함량을 나타냈으며, DPPH와 ABTS 라디칼 소거능도 발효 기간에 따라 점차 증가하여 총 폴리페놀 함량과 유사한 패턴을 보였다. 결론적으로 고추씨를 발효시켰을 때 캡사이신 함량은 감소하지만, 폴리페놀 함량과 항산화능은 오히려 증가하는 것을 확인하였다. 본 연구 결과를 통해 고추씨 활용에 제한점으로 작용하던 캡사이신을 성공적으로 분해하여 매운맛을 효과적으로 저감화하였고 폴리페놀이나 항산화능은 증가시켜 고추씨의 다양한 활용 방안을 제시할 것으로 보인다.

이 논문은 2018학년도 원광대학교 숭산학술연구기금 지원에 의해서 연구됨.