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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(7): 633-639

Published online July 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.7.633

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Inhibitory Effect of Mulberry Root Bark Extract and Its Derived Compounds on Cholesterol Regulation, Inflammation, and Platelet Aggregation

Yeon-Ji Kim1 , Kyungho Kim1, HaeYong Kweon2, Hyun-bok Kim2, and Ji Hae Lee2

1Korean Medicine-Application Center, Korea Institute of Oriental Medicine
2Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration

Correspondence to:Ji Hae Lee, Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, 166, Nongsaengmyeong-ro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea, E-mail: jihae@korea.kr

Received: February 16, 2022; Revised: May 17, 2022; Accepted: May 19, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Vascular abnormalities are a major risk factor in heart disease and have a high mortality rate. The mortality rate of heart disease is increasing every year due to lifestyle changes and the extension of lifespans. Therefore, the development of functional materials for the prevention of heart disease is required. In this study, the effect of mulberry root bark extracts and their compounds (resveratrol, oxyresveratrol, mulberroside A, morusin) on vascular health were investigated. The 100% ethanol extract of mulberry root bark resulted in the highest inhibition of cholesterol synthesis (−95%, P<0.05 vs. control), anti-inflammatory effects [−83%, P<0.05 vs. lipopolysaccharide (LPS) induced cell], and inhibition of platelet aggregation (−97%, P<0.05 vs. control). Stilbene chemicals, resveratrol and oxyresveratrol were highly effective in inhibiting platelet aggregation (−95% in both, P<0.05 vs. control). Morusin restored the secretion of nitric oxide and tumor necrosis factor-α to normal cell levels in LPS-induced Raw 264.7 cells. In conclusion, mulberry root bark and its compounds effectively suppressed cholesterol biosynthesis, inflammation, and platelet aggregation. Therefore, the 100% ethanol extract of mulberry root bark and its compounds could find application as functional food materials to promote vascular health and prevent atherosclerosis.

Keywords: mulberry root bark, cholesterol, vascular disease, oxyresveratrol, morusin

심혈관질환은 2020년 기준으로 우리나라 성인 사망률의 2위에 해당하며, 서구화된 식습관과 운동 부족으로 인한 심혈관질환 사망률은 점차 증가하고 있어 우리나라 인구 10만 명당 사망률이 2010년 46.9명에서 2020년 63.0명으로 지속적 증가세를 나타내고 있다(Statistics Korea, 2021). 높은 치사율을 나타내는 심혈관질환은 콜레스테롤의 축적과 염증이 문제가 되는 협심증, 동맥경화, 혈전에 의한 심근경색 등 복합적 원인에 의하여 심화한다. 특히 고콜레스테롤혈증은 혈관 건강의 주요 위험 요소로, 혈중 LDL 콜레스테롤의 증가는 혈관내피세포에 축적되고 산화되어 혈관내피세포의 부착 인자, 화학 유인물질, 성장인자의 발현을 촉진하고, 침윤된 monocyte의 대식세포로의 분화를 촉진한다. 또한 혈액 내 염증 인자도 혈관내피세포의 자극에 의한 부착 인자 발현량을 증가시키며, 이렇게 형성된 콜레스테롤 축적 대식세포는 포말형 세포로 분화되어 동맥경화 초기 병변을 형성한다(Hong 등, 2005; Bentzon 등, 2014). 혈전은 응고와 용해작용이 평형을 이루로 있는 혈액의 상태에 이상이 발생하여, 혈소판이 점착, 활성화, 응집단계를 걸쳐 형성되는 것으로 순환기에 발생하는 경우 혈류의 흐름을 막을 수 있는 위험인자이다(Yang 등, 2012). 이와 같은 심혈관계 이상 증상을 유의적으로 낮춰주는 것으로 알려진 약물로는 statin 계열이 있으며, 이는 주로 콜레스테롤 생합성 효소인 HMG-CoA reductase의 활성부위에 결합해 기질과 효소의 반응을 차단하여 혈중 콜레스테롤 농도를 낮춤으로써 작용한다(Istvan과 Deisenhofer, 2001). 그러나 statin 섭취 환자의 1~10%는 근육통을 겪은 것으로 보고되고 간, 신장 등에 부작용을 나타내는 것으로 알려져, 대체 약물의 개발 및 예방을 목적으로 하는 식품 및 천연물 소재 원료에 관한 연구가 지속해서 이루어지고 있다(Ramkumar 등, 2016).

상백피는 뽕나무의 뿌리껍질로, 식품 원료로 등록이 되어있는 소재이나 목질로 구성되어 있어 우리나라에서는 차로 섭취하거나 한약재로 사용되고 있다(Kwon 등, 1998). 지금까지 알려진 연구에 의하면 morusin, kuwanon, mulberroside 등 상백피 특이성분이 동정되었으며, stilbene 계열의 물질도 다량 함유되어 있다. Resveratrol을 기본 모체로 하는 stilbene은 포도, 땅콩, 뽕나무 등 몇몇 종류의 식물에서 발견되는 물질로, 심혈관계 질환 예방이나 항암, 항균 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 배당체화, 수산화 등에 의하여 다양한 화합물의 형태를 띤다(Choi, 2011). 상백피에는 국내 뽕나무 품종을 기준으로 resveratrol에 수산화기가 하나 더 결합한 oxyresveratrol의 함량이 더 높으며(Choi 등, 2005), 이는 resveratrol에 비해 항산화, 항염증 등의 효능이 더 우수한 물질로 보고되어 있고(Lorenz 등, 2003) 배당체인 mulberroside 등도 안정성 및 체내이동성이 증대되는 것으로 알려져 있다.

본 연구에서는 심혈관질환의 예방 및 치료를 위한 천연물 소재 탐색을 위하여 상백피 및 유래 물질의 고콜레스테롤혈증, 염증, 혈전 개선 여부를 확인하고자 하였으며, 이에 대한 접근방법으로 HMG-CoA reductase 활성, 콜레스테롤 대사 관련 유전자 발현 변화, 혈소판응집, 대식세포 염증반응을 측정하였다. Lee 등(2020)의 사전 연구에 따르면 상백피는 추출용매 및 추출온도에 따라 다른 항산화 활성 결과를 보였다. 에탄올 100% 추출물에서 가장 높은 폴리페놀 함량과 항산화 효능을 나타냈으며, 에탄올 농도가 감소할수록 함량이 낮아졌다. 따라서 생리활성이 가장 높은 에탄올 100% 추출물을 포함하는 4종의 추출물을 실험 대상으로 선발하였으며, 상백피 유래 물질로 resveratrol, oxyresveratrol, mulberroside A, morusin을 선발하여 추출물 및 유래 물질의 효능을 비교 분석하였다. 이와 같은 연구 결과는 차로 음용되던 상백피의 활용방안을 다양화하고, 기능성 원료 개발 분야의 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

상백피 추출물 및 단일물질 준비

상백피 시료는 울진농원(Uljin, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 상백피 분말 50 g을 취하여 용매(물, 50%, 100% 에탄올, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) 1 L를 가하고 2시간 동안 상온 또는 100°C에서 추출하였다. 이후 Miracloth(Millipore, Burlington, MA, USA)를 이용하여 시료를 거른 후 동결 건조하였고 -80°C에서 보관하며 실험에 사용하였다(Lee 등, 2020). 고온 100% 에탄올 추출물은 HE100, 고온 50% 에탄올 추출물은 HE50, 고온 증류수 추출물은 HE0, 상온 100% 에탄올 추출물은 LE100으로 표기하였다. 단일물질 resveratrol(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), oxyresveratrol(Sigma-Aldrich), mulberroside A(Aktin Chemicals, Inc., Chengdu, China), morusin(EnsolBio, Daejeon, Korea)은 구매하여 사용하였다. 분말 형태의 추출물과 단일물질은 각 100 mg/mL와 100 mM 농도로 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich)에 용해하고, 최종 처리농도에 맞게 희석하여 사용하였다.

콜레스테롤 생합성 효소 저해 활성 분석

HMG-CoA reductase assay kit(Sigma-Aldrich)을 이용하여 콜레스테롤 생합성 저해 효능을 측정하였다. 추출물 시료(10~100 mg/mL), 단일물질(0.1~100 mM), 양성대조군(pravastatin)을 1 μL씩 96-well plate에 분주하였다. Assay buffer와 NADPH 기질 용액, HMG-CoA reductase 효소 혼합물을 각 well에 199 μL씩 분주하고 37°C로 설정된 multiplate reader(Multiskan GO, Thermo Fisher, Waltham, MS, USA)를 이용하여 340 nm에서 30초 단위로 10분간 효소활성을 측정하였다(Kim 등, 2021a). 최종 처리농도는 반응 시약과 혼합비율을 반영하여 시료 5~500 μg/mL 및 단일물질 0.5~500 μM로 표기되었다.

간세포에서의 LDL 흡수량 측정

간 조직에서의 LDL 흡수량을 측정하기 위해 HepG2 세포주를 사용하였다. 검은색 96 well-plate에 세포를 1.5×105 cells/mL의 농도로 배양하고 추출 용매별 상백피 추출물을 100 μg/mL의 농도로 24시간 처리하였다. 이후 형광 표지된 LDL-DylightTM550(Abcam, Cambridge, UK)을 3시간 동안 처리한 뒤, 흡수된 LDL의 양을 540/570 nm에서 측정하여 대조군 대비 값으로 표기하였다.

콜레스테롤 대사 유전자 real-time PCR 분석

주요 콜레스테롤 대사 유전자인 LDL receptor(LDLR), ATP-binding cassette transporter(ABCA1), cholesterol 7 alpha-hydroxylase(CYP7A1)의 발현량을 HepG2 세포주에서 측정하였다. 상백피 LE100 추출물을 100 μg/mL의 농도로 24시간 처리한 후, PureLink RNA Mini Kit(Thermo Fisher)을 이용해 분리한 2 μg의 RNA를 amfi RivertII cDNA Synthesis Master Mix(Gendepot, Barker, TX, USA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 이후 TOPreal qPCR 2X PreMiX kit(Enzynomics, Daejeon, Korea)을 사용하여 증폭된 cDNA 값을 측정하였다(Kim 등, 2021a).

혈소판응집 분석

마우스(6~8주)의 혈소판은 citrate-dextrose 용액(ACD, Sigma-Aldrich)이 전처리된 주사기를 이용하여 마우스의 복부 정맥에서 채혈하였다. 혈소판이 풍부한 혈장을 얻기 위해 실온에서 20분 동안 300×g로 원심 분리한 후, 적혈구에서 분리된 혈장에 0.5 μM prostaglandin E1(Sigma-Aldrich)을 첨가하여 4분 동안 700×g에서 재원심 분리하였으며, 침전된 혈소판 10% ACD를 함유한 HEPES-Tyrode 완충액(5 mM HEPES/NaOH, pH 7.3, 5 mM 포도당, 136 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl)으로 세척 후 5분 동안 700×g에서 재원심 분리하였다. 침전된 혈소판은 HEPES-Tyrode 버퍼에서 3×108 cells/mL의 농도로 조정되어 실험에 적용하였다. 혈소판 응집측정을 위해서 마우스 혈소판을 HEPES-Tyrode 버퍼에 넣고 37°C에서 15분 동안 추출물 시료 처리 후 혈소판 응집계에서 collagen으로 활성화시켰다. 혈소판응집은 37°C의 혈소판 응집계(Chronolog Corp., Havertown, PA, USA)에서 1,000 rpm 속도로 혈소판응집을 유도하여 측정하였다(Kim 등, 2021b). 모든 동물실험 절차는 국립보건원 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침을 따랐으며 한국한의학연구원의 동물 관리 및 사용위원회(승인번호 KIOM-D-20-057)의 승인을 받았다.

항염증 활성 분석

항염증 실험에는 RAW 264.7 세포를 사용했으며, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(Caisson, North Logan, UT, USA) 배지에 10% fetal bovine serum(Gendepot)과 1% penicillin/streptomycin(Caisson)을 첨가하고, 37°C, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 염증 유도를 위해서 세포를 12-well plate에 2.5×105 cell/well로 분주하고, 24시간 이후 lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich) 1 μg/mL와 추출물(100 μg/mL) 혹은 단일물질(10~100 μM)을 처리하였다. 처리 24시간 이후 배지를 수거하여 nitric oxide(NO, Griess assay kit, Sigma-Aldrich) 및 tumor necrosis factor-α(TNFα, ELISA kit, Abcam)의 농도를 제조사의 지침에 따라 측정하였다(Kang 등, 2017).

통계처리

결괏값은 평균±표준편차로 표기하였다. 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 검정은 SAS Enterprise Guide 7.1 프로그램(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용했으며, Duncan의 다중범위 검정을 적용하였다(P<0.05; Lee 등, 2021)

상백피 및 유래 물질의 콜레스테롤 대사 조절 효능

콜레스테롤 생합성 효소인 HMG-CoA reductase 활성 실험 결과, 500 μg/mL 처리군에서 추출온도 및 용매와 관계없이 모두 대조군과 대비하여 유의적인 차이를 보였다(P<0.05, Fig. 1). 에탄올 100%를 이용한 LE100과 HE100에서 효소활성이 각각 95와 75% 감소하여 가장 높은 효과를 나타냈다. 단일물질 처리군에서는 resveratrol, oxyresveratrol, mulberroside A가 500 μM에서 효과를 나타냈으나, morusin 처리군은 대조군 대비 유의적 효과를 나타내지 않았다. 상백피 추출물을 이용한 간세포 LDL 흡수 실험에서는 100% 에탄올을 사용한 LE100과 HE100 군에서 대조군 대비 각각 10과 13% 증가하였다. 다음으로 HMG-CoA reductase와 LDL 흡수 실험에서 가장 높은 효능을 보인 상백피 LE100 추출물을 이용하여 주요 콜레스테롤 대사 유전자인 LDLR, ABCA1, CYP7A1의 발현 변화를 측정하였다. LDLR과 ABCA1은 대조군 대비 각각 3.1배, 2.4배 증가하였으며 CYP7A1은 변화가 없었다.

Fig. 1. Effect of mulberry root bark and its single compounds on cholesterol regulation. HMG-CoA reductase activities after mulberry root bark extract treatments (A) and single compounds treatments (B) were measured. In addition, hepatic cholesterol regulations were examined through LDL uptake assay (C) and real-time PCR in extract stimulated HepG2. Con, control; ST, pravastatin; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C; LDLR, LDL receptor; ABCA1, ATP-binding cassette transporter; CYP7A1, cholesterol 7 alpha-hydroxylase. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

고콜레스테롤혈증은 혈중 콜레스테롤 농도가 높아지는 대사질환으로 혈관 벽이 좁아지는 동맥경화의 대표적 원인이다(Rosmi 등, 2021). 혈중 콜레스테롤을 낮추는 약물인 statin은 콜레스테롤 합성에 관여하는 HMG-CoA reductase의 활성을 저해함으로써 혈중 콜레스테롤을 낮추는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2015). 상백피 추출물은 용매의 에탄올 함량이 높아질수록 효소의 활성 저해 효능이 증가하는 경향을 보였는데, 이는 물에 비해 극성이 낮은 에탄올에 용출되어 나오는 성분 중 HMG-CoA reductase를 효과적으로 저해시킬 수 있는 성분들이 함유된 것으로 추측해볼 수 있다. 단일물질 중 가장 높은 활성을 보인 oxyresveratrol의 500 μM은 122 μg/mL로 100% 에탄올 추출물 500 μg/mL에는 이보다 낮은 oxyresveratrol이 함유되어 있을 것으로 추측되며, 단일물질보다는 혼합물의 효과가 더 높은 결과를 보인 것으로 해석된다. 또한 저온에서 추출한 LE100이 HE100보다 높은 효능을 나타내었는데, 이는 물질의 열 안정성과 연관이 있을 것으로 추측된다. 열처리는 세포벽의 투과성을 높여 내부물질의 용출을 증가시키는 반면, 열 안정성이 낮은 물질의 손실을 야기한다. Resveratrol, oxyresveatrol 등은 stilbene 계열의 물질로 분류되며, Kosović 등(2020)의 연구에서는 stilbene의 종류, 시간, 열처리 온도에 따라 안정성이 달라지는 결과를 나타내어 고온 추출과정에서 일부 물질들이 영향을 받았을 가능성이 있을 것으로 사료되며, 상백피 추출조건에 따른 폴리페놀의 함량을 분석한 선행연구에서도 100% 에탄올 상온 추출이 고온 추출보다 더 높은 함량을 함유한 것으로 나타났다(Lee 등, 2020).

간조직은 콜레스테롤 대사에 있어 항상성 유지에 관여한다. 말단조직에 지질 성분의 축적을 유도하는 LDL 콜레스테롤은 LDLR에 의하여 조직 내로 흡수되고 재사용된다(Go와 Mani, 2012). 상백피 추출물은 간조직에서의 LDLR의 발현량을 증가시켜 LDL의 흡수를 증가시킴을 확인하였으며, 따라서 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 추측된다. ABCA1은 HDL 콜레스테롤을 활성화하는 유전자로(Oram과 Lawn, 2001), 상백피 처리군에서 발현이 증가했음을 확인하였으며, LDLR과 유사하게 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는 데 기여할 수 있다. 반면 담즙산을 생성하는 CYP7A1의 발현은 변화가 없었고 이는 세포막 등 다른 목적으로 사용됐을 가능성을 제시하였으며(Chiang과 Ferrell, 2020), 추후 in vivo 실험을 통한 조직 간 유기적 대사 분석이 필요할 것으로 생각된다.

상백피 및 유래 물질의 항염증 효능

염증 유도물질인 LPS로 염증반응을 유도한 Raw 264.7 세포에서 상백피 추출물 및 단일물질의 항염증 효능을 분석하였다(Fig. 2). 추출물 NO 저하 효능은 LE100과 HE100에서 LPS 처리군 대비 각각 83, 82%로 감소하였다(P<0.05 vs LPS). 단일물질 중 NO 저하 효능이 우수한 물질은 morusin으로 100과 10 μM 농도 처리 시 각각 95, 35% 감소하였다(P<0.05 vs. LPS). Resveratrol과 oxyresveratrol은 유사한 수준의 효과를 보였으며(100 μM 농도 기준 70~71% 감소), mulberroside A는 LPS 대비 유의적 차이가 없었다. 염증성사이토카인의 종류인 TNFα의 농도는 NO와 유사하게 LE100에서 가장 높은 감소율(-80% vs. LPS, P<0.05)을 보였으며, 물질에서도 morusin, resveratrol, oxyresveratrol, mulberroside A의 순서로 효과를 나타냈다.

Fig. 2. Effect of mulberry root bark and its single compounds on anti-inflammation. NO concentration after mulberry root bark extract (100 μg/mL) treatments (A) and single compounds (100 and 10 μM) treatments (B) were measured in the media of Raw 264.7 cells. TNFα concentration was also measured in the same media after mulberry root bark extract treatments (C), and single compounds (100 and 10 μM) treatments (D). Con, control; LPS, lipopolysaccharide; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). ND: not detected.

만성 염증은 동맥경화 등 혈관 건강의 위험요인으로 작용하며, 일부 사이토카인의 분비는 반응을 더 촉진한다(Zhang 등, 2019). Zhang 등(2014)의 연구에 따르면, 대표적 사이토카인인 TNFα의 마우스 주입은 죽상동맥경화증 발병을 심화시켰으며, LDL 침윤과 관련된 유전자의 전사를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 대식세포의 분화는 동맥경화의 초기 발병단계에서 플라크 형성에 관여하는데, 산화된 LDL도 이와 같은 반응의 가속화 요인으로 작용한다(Hu 등, 2012). 염증반응이 유도된 대식세포에서 상백피 추출물 및 단일물질의 처리는 염증반응을 완화하는 것으로 나타났으며, 단일물질 중에서는 morusin의 효과가 뛰어났다. 염증 조건하에서 비정상적으로 상승한 NO 및 TNFα의 분비량을 정상세포 수준으로 감소시킴이 확인되어 stilbene 계열 물질보다 강력한 항염증 효능을 보이는 것으로 나타났다. 또한 선행연구에서 상백피 추출물은 높은 항산화 활성을 나타내었다(Lee 등, 2020). 에탄올 100% 추출물에서 주요 항산화 물질인 폴리페놀과 플라보노이드 계열 물질의 용출량이 증가하였으며, 라디칼 소거 활성이 물 추출물에 비해 높게 측정되었다. 따라서 만성 염증 및 대식세포 변형의 원인이 되는 산화 LDL을 안정화함에도 상백피 추출물이 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.

상백피 및 유래 물질의 항혈전 효능

상백피 에탄올 50~100% 추출물의 100 μg/mL 농도 처리군에서는 높은 수준의 혈소판응집률을 나타냈다(3.1~3.6%, Fig. 3). 저농도인 10 μg/mL 처리군에서는 HE50과 HE100의 응집률이 6.2~6.7%로 우수하였고, LE100이 23%, HE0이 70%로 측정되었다. 단일물질에서는 resveratrol과 oxyresveratrol이 유사한 수준으로 응집력이 낮았으며, morusin, mulberroside A의 순으로 나타났다.

Fig. 3. Effect of mulberry root bark and its single compounds on anti-platelet aggregation. Platelet aggregation efficiency was measured after mulberry root bark extract (100 and 10 μg/mL) treatments (A) and single compounds (100 and 10 μM) treatments (B). Con, control; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

혈전생성은 혈액순환을 방해하며, 뇌 혹은 심장에 발생할 경우 생명에 치명적이고 후유증을 남긴다. 정상인에게서는 혈액의 응고와 용해작용이 균형을 이루나, 혈관 벽의 생리적 손상이 발생하는 경우 혈소판이 침착하며 혈전생성 기전이 시작된다(Park 등, 2009).

혈소판응집은 단계적 반응에 따라 진행되며, 본 연구에서는 콜라겐에 의해 활성화된 혈소판에서의 응집반응을 측정하였다. 응고 과정에서 콜라겐은 내피세포와 혈소판의 부착을 지지하고 응집, 분비, 응고를 활성화한다. 이후 혈소판 내 칼슘 농도의 변화를 유도하여 관련 단백질(plecktrin)의 인산화와 단백질의 재배열에 따른 응집반응을 일으킨다(Lee, 2020). 혈소판응집률 저해 효과는 resveratrol과 oxyresveratrol에서 높게 나타났고, 배당체인 mulberroside A에서는 100 μg/mL 농도에서만 유의적 차이를 나타냈다. 상대적으로 수용성이 높은 mulberroside A에서 효과가 미미하게 나타난 것은 상백피 물 추출물에서 효과가 감소하는 결과와도 일치되는 경향을 보였다. 상백피의 대표적 물질들을 선발하여 추출물과의 효능을 비교하였으며, 본 연구에서 제시된 물질 외에도 혈관 건강에 영향을 미치는 물질들이 추출물에는 다수 함유되어 있을 것으로 예상된다. 상백피 추출물의 혈관 건강증진 효능과 관련된 지표 물질에 관한 연구가 추후 요구된다.

뽕나무의 뿌리껍질이 원료인 상백피는 콜레스테롤 합성 저해, 염증 억제, 혈소판 항응집 효능을 보였으며, 에탄올 100% 추출물에서 높은 활성을 나타냈다. 상백피 100% 에탄올 추출물은 콜레스테롤 생합성 억제뿐 아니라 LDLR 발현량 증가에 따른 LDLR 흡수율을 증가시켜 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시킬 수 있을 것으로 예상되었다. 또한 항염증 및 콜라겐 활성에 의한 혈소판응집에서도 효과를 나타내 복합적 원인에 의한 심혈관계 질환 예방에 효과를 나타낼 것으로 분석된다. 상백피의 유래 물질 중 stilbene 계열의 resveratrol과 oxyresveratrol은 혈소판응집률 저해가 우수하였고, morusin은 염증 발생으로 인한 대식세포에서의 NO 및 TNFα의 분비량을 정상세포 수준으로 감소시키는 효능을 나타냈다. HMG-CoA reductase의 활성 저해에는 oxyresveratrol의 효능이 뛰어났으나 상백피 추출물 자체의 활성이 더 높게 나타나, 복합물 혹은 다른 물질에 의한 효소 저해 활성이 더 뛰어난 것으로 사료된다. 상백피 유래 물질에 따라 활성에 차이가 있음을 확인하였으며, 이와 같은 연구데이터는 혈관 염증, 혈전생성 및 고콜레스테롤혈증으로 인한 동맥경화 등 혈관 건강을 개선하는 기능성 원료를 개발함에 있어 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

본 연구는 농촌진흥청 연구비 지원(과제번호 PJ01510701)에 의하여 연구되었으며 이에 감사드립니다.

  1. Bentzon JF, Otsuka F, Virmani R, Falk E. Mechanisms of plaque formation and rupture. Circ Res. 2014. 114:1852-1866.
    Pubmed CrossRef
  2. Chiang JYL, Ferrell JM. Up to date on cholesterol 7 alpha-hydroxylase (CYP7A1) in bile acid synthesis. Liver Res. 2020. 4:47-63.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  3. Choi SJ. The identification of stilbene compounds and the change of their contents in UV-irradiated grapevine leaves. Kor J Hort Sci Technol. 2011. 29:374-381.
  4. Choi SY, Lee KJ, Kim SS, Kim SY. Comparison of resveratrol and oxyresveratrol contents among varietes of Morus alba L. Korean J Medicinal Crop Sci. 2005. 13:146-149.
  5. Go GW, Mani A. Low-density lipoprotein receptor (LDLR) family orchestrates cholesterol homeostasis. Yale J Biol Med. 2012. 85:19-28.
  6. Hong SH, Chai HY, Kim TM, Lee NJ, Kim DK, Cho JH, et al. Therapeutic effects of mulberry root-bark (Mori radicis cortex) ethanol extract on atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits. Lab Anim Res. 2005. 21:273-279.
  7. Hu LH, Zhang T, Shao Q, Li DD, Jin SX, Nie P, et al. Atorvastatin suppresses oxidized LDL-induced dendritic cell-like differentiation of RAW264.7 cells regulated by the p38 MAPK pathway. Mol Cell Biochem. 2012. 371:105-113.
    Pubmed CrossRef
  8. Istvan ES, Deisenhofer J. Structural mechanism for statin inhibition of HMG-CoA reductase. Science. 2001. 292:1160-1164.
    Pubmed CrossRef
  9. Kang MS, Kim MJ, Han JS, Kim AJ. Fatty acid composition and anti-inflammatory effects of the freeze dried Tenebrio molitor larva. Korean J Food Nutr. 2017. 30:251-256.
    CrossRef
  10. Kim SH, Jo YY, Kweon HY, Lee JH. Effect of extraction conditions on radical scavenging and cholesterol metabolism regulating capacity of silkworm larvae. Int J Indust Entomol. 2021a. 43:45-51.
  11. Kim TI, Kim YJ, Kim K. Extract of seaweed Codium fragile inhibits integrin αⅡbβ3-induced outside-in signaling and arterial thrombosis. Front Pharmacol. 2021b. 12:685948. https://doi.org/10.3389/fphar.2021.685948
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Kosović E, Topiař M, Cuřínová P, Sajfrtová M. Stability testing of resveratrol and viniferin obtained from Vitis vinifera L. by various extraction methods considering the industrial viewpoint. Sci Rep. 2020. 10:5564. https://doi.org/10.1038/s41598-020-62603-w
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Kwon SK, Park SW, Choi WY. Properties of the proteolytic enzymes from mulberry tree barks (Morus alba Linne). Korean J Food Nutr. 1998. 11:576-579.
  14. Lee DH. Inhibitory effects of scoparone on thrombus formation via regulation of cyclic nucleotides in collagen-induced platelets. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2020. 49:11-18.
    CrossRef
  15. Lee JH, Jo YY, Kim SW, Kweon HY. Antioxidant capacity of silkworm pupa according to extraction condition, variety, pupation time, and sex. Int J Indust Entomol. 2021. 43:59-66.
  16. Lee JH, Lee SY, Kim B, Seo WD, Jia Y, Wu C, et al. Barley sprout extract containing policosanols and polyphenols regulate AMPK, SREBP2 and ACAT2 activity and cholesterol and glucose metabolism in vitro and in vivo. Food Res Int. 2015. 72:174-183.
    CrossRef
  17. Lee S, Kim SH, Jo YY, Kim SW, Kim HB, Kweon HY, et al. Characterization of mulberry root bark extracts (Morus alba L.) based on the extraction temperature and solvent. Int J Indust Entomol. 2020. 41:36-44.
  18. Lorenz P, Roychowdhury S, Engelmann M, Wolf G, Horn TFW. Oxyresveratrol and resveratrol are potent antioxidants and free radical scavengers: effect on nitrosative and oxidative stress derived from microglial cells. Nitric Oxide. 2003. 9:64-76.
    Pubmed CrossRef
  19. Oram JF, Lawn RM. ABCA1: the gatekeeper for eliminating excess tissue cholesterol. J Lipid Res. 2001. 42:1173-1179.
    CrossRef
  20. Park SH, Park KJ, Kim JK. The effects of Mume Fructus extracts on blood flow improvement. Yakhak Hoeji. 2009. 53:298-302.
  21. Ramkumar S, Raghunath A, Raghunath S. Statin therapy: Review of safety and potential side effects. Acta Cardiol Sin. 2016. 32:631-639.
  22. Rosmi NSAM, Shafie NH, Azlan A, Abdullah MA. Functional food mixtures: Inhibition of lipid peroxidation, HMGCoA reductase, and ACAT2 in hypercholesterolemia-induced rats. Food Sci Nutr. 2021. 9:875-887.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  23. Statistics Korea. Causes of death statistics in 2020. 2021 [cited 2022 Feb 14]. Available from: https://kostat.go.kr/portal/korea/kor_nw/1/6/2/index.board?bmode=read&bSeq=&aSeq=403046&pageNo=1&rowNum=10&navCount=10&currPg=&searchInfo=&sTarget=title&sTxt=
  24. Yang WK, Sung YY, Kim HK. Antithrombotic effect and antiplatelet activity of Polygonum cuspidatum extract. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2012. 41:168-173.
    CrossRef
  25. Zhang H, Gong X, Ni S, Wang Y, Zhu L, Ji N. C1q/TNF-related protein-9 attenuates atherosclerosis through AMPK-NLRP3 inflammasome singling pathway. Int Immunopharmacol. 2019. 77:105934. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2019.105934
    Pubmed CrossRef
  26. Zhang Y, Yang X, Bian F, Wu P, Xing S, Xu G, et al. TNF-α promotes early atherosclerosis by increasing transcytosis of LDL across endothelial cells: Crosstalk between NF-κB and PPAR-γ. J Mol Cell Cardiol. 2014. 72:85-94.
    Pubmed CrossRef

Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(7): 633-639

Published online July 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.7.633

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

뽕나무 상백피 추출물과 유래 물질의 콜레스테롤 조절, 염증, 혈소판응집 억제 효능

김연지1․김경호1․권해용2․김현복2․이지혜2

1한국한의학연구원 한의기술응용센터
2국립농업과학원 농업생물부

Received: February 16, 2022; Revised: May 17, 2022; Accepted: May 19, 2022

Inhibitory Effect of Mulberry Root Bark Extract and Its Derived Compounds on Cholesterol Regulation, Inflammation, and Platelet Aggregation

Yeon-Ji Kim1 , Kyungho Kim1, HaeYong Kweon2, Hyun-bok Kim2, and Ji Hae Lee2

1Korean Medicine-Application Center, Korea Institute of Oriental Medicine
2Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration

Correspondence to:Ji Hae Lee, Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, 166, Nongsaengmyeong-ro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea, E-mail: jihae@korea.kr

Received: February 16, 2022; Revised: May 17, 2022; Accepted: May 19, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Vascular abnormalities are a major risk factor in heart disease and have a high mortality rate. The mortality rate of heart disease is increasing every year due to lifestyle changes and the extension of lifespans. Therefore, the development of functional materials for the prevention of heart disease is required. In this study, the effect of mulberry root bark extracts and their compounds (resveratrol, oxyresveratrol, mulberroside A, morusin) on vascular health were investigated. The 100% ethanol extract of mulberry root bark resulted in the highest inhibition of cholesterol synthesis (−95%, P<0.05 vs. control), anti-inflammatory effects [−83%, P<0.05 vs. lipopolysaccharide (LPS) induced cell], and inhibition of platelet aggregation (−97%, P<0.05 vs. control). Stilbene chemicals, resveratrol and oxyresveratrol were highly effective in inhibiting platelet aggregation (−95% in both, P<0.05 vs. control). Morusin restored the secretion of nitric oxide and tumor necrosis factor-α to normal cell levels in LPS-induced Raw 264.7 cells. In conclusion, mulberry root bark and its compounds effectively suppressed cholesterol biosynthesis, inflammation, and platelet aggregation. Therefore, the 100% ethanol extract of mulberry root bark and its compounds could find application as functional food materials to promote vascular health and prevent atherosclerosis.

Keywords: mulberry root bark, cholesterol, vascular disease, oxyresveratrol, morusin

서 론

심혈관질환은 2020년 기준으로 우리나라 성인 사망률의 2위에 해당하며, 서구화된 식습관과 운동 부족으로 인한 심혈관질환 사망률은 점차 증가하고 있어 우리나라 인구 10만 명당 사망률이 2010년 46.9명에서 2020년 63.0명으로 지속적 증가세를 나타내고 있다(Statistics Korea, 2021). 높은 치사율을 나타내는 심혈관질환은 콜레스테롤의 축적과 염증이 문제가 되는 협심증, 동맥경화, 혈전에 의한 심근경색 등 복합적 원인에 의하여 심화한다. 특히 고콜레스테롤혈증은 혈관 건강의 주요 위험 요소로, 혈중 LDL 콜레스테롤의 증가는 혈관내피세포에 축적되고 산화되어 혈관내피세포의 부착 인자, 화학 유인물질, 성장인자의 발현을 촉진하고, 침윤된 monocyte의 대식세포로의 분화를 촉진한다. 또한 혈액 내 염증 인자도 혈관내피세포의 자극에 의한 부착 인자 발현량을 증가시키며, 이렇게 형성된 콜레스테롤 축적 대식세포는 포말형 세포로 분화되어 동맥경화 초기 병변을 형성한다(Hong 등, 2005; Bentzon 등, 2014). 혈전은 응고와 용해작용이 평형을 이루로 있는 혈액의 상태에 이상이 발생하여, 혈소판이 점착, 활성화, 응집단계를 걸쳐 형성되는 것으로 순환기에 발생하는 경우 혈류의 흐름을 막을 수 있는 위험인자이다(Yang 등, 2012). 이와 같은 심혈관계 이상 증상을 유의적으로 낮춰주는 것으로 알려진 약물로는 statin 계열이 있으며, 이는 주로 콜레스테롤 생합성 효소인 HMG-CoA reductase의 활성부위에 결합해 기질과 효소의 반응을 차단하여 혈중 콜레스테롤 농도를 낮춤으로써 작용한다(Istvan과 Deisenhofer, 2001). 그러나 statin 섭취 환자의 1~10%는 근육통을 겪은 것으로 보고되고 간, 신장 등에 부작용을 나타내는 것으로 알려져, 대체 약물의 개발 및 예방을 목적으로 하는 식품 및 천연물 소재 원료에 관한 연구가 지속해서 이루어지고 있다(Ramkumar 등, 2016).

상백피는 뽕나무의 뿌리껍질로, 식품 원료로 등록이 되어있는 소재이나 목질로 구성되어 있어 우리나라에서는 차로 섭취하거나 한약재로 사용되고 있다(Kwon 등, 1998). 지금까지 알려진 연구에 의하면 morusin, kuwanon, mulberroside 등 상백피 특이성분이 동정되었으며, stilbene 계열의 물질도 다량 함유되어 있다. Resveratrol을 기본 모체로 하는 stilbene은 포도, 땅콩, 뽕나무 등 몇몇 종류의 식물에서 발견되는 물질로, 심혈관계 질환 예방이나 항암, 항균 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 배당체화, 수산화 등에 의하여 다양한 화합물의 형태를 띤다(Choi, 2011). 상백피에는 국내 뽕나무 품종을 기준으로 resveratrol에 수산화기가 하나 더 결합한 oxyresveratrol의 함량이 더 높으며(Choi 등, 2005), 이는 resveratrol에 비해 항산화, 항염증 등의 효능이 더 우수한 물질로 보고되어 있고(Lorenz 등, 2003) 배당체인 mulberroside 등도 안정성 및 체내이동성이 증대되는 것으로 알려져 있다.

본 연구에서는 심혈관질환의 예방 및 치료를 위한 천연물 소재 탐색을 위하여 상백피 및 유래 물질의 고콜레스테롤혈증, 염증, 혈전 개선 여부를 확인하고자 하였으며, 이에 대한 접근방법으로 HMG-CoA reductase 활성, 콜레스테롤 대사 관련 유전자 발현 변화, 혈소판응집, 대식세포 염증반응을 측정하였다. Lee 등(2020)의 사전 연구에 따르면 상백피는 추출용매 및 추출온도에 따라 다른 항산화 활성 결과를 보였다. 에탄올 100% 추출물에서 가장 높은 폴리페놀 함량과 항산화 효능을 나타냈으며, 에탄올 농도가 감소할수록 함량이 낮아졌다. 따라서 생리활성이 가장 높은 에탄올 100% 추출물을 포함하는 4종의 추출물을 실험 대상으로 선발하였으며, 상백피 유래 물질로 resveratrol, oxyresveratrol, mulberroside A, morusin을 선발하여 추출물 및 유래 물질의 효능을 비교 분석하였다. 이와 같은 연구 결과는 차로 음용되던 상백피의 활용방안을 다양화하고, 기능성 원료 개발 분야의 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

재료 및 방법

상백피 추출물 및 단일물질 준비

상백피 시료는 울진농원(Uljin, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 상백피 분말 50 g을 취하여 용매(물, 50%, 100% 에탄올, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) 1 L를 가하고 2시간 동안 상온 또는 100°C에서 추출하였다. 이후 Miracloth(Millipore, Burlington, MA, USA)를 이용하여 시료를 거른 후 동결 건조하였고 -80°C에서 보관하며 실험에 사용하였다(Lee 등, 2020). 고온 100% 에탄올 추출물은 HE100, 고온 50% 에탄올 추출물은 HE50, 고온 증류수 추출물은 HE0, 상온 100% 에탄올 추출물은 LE100으로 표기하였다. 단일물질 resveratrol(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), oxyresveratrol(Sigma-Aldrich), mulberroside A(Aktin Chemicals, Inc., Chengdu, China), morusin(EnsolBio, Daejeon, Korea)은 구매하여 사용하였다. 분말 형태의 추출물과 단일물질은 각 100 mg/mL와 100 mM 농도로 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich)에 용해하고, 최종 처리농도에 맞게 희석하여 사용하였다.

콜레스테롤 생합성 효소 저해 활성 분석

HMG-CoA reductase assay kit(Sigma-Aldrich)을 이용하여 콜레스테롤 생합성 저해 효능을 측정하였다. 추출물 시료(10~100 mg/mL), 단일물질(0.1~100 mM), 양성대조군(pravastatin)을 1 μL씩 96-well plate에 분주하였다. Assay buffer와 NADPH 기질 용액, HMG-CoA reductase 효소 혼합물을 각 well에 199 μL씩 분주하고 37°C로 설정된 multiplate reader(Multiskan GO, Thermo Fisher, Waltham, MS, USA)를 이용하여 340 nm에서 30초 단위로 10분간 효소활성을 측정하였다(Kim 등, 2021a). 최종 처리농도는 반응 시약과 혼합비율을 반영하여 시료 5~500 μg/mL 및 단일물질 0.5~500 μM로 표기되었다.

간세포에서의 LDL 흡수량 측정

간 조직에서의 LDL 흡수량을 측정하기 위해 HepG2 세포주를 사용하였다. 검은색 96 well-plate에 세포를 1.5×105 cells/mL의 농도로 배양하고 추출 용매별 상백피 추출물을 100 μg/mL의 농도로 24시간 처리하였다. 이후 형광 표지된 LDL-DylightTM550(Abcam, Cambridge, UK)을 3시간 동안 처리한 뒤, 흡수된 LDL의 양을 540/570 nm에서 측정하여 대조군 대비 값으로 표기하였다.

콜레스테롤 대사 유전자 real-time PCR 분석

주요 콜레스테롤 대사 유전자인 LDL receptor(LDLR), ATP-binding cassette transporter(ABCA1), cholesterol 7 alpha-hydroxylase(CYP7A1)의 발현량을 HepG2 세포주에서 측정하였다. 상백피 LE100 추출물을 100 μg/mL의 농도로 24시간 처리한 후, PureLink RNA Mini Kit(Thermo Fisher)을 이용해 분리한 2 μg의 RNA를 amfi RivertII cDNA Synthesis Master Mix(Gendepot, Barker, TX, USA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 이후 TOPreal qPCR 2X PreMiX kit(Enzynomics, Daejeon, Korea)을 사용하여 증폭된 cDNA 값을 측정하였다(Kim 등, 2021a).

혈소판응집 분석

마우스(6~8주)의 혈소판은 citrate-dextrose 용액(ACD, Sigma-Aldrich)이 전처리된 주사기를 이용하여 마우스의 복부 정맥에서 채혈하였다. 혈소판이 풍부한 혈장을 얻기 위해 실온에서 20분 동안 300×g로 원심 분리한 후, 적혈구에서 분리된 혈장에 0.5 μM prostaglandin E1(Sigma-Aldrich)을 첨가하여 4분 동안 700×g에서 재원심 분리하였으며, 침전된 혈소판 10% ACD를 함유한 HEPES-Tyrode 완충액(5 mM HEPES/NaOH, pH 7.3, 5 mM 포도당, 136 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl)으로 세척 후 5분 동안 700×g에서 재원심 분리하였다. 침전된 혈소판은 HEPES-Tyrode 버퍼에서 3×108 cells/mL의 농도로 조정되어 실험에 적용하였다. 혈소판 응집측정을 위해서 마우스 혈소판을 HEPES-Tyrode 버퍼에 넣고 37°C에서 15분 동안 추출물 시료 처리 후 혈소판 응집계에서 collagen으로 활성화시켰다. 혈소판응집은 37°C의 혈소판 응집계(Chronolog Corp., Havertown, PA, USA)에서 1,000 rpm 속도로 혈소판응집을 유도하여 측정하였다(Kim 등, 2021b). 모든 동물실험 절차는 국립보건원 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침을 따랐으며 한국한의학연구원의 동물 관리 및 사용위원회(승인번호 KIOM-D-20-057)의 승인을 받았다.

항염증 활성 분석

항염증 실험에는 RAW 264.7 세포를 사용했으며, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(Caisson, North Logan, UT, USA) 배지에 10% fetal bovine serum(Gendepot)과 1% penicillin/streptomycin(Caisson)을 첨가하고, 37°C, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 염증 유도를 위해서 세포를 12-well plate에 2.5×105 cell/well로 분주하고, 24시간 이후 lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich) 1 μg/mL와 추출물(100 μg/mL) 혹은 단일물질(10~100 μM)을 처리하였다. 처리 24시간 이후 배지를 수거하여 nitric oxide(NO, Griess assay kit, Sigma-Aldrich) 및 tumor necrosis factor-α(TNFα, ELISA kit, Abcam)의 농도를 제조사의 지침에 따라 측정하였다(Kang 등, 2017).

통계처리

결괏값은 평균±표준편차로 표기하였다. 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 검정은 SAS Enterprise Guide 7.1 프로그램(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용했으며, Duncan의 다중범위 검정을 적용하였다(P<0.05; Lee 등, 2021)

결과 및 고찰

상백피 및 유래 물질의 콜레스테롤 대사 조절 효능

콜레스테롤 생합성 효소인 HMG-CoA reductase 활성 실험 결과, 500 μg/mL 처리군에서 추출온도 및 용매와 관계없이 모두 대조군과 대비하여 유의적인 차이를 보였다(P<0.05, Fig. 1). 에탄올 100%를 이용한 LE100과 HE100에서 효소활성이 각각 95와 75% 감소하여 가장 높은 효과를 나타냈다. 단일물질 처리군에서는 resveratrol, oxyresveratrol, mulberroside A가 500 μM에서 효과를 나타냈으나, morusin 처리군은 대조군 대비 유의적 효과를 나타내지 않았다. 상백피 추출물을 이용한 간세포 LDL 흡수 실험에서는 100% 에탄올을 사용한 LE100과 HE100 군에서 대조군 대비 각각 10과 13% 증가하였다. 다음으로 HMG-CoA reductase와 LDL 흡수 실험에서 가장 높은 효능을 보인 상백피 LE100 추출물을 이용하여 주요 콜레스테롤 대사 유전자인 LDLR, ABCA1, CYP7A1의 발현 변화를 측정하였다. LDLR과 ABCA1은 대조군 대비 각각 3.1배, 2.4배 증가하였으며 CYP7A1은 변화가 없었다.

Fig 1. Effect of mulberry root bark and its single compounds on cholesterol regulation. HMG-CoA reductase activities after mulberry root bark extract treatments (A) and single compounds treatments (B) were measured. In addition, hepatic cholesterol regulations were examined through LDL uptake assay (C) and real-time PCR in extract stimulated HepG2. Con, control; ST, pravastatin; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C; LDLR, LDL receptor; ABCA1, ATP-binding cassette transporter; CYP7A1, cholesterol 7 alpha-hydroxylase. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

고콜레스테롤혈증은 혈중 콜레스테롤 농도가 높아지는 대사질환으로 혈관 벽이 좁아지는 동맥경화의 대표적 원인이다(Rosmi 등, 2021). 혈중 콜레스테롤을 낮추는 약물인 statin은 콜레스테롤 합성에 관여하는 HMG-CoA reductase의 활성을 저해함으로써 혈중 콜레스테롤을 낮추는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2015). 상백피 추출물은 용매의 에탄올 함량이 높아질수록 효소의 활성 저해 효능이 증가하는 경향을 보였는데, 이는 물에 비해 극성이 낮은 에탄올에 용출되어 나오는 성분 중 HMG-CoA reductase를 효과적으로 저해시킬 수 있는 성분들이 함유된 것으로 추측해볼 수 있다. 단일물질 중 가장 높은 활성을 보인 oxyresveratrol의 500 μM은 122 μg/mL로 100% 에탄올 추출물 500 μg/mL에는 이보다 낮은 oxyresveratrol이 함유되어 있을 것으로 추측되며, 단일물질보다는 혼합물의 효과가 더 높은 결과를 보인 것으로 해석된다. 또한 저온에서 추출한 LE100이 HE100보다 높은 효능을 나타내었는데, 이는 물질의 열 안정성과 연관이 있을 것으로 추측된다. 열처리는 세포벽의 투과성을 높여 내부물질의 용출을 증가시키는 반면, 열 안정성이 낮은 물질의 손실을 야기한다. Resveratrol, oxyresveatrol 등은 stilbene 계열의 물질로 분류되며, Kosović 등(2020)의 연구에서는 stilbene의 종류, 시간, 열처리 온도에 따라 안정성이 달라지는 결과를 나타내어 고온 추출과정에서 일부 물질들이 영향을 받았을 가능성이 있을 것으로 사료되며, 상백피 추출조건에 따른 폴리페놀의 함량을 분석한 선행연구에서도 100% 에탄올 상온 추출이 고온 추출보다 더 높은 함량을 함유한 것으로 나타났다(Lee 등, 2020).

간조직은 콜레스테롤 대사에 있어 항상성 유지에 관여한다. 말단조직에 지질 성분의 축적을 유도하는 LDL 콜레스테롤은 LDLR에 의하여 조직 내로 흡수되고 재사용된다(Go와 Mani, 2012). 상백피 추출물은 간조직에서의 LDLR의 발현량을 증가시켜 LDL의 흡수를 증가시킴을 확인하였으며, 따라서 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 추측된다. ABCA1은 HDL 콜레스테롤을 활성화하는 유전자로(Oram과 Lawn, 2001), 상백피 처리군에서 발현이 증가했음을 확인하였으며, LDLR과 유사하게 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는 데 기여할 수 있다. 반면 담즙산을 생성하는 CYP7A1의 발현은 변화가 없었고 이는 세포막 등 다른 목적으로 사용됐을 가능성을 제시하였으며(Chiang과 Ferrell, 2020), 추후 in vivo 실험을 통한 조직 간 유기적 대사 분석이 필요할 것으로 생각된다.

상백피 및 유래 물질의 항염증 효능

염증 유도물질인 LPS로 염증반응을 유도한 Raw 264.7 세포에서 상백피 추출물 및 단일물질의 항염증 효능을 분석하였다(Fig. 2). 추출물 NO 저하 효능은 LE100과 HE100에서 LPS 처리군 대비 각각 83, 82%로 감소하였다(P<0.05 vs LPS). 단일물질 중 NO 저하 효능이 우수한 물질은 morusin으로 100과 10 μM 농도 처리 시 각각 95, 35% 감소하였다(P<0.05 vs. LPS). Resveratrol과 oxyresveratrol은 유사한 수준의 효과를 보였으며(100 μM 농도 기준 70~71% 감소), mulberroside A는 LPS 대비 유의적 차이가 없었다. 염증성사이토카인의 종류인 TNFα의 농도는 NO와 유사하게 LE100에서 가장 높은 감소율(-80% vs. LPS, P<0.05)을 보였으며, 물질에서도 morusin, resveratrol, oxyresveratrol, mulberroside A의 순서로 효과를 나타냈다.

Fig 2. Effect of mulberry root bark and its single compounds on anti-inflammation. NO concentration after mulberry root bark extract (100 μg/mL) treatments (A) and single compounds (100 and 10 μM) treatments (B) were measured in the media of Raw 264.7 cells. TNFα concentration was also measured in the same media after mulberry root bark extract treatments (C), and single compounds (100 and 10 μM) treatments (D). Con, control; LPS, lipopolysaccharide; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). ND: not detected.

만성 염증은 동맥경화 등 혈관 건강의 위험요인으로 작용하며, 일부 사이토카인의 분비는 반응을 더 촉진한다(Zhang 등, 2019). Zhang 등(2014)의 연구에 따르면, 대표적 사이토카인인 TNFα의 마우스 주입은 죽상동맥경화증 발병을 심화시켰으며, LDL 침윤과 관련된 유전자의 전사를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 대식세포의 분화는 동맥경화의 초기 발병단계에서 플라크 형성에 관여하는데, 산화된 LDL도 이와 같은 반응의 가속화 요인으로 작용한다(Hu 등, 2012). 염증반응이 유도된 대식세포에서 상백피 추출물 및 단일물질의 처리는 염증반응을 완화하는 것으로 나타났으며, 단일물질 중에서는 morusin의 효과가 뛰어났다. 염증 조건하에서 비정상적으로 상승한 NO 및 TNFα의 분비량을 정상세포 수준으로 감소시킴이 확인되어 stilbene 계열 물질보다 강력한 항염증 효능을 보이는 것으로 나타났다. 또한 선행연구에서 상백피 추출물은 높은 항산화 활성을 나타내었다(Lee 등, 2020). 에탄올 100% 추출물에서 주요 항산화 물질인 폴리페놀과 플라보노이드 계열 물질의 용출량이 증가하였으며, 라디칼 소거 활성이 물 추출물에 비해 높게 측정되었다. 따라서 만성 염증 및 대식세포 변형의 원인이 되는 산화 LDL을 안정화함에도 상백피 추출물이 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.

상백피 및 유래 물질의 항혈전 효능

상백피 에탄올 50~100% 추출물의 100 μg/mL 농도 처리군에서는 높은 수준의 혈소판응집률을 나타냈다(3.1~3.6%, Fig. 3). 저농도인 10 μg/mL 처리군에서는 HE50과 HE100의 응집률이 6.2~6.7%로 우수하였고, LE100이 23%, HE0이 70%로 측정되었다. 단일물질에서는 resveratrol과 oxyresveratrol이 유사한 수준으로 응집력이 낮았으며, morusin, mulberroside A의 순으로 나타났다.

Fig 3. Effect of mulberry root bark and its single compounds on anti-platelet aggregation. Platelet aggregation efficiency was measured after mulberry root bark extract (100 and 10 μg/mL) treatments (A) and single compounds (100 and 10 μM) treatments (B). Con, control; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

혈전생성은 혈액순환을 방해하며, 뇌 혹은 심장에 발생할 경우 생명에 치명적이고 후유증을 남긴다. 정상인에게서는 혈액의 응고와 용해작용이 균형을 이루나, 혈관 벽의 생리적 손상이 발생하는 경우 혈소판이 침착하며 혈전생성 기전이 시작된다(Park 등, 2009).

혈소판응집은 단계적 반응에 따라 진행되며, 본 연구에서는 콜라겐에 의해 활성화된 혈소판에서의 응집반응을 측정하였다. 응고 과정에서 콜라겐은 내피세포와 혈소판의 부착을 지지하고 응집, 분비, 응고를 활성화한다. 이후 혈소판 내 칼슘 농도의 변화를 유도하여 관련 단백질(plecktrin)의 인산화와 단백질의 재배열에 따른 응집반응을 일으킨다(Lee, 2020). 혈소판응집률 저해 효과는 resveratrol과 oxyresveratrol에서 높게 나타났고, 배당체인 mulberroside A에서는 100 μg/mL 농도에서만 유의적 차이를 나타냈다. 상대적으로 수용성이 높은 mulberroside A에서 효과가 미미하게 나타난 것은 상백피 물 추출물에서 효과가 감소하는 결과와도 일치되는 경향을 보였다. 상백피의 대표적 물질들을 선발하여 추출물과의 효능을 비교하였으며, 본 연구에서 제시된 물질 외에도 혈관 건강에 영향을 미치는 물질들이 추출물에는 다수 함유되어 있을 것으로 예상된다. 상백피 추출물의 혈관 건강증진 효능과 관련된 지표 물질에 관한 연구가 추후 요구된다.

요 약

뽕나무의 뿌리껍질이 원료인 상백피는 콜레스테롤 합성 저해, 염증 억제, 혈소판 항응집 효능을 보였으며, 에탄올 100% 추출물에서 높은 활성을 나타냈다. 상백피 100% 에탄올 추출물은 콜레스테롤 생합성 억제뿐 아니라 LDLR 발현량 증가에 따른 LDLR 흡수율을 증가시켜 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시킬 수 있을 것으로 예상되었다. 또한 항염증 및 콜라겐 활성에 의한 혈소판응집에서도 효과를 나타내 복합적 원인에 의한 심혈관계 질환 예방에 효과를 나타낼 것으로 분석된다. 상백피의 유래 물질 중 stilbene 계열의 resveratrol과 oxyresveratrol은 혈소판응집률 저해가 우수하였고, morusin은 염증 발생으로 인한 대식세포에서의 NO 및 TNFα의 분비량을 정상세포 수준으로 감소시키는 효능을 나타냈다. HMG-CoA reductase의 활성 저해에는 oxyresveratrol의 효능이 뛰어났으나 상백피 추출물 자체의 활성이 더 높게 나타나, 복합물 혹은 다른 물질에 의한 효소 저해 활성이 더 뛰어난 것으로 사료된다. 상백피 유래 물질에 따라 활성에 차이가 있음을 확인하였으며, 이와 같은 연구데이터는 혈관 염증, 혈전생성 및 고콜레스테롤혈증으로 인한 동맥경화 등 혈관 건강을 개선하는 기능성 원료를 개발함에 있어 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

감사의 글

본 연구는 농촌진흥청 연구비 지원(과제번호 PJ01510701)에 의하여 연구되었으며 이에 감사드립니다.

Fig 1.

Fig 1.Effect of mulberry root bark and its single compounds on cholesterol regulation. HMG-CoA reductase activities after mulberry root bark extract treatments (A) and single compounds treatments (B) were measured. In addition, hepatic cholesterol regulations were examined through LDL uptake assay (C) and real-time PCR in extract stimulated HepG2. Con, control; ST, pravastatin; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C; LDLR, LDL receptor; ABCA1, ATP-binding cassette transporter; CYP7A1, cholesterol 7 alpha-hydroxylase. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 633-639https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.7.633

Fig 2.

Fig 2.Effect of mulberry root bark and its single compounds on anti-inflammation. NO concentration after mulberry root bark extract (100 μg/mL) treatments (A) and single compounds (100 and 10 μM) treatments (B) were measured in the media of Raw 264.7 cells. TNFα concentration was also measured in the same media after mulberry root bark extract treatments (C), and single compounds (100 and 10 μM) treatments (D). Con, control; LPS, lipopolysaccharide; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05). ND: not detected.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 633-639https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.7.633

Fig 3.

Fig 3.Effect of mulberry root bark and its single compounds on anti-platelet aggregation. Platelet aggregation efficiency was measured after mulberry root bark extract (100 and 10 μg/mL) treatments (A) and single compounds (100 and 10 μM) treatments (B). Con, control; LE100, 100% ethanol extract at 25°C; HE0, distilled water extract at 100°C; HE50, 50% ethanol extract at 100°C; HE100, 100% ethanol extract at 100°C. The data were mean±SD. Different letters are significant differences by Duncan’s multiple range test (P<0.05).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 633-639https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.7.633

References

  1. Bentzon JF, Otsuka F, Virmani R, Falk E. Mechanisms of plaque formation and rupture. Circ Res. 2014. 114:1852-1866.
    Pubmed CrossRef
  2. Chiang JYL, Ferrell JM. Up to date on cholesterol 7 alpha-hydroxylase (CYP7A1) in bile acid synthesis. Liver Res. 2020. 4:47-63.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  3. Choi SJ. The identification of stilbene compounds and the change of their contents in UV-irradiated grapevine leaves. Kor J Hort Sci Technol. 2011. 29:374-381.
  4. Choi SY, Lee KJ, Kim SS, Kim SY. Comparison of resveratrol and oxyresveratrol contents among varietes of Morus alba L. Korean J Medicinal Crop Sci. 2005. 13:146-149.
  5. Go GW, Mani A. Low-density lipoprotein receptor (LDLR) family orchestrates cholesterol homeostasis. Yale J Biol Med. 2012. 85:19-28.
  6. Hong SH, Chai HY, Kim TM, Lee NJ, Kim DK, Cho JH, et al. Therapeutic effects of mulberry root-bark (Mori radicis cortex) ethanol extract on atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits. Lab Anim Res. 2005. 21:273-279.
  7. Hu LH, Zhang T, Shao Q, Li DD, Jin SX, Nie P, et al. Atorvastatin suppresses oxidized LDL-induced dendritic cell-like differentiation of RAW264.7 cells regulated by the p38 MAPK pathway. Mol Cell Biochem. 2012. 371:105-113.
    Pubmed CrossRef
  8. Istvan ES, Deisenhofer J. Structural mechanism for statin inhibition of HMG-CoA reductase. Science. 2001. 292:1160-1164.
    Pubmed CrossRef
  9. Kang MS, Kim MJ, Han JS, Kim AJ. Fatty acid composition and anti-inflammatory effects of the freeze dried Tenebrio molitor larva. Korean J Food Nutr. 2017. 30:251-256.
    CrossRef
  10. Kim SH, Jo YY, Kweon HY, Lee JH. Effect of extraction conditions on radical scavenging and cholesterol metabolism regulating capacity of silkworm larvae. Int J Indust Entomol. 2021a. 43:45-51.
  11. Kim TI, Kim YJ, Kim K. Extract of seaweed Codium fragile inhibits integrin αⅡbβ3-induced outside-in signaling and arterial thrombosis. Front Pharmacol. 2021b. 12:685948. https://doi.org/10.3389/fphar.2021.685948
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Kosović E, Topiař M, Cuřínová P, Sajfrtová M. Stability testing of resveratrol and viniferin obtained from Vitis vinifera L. by various extraction methods considering the industrial viewpoint. Sci Rep. 2020. 10:5564. https://doi.org/10.1038/s41598-020-62603-w
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Kwon SK, Park SW, Choi WY. Properties of the proteolytic enzymes from mulberry tree barks (Morus alba Linne). Korean J Food Nutr. 1998. 11:576-579.
  14. Lee DH. Inhibitory effects of scoparone on thrombus formation via regulation of cyclic nucleotides in collagen-induced platelets. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2020. 49:11-18.
    CrossRef
  15. Lee JH, Jo YY, Kim SW, Kweon HY. Antioxidant capacity of silkworm pupa according to extraction condition, variety, pupation time, and sex. Int J Indust Entomol. 2021. 43:59-66.
  16. Lee JH, Lee SY, Kim B, Seo WD, Jia Y, Wu C, et al. Barley sprout extract containing policosanols and polyphenols regulate AMPK, SREBP2 and ACAT2 activity and cholesterol and glucose metabolism in vitro and in vivo. Food Res Int. 2015. 72:174-183.
    CrossRef
  17. Lee S, Kim SH, Jo YY, Kim SW, Kim HB, Kweon HY, et al. Characterization of mulberry root bark extracts (Morus alba L.) based on the extraction temperature and solvent. Int J Indust Entomol. 2020. 41:36-44.
  18. Lorenz P, Roychowdhury S, Engelmann M, Wolf G, Horn TFW. Oxyresveratrol and resveratrol are potent antioxidants and free radical scavengers: effect on nitrosative and oxidative stress derived from microglial cells. Nitric Oxide. 2003. 9:64-76.
    Pubmed CrossRef
  19. Oram JF, Lawn RM. ABCA1: the gatekeeper for eliminating excess tissue cholesterol. J Lipid Res. 2001. 42:1173-1179.
    CrossRef
  20. Park SH, Park KJ, Kim JK. The effects of Mume Fructus extracts on blood flow improvement. Yakhak Hoeji. 2009. 53:298-302.
  21. Ramkumar S, Raghunath A, Raghunath S. Statin therapy: Review of safety and potential side effects. Acta Cardiol Sin. 2016. 32:631-639.
  22. Rosmi NSAM, Shafie NH, Azlan A, Abdullah MA. Functional food mixtures: Inhibition of lipid peroxidation, HMGCoA reductase, and ACAT2 in hypercholesterolemia-induced rats. Food Sci Nutr. 2021. 9:875-887.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  23. Statistics Korea. Causes of death statistics in 2020. 2021 [cited 2022 Feb 14]. Available from: https://kostat.go.kr/portal/korea/kor_nw/1/6/2/index.board?bmode=read&bSeq=&aSeq=403046&pageNo=1&rowNum=10&navCount=10&currPg=&searchInfo=&sTarget=title&sTxt=
  24. Yang WK, Sung YY, Kim HK. Antithrombotic effect and antiplatelet activity of Polygonum cuspidatum extract. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2012. 41:168-173.
    CrossRef
  25. Zhang H, Gong X, Ni S, Wang Y, Zhu L, Ji N. C1q/TNF-related protein-9 attenuates atherosclerosis through AMPK-NLRP3 inflammasome singling pathway. Int Immunopharmacol. 2019. 77:105934. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2019.105934
    Pubmed CrossRef
  26. Zhang Y, Yang X, Bian F, Wu P, Xing S, Xu G, et al. TNF-α promotes early atherosclerosis by increasing transcytosis of LDL across endothelial cells: Crosstalk between NF-κB and PPAR-γ. J Mol Cell Cardiol. 2014. 72:85-94.
    Pubmed CrossRef