전 세계의 북반구에 약 48여 종이 분포된 전나무 속(Abies) 중에서 우리나라에서는 구상나무(Abies koreana Wilson)와 분비나무(Abies nephrolepis Maxim) 및 전나무(Abies holophylla Maxim)가 자생하는 것으로 알려져 있다(Seong 등, 2018). 예로부터 전나무는 건축 자재나 가구의 재료 및 관상용 등으로 이용되어 왔는데(Lee 등, 2006), 전나무 속의 추출물은 소화불량, 류마티스, 복통, 혈관 및 폐질환, 감기 등에 효과적인 것으로 알려져 민간요법으로 이용되고 있다(Richardson 등, 1992). 일반적으로 정유 성분은 복합 천연화합물로서 식물의 자기방어를 위한 2차 대사산물로 알려져 있는데(Bakkali 등, 2008), 전나무 속은 많은 2차 대사물질을 갖고 있어(Bakkali 등, 2008; Lee와 Hong, 2009) 항산화, 항염증 및 항박테리아 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2016). 또한 전나무는 약리적으로 효과를 가진다고 보고되고 있기에 한방에서는 전나무 잎과 뿌리에서 채취한 방향유를 여러 가지 약용으로 사용하는 것으로 보고되어 있다(Lee 등, 2006).

알코올은 주로 간에서 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)와 catalase 및 cytochrome p450 2E1(CYP2E1)에 의하여 acetaldehyde로 분해되는데, 만성적인 알코올 섭취로 생성된 과량의 acetaldehyde는 간독성을 촉진할 뿐만 아니라 뇌로의 혈액순환을 약화해 현기증이나 근육통, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사 등의 숙취 증상과 혈압 저하 등을 야기할 수 있다(Tuma와 Casey, 2003). 또한 알코올 대사 경로에서는 유해 부산물로 반응성이 높은 자유라디칼이 생성되는데(Das 등, 2006; Jung, 1991), 이는 항산화 시스템 저해, 산화스트레스 유발 및 다양한 메커니즘을 통해 세포 손상을 야기한다(Koch 등, 2004). 특히 에탄올로 인한 간세포의 산화스트레스는 알코올성 간 질환(alcoholic liver disease)의 발생에 핵심적인 역할을 하는데(Sergent 등, 2001; Cederbaum, 1991), 간세포의 apoptosis는 여러 가지 형태의 간질환에서 주요한 특징으로 알려져 있다(Chiarugi 등, 1994; Nagata, 1997). Apoptosis 과정은 많은 효소와 단백질이 관여하는데, 이중 Bcl-2 family는 미토콘드리아에서 cytochrome c의 방출을 조절하여 apoptosis에 관여한다(Lee 등, 2009). 에탄올은 간세포의 손상에 직접적인 영향을 주는 것으로 알려져 있기에 알코올성 간질환 연구에 중요한 지표로 사용된다(Lieber, 2001). 그러나 현재 알코올로 손상된 간세포의 apoptosis 과정에서 전나무 잎 추출물이 미치는 영향에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.

따라서 본 연구에서는 전나무 잎 추출물이 알코올 분해 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 alcohol dehydrogenase 및 acetaldehyde dehydrogenase 활성을 측정하고, 에탄올과 과산화수소(H₂O₂)를 이용하여 HepG2 인간 간암 세포주에 알코올 독성 및 산화스트레스를 유도한 후 전나무 잎 추출물의 간세포 보호 효과를 확인하였다.

실험재료 및 시료 제조

본 연구에 사용한 전나무(Abies holophylla) 잎은 지리산(경상남도 함양)에서 채취하여 건조한 것으로 인산가(Insanga Co., Ltd., Gyeongnam, Korea)에서 제공받아 후드믹서(FM-681C, Hanil Electric, Seoul, Korea)로 분쇄하여 시료로 사용하였다. 전나무 잎의 생리활성 측정을 위해 전나무 잎 분말 50 g에 80% 에탄올 500 mL를 가하여 상온에서 24시간 동안 추출하였다. 추출물은 Whatman No. 2 filter paper(Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 여과하여 rotary evaporator(EYELA N-1000, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축한 다음 동결 건조하여 -70°C에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 전나무 잎 에탄올 추출물의 수율은 27.23%였다. 실험에 사용한 모든 시약은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.

Alcohol dehydrogenase(ADH) 활성 측정

ADH 효소활성 측정은 Choi 등(1995)과 Racker(1955)의 방법을 변형하여 측정하였으며, 생성된 NADH의 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험관에 알코올 0.1 mL, NAD 수용액(2 mg/mL) 0.5 mL 및 농도별 전나무 잎 추출물을 각각 0.1 mL 첨가하고 10 mM glycine-NaOH buffer(pH 8.8)를 총부피가 1.8 mL가 되도록 조절하여 25°C 항온수조에서 10분간 반응시킨 후 ADH(10 unit/mL, Sigma Chemical Co.)를 가하여 340 nm에서 spectrophotometer(Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, UK)를 이용하여 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 첨가했으며, positive control은 약국에서 구입한 Hepos를 1/2로 희석하여 사용하였다. ADH의 활성은 다음과 같은 식으로 상대적인 백분율로 계산하였다.

$$ADHactivity\left(\%\right)=\frac{실험구의최대흡광도}{대조구의최대흡광도}\times 100$$

Acetaldehyde dehydrogenase(ALDH) 활성 측정

ALDH의 효소활성 측정은 Koivula와 Koivusalo의 방법(1975)을 약간 변형하여 측정하였다. 반응용액은 증류수 2.1 mL, 1.0 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 0.3 mL, 20 mM NAD⁺ 0.1 mL, 0.1 M acetaldehyde 0.1 mL, 3.0 M KCl 0.1 mL, 0.33 M 2-mercaptoethanol 0.1 mL 및 농도별 전나무 잎 추출물을 각각 0.1 mL 혼합하여 25°C에서 10분간 반응시킨 후 ALDH(1 unit/mL) 0.1 mL를 첨가하여 25°C 항온수조에서 5분간 반응시킨 다음 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 첨가하여 상대 활성(%)으로 나타내었고 positive control은 ADH 활성 측정에서와 같이 Hepos를 사용했으며, ALDH 활성 측정은 ADH 활성 측정식과 동일한 식을 사용하였다.

HepG2 세포 배양

한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받은 HepG2 세포의 배양을 위해 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Cellgro by Mediatech, Inc., Manassas, VA, USA) 배지를 이용하여 37°C, 5% CO₂ incubator(Panasonic, Tokyo, Japan)에서 배양하였다.

HepG2 세포의 cell viability 측정

세포의 성장과 cell viability를 확인하기 위해 세포가 confluence 상태가 되면 96-well cell culture plate(SPL Lifesciences, Gyeonggi, Korea)에 HepG2 세포를 1×10⁴ cells/well의 농도로 seeding 하고 24시간 배양 후 농도별로 추출물을 처리하였다. 2시간 배양 후 300 μM H2O2 또는 1 M 에탄올을 각각 처리하여 스트레스를 유도하였다. 24시간 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시킨 후 상등액을 제거한 다음 dimethyl sulfoxide 150 μL를 첨가하여 formazan을 녹인 후 ELISA reader(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

HepG2 세포에 대한 intracellular reactive oxygen species(ROS) level 측정

산화적 스트레스에 의해 과산화지질을 생성하여 세포독성으로 작용할 뿐만 아니라 세포 손상을 유발하는 ROS를 측정하기 위해 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA, Sigma Chemical Co.) 형광염료를 이용하였다. DCF-DA는 세포에서 아세틸기를 제거하고, 그것이 세포 내의 hydrogen peroxide와 같은 라디칼에 정량적으로 반응하여 DCF 형광물질로 변화되는 것을 측정하는 원리이다. 세포가 confluence 상태가 되면 96-well plate에 well당 2×10⁴ cells/mL로 seeding 하여 24시간 배양하고, 시료를 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후 300 μM H₂O₂ 또는 1 M 에탄올을 첨가하여 24시간 배양하여 스트레스를 유도한 다음 배양된 media를 제거하고 PBS로 두 번 세척하였다. 세포에 100 μM의 DCF-DA를 넣어 15분 배양 후 상층액을 제거하고, 동일 농도로 다시 60분 동안 실온에서 배양한 다음 flowcytometer(Tecan, Männedorf, Switzerland)로 DCF-DA fluorescence 상승률을 측정하였다.

HepG2 세포에 대한 Bax, Bcl-2 및 caspase-3 단백질 발현 측정

HepG2 세포를 6 well plate에 1×10⁶ cells/well로 seeding 하여 시료를 농도별로 처리하고 2시간 배양한 후 300 μM H₂O₂ 또는 1 M 에탄올을 첨가하여 24시간 동안 37°C에서 배양하였다. Sample은 RIPA lysis buffer를 이용하여 단백질을 lysis 후 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층액에 있는 단백질을 회수하고 회수한 단백질은 Bio-Rad protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 농도를 측정하여 30 μg으로 농도를 맞춘 후 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 수행하였다. PAGE 후 nitrocellulose membrane에 transfer하고, 5% skim milk에서 1시간 동안 상온에서 blocking 시킨 후 1차 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 희석하여 4°C에서 overnight 시켰다. 그다음 tris buffered saline with tween-20(TBS-T)로 10분씩 5번 세척하고, 2차 항체(Cell Signaling Technology)를 상온에서 1시간 반응시킨 후 다시 TBS-T로 10분간 5회 세척한 다음 Chemiluminescence detection system(ECL)을 처리 후 감광시켜 단백질 발현량을 확인하였다.

통계처리

실험 결과는 통계 SAS package(Statistical Analysis System, version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 각 시료의 평균과 표준편차를 계산하였고, 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하여 P<0.05 수준에서 시료 간의 유의차를 검정하였다.

알코올 분해 활성(ADH, ALDH)

만성적인 알코올의 섭취 또는 다량의 알코올은 소화관의 점막 손상을 야기하여 영양소 흡수장애 및 영양 결핍이 발생할 수 있으며, 모든 조직과 장기에 유독한 영향을 주게 되어 간 괴사, 암, 심근증, 췌장염 등이 발생할 수 있다(Choi 등, 2011). 또한 알코올에 의한 간 조직 손상은 생체 내 대사 균형을 파괴하고 탄수화물과 지질, 핵산, 호르몬 등의 대사를 교란해 건강을 악화시키는 원인이 된다(Baillie, 1971; Szilagyi, 1986). 특히 한국인은 알코올 분해 효소활성이 서양인에 비해 낮기 때문에 알코올 분해효율이 떨어지는 것으로 알려져 있으므로 다량의 알코올이나 만성적인 알코올의 섭취는 건강상의 문제로 발전할 수 있다(Choi 등, 2011). 이에 따라 숙취의 경감 및 알코올 해독을 위한 다양한 연구를 위해 부작용이 없는 천연물을 이용한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Choi 등, 2011; Hwang과 Kim, 2020). 따라서 본 연구에서는 알코올 분해의 1차 효소인 ADH 활성과 1차 대사산물인 아세트알데하이드를 분해하는 ALDH 활성에 대한 전나무 잎 추출물의 효과를 확인하였다. 먼저 전나무 잎 추출물의 ADH 활성을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 양성 대조군인 Hepos의 ADH 활성은 165.11%였고, 전나무 잎 추출물 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg/mL 농도에서의 ADH 활성은 각각 102.78, 110.93, 138.62 및 155.53%로 유의적으로 활성이 증가하였는데(P<0.05), 전나무 추출물 1 mg/mL 농도에서는 Hepos와 유의적인 차이가 없었다. 전나무 잎 추출물의 ALDH 활성을 측정한 결과(Fig. 2) Hepos는 142.78%로 나타났고, 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg/mL 농도에서 전나무 잎 추출물은 각각 90.48, 104.61, 116.48 및 130.89%로 농도 의존적으로 활성이 증가하였다(P<0.05). 전나무의 알코올 분해 활성에 관한 연구는 거의 없는 실정으로 본 연구 결과 전나무 잎 추출물의 알코올 분해 활성이 우수한 것으로 확인되었기에 숙취 해소를 위한 기능성 소재 개발을 위한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 한편 숙취 개선에 도움이 되는 천연 소재로는 헛개나무(Na 등, 2004), 헛개나무 열매(Ko 등, 2006), 가시오가피(Yoon과 Jo, 2010), 보이차(Song 등, 2005), 조개추출분말(Cho 등, 2017) 등이 보고되어 있다.

Fig 1. Effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on the alcohol dehydrogenase (ADH) activity. Results are mean±SD of triplicate data. Hepos (50%) is used as positive control. Different letters (a-c) within a total sample differ significantly (P<0.05).

Fig 2. Effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on the aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity. Results are mean±SD of triplicate data. Hepos (50%) is used as positive control. Different letters (a-e) within a total sample differ significantly (P<0.05).

HepG2 세포에 대한 세포독성

활성산소종(ROS) 생성에 대한 전나무 잎 추출물의 효과 및 간세포 보호 효과 실험에 앞서, 인체 간암 세포주인 HepG2 세포에서 전나무 잎 추출물의 독성 여부를 확인하기 위하여 추출물을 10~500 μg/mL까지 농도별로 처리하여 세포생존율을 측정하였다. 세포생존율은 MTT 분석을 통해 측정했으며, 그 결과(Fig. 3) 10, 25, 50, 100, 250 및 500 μg/mL 농도의 전나무 추출물로 처리된 간암 세포주인 HepG2 세포의 세포생존율은 각각 98.72, 95.20, 96.35, 94.92, 89.24 및 81.30%로 나타났다. 따라서 이후 세포실험은 독성을 나타내지 않는 농도인 100 μg/mL 이하의 전나무 잎 추출물을 처리하여 실험을 진행하였다.

Fig 3. Cytotoxic effects of Abies holophylla leaf ethanol extract in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with Abies holophylla leaf ethanol extract (0, 10, 25, 50, 100, 250, and 500 μg/mL) for 24 h, and the cell viability was determined by MTT assay. Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-c) within a total sample differ significantly (P<0.05).

과산화수소(H₂O₂)는 세포에서 많이 발견되는 활성산소종으로 알려져 있다(Youn 등, 2015). 따라서 본 연구에서 산화스트레스 유도 물질인 H₂O₂를 처리하여 HepG2 세포에 스트레스를 유도한 후 전나무 잎 추출물의 간세포 보호 효과를 확인하였다. 10~100 μg/mL의 전나무 잎 추출물을 처리한 결과(Fig. 4A) 세포생존율은 44.37~61.46%로, 과산화수소 단독 처리구 38.34%에 비해 15.73~60.30% 높게 나타났다(P<0.05). Kim 등(2018)은 에탄올을 처리한 HepG2 세포에 참죽나무 잎 추출물을 처리하여 ROS level을 측정한 결과, 에탄올 처리로 증가한 ROS는 추출물의 농도가 증가할수록 ROS level이 감소함에 따라 산화스트레스 및 알코올성 간 손상에 대해 보호 효과가 있는 것으로 보고하였다. 따라서 본 연구에서도 알코올성 간 손상으로부터 전나무 잎 추출물의 효과를 검증하기 위해 에탄올로 스트레스를 유도한 HepG2 세포에 10~100 μg/mL의 전나무 추출물을 처리한 결과(Fig. 4B), 세포생존율은 23.84~55.63%로 알코올 단독 처리구 20.52%에 비해 16.18~171.10% 증가하는 것으로 나타났다(P<0.05). 따라서 전나무 잎 추출물은 H₂O₂ 및 알코올 손상에 대한 간 보호 효과가 있는 것으로 판단된다.

Fig 4. Cell viability of Abies holophylla leaf ethanol extract against (A) H₂O₂ and (B) alcohol-induced stress in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with H₂O₂ (300 μM) or EtOH (1 M) for 24 h in the presence of Abies holophylla leaf ethanol extract. Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-e) within a total sample differ significantly (P<0.05).

ROS 생성에 대한 전나무 잎 추출물의 효과

산화적 스트레스는 활성질소(RNS)와 활성산소종(ROS)의 증가 및 이들의 무독화 기전 감소로 인하여 발생한다(Kim 등, 2018). 생체 내에서 생성된 ROS는 반응성이 큰 자유라디칼을 포함하고 있어 불안정하기 때문에 세포 내 핵산과 같은 거대 생체 분자와 지단백질 및 세포막 지질과 결합하여 그 기능을 저하하게 되므로 ROS는 세포의 손상을 통한 인체의 노화 및 당뇨병, 퇴행성 신경계 질환 등의 각종 질병을 유발하는 중요한 요인 중 하나로 인식되고 있다(Chandra 등, 2000; Ha 등, 2016). 또한 다양한 원인에 의하여 발생한 산화스트레스는 간 실질세포의 사멸과 이를 통한 성상세포 및 염증세포의 활성화로 간염과 지방간, 간섬유화, 간경화 및 간암 등의 다양한 급만성 간질환을 유발하는 중요한 원인으로 인식되고 있다(Chandra 등, 2000; Li 등, 2015). 따라서 이로 인해 발생할 수 있는 피해를 감소시키기 위하여 경제성을 갖는 천연 항산화제의 개발을 위한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 본 연구에서는 전나무 잎 추출물의 처리에 따른 세포 내 ROS를 측정하기 위하여 DCF-DA를 이용하여 flowcytometer로 분석하였다. 그 결과(Fig. 5A, 5B), H₂O₂ 및 에탄올로 유도된 HepG2 세포의 ROS level이 전나무 잎 추출물 농도에 의존적으로 감소하였다(P<0.05). 먼저 H₂O₂로 스트레스를 유도한 HepG2 세포에 10~100 μg/mL의 전나무 추출물을 처리한 결과 ROS 수준은 230.47~170.27%로 H₂O₂ 단독 처리구 234.51%에 비해 현저하게 감소하였다(P<0.05). 또한 에탄올로 스트레스를 유도한 HepG2 세포에 10~100 μg/mL의 전나무 추출물을 처리한 결과 세포생존율은 174.30~147.38%로 알코올 단독 처리구 186.34%에 비해 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 한편 Kim 등(2018)은 에탄올을 처리한 HepG2 세포에서의 ROS 생성은 참죽나무 잎 추출물 농도에 의존적으로 감소하는 것으로 보고하였는데, 전나무 잎 추출물의 세포 내 ROS 생성에 관련된 연구는 미비한 실정이다. ROS는 미토콘드리아의 대사활동을 통하여 생성되는 반응성이 강한 산소를 함유한 분자로서 특히 간에서 세포 분자와 반응하여 산화스트레스를 유발하는 물질로 알려져 있다(Choi 등, 2012). 본 연구 결과에서 H₂O₂ 및 에탄올로 유도된 HepG2 세포의 ROS 생성은 각각 234.51%와 186.34%로 100 μg/mL의 전나무 잎 추출물 처리에 의해 각각 72.60% 및 79.09% 감소하였기에 전나무 잎 추출물은 산화스트레스 및 알코올성 간독성으로 인한 ROS 수준을 낮추어 간 손상 억제 및 산화 억제 효과가 뛰어난 것으로 사료된다.

Fig 5. Effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on ROS level against (A)　H₂O₂ and (B) alcohol-induced stress in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with H₂O₂ (300 μM) or EtOH (1 M) for 24 h in the presence of Abies holophylla leaf ethanol extract. Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-e) within a total sample differ significantly (P<0.05).

Bcl-2 family 및 caspase-3 단백질 발현

H₂O₂ 및 알코올로 인한 간세포의 손상과 apoptosis 과정에는 다양한 신호전달 체계가 관여한다. Bcl-2 family 단백질들은 미토콘드리아의 기능 손상과 관련된 apoptosis 유도에 핵심적인 조절자로 작용하는데(Kim 등, 2019), Bcl-2 family 중 Bax는 스스로 channel을 형성하는 대표적인 pro-apoptotic 분자로 apoptosis의 유발과 관련이 있으며, Bcl-2는 anti-apoptotic 분자로서 apoptosis의 유발을 억제하는 기능을 가진 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2009). 또한 Bcl-2 family protein 발현에 의해서 활성화되는 cytosolic protease series 중 하나인 caspase는 세포 내의 핵과 미토콘드리아의 외막에 존재하며, apoptosis 형태적 특징을 발현시키는 역할을 담당한다(Jin 등, 2016). 세포가 apoptosis 자극을 받으면 caspase-9과 caspase-3를 활성화해 핵의 응축과 DNA 절단을 유도하면서 apoptosis 신호전달과정이 일어나게 된다(Castañeda와 Kinne, 2001). 따라서 본 연구에서는 HepG2 세포에서 H₂O₂에 의한 산화스트레스 및 알코올성 apoptosis에 대한 전나무 잎 추출물의 보호 효과를 확인하기 위하여 Bax, Bcl-2 및 caspase-3 단백질 발현을 측정하였다.

먼저 pro-apoptotic gene인 Bax 유전자의 단백질 발현을 측정한 결과(Fig. 6A, 6B), H₂O₂ 및 에탄올로 처리된 배지에서 배양한 HepG2 세포에서의 Bax 발현은 증가하였으나 전나무 잎 추출물을 함께 처리한 HepG2 세포에서는 Bax 발현이 감소하였다(P<0.05). 따라서 본 연구 결과로 전나무 잎 추출물이 H₂O₂ 및 알코올에 의한 Bax 유전자의 단백질 발현 변화를 조절함으로써 미토콘드리아의 기능 손상을 차단해 간에서의 apoptosis 유도를 억제할 수 있을 것으로 판단된다.

Fig 6. Effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on Bax and Bcl-2 protein expression against (A) H₂O₂ and (B) alcohol-induced stress in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with H₂O₂ (300 μM) or EtOH (1 M) for 24 h in the presence of Abies holophylla leaf ethanol extract. Equal amounts of cell lysates (30 μg) were subjected to electrophoresis and analyzed for Bax and Bcl-2 expressions by use Western blot. Actin was used as an internal control. Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-d) within a total sample differ significantly (P<0.05).

다음은 anti-apoptotic gene인 Bcl-2 유전자의 단백질 발현을 측정하였다. 그 결과(Fig. 6A, 6B) H₂O₂로 처리된 배지에서 배양한 HepG2 세포에서의 Bcl-2 발현은 대조군에 비해 감소하였고 전나무 잎 추출물 처리에 의해 Bcl-2 발현이 증가하였다(P<0.05). 그러나 에탄올을 처리한 HepG2 세포에서의 Bcl-2 단백질 발현은 전나무 잎 추출물 처리군과 유의적인 차이가 없었다. 본 연구 결과에서 H₂O₂로 간 손상을 유도했을 때 Bcl-2의 발현이 증가했으나, 에탄올로 간독성을 유도했을 때는 전나무 추출물 처리에 의한 발현량 변화는 나타나지 않았다. 본 실험을 통해 전나무 잎 추출물이 산화스트레스에 의한 apoptosis를 효과적으로 억제하여 간독성에 대한 보호 효과가 있음을 확인하였다.

Apoptotic process에서 매우 중요한 역할을 하는 세포 신호전달 분자인 caspase-3 단백질 발현을 측정한 결과(Fig. 7A, 7B), H₂O₂와 에탄올로 처리한 세포에서 caspase-3 발현이 control과 비교하여 각각 6.3배와 1.9배 증가하였다. 그러나 전나무 잎 추출물을 함께 처리한 결과, caspase-3 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 특히 10 μg/mL의 전나무 잎 추출물 처리군에서 더 큰 caspase-3 발현 억제 양상이 나타났다. 이는 전나무 잎 추출물이 caspase-3 활성을 조절하여 H₂O₂와 에탄올로 유도된 간세포의 산화적 손상과 apoptosis를 감소시켜 세포를 보호함을 시사한다.

Fig 7. Effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on caspase-3 protein expression against (A) H₂O₂ and (B) alcohol-induced stress in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with H₂O₂ (300 μM) or EtOH (1 M) for 24 h in the presence of Abies holophylla leaf ethanol extract. Equal amounts of cell lysates (30 μg) were subjected to electrophoresis and analyzed for caspase-3 expressions by use western blot. Actin was used as an internal control. Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-d) within a total sample differ significantly (P<0.05).

본 연구에서는 전나무 잎 추출물이 알코올 분해 활성(ADH, ALDH)에 미치는 영향을 알아보고, H₂O₂ 및 알코올로 손상된 간세포의 apoptosis 과정에서 전나무 잎 추출물이 미치는 영향을 확인하기 위해 H₂O₂와 에탄올을 이용하여 HepG2 인간 간암 세포주에 산화스트레스를 유도한 후 항산화 효과와 간세포 보호 효과를 확인하였다. 알코올 분해의 1차 효소인 ADH 활성과 1차 대사산물인 아세트알데하이드를 분해하는 ALDH 활성에 대한 전나무 잎 추출물의 효과를 확인한 결과, 두 가지 효소 모두 전나무 잎 추출물에 농도 의존적으로 증가하였으며(P<0.05), 1 mg/mL 농도에서의 ADH 및 ALDH 활성은 각각 155.53% 및 130.89%로 나타났다. 산화적 스트레스 및 알코올성 간 손상으로부터 전나무 잎 추출물의 효과를 검증하기 위하여 H₂O₂ 및 에탄올로 스트레스를 유도한 HepG2 세포에 전나무 잎 추출물을 처리한 결과 H₂O₂ 및 에탄올 단독 처리구에 비해 세포생존율은 유의적으로 증가하였다(P<0.05). H₂O₂ 및 에탄올로 유도된 HepG2 세포의 ROS level은 전나무 추출물에 농도 의존적으로 현저하게 감소하였다(P<0.05). 전나무 잎 추출물이 H₂O₂ 및 에탄올로 유도된 HepG2 간세포의 apoptosis에 미치는 영향을 알아보기 위해 Bax, Bcl-2 및 caspase-3 유전자의 단백질 발현 정도를 측정하였다. H₂O₂ 및 에탄올로 처리된 배지에서 배양한 HepG2 세포에서의 pro-apoptotic gene인 Bax 유전자 발현은 증가하였으나 전나무 잎 추출물의 처리에 의해 발현이 감소하였다(P<0.05). 또한 H₂O₂ 및 에탄올로 처리된 배지에서 배양한 HepG2 세포에서의 anti-apoptotic gene인 Bcl-2 유전자의 발현을 측정한 결과 H₂O₂로 간 손상을 유도했을 때 Bcl-2의 발현은 전나무 잎 추출물의 처리에 의해 증가하였으나(P<0.05), 에탄올로 간독성을 유도했을 때는 전나무 잎 추출물 처리에 의한 발현량 변화는 나타나지 않았다. Caspase-3 단백질 발현을 측정한 결과, H₂O₂ 및 에탄올로 간독성을 유도했을 때는 발현이 증가했으며, 전나무 잎 추출물 처리 시 발현을 감소시켜 산화적 손상 및 apoptosis 보호 효과를 확인하였다. 따라서 본 연구 결과 전나무 잎 추출물은 알코올 분해 활성과 함께 산화적 스트레스 및 알코올성 간독성으로 인한 ROS level을 낮추고 산화적 스트레스 및 알코올에 의한 apoptosis를 효과적으로 억제하여 간독성에 대한 보호 효과가 있는 것으로 판단된다.