경제 및 문화의 지속적인 성장과 함께 삶의 질을 높이고자 하는 사람들의 욕구가 증가하는 가운데 최근 소비자들은 기능성 화장품으로 피부미용은 물론 노화 방지, 질병 예방 및 치료 기능을 기대하게 되었다. 주로 미백, 항노화 외에 염증 예방, 미세먼지 대응 기능 등의 고기능성 제품을 선호하고 그에 맞는 화장품 수요가 증가하는 추세에 있다. 또한 피부 질환을 예방하기 위해 천연 성분에 관한 관심이 높아지면서 화학 원료보다 천연물 유래 고기능성 화장품에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Corinaldesi 등, 2017; Roh 등, 2015; Limtrakul 등, 2016).

구기자(Lycii fructus)는 가지과(Solanceae)에 속한 구기자나무의 성숙한 과실을 건조한 것으로 우리나라를 비롯한 중국, 대만, 일본 등지에서 자생하거나 재배되고 있는 생약재이다. 구기자는 최근 서양에서도 ‘Goji berries’라 불리면서 열매와 주스 등이 항노화 및 웰빙 식소재로 주목받게 되었다. ‘Goji’라는 명칭은 비교적 최근에 새로 명명된 이름으로 Lycium barbarum Linne(寧夏枸杞子라 불림, L. barbarum)와 Lycium chinense Miller(L. chinense)의 두 가지 종을 포함한다. 국내에서 청양을 중심으로 재배되고 있는 구기자는 L. chinense Miller 종이며 중국과 몽고, 티벳 등에서는 L. barbarum Linne가 주로 재배되고 있다(Potterat, 2010). 전통적으로 구기자는 주로 약재로 사용되었으며 일부 지역에서는 수프나 죽, 차 등의 식재료로도 활용해 왔다. 구기자에는 carotinoids, ascorbic acid, 비타민 B군 등의 영양소와 quercetin, kaempferol, rutin 등의 플라보노이드가 풍부하고 기타 β-sitosterol, betaine, meliscic acid, choline 등이 다량 함유되어 있어(Potterat, 2010) 간기능 개선(Liu 등, 2015), 항암(Telang 등, 2014), 면역증진(Park 등, 2000), 혈중지질 저하(Masci 등, 2018) 등의 효능에 관한 연구가 진행되어왔다. 특히 구기자에는 46% 정도의 다량의 탄수화물이 함유되어 있으며 열매 건조 중량의 5~8% 정도의 수용성 다당체(Lycium barbarum polysaccharides: LBP)가 함유되어 있어 최근 LBP의 항산화, 항염, 항암 효능에 관한 연구 보고가 계속 발표되고 있다(Ma 등, 2019; Chen 등, 2016; Kwok 등, 2019).

한편 구기엽에도 구기자와 유사한 성분들이 함유되어 있어 glutamic acid, proline, 비타민 C, rutin, betaine 등과 플라보노이드계 화합물들이 확인되었으며(Liu 등, 2017), 이와 관련된 항산화 및 항균 활성에 관한 연구가 일부 진행되어왔다(Mocan 등, 2014). 일부 지역에서는 예로부터 구기엽의 어린잎을 취하여 나물로 음건하여 차로 마셔왔다. 구기엽과 같은 녹색 잎 내의 클로로필과 그 유도체들의 항산화 효능은 잘 알려져 있으며(Lanfer-Marquez 등, 2005), 활성 산소와 관련성이 있는 질병의 치료제로 활용되고 있다(Solymosi와 Mysliwa-Kurdziel, 2017). 그러나 녹엽 추출물을 화장품의 원료 소재로 활용하고자 하는 산업체에서는 가공과정 중 열과 pH 등에 의한 색소의 변화로 인해 갈색이나 olive-green과 같은 색소를 띠게 되는 소재에 대한 소비자들의 기호도가 낮아져(Nurhayati와 Suendo, 2011; Schoefs, 2012; Singh, 2006), 클로로필 제거에 관한 기술이 요구되고 있다.

본 연구실의 선행연구에서는 클로로필을 제거한 구기자 잎의 에탄올 추출물에 대해 항산화와 항염 효능을 검토하여 우수한 항산화 및 항염 효능을 검증한 바 있다(Kim 등, 2019; Bae 등, 2019). 본 연구에서는 보습성이 기대되는 구기자 열매 에탄올 추출물과 항산화 및 항염 효능이 확인된 클로로필 제거 구기엽 에탄올 추출물로부터 용출한 분획물의 배합비를 달리하여 제조된 시료의 항산화 활성, 미백 및 항염증 효과를 측정하여 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 검토하고자 하였다.

시료 제조

실험의 원재료는 중국 북서부의 Ningxia Hui 자치구에서 재배되는 영하구기자(L. barbarum Linne)의 열매(이하 구기자)와 구기엽으로 구기자는 8~10월 사이 수확한 것이며 구기엽은 3~4월에 채취한 어린잎(이하 구기엽)으로 Zaokang Goji Berry Inc.(Yinchuan, Ningxia, China)에서 구입하여 사용하였다. 구기자와 구기엽 시료의 제조는 식물추출물 제조 전문기업인 엘로힘(Daejeon, Korea)으로부터 공급받아 사용하였다. 제조 방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 구기자 및 구기엽은 각각 100 g을 취하여 중량의 8배수가 되도록 70% 에탄올을 첨가하여 3시간 동안 70°C에서 3회 반복 교반 추출하고 여과(filter paper, Advantec No.3, Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)한 후 rotary vacuum evaporator(Eyela A 1000S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)에서 감압 농축하여 구기자 및 구기엽 70% 에탄올 추출물을 얻었다. 구기엽 70% 에탄올 추출물은 먼저 클로로필을 제거하기 위해 클로로포름(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)으로 용해시킨 후 메탄올(Sigma-Aldrich Co.)을 섞어 색소를 침전시킨 다음 charcoal column과 silica gel column chromatography를 사용하여 클로로필을 제거하였다. 이후 클로로필 제거 구기엽 추출물과 구기자 70% 에탄올 추출물 각각에 대해 용출 용매로 4종의 물-에탄올 혼합물을 사용하여 HP20 column chromatography를 수행하여 각각 FL1(H₂O:EtOH＝70:30), FL2 (H₂O:EtOH＝50:50), FL3(H₂O:EtOH＝30:70), FL4(H₂O :EtOH＝0:100) 4개의 분획물을 얻었다. 이 중 가장 높은 항산화 활성을 나타내는 클로로필 제거 구기엽의 FL2 분획물과 다당체가 많이 함유된 구기자 추출물의 FL2 분획물을 각각 1:1(M1), 2:1(M2), 3:1(M3) 및 5:1(M5) 비율로 혼합하여 본 연구의 최종 시료로 사용하였다.

총 페놀 함량 측정

시료의 총 폴리페놀 화합물 함량의 측정은 Folin과 Denis(1915)의 방법을 일부 수정하여 수행하였다. 2 N Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)와 증류수를 1:2로 섞은 혼합액 10 μL에 시료 10 μL를 넣고 암실에서 3분간 방치한 뒤 20% sodium carbonate(Na₂CO₃, Sigma-Aldrich Co.) 150 μL를 가하고 1시간 동안 암소에서 반응시켰다. 이후 ELISA reader(Microplate Absorbance Spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 표준물질로 사용하여 작성한 표준 검량곡선에 측정한 흡광도를 대입하여 시료의 총 페놀 화합물의 농도를 구하였다.

항산화능 측정

항산화 지표로는 1,1 diphenyl-2-picrylhrdrazyl(DPPH) 라디칼 소거능, 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothizoline-6-sulfonate)(ABTS) 라디칼 소거능, ferric reducing antioxidant power(FRAP)를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 Blois(1958)의 방법에 따라 측정하였다. 0.15 mM DPPH(Sigma-Aldirich Co.) 용액 190 μL와 농도별 시료 10 μL를 넣어 교반한 뒤 암실에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능 측정은 Fellegrini 등(1999)의 방법에 따라 측정하였다. ABTS solution은 7 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.) 10 mL와 140 mM K2S2O8(Sigma-Aldrich Co.) 176 μL를 혼합하여 암소에서 16시간 이상 반응시킨 후 이 용액과 에탄올을 1:88 비율로 혼합하여 제조하였다. ABTS solution 200 μL를 취하여 농도별 시료 10 μL를 혼합하여 암실에서 2분 30초간 방치한 후 ELISA reader를 이용하여 734 nm에서 흡광도(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 측정하였다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거능의 결과는 IC₅₀값으로 산출했으며, IC50값은 시료를 첨가하지 않은 무처리군의 값을 50% 감소시키는 시료의 농도를 의미한다. 시료의 항산화능은 항산화제로 잘 알려진 ascorbic acid의 항산화능을 측정한 값과 비교하였다. FRAP는 Benzie와 Strain(1996)의 방법에 따라 측정하였다. FRAP reagent는 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.5)와 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ)(Sigma-Aldrich Co.), 20 mM FeCl₃·6H₂O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 제조하였다. 농도별로 희석한 시료 30 μL와 FRAP reagent 300 μL를 혼합하여 37°C에서 10분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도(Bio- Rad Laboratories, Inc.)를 측정하였다. FRAP value는 표준물질인 iron sulfate hexahydrate(FeSO₄·7H₂O)를 사용하여 측정한 표준 검량곡선에 대입하여 얻었다.

Tyrosinase 저해 활성 측정

Tyrosinase 저해 활성 측정은 Flurkey(1991)의 방법을 수정하여 측정하였다. 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.8) 0.5 mL, 10 mM L-DOPA(dihydroxyphenylalanine; Sigma-Aldrich Co.) 0.2 mL와 시료 0.1 mL의 혼합액에 110 U/mL mushroom tyrosinase 0.2 mL를 첨가하여 25°C에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA-chrome의 흡광도를 475 nm에서 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 측정하였다. 대조군은 시료 대신 potassium phosphate buffer를 넣어 측정했으며 tyrosinase 억제 활성이 잘 알려진 kojic acid를 양성대조군으로 사용하였다. Tyrosinase 저해 활성은 시료 무첨가 대조군의 흡광도 대비 시료 첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

Elastase 저해 활성 측정

Elastase 저해 활성 측정은 Kusirisin 등(2009)의 방법을 참고하여 측정하였다. 0.2 M Tris-HCl(pH 8.0) buffer (Sigma-Aldrich Co.) 0.35 mL에 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide(Sigma-Aldrich Co.) 0.125 mL와 시료 0.02 mL를 첨가한 후 50 μL/mL elastase(pancreatic from porcine pancreas, 1.4 units/mg, Sigma-Aldrich Co.) 0.005 mL를 가하여 37°C에서 20분 동안 반응시킨 다음 410 nm에서 흡광도(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 측정하였다. 시료 무첨가 대조군은 시료 대신 Tris-HCl buffer를 넣은 것으로 하였으며 양성대조군으로는 ursolic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. Elastase 저해 활성은 시료 무첨가 대조군의 흡광도 대비 시료 첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포 배양 및 시료의 세포독성 평가

마우스 대식세포인 Raw 264.7 cell line을 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입한 후 실험에 사용하였다. 1% penicillin-streptomycin(Gibco, Grand Island, NY, USA)과 10% fetal bovine serum(Hyclone, Victoria, Australia)을 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Gibco) 배지를 사용하여 5%, CO₂를 함유한 37°C incubator(BB 15, Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에서 배양하였다. 추출물 혼합시료가 Raw 264.7 세포의 metabolic activity에 미치는 영향을 알아보기 위하여 water soluble tetrazolium(WST)을 이용한 cell proliferation assay를 실시하였다. Raw 264.7 세포를 1×106 cells/mL의 농도로 희석하여 5% CO₂, 37°C incubator(Thermo Scientific Inc.)에서 24시간 배양한 후, 0, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 µL/mL 농도의 추출물 시료를 24시간 처리하였다. 배양 후 EZ-Cytox WST assay reagent(Daeil Lab Service Co., Ltd., Seoul, Korea) 10 μL를 첨가하고 3시간 후에 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Raw 264.7 세포의 생존율은 추출물 처리를 하지 않은 대조군 세포의 생존율 대비 상대 세포생존율(%)을 계산하여 나타내었다.

Nitric oxide(NO) 및 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6) 생성량 측정

Raw 264.7 세포 용액을 5×10⁵ cells/mL의 농도로 희석하여 48-well plate에 500 μL씩 분주하고 24시간 동안 배양한 후 시료(0, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL)와 1 μg/mL 농도의 LPS(Sigma-Aldrich Co.)를 처리하여 24시간 배양하였다. NO 생성량을 측정하기 위하여 50 μL의 세포배양액을 취해 100 μL의 Griess reagent(Promega, Madison, WI, USA)와 혼합하여 10분간 암반응 시킨 후 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포로부터 생성된 NO의 함량은 sodium nitrite(NaNO₂)를 사용하여 작성한 표준 검량곡선에 대입하여 산출하였다. 또한 세포배양액 내의 TNF-α와 IL-6의 생성량은 mouse ELISA kits(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 매뉴얼에 제시된 방법에 따라 처리한 다음, ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Inc.)로 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 각 표준 검량곡선을 바탕으로 염증성 사이토카인들의 생성량을 산출하였다.

통계처리

SPSS(SPSS Statistics 24, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하여 통계처리를 하였으며, 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 각 군 간의 평균값 차이에 대한 유의성 검증은 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)과 사후검증으로 Duncan’s multiple range test를 이용하여 α=0.05 수준에서 실시하였다.

구기엽-구기자 혼합물의 항산화 효능

구기엽-구기자 혼합물(M1, M2, M3, M5)의 총 폴리페놀 함량 및 항산화 활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 네 가지 시료 중 M3와 M5의 총 폴리페놀 함량은 각각 154.59±1.69 mg GAE/g과 142.37±22.78 mg GAE/g이었고, M1과 M2의 폴리페놀 함량은 각각 37.00±0.55 mg GAE/g과 42.56±5.00 mg GAE/g으로 M3와 M5가 유의하게 높았다(P<0.05). 이들 시료의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, M1, M2, M3, M5군의 IC₅₀값은 각각 3.77±0.43 mg/mL, 3.60±0.30 mg/mL, 1.47±0.08 mg/mL 및 1.44±0.06 mg/mL로 M3와 M5가 M1이나 M2에 비해 유의하게 낮았다. 잘 알려진 항산화제인 ascorbic acid의 IC₅₀값은 0.08 mg/mL로 측정되었다. ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, M1, M2, M3, M5군의 IC₅₀값은 각각 1.51±0.02 mg/mL, 1.43±0.03 mg/mL, 0.51±0.00 mg/mL, 0.44±0.00 mg/mL로 M5> M3> M2> M1의 순으로 소거능이 높게 나타났으며 ascorbic acid의 IC₅₀값인 0.02 mg/mL에 비해 높은 편이었다. 또한, 혼합물의 FRAP value는 M3(0.46±0.01 mM)에서 가장 높았고 그다음은 M5(0.38±0.08 mM)였으며, 이 두 시료의 FRAP values는 M1(0.12±0.01 mM)이나 M2(0.16±0.01 mM)에 비해 유의하게 높았다(P<0.05).

Table 1 . Antioxidant capacities of the mixture of Lycium Barbarum’s leaf-fruit extract mixture on tyrosinase activities.

Groups1)	Total polyphenol (mg GAE2)/g)	IC50 (mg/mL)3)		FRAP value (mmol Fe(Ⅱ)/100 g)
		DPPH	ABTS
M1	37.00±0.55b4)5)	3.77±0.43b	1.51±0.02d	0.12±0.01a
M2	42.56±5.00b	3.60±0.30b	1.43±0.03c	0.16±0.01b
M3	154.59±1.69a	1.47±0.08a	0.51±0.00b	0.46±0.01d
M5	142.37±22.78a	1.44±0.06a	0.44±0.00a	0.38±0.08c
Acorbic acid		0.08±0.00	0.02±0.00

¹⁾M1∼M5: mixture of Lycium barbarum’s leaf-fruit extract mixture at the ration 1:1, 2:1, 3:1, and 5:1, respectively..

²⁾GAE: gallic acid equivalents..

³⁾The concentration in mg/mL required for 50% reduction of DPPH and ABTS radical..

⁴⁾Mean±SD (n=3)..

⁵⁾Different superscripts (a-c) in a column indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

시료의 항산화능에 대한 연구 결과, 총 폴리페놀 함량과 측정한 항산화능은 모두 M1이나 M2에 비해 M3와 M5에서 유의하게 높았다. 이러한 결과는 구기자 열매보다 구기엽 추출물의 항산화능이 높다는 뜻이며, 그 원인은 엽록소 추출과정에서 농축된 폴리페놀에 기인하는 것으로 볼 수 있다. 또한 M3와 M5의 효능을 비교했을 때 폴리페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능은 비슷했지만, ABTS 라디칼 소거능은 M5가 높았고 FRAP value는 M3가 높았다. 일반적으로 시료의 폴리페놀 함량과 항산화능은 양의 상관성을 보이는 것으로 보고되어 있다. Sánchez-González 등(2005)은 시료 내 폴리페놀의 함량과 FRAP value 간의 높은 상관관계를 가지고 있다고 보고하였고, Skotti 등(2014)은 약용식물의 총 페놀 함량과 DPPH나 ABTS 간의 상관성을 연구한 논문에서 상당히 높은 양의 상관관계가 있음을 보고하고 있다. 선행연구 결과 구기자에 함유된 중요한 생리활성물질로는 polysaccharides와 carotenoids, phenolic acids와 flavonoids 등으로 이 중 phenolic acids와 flavonoids로는 caffeic acid, chlorogenic acid, quercetin-diglucoside, kaempferol-3-O-rutinoside와 rutin 등이 함유량이 높고 항산화 활성의 근원이기도 하다고 보고하고 있다(Wang 등, 2010). 또한 Mocan 등(2014)은 구기자의 잎 추출물도 비타민, 무기질, 폴리페놀, 다당체들의 복합적인 효능으로 높은 항산화능을 보인다고 하였다. 본 연구 결과 구기자와 구기엽 추출물의 혼합물 중 구기엽 함량이 높은 M3와 M5가 총 폴리페놀 함량도 높고 항산화능도 높은 결과를 보여 클로로필을 제거한 구기엽 추출물 중 50% 에탄올 분획물의 첨가가 원료 소재의 항산화 기능성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

구기엽-구기자 혼합물의 tyrosinase 저해 활성

멜라닌은 자외선을 조사하면 melanocyte의 멜라닌 생성 반응과정을 통해 피부색을 검게 변화시켜 자외선으로부터 피부세포의 핵을 보호하는 역할을 한다(Lin과 Fisher, 2007). 멜라닌 합성과정에서 멜라닌 생성을 촉진하는 역할을 하는 효소인 tyrosinase는 L-tyrosine을 hydroxylation시켜 L-DOPA(L-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)를 합성하고 L-DOPA quinone으로 산화시킨 후 DOPA chrome을 거쳐 멜라닌 색소를 중합하는데, 이때 tyrosinase의 활성이 감소하거나 중간체의 산화반응이 억제되면 멜라닌 색소의 생성이 감소하게 되어 미백효과를 나타내게 된다(Le 등, 2021). 현재까지 미백 기능으로 검증받은 소재로는 arbutin, kojic acid, hydroquinones 등이 보고되고 있으나 arbutin과 kojic acid의 경우 정상 melanocyte에서도 작용하여 색소 침착을 억제하는 것으로 알려져 있으며, hydroquinones는 세포독성으로 인하여 널리 사용되지 못하고 있다(Ladizinski 등, 2011). 따라서 tyrosinase 활성을 억제할 수 있으면서 부작용이 없는 소재 개발에 관한 연구는 여전히 요구되고 있다.

M1~M5 혼합물의 tyrosinase 활성 저해 효과를 1,000 μg/mL 농도에서 측정한 결과, M2(69.75±0.28%)와 M5(68.38±0.55%)의 저해 효과가 M1(64.35±0.42%)이나 M3(63.34±0.16%)에 비해 높은 저해율을 나타내었다(Table 2). 양성대조군으로 사용한 kojic acid는 1,000 μg/mL 농도에서 89.13±0.25%의 저해율을 보여 본 연구에서 사용한 혼합물의 tyrosinase 활성 저해 효과는 kojic acid 대비 71~78% 수준으로 상당히 우수한 억제효능을 보이고 있으므로 미백 효능을 충분히 기대할 수 있을 것으로 생각되었다. Choi 등(2014)은 구기자 열매 열수 추출물이 1,000 μg/mL 농도에서 29.6±12.4%의 tyrosinase 활성 저해율을 나타냈다고 보고하였고, Kim 등(2011)은 건조 구기엽 70% 에탄올 추출물이 500 μg/mL에서 44%의 tyrosinase 활성 저해율을 보였다고 하였다. 본 연구실에서 측정한 구기엽 70% 에탄올 추출물 1,000 μg/mL의 tyrosinase 활성 저해율은 63.2±3.7%였으며, 구기자 추출물 1,000 μg/mL의 tyrosinase 활성 저해율은 63.0±2.1%였다(자료 미제시). 이처럼 구기자에 비해 구기자 잎 추출물의 tyrosinase 활성 저해 효능은 낮지 않아 구기자에 견줄 수 있는 우수한 효능을 보이고 있었다. 선행연구들에서 구기자나무의 뿌리에 들어있는 rutin이나 chlorogenic acid 등의 성분은 멜라닌 생성을 억제하는 효능을 보유하고 있음이 보고된 바 있다(de Freitas 등, 2016; Huang 등, 2014). 산삼배양근의 80% 에탄올 추출물은 1,000 μg/mL의 농도에서 41.55% 저해 활성률을 나타내었으며, 이는 25 μg/mL의 arbutin의 저해 활성과 유사한 값이었다(Ko 등, 2018). 또한 Kang 등(2016)은 산양삼 에탄올 추출물이 약 31%의 tyrosinase 저해 활성을 나타낸다고 보고하였고, Lee 등(2002)은 함초 추출물을 대상으로 tyrosinase 억제 활성을 측정한 결과 1,000 ppm의 농도에서 10%의 저해 효과를 나타낸다고 보고하였다. 삼백초 추출물 25%, 뽕나무 줄기 추출물 20%와 식약처에서 미백 원료로 고시한 닥나무 줄기 추출물 20%를 함유한 혼합물의 화장품 소재로서의 이용 가능성을 검토하고자 tyrosinase 활성 저해 효과를 살펴본 결과 200 μg/mL에서 60%, 1,000 μg/mL의 농도에서 약 70%의 저해 활성을 보였다(Jeong 등, 2012). 천연 미백 소재의 경우 일반적으로 200 μg/mL의 농도에서 40~70%의 tyrosinase 저해 활성을 나타내는 점을 고려하면 본 구기자-구기엽 혼합물의 tyrosinase 저해 활성은 낮지 않음을 알 수 있다.

Table 2 . Inhibitory effects of mixture of Lycium Barbarum’s leaf-fruit extract mixture on tyrosinase activities.

Groups1)	Concentration (μg/mL)	Tyrosinase inhibition (%)
M1	1,000	64.35±0.42a3)4)
M2	1,000	69.75±0.28b
M3	1,000	63.34±0.16a
M5	1,000	68.38±0.55b
Kojic acid2)	1,000	89.13±0.25

¹⁾M1∼M5: mixture of Lycium barbarum’s leaf-fruit extract mixture at the ration 1:1, 2:1, 3:1, and 5:1, respectively..

²⁾Positive control..

³⁾Mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different superscripts (a-c) in a column indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

구기엽-구기자 혼합물의 elastase 저해 활성

Elastase는 피부의 진피를 구성하는 콜라겐과 elastin을 분해하는 비특이적 가수분해 효소로, 활성이 증가하면 조직손실을 유발하므로 피부에서는 주름이 늘고 탄력감이 소실되는 결과를 낳는다. 따라서 elastase 저해 활성을 보이는 소재는 피부의 주름을 개선하는 효능을 갖는 것으로 볼 수 있다. 본 연구 시료인 혼합물에 대한 elastase 저해 활성을 측정한 결과, 1,000 μg/mL의 농도에서 M5가 가장 높아 16.41±2.23%로 측정되었으며, M3(10.00±0.96%)와 M2(8.14±7.86%)가 비슷하였고 M1(5.24±4.21%)의 저해율이 가장 낮았다(Table 3).

Table 3 . Inhibitory effect of mixture of Lycium Barbarum’s leaf-fruit extract mixture on elastase activities.

Groups1)	Concentration (μg/mL)	Elastase inhibition (%)
M1	1,000	5.24±4.21a3)4)
M2	1,000	8.14±7.86a
M3	1,000	10.00±0.96ab
M5	1,000	16.41±2.23bc
Ursolic acid2)	1,000	77.20±1.38

¹⁾M1∼M5: mixture of Lycium barbarum’s leaf-fruit extract mixture at the ration 1:1, 2:1, 3:1, and 5:1, respectively..

²⁾Positive control..

³⁾Mean±SD (n=3)..

⁴⁾Different superscripts (a-c) in a column indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

혼합물에 의한 elastase 활성 억제 효과는 클로로필 제거 구기엽 분획물의 조성비가 높을수록(M5> M3> M2> M1) 억제 효과가 큰 것으로 나타났다. 그러나 양성대조군으로 사용한 ursolic acid는 1,000 μg/mL 농도에서 77.20±1.38%의 저해율을 가진 것으로 나타나 상대적으로 혼합물의 elastase 저해 활성은 높지 않은 것으로 판단되었다. 본 연구실에서 측정한 구기엽 70% 에탄올 추출물 1,000 μg/mL의 elastase 활성 저해율은 11.1±1.95%였으며, 구기자 70% 에탄올 추출물의 elastase 활성 저해율은 유의미한 차이를 보이지 않았고 양성대조군인 ursolic acid(77.2±1.38%)에 비해 매우 낮았다(자료 미제시). Choi 등(2014)은 melanoma cell에서 구기자 열수 추출물의 elastase 저해 활성을 측정한 결과, 제1형과 4형의 elastase 저해율은 1,000 μg/mL에서 각각 61.96%와 9.20%였다고 보고하였다. 삼백초, 뽕나무 줄기, 닥나무 줄기 추출물의 혼합물에서도 elastase 저해 활성은 100 μg/mL에서 68%로 나타나 매우 우수하였지만, 이에 구기자-구기엽 혼합물의 elastase 저해 활성이 크지 않은 것은 구기엽의 보습 효과 등이 구기자에 못 미치기 때문으로 사료된다. 본 연구의 시료인 혼합물과는 많은 차이를 보이고 있으므로 추후 피부세포 및 동물실험을 통한 확인이 필요할 것으로 사료된다. 반면 산양삼 추출물의 elastase 저해 활성은 2,000 μg/mL 농도에서 40% 이상이 관찰되지 않았다고 하여(Ko 등, 2018) 시료에 따라 다양한 결과가 도출되고 있음을 알 수 있다.

구기엽-구기자 혼합물의 항염증 활성

마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포를 이용하여 혼합물의 항염증 효과를 확인하기 위해 혼합물의 세포독성을 측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 구기자-구기엽 분획물의 혼합물을 세포에 24시간 처리한 결과 1,000 μg/mL까지 세포독성이 없었다. LPS로 자극한 Raw 264.7 세포의 NO 생성량을 혼합물이 억제할 수 있는지 관찰하였으며, 결과는 Fig. 2에 나타내었다. LPS와 구기자-구기엽 혼합물을 함께 처리했을 때 M1은 125 μg/mL, M2는 250 μg/mL 이상의 농도에서 NO의 생성을 유의하게 감소시켰고 각각 최종 45.9%와 42.57%의 저해율을 보였다. 반면 M3와 M5는 모두 15.6 μg/mL 농도에서부터 NO 생성이 유의하게 감소하였으며, 1,000 μg/mL 농도에서 최종 저해율은 각각 53.1%와 48.3%를 나타냈다. 본 연구실의 선행연구에서 구기자나 구기엽 100% 에탄올 추출물과 클로로필을 제거한 구기엽 100% 에탄올 추출물의 NO 생성 억제능을 측정했을 때, 1,000 μg/mL 농도에서 구기자 추출물은 60.3%, 구기엽 추출물과 클로로필 제거 구기엽 추출물은 모두 75% 정도 억제효능을 보였다(Bae 등, 2019). 이에 반해 본 연구에서 사용한 분획물의 혼합물은 최종 억제능이 약간 낮은 수치를 보여주었으나 억제 효과가 잘 유지되고 있음을 알 수 있었으며, 특히 M3와 M5 시료 처리 효과는 15.6 μg/mL 저농도에서부터 잘 나타나 항염 효능이 우수한 것으로 판단되었다.

Fig 1. Effect of the Lycium barbarum’s leaf-fruit extract mixture (M1, M2, M3, M5) on Raw 264.7 cell viability. M1∼M5: mixture of Lycium barbarum’s leaf-fruit extract at the ration 1:1, 2:1, 3:1, and 5:1, respectively. Values are mean of three replicate determinations (n=3).

Fig 2. Effects of M1 (A), M2 (B), M3 (C), and M5 (D) on NO production in LPS-stimulated Raw 267.4 cells. M1∼M5: mixture of Lycium barbarum’s leaf-fruit extract at the ration 1:1, 2:1, 3:1, and 5:1, respectively. Values are mean±standard deviation of four replicate determinations (n=4). Different letters (a-f) above the bars indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

또한, 각각의 혼합물에 대하여 LPS에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6 생성 저해 효과를 확인하였다. LPS와 구기자-구기엽 혼합물을 함께 처리했을 때 M1~M5의 모든 혼합물은 15.6~31.53 μg/mL 농도에서부터 TNF-α 생성을 유의하게 감소시켰으며, 1,000 μg/mL 농도에서 각각 92.92%, 94.14%, 94.06%, 89.38% TNF-α 생성이 억제되었다(Fig. 3). 세포에서 IL-6 생성에 대한 억제 효과를 측정한 결과, LPS와 혼합물을 함께 처리했을 때 M1과 M3, M5는 모두 15.6 μg/mL 농도에서부터 IL-6 생성이 유의하게 감소했으며, 1,000 μg/mL 농도일 때 각각 73.27%, 66.0%, 72.2% IL-6 생성이 저해되었다(Fig. 4). 예외적으로 M2 처리 시 농도 의존적으로 IL-6 생성량이 감소하는 경향을 보였으나 유의한 차이는 500 μg/mL 농도 이상에서 보였다. 최종 저해율은 59.94%로 다른 혼합물에 비해 억제 효과가 다소 낮게 나타났다. 본 연구실의 선행연구로 구기자와 클로로필 제거 구기엽의 100% 에탄올 추출물은 LPS로 염증을 유도한 Raw 264.7 세포와 동물실험에서 항염 효능이 입증되었다(Bae 등, 2019). 본 연구 결과 구기자-클로로필 제거 구기엽 분획물의 혼합물은 각각의 에탄올 추출물에 비해 우수한 항염 효능을 보였다.

Fig 3. Effects of M1 (A), M2 (B), M3 (C), and M5 (D) on the TNF-α production in LPS-stimulated Raw 267.4 cells. M1∼M5: mixture of Lycium barbarum’s leaf-fruit extract at the ration 1:1, 2:1, 3:1, and 5:1, respectively. Values are mean±standard deviation of four replicate determinations (n=4). Different letters (a-c) above the bars indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Fig 4. Effects of M1 (A), M2 (B), M3 (C), and M5 (D) on the IL-6 production in LPS-stimulated Raw 267.4 cells. M1∼M5: mixture of Lycium bararum’s leaf-fruit extract at the ration 1:1, 2:1, 3:1, and 5:1, respectively. Values are mean±standard deviation of four replicate determinations (n=4). Different letters (a-e) above the bars indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

최근 구기자에 함유된 polysaccharides(LBP)의 생리적 효능에 관한 연구 결과가 다수 발표되고 있다. 특히 LBP는 target dendritic cell, 대식세포, T 및 B 림프구, 자연 살해(NK) 세포에서 면역조절 기능을 나타냈으며(Zhang 등, 2015), L. barbarum 추출물은 Raw 264.7 세포에서 산화질소와 사이토카인의 촉진 효과를 통해 상당한 면역조절 활성을 나타내었다(Lin 등, 2008). 반면 구기자와 유사한 성분을 함유하고 있고 대량 재배되는 지역에서는 비교적 쉽게 수거할 수 있는 구기엽 추출물에 관한 연구들이 발표되었으며, 최근 구기엽 추출물이 대장염을 유발한 마우스의 장에서 ER 스트레스와 염증을 억제하였고 천식 유발 마우스에서 항염 효능을 보이는 등(Cui 등, 2020) 염증 관련 연구가 진행되었다. 구기엽 추출물은 장점막의 tight junction integrity를 강화하고 소포체 스트레스와 염증을 억제할 수 있는 것으로 보고되었다(Lee 등, 2021).

본 연구에서는 항염 효능을 갖는 것으로 알려진 L. barbarum의 열매와 잎의 생리활성을 높일 수 있도록 각각의 에탄올 분획물을 제조하고 혼합하여 실험한 결과, 클로로필 제거 구기엽 분획물의 비율이 높은 혼합물 M3와 M5의 혼합물에서 유의미한 결과를 얻을 수 있었다.

본 연구의 제한점으로는 in vitro 실험에서 구기자와 구기엽 에탄올 분획물의 다양한 효능을 검증하였으나 전임상 실험과 인체 적용 실험이 이루어지지 않았으므로 생체를 대상으로 하는 실험을 통해 안전성과 효과를 입증해야 한다는 것이다. 또한 M2의 결과가 다른 시료에 비해 다른 양상을 보이는 것에 대한 추가연구로 혼합물의 성분 분석에 따른 효능 평가가 필요하다.

본 연구에서는 천연물 유래 화장품 소재를 개발하기 위하여 클로로필을 제거한 구기엽 에탄올 추출물 중 항산화 활성이 높은 50% 에탄올 분획물과 구기자 70% 에탄올 추출물의 50% 에탄올 분획물을 각각 1~5:1의 비율로 혼합한 시료(M1, M2, M3 및 M5)의 항산화와 항염, 미백 및 주름 개선 효능을 확인하고자 하였다. 항산화 활성으로 시료의 총 폴리페놀 함량과 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, FRAP value를 측정하였고 항염 효능으로 Raw 264.7 세포에서 NO와 TNF-α, IL-6의 생성 억제 효과를 측정하였다. 또한 화장품 원료로서의 기능성을 위하여 미백 및 주름 개선 효능을 측정하기 위하여 시료의 tyrosinase와 elastase 활성 억제효능을 측정하였다. 연구 결과 시료의 클로로필 제거 구기엽 분획물의 함량이 높은 혼합물 M3(154.6 mg GAE/g)와 M5(142.4 mg GAE/g)에서 폴리페놀 함량이 유의하게 높았고 M1이나 M2에 비해 FRAP value와 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능에서 높은 활성을 나타냈다. Tyrosinase의 활성 억제 효과는 kojic acid 대비 M2에서 78%, M5에서 77%로 유의하게 높았고 M1과 M3에서도 71~72%로 낮지 않았다. 시료는 Raw 264.7 세포에서 1,000 μg/mL 농도까지 세포독성을 보이지 않았으며, LPS로 염증을 유도한 세포에 혼합물 시료를 처리하였을 때 M3와 M5 처리군에서 NO, TNF-α, IL-6 생성을 유의하게 저해하는 효과를 확인할 수 있었다. 결론적으로 구기엽-구기자 혼합물의 항산화, 항염 및 미백 효능은 클로로필 제거 구기엽 분획물의 혼합 비율이 높은 시료에서 대체로 우수한 활성을 보였다. 따라서 본 연구에서 검증된 구기자-구기엽 혼합물 중 M3 및 M5는 기능성 소재로써 활용이 가능할 것으로 기대된다.

본 연구는 2017년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업(NRF-2017R1D1A3B03028628)과 중소벤처기업부의 창업성장기술개발사업(S2798486, 면역 억제 효능을 가지는 천연생물소재(고지베리)를 이용한 아토피 피부 개선 및 보습효과가 우수한 기능성 화장품 개발)의 일환으로 수행하였음.